Summary
Опишем аналитический метод оценки срока службы глутамата астроцитов в мембранах из электрофизиологических записей глутамата токи транспортера в астроциты.
Abstract
Высокая плотность транспортеры глутамата в мозге находится в астроциты. Глутамат пару транспортеры движение глутамата через мембрану при содействии транспортировки 3 Na + и 1 H + и противоположно направленного транспорта 1 К +. Стехиометрического ток, генерируемый транспортного процесса можно контролировать с цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов. Временной ход записан текущий формируется временной ход глутамата профиль концентрации в котором астроциты подвергаются, кинетика глутамата транспортеры, и пассивный электротоническим свойства астроцитов мембран. Здесь мы описываем экспериментальных и аналитических методов, которые могут быть использованы для записи глутамата токи транспортера в астроцитах и изолировать временной ход глутамата зазор от всех других факторов, которые определяют форму волны тока астроцитов транспортер. Методы, описанные здесь, могут быть использованы для оценки времени жизни оF-вспышкой и Uncaged синаптически выпустили глутамата на мембранах астроцитов в любом регионе центральной нервной системы во время здоровья и болезни.
Introduction
Астроциты являются одним из наиболее распространенных типов клеток в мозге со звездообразной морфологии и мелкие выступы мембраны, которая распространяется на всю нейропилей и достичь 1,2 соседних синаптических контактов. Клеточной мембраны астроцитов 'плотно заполнена молекулы глутамата Перевозчик 3. В физиологических условиях глутамата транспортеры быстро связывать глутамат на внеклеточный стороне мембраны и передавать ее в цитоплазме клетки. Поступая таким образом, транспортеры поддерживать низкие базальные концентрации глутамата во внеклеточном пространстве 4. Глутамат транспортеры в хорошую астроцитов процессов, прилегающих к возбуждающих синапсов идеально расположены для связывания глутамата выделяется при синаптических событий, как это диффундирует из синаптической щели. Поступая таким образом, транспортеры глутамата также ограничить побочные к пери-и экстра-синаптических регионах и на соседние синапсы, уменьшая пространственное распространение возбуждающего сигналасек в мозге 5-7.
Глутамат транспорт электрогенных процесс стехиометрически сочетании с движением 3 Na + и 1 H + вдоль их электрохимического градиента и противоположно направленного транспорта 1 К + 8. Глутамат транспорта связан с (но не стехиометрическом соединены с) анионные проводимости проницаемой для SCN - (тиоцианатом)> NO 3 - (нитрат) ≈ ClO 4 - (перхлораты)> I -> Br -> Cl -> F -, а не СН 3 SO 3 - (метансульфоната) и C 6 H 11 O 7 - (глюконат) 9-11. Оба токов (стехиометрические и нестехиометрическое) могут быть записаны путем получения цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов, визуально, выявленных в рамках Dodt освещения или инфракрасных дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) в acutэлектронной срезах мозга 12. Стехиометрического составляющей тока, связанных с глутаматом транспорт через мембрану может быть выделен с помощью CH 3 SO 3 - или С 6 Н 11 О 7 - на основе внутриклеточных растворов и может быть вызвано с помощью флэш-uncaging глутамата на астроциты 13,14, или путем активации высвобождение глутамата из соседних синапсов, либо электрическим, 12 или с целевой контроль optogenetic.
Временной ход стехиометрического компонент транспортер ток имеет форму временем жизни глутамата профиль концентрации при астроцитов мембраны (например, глутамат зазор), кинетика глутамата транспортеры, пассивный свойства мембраны астроцитов, а в синаптической стимуляции, к синхронность высвобождение глутамата через активированный синапсы 13. Здесь мы опишем во всех деталях: (1) экспериментальная провертренере, чтобы изолировать стехиометрического компонентом глутамат токов транспортер с цельноклеточной патч-зажим записи из астроцитов использованием острого мышь срезах гиппокампа в качестве примера экспериментального препарата, (2) аналитический метод для получения временной ход глутамата очистка от этих записей 13, 14. Эти методы могут быть использованы для записи и анализа глутамата токов транспортер из астроцитов в любой области центральной нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Slice
- Подготовьте 500 мл нарезки / хранения раствора, содержащего (в мм): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, 22 и глюкозы, 320 мОсм, рН 7,4
- Используйте 250 мл стакан подготовить камеру для погружения ломтиками, залейте его 200 мл нарезки / решение для хранения данных, согрейте его в водяной бане при 34 ° С и пузырь его с 95% O 2, 5% СО 2.
- Держите оставшуюся нарезки / решение для хранения данных в стеклянной бутылке при 4 ° C.
- Используйте цианакрилатный клей для прикрепления небольшой блок агара (6%, подготовленный в ACSF) на Vibratome держатель образца и хранить его при температуре 4 ° C.
- 30 мин до начала нарезки, поместите стеклянную бутылку, содержащую нарезки / решение для хранения данных в ведро со льдом и пузырь его с 95% O 2, 5% СО 2.
2. Astrocyte идентификации и записи 3. Pharmacгические Выделение Устойчивый К + тока 4. Яsolation облегченного Часть синаптически-активированный Токи Transporter (fSTCs) 5. Вычитание остаточной zdustained K +-ток от fSTCs 6. Выделение флэш-активированной Токи Transporter (FTCs) 7. Деконволюция анализа
Примечание: для получения высококачественных ломтиками, важно, чтобы эти две части головного мозга прочно приклеен к Vibratome основанием. Чтобы сделать это, используйте цианакрилатный клей, который не слишком жидким, и что не высыхает слишком быстро.
Примечание: если все ориентировано правильно, Vibratome следует резки ломтиками парасагиттальной из спинной к вентральной и с медиальной стороны боковой поверхности мозга.
Примечание: астроциты как правило, имеют низкий входной Resistancе (~ 10 МОм), гиперполяризованного мембранного потенциала покоя (~ -90 мВ), и никакой стрельбы активности. Астроциты хранятся на его мембранный потенциал покоя в течение экспериментов в фиксации потенциала режиме (т.е. ток удержания должен показывать 0 Па). Перед каждым стимуляции, 10 мс гиперполяризующих напряжение шаг (-3 мВ) используется для контроля серии и входное сопротивление астроцитов. 
Примечание: TBOA регистра компонент (то есть тот, который записан в присутствии TBOA (50 - 100 мкМ)) представляет собой устойчивый К +-ток. Его время, конечно аппроксимируется моно-экспоненциальной функции описанных выше.
Примечание: В записи условий, описанных здесь (т.е. внутриклеточные CH 3 SO 3 - или C 6 H 11 O 7 -), синаптической стимуляции возбуждающих аксоны генерировать астроцитов токов с сложной формы, состоящий из быстрого роста переходных внутрь стехиометрического тока и медленного -рост, устойчивый внутренний K +-отражающие текущие K + переуравновешивания во внеклеточном пространстве после распространения потенциала действия вдоль соседних аксонов. Очень важно, чтобы удалить этот устойчивый K +-ток, как и любой остаточный ток приведет кпереоценить глутамата жизни.
Примечание помнить, что анализ, описанный в 4.7-4.10 должны быть выполнены в среднем следов, полученных в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ).
Примечание: в записи условий, описанных здесь (т.е. внутриклеточные CH 3 SO 3 - или C 6 H 11 O 7 -), флэш-раздражители генерировать токи астроцитов, состоящие только из быстрого роста переходных стехиометрического входящего тока.
Примечание: анализ, описанный в 6,7 должны быть выполнены в среднем следов, полученных в контрольных условиях и в TBOA (10 мкМ). 
икоторая лучше всего описывает распадающейся фазе Transporter текущего записан в TBOA (10 мкм) (рис. 3б).
Примечание: функция, описанная в 7.2 (т.е. H (т)) представляет собой время, конечно глутамата зазор из астроцитов в присутствии TBOA (10 мкМ).
Примечание: деконволюцией это математическая операция, включены во многие программное обеспечение для анализа пакетов, таких как (например, Matlab, Python). В IgorPro, программный код, который мы обычно используем для выполнения этого вида анализа, деконволюции операция может быть эффективно вычислено, как описано ниже, с использованием быстрого дискретного преобразования Фурье. Во-первых, с помощью операции БПФ для вычисления диscrete быстрого преобразования Фурье с моно-экспоненциальной функции, полученные в 7.2 и в приступе Transporter текущего записан в TBOA полученные в 7.1. Затем с помощью операции IFFT для вычисления обратного быстрого дискретного преобразования Фурье отношение двух функций FFT. В результате функции I (т) может быть описан следующим образом: 
Стадии, описанной в 7,3 позволяет выводе фильтр транспортера тока в TBOA (10 мкМ) (рис. 3c справа). Фильтр представляет искажающих факторов, которые превращают жизнь глутамата на мембранах астроцитов в текущем Transporter изолированы в разделах 4 - 6 (т.е. FSTC или FTC).
Примечание: Этот шаг позволяет выводе временной ход оформления глутамата из астроцитов в контрольных условиях (рис. 3 справа). Предположения, лежащие в основе этого деконволюцией шагом является то, что временной профиль фильтра остается неизменной в контрольных условиях и в TBOA (10 мкм).
где G (T) сигнала, полученного на стадии 7.1. В уравнении описано выше, термин т соответствует времени, в течение которого окно интеграл вычисляется.
Обратите внимание: когда этот метод был впервые создан,Ф рассчитывали с течением времени окна, которые остались неограниченной 13. Этот подход может быть использован при условии, интеграция окна устанавливается быть шире, чем продолжительность глутамата оформления и распады оформление сигнала полностью возвращалась к базовому уровню. Если это не так, однако, этот метод оценки Ф встречает некоторые ограничения. Например, если зазор сигнала не затухает точно возвращалась к базовому уровню, то ф возрастает с увеличением ширины интеграции окна. Во избежание потенциального источника погрешности для оценки Ф, мы теперь вычислить ее в течение временного окна соответствует 10% от пикового транспортера тока до и после ее начала 14. Последний подход улучшает последовательность, с которой Ф измеряют на клетки. Это очень удобно, особенно при анализе малых эффектов фармакологических методов лечения от времени ход оформления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успех аналитический подход, описанный здесь критически зависит от получения высококачественных электрофизиологических записей транспортера токи из астроцитов в любой области центральной нервной системы. При острых срезов гиппокампа мыши, астроциты могут быть легко идентифицированы под Dodt освещения или ИК-DIC из-за их малого тела клетки (Ø = 10 мкм) и видный ядра (рис. 1). Их отличительная звездная морфологии могут быть оценены с эпифлуоресцентной, конфокальной или двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии, при добавлении флуорофором как Alexa 594 (50 мкм) с внутриклеточным решение, (рис. 1). На уровне электрофизиологии, астроциты характеризуются низким входным сопротивлением, гиперполяризованным мембранный потенциал (~ -90 мВ) и неспособность генерировать потенциалы действия. Астроциты генерировать токи в ответ на электрические или optogenetic стимуляции соседних нейронов и УФ-фотолиза околоGED соединений, таких как MNI-L-глутамата.
Астроцитов токи транспортера может быть записано с помощью Cs + или K + на основе внутренних решений. Обратите внимание, что Cs +, K + популярным замену, поддерживает глутамата транспорта, но замедляет глутамата частого Transporter 16,17 (потому что связывают транспортеры глутамата и / или перемещать Cs + через мембрану медленнее, чем K +). Если Cs + значительно снижает количество транспортеры для связывания глутамата, это также приводит к меньшим / медленнее транспортер токи, чем те, записанных с K + на основе внутренних решений 16,17.
При использовании CH 3 SO 3 - или С 6 Н 11 О 7 - в качестве основных внутриклеточных анион, ток, генерируемый глутамата транспортеры в астроцитах связано с стехиометрически-совместного движения 1 глутамат, 3 Na
Нынешний записан в астроциты, когда вызывающий синаптической высвобождение глутамата имеет более сложную форму волны. Он состоит из быстро растущих, переходные внутрь составляющая из-за стехиометрическом связью текущего транспортера глутамата описано выше. Кроме того, она содержит медленно растет, устойчивый внутрь К +-тока из-за притока K + накопленных во внеклеточном пространстве после потенциала действияраспространение вдоль соседних аксонов. Фармакологический подход может быть использован для изоляции транспортер тока от устойчивого К +-тока и требует использования высоких концентраций широкого спектра действия глутамата транспортер антагонист TBOA (100 мкМ) в конце эксперимента 12. Описанный здесь метод использует чисто аналитический подход, чтобы изолировать глутамата транспортер тока от устойчивого К +-ток и, следовательно, позволяет сократить экспериментов (рис. 2).
В качестве первого шага, мы чередования одиночных и парных импульсов синаптической стимуляции (100 мс друг от друга), каждые 10 - 20 с, а среднее равного количества разверток, полученных с одного и парными импульсами раздражители. Амплитуда первой ток, вызванный парных стимулов должна соответствовать амплитуде тока, вызванный одного стимула. Мы начнем этот анализ путем вычитания текущей вызванные одного стимула, что вызванопарных стимулов. Это позволяет вычитание изолирующий ответ на второй стимул, который также состоит из быстро растущих, переходные транспортер глутамата тока и медленно растет, устойчивые К +-ток (правый рисунок 2а). Далее, мы переходим ответ на один стимул на временной интервал, соответствующий между интервалом импульса парных стимулов, так что время начала одного ответа соответствует времени начала второй ответ изолированы выше (фиг. 2b ). Путем вычитания этих двух течений, мы изолируем облегченный части транспортера ток, который мы называем здесь FSTC (рис. 2в). Кинетика FSTC похожи на кинетику синаптически активированных транспортер тока (СПУ), выделенных фармакологически с высоким содержанием глутамата транспортер антагонист TBOA (100 мкМ) 13. По этой причине и для простоты, в предыдущей работе, мы ссылались на FSTCкак STC 13,14. Несмотря на то, токи с аналогичными свойствами, fSTCs и СПУ, не то же самое тока. По этой причине и на точность, в этой работе, мы будем ссылаться на них в явном виде fSTCs и СПУ. Метод вычитания описанный здесь позволяет точно изоляции fSTCs в большинстве записей. Тем не менее, в некоторых случаях, остаточный устойчивого К +-ток все еще присутствует. В этом случае необходимо изолировать устойчивого К +-тока в отдельных экспериментах с использованием высоких концентраций TBOA (50 - 100 мкМ). Временной ход фармакологически изолированной устойчивый К +-ток может быть описано с помощью моно-экспоненциальной функции в виде:
Записывая астроцитов токи в различных клетках, по нашим оценкам среднее значение ростом Τ. Мы следующего создающихе моно-экспоненциальной функции, как описанный выше, в котором Τ рост соответствует среднему значению рост Τ измерена экспериментально в различных астроцитов и соответствует амплитуде остаточного устойчивого К +-ток, который мы хотим удалить (рис. 2d ).
Метод, который мы только что описали, чтобы изолировать fSTCs работает хорошо, когда вызывающий высвобождение глутамата от содействия синапсов, а также может быть использована для изучения высвобождение глутамата из синапсов, которые подвергаются парных импульсов депрессии. Тем не менее, приносит мало пользы, когда синапсы глутаматергические исследуемых не показывают четкой форме краткосрочных упрощении или депрессии. В этом случае фармакологических изоляции транспортер токи с высокой концентрацией TBOA (100 мкМ) остается наиболее подходящим решением для изоляции стехиометрически связью, синаптически вызываемой глутамата транспортер тока.
(т.е. без ее полного блокирования). Цель здесь заключается в значительно замедлить ход времени Transporter ток без потери возможности, чтобы отличить его от шума записей. Лежит предположение, что в присутствии малых концентраций TBOA, когда поглощение мощности астроциты уменьшается, основным фактором, определяющим распада транспортер ток постепенное снижение концентрации глутамата в астроцитов мембраны 12,18. Мы подходим Transporter тока в контрольных условиях и в TBOA (10 мкм) с мульти-экспоненциальной функции:
(Рис. 3а). Аппроксимируем глутамата оформление в TBOA (10 мкм) с ростом мгновенно-функции с моно-экспоненциальный спад (рис. 3б), и мы деконволюции его из мульти-экспоненциальной функции, описывающей Transporter ток в TBOA (10 мкМ, рисунок 3в). Полученная форма волны "фильтр", и представляет собой сочетание факторов, которые искажают (т.е. фильтром) профиль концентрации глутамата в текущем транспортер (рис. 3в). Deconvolving фильтр с мульти-экспоненциальной подгонки Transporter тока в контрольных условиях позволяет оценить временной ход концентрации глутамата профиль на записанные астроцитов в контрольных условиях (рис. 3D). Для этого деконволюцией анализе мы предполагаем, что кинетикана фильтре остаются неизменными в отсутствие и в присутствии TBOA (10 мкМ). Это разумное предположение, поскольку все факторы, которые способствуют фильтра (т.е. Transporter кинетика, электротонических фильтрации, и во время синаптической стимуляции, асинхронный высвобождение глутамата через синапсы) вряд ли будут оказывать влияние на присутствие TBOA, соединение, которое уменьшает количество транспортеров использовать для связывания глутамата. Мы используем центроида (Ф) в качестве меры глутамата срок службы при астроцитов мембран в различных клетках. Ф представляет собой "центр масс" зазора сигнала, а также чувствительна к изменениям как время нарастания и затухания глутамат сигнала оформления. Центроида выражается в виде:
В 1 "FO: Content-ширина =" 3 дюйма "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Идентификация астроцитов при острых срезов гиппокампа. (AB) Dodt изображения астроцитов гиппокампа CA1 в слое radiatum. Под Dodt освещенности и ИК-ДИК, астроциты могут быть идентифицированы по их небольшой клетке тела и видных ядра. Красные стрелки указывают на несколько астроциты, которые могут быть определены при подготовке ломтиками. Желтая стрелка показывает астроцитов, что было исправлено и заполнены флуоресцентным красителем (см. ниже). (CD), облицованная Dodt изображение срезов гиппокампа и двухфотонного из исправленных астроциты, выделены желтым стрелку в (AB). Для этого эксперимента были исправлены астроцитов и заполнены KCH 3 SO 3 - на основе внутренней раствор, добавленный с Alexa 594 (50 мкМ). Астроцитов процессы увеличивают в несколько десятков мкм от TОн тела клетки. Аннотации левого определить три основных клеточных слоев гиппокампа CA1 которые могут быть признаны в срезах.
Рисунок 2. Выделение fSTCs от синаптически активированных Transporter токов, зарегистрированных в астроциты. (AC) Схема аналитического шаги, необходимые, чтобы изолировать от fSTCs синаптически активированных Transporter токов, зарегистрированных в астроциты. (D) Аналитический подход, используемый для удаления остаточного устойчивого K +-ток от fSTCs (см. раздел 5). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
ЛОР-ширина = "6.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
Рисунок 3. Деконволюция анализа используются для получения временной ход оформления глутамата из астроцитов (а) Моно-экспоненциальной подгонки FSTC / FTC изолированы в контрольных условиях (слева) и в присутствии TBOA (10 мкМ; справа).. (Б) время хода глутамата оформление в TBOA (10 мкМ) аппроксимируется мгновенно растущим функции с моно-экспоненциальное затухание. (В) Deconvolving временной ход глутамата зазор в TBOA (10 мкМ) с мульти-экспоненциальной подгонки транспортер тока в TBOA (10 мкМ) позволяет оценить фильтра. (D) Deconvolving фильтр с мульти-экспоненциальной подгонки Transporter тока в контрольных условиях позволяет оценить временной ход оформления глутамата из астроцитов в контрольных условиях.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем экспериментальный подход, чтобы получить электрофизиологических записей из астроцитов, аналитический протокол для изоляции глутамата токи транспортера в астроцитах и математические методы для получения временной ход глутамата зазор от астроцитов токов транспортер.
Успех анализ основан на способности для получения высококачественной записи патч зажим из астроцитов и от точности установки алгоритмы, используемые для описания транспортер токов. Деконволюции анализ основан на следующих двух предположений. (1) несколько процессов, которые искажают временной ход глутамата зазор в экспериментально записанных транспортер ток может быть представлен в виде линейной системы. Хотя в абсолютном выражении многие из факторов, что токи формы Transporter являются нелинейными системами (в принципе связывания глутамата и транспорта может проходить как насыщенность), экспериментальные данные показателиTES, что их линейном режиме широк. Соответственно, время хода транспортера токов и глутамата зазор остается тем же самым в широком диапазоне стимул силы, высвобождение вероятности, и глутамат концентрации 13,14,18. Хотя это приближение кажутся нормальными, для наших экспериментальных условиях, должны быть проверены, прежде чем повторять этот анализ в различных экспериментальных препаратов. (2) характеристики фильтра не влияет на присутствие TBOA (10 мкм). Это предположение кажется разумным, потому что все факторы, влияющие на фильтре (т.е. Transporter кинетика, электротонических фильтрации, и во время синаптической стимуляции, асинхронный высвобождение глутамата через синапсы) вряд ли будут оказывать влияние на присутствие TBOA.
По получении глутамата сигнала разрешения от fSTCs и FTCs, получаем два различных типов информации. Анализируя fSTCs, мы измеряем время, которое astrocyкрестики мембраны воздействию глутамата освобожден от синапсов. , Вызывая FTCs с полным освещением УФ поля (т.е. uncaging глутамат по всей поверхности астроцитов), мы измеряем время, астроцитов мембраны подвергаются Uncaged глутамата. В этих экспериментах все uncaging глутамата молекулы высвобождаются (т.е. Uncaged) одновременно и все транспортеры активируются в то же время, по той же концентрации глутамата. Таким образом, на основе анализа FTCs, можно получить косвенное считывание астроцитов способности поглощать глутамата.
Важно отметить, что описанные здесь методы позволяют оценить ход времени глутамат оформления, а не фактическое значение глутамата вызывая Transporter токов. Предполагаемый курс времени является средним показателем временной ход глутамата оформление на всех областях астроцитов мембраны, к которой мы должны электрофизиологических доступа: это неT чувствительны к неоднородности в глутамата с различных сайтов астроцитов мембраны 19. Эта информация скорее всего, будут получены при микроскопии высокого разрешения глутамата люминесцентный репортеров 20. Тем не менее, в настоящее время глутамат-чувствительные журналисты проявляют относительно узким динамическим диапазоном. Это может привести к нелинейных искажений между глутамата профиль концентрации и флуоресцентного сигнала, что ограничивает использование этих зондов для извлечения временной информации на глутамата переходного процесса. Таким образом, это, вероятно, объединив все эти различные подходы, которые можно получить наиболее полное понимание динамики глутаматергической сигналов на астроцитов мембран.
Таким образом, методы, представленные здесь, могут быть использованы для оценки ходе оформления время синаптически выпустили или флэш-Uncaged глутамата на мембранах астроцитов. Они обеспечивают ценные инструменты, которые окн быть использованы для оценки срока службы глутамата во внеклеточном пространстве на различных стадиях развития 13 в различных видов животных, 14 и мозга в физиологических и патологических состояний 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института неврологических расстройств и инсульта Внутренние программы исследований (NS002986). Как писал рукопись и реализованы деконволюцией анализа. JSD разработал первоначальный вариант деконволюцией анализа и прокомментировал текст.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
