Summary
Wir beschreiben eine analytische Methode, um die Lebensdauer von Glutamat an astrozytären Membranen schätzen von elektrophysiologischen Ableitungen von Glutamat-Transporter Ströme in Astrozyten.
Abstract
Die höchste Dichte von Glutamat-Transporter im Gehirn in Astrozyten gefunden. Glutamattransporter Paar die Bewegung von Glutamat durch die Membran mit dem Co-Transport von 3 Na + und H + 1 und der Gegenelektrode Transport von 1 K +. Das stöchiometrische Strom, der durch den Transport Prozess erzeugt wird, kann mit whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten überwacht werden. Der zeitliche Verlauf der aufgezeichneten Strom wird durch den zeitlichen Verlauf der Glutamatkonzentration Profil auf die Astrozyten ausgesetzt sind, die Kinetik der Glutamat-Transporter, und die passive elektrotonischen Eigenschaften von Astrozyten Membranen geformt. Hier beschreiben wir die experimentellen und analytischen Methoden, die verwendet werden, um Glutamattransporter Ströme in Astrozyten erfassen und isolieren den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von allen anderen Faktoren, die die Wellenform der Astrozyten-Transporter Ströme formen kann. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um die Lebensdauer o abzuschätzenf Flash-uncaged und Glutamat in Astrozyten Membranen in jeder Region des zentralen Nervensystems bei Gesundheit und Krankheit synaptisch-released.
Introduction
Astrozyten sind eine der am häufigsten vorkommenden Zelltypen im Gehirn mit sternförmigen Morphologie und feine Membran Vorsprünge, die in der gesamten Neuropils erweitern und erreichen benachbarten synaptische Kontakte 1,2. Die Astrozyten 'Zellmembran ist dicht mit Glutamat-Transporter-Moleküle 3 verpackt. Unter physiologischen Bedingungen Glutamattransporter schnell binden Glutamat an der extrazellulären Seite der Membran und überträgt es auf Zytoplasma der Zelle. Auf diese Weise erhalten die Transporter günstig die basale Konzentration von Glutamat in den extrazellulären Raum 4. Glutamat-Transporter in feine Astrozytenfortsätze benachbarten Synapsen erregenden sind ideal positioniert, um Glutamat während der synaptischen Ereignisse veröffentlicht, sobald sie weg aus dem synaptischen Spalt diffundiert binden. Damit die Transporter auch begrenzen Glutamat Spillover auf peri-und extra-synaptischen Regionen und auf benachbarten Synapsen, die Verringerung der räumlichen Ausbreitung der erregenden Signals im Gehirn 5-7.
Glutamate Transport ist ein Prozess elektrogenen stöchiometrisch auf die Bewegung von 3 gekoppelt Na + und H + 1 entlang ihrer elektrochemischen Gradienten und dem Zähler-Transport von 1 K + 8. (Thiocyanat)> NO - 3 - (Nitrat) ≈ ClO 4 - (Perchlorat)> I -> Br -> Cl -> F -, nicht Glutamate Transport mit (aber nicht stöchiometrisch gekoppelt) ein anionisches Leitwert durchlässig SCN verbunden um CH 3 SO 3 - (Methansulfonat) und C 6 H 11 O 7 - (Gluconat) 9-11. Beide Ströme (stöchiometrischen und nicht-stöchiometrischen) durch Erhalten Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten, visuell unter Dodt Beleuchtungs-oder Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) in acut identifiziert aufgezeichnet werdene Gehirnscheiben 12. Das stöchiometrische Komponente des Stroms mit Glutamat Transport über die Membran verbunden sind, können durch Verwendung von CH 3 SO 3 isoliert werden - oder C 6 H 11 O 7 - basierten intrazellulären Lösungen und kann durch Flash-Uncaging Glutamat auf Astrozyten 13,14 hervorgerufen werden, oder durch die Aktivierung Glutamat-Freisetzung aus benachbarten Synapsen, entweder elektrisch 12 oder mit einer gezielten optogenetische Kontrolle.
Der zeitliche Verlauf der stöchiometrischen Komponente des Transporters Strom durch die Lebensdauer des Glutamat-Konzentration in Astrozyten Profil Membranen (zB Glutamat Clearance) geformt, die Kinetik der Glutamat-Transporter, die passive Membran Eigenschaften von Astrozyten und während der synaptischen Reize, durch die Synchronität der Freisetzung von Glutamat in den aktivierten Synapsen 13. Hier beschreiben wir ausführlich: (1) eine experimentelle ca.oach die stöchiometrische Komponente von Glutamat-Transporter Ströme von whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten mit akuten Maus Hippocampus als Beispiel experimentelle Vorbereitung isolieren, (2) ein analytischer Ansatz zur Ableitung des zeitlichen Verlaufs von Glutamat-Clearance von diesen Aufnahmen 13, 14. Diese Methoden können verwendet werden, um aufzuzeichnen und zu analysieren Glutamattransporter Ströme von Astrozyten in einer beliebigen Region des zentralen Nervensystems werden.
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Protocol
1. Scheibe Vorbereitung
- Bereiten Sie 500 ml Schneiden / Storage-Lösung, die (in mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26.2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4 und 22 Glucose, 320 mOsm, pH 7,4
- Verwenden Sie einen 250 ml-Becher, ein Untertauchen Kammer für die Scheiben vorzubereiten, füllen Sie es mit 200 ml Schneiden / Storage-Lösung, warm es in einem Wasserbad bei 34 ° C und blase sie mit 95% O 2, 5% CO 2.
- Halten Sie die restlichen Scheiben / Storage-Lösung in einer Glasflasche bei 4 ° C.
- Verwenden Sie einen Cyanacrylatklebstoff eine kleine Agarblock (6%, hergestellt in ACSF) auf der Vibratom Probenhalter befestigen und speichern sie bei 4 ° C.
- 30 min vor Beginn Schneiden, legen Sie die Glasflasche mit dem Schneiden / Storage-Lösung in einen Eimer mit Eis und blase sie mit 95% O 2, 5% CO 2 gefüllt.
2. Astrocyte Identifizierung und Recordings 3. Pharmacological Isolation des Anhaltende K +-Strom 4. Isolation der erleichterten Portion Synaptisch-Activated Transporter Currents (fSTCs) 5. Subtraktion des Residual zdustained K +-Strom von fSTCs 6. Isolation des Flash-aktivierten Transporter Currents (FTCs) 7. Dekonvolutionsanalyse
Hinweis: Um die hochwertigsten Scheiben zu erhalten, ist es wichtig, dass die beiden Teile des Gehirns fest mit dem Vibratom Grundplatte verklebt. Um dies zu tun, verwenden Sie einen Cyanacrylatklebstoff, die nicht zu flüssig ist, und das nicht zu schnell austrocknen.
Hinweis: Wenn alles korrekt ausgerichtet ist, die Vibratom sollte parasagittal Schneiden von Scheiben von der dorsalen Richtung ventral und von der medialen zur lateralen Seite des Gehirns.
Hinweis: Astrozyten haben in der Regel niedrige Eingangs resistance (~ 10 MQ), hyperpolarisierte Ruhemembranpotential (~ -90 mV) und kein Brennen Aktivität. Die Astrozyten an seinem Ruhemembranpotenzial während der Experimente in Voltage-Clamp-Modus (dh die Haltestromwert sollte 0 pA lesen) gehalten. Vor jeder Stimulation wird ein 10 ms hyperpolarisierenden Spannung Schritt (-3 mV) verwendet, um die Serie und Eingangswiderstand der Astrozyten überwachen.
Hinweis: Die TBOA-und Kleinschreibung Komponente (dh derjenige, der in Gegenwart von TBOA (50 aufgezeichnet wird - 100 pM)) stellt die nachhaltige K +-Strom. Seine Zeit Kurs wird von der mono-exponentielle Funktion beschrieben angenähert.
Hinweis: Bei den hier beschriebenen Aufnahmebedingungen (dh intrazelluläre CH 3 SO 3 - oder C 6 H 11 O 7 -), erzeugen synaptische Stimulation von exzitatorischen Axone astrozytären Strömungen mit komplexen Wellenformen aus einer schnell steigenden transiente innen stöchiometrischen aktuellen und einem langsamen steigenden, nachhaltigen innen K +-Strom reflektierenden K + Reäquilibrierung in den extrazellulären Raum nach der Maßnahme potenziellen Ausbreitung entlang benachbarten Axonen. Es ist wichtig, dass diese nachhaltig K +-Strom zu entfernen, wie jeder Reststrom würde ein führenüberschätzen von Glutamat Lebensdauer.
Hinweis: Beachten Sie, dass die Analyse in 4,7-4,10 beschrieben auf den durchschnittlichen Spuren im Kontrollbedingungen und in TBOA (10 pM) erhalten müssen durchgeführt werden.
Hinweis: in der Aufnahme hier beschriebenen Bedingungen (dh intrazelluläre CH 3 SO 3 - oder C 6 H 11 O 7 -), erzeugen Flash Reize astrozytären Strömungen, die nur aus der schnell steigenden transiente stöchiometrischen Einwärtsstrom.
Hinweis: die Analyse in 6.7 beschrieben sind, müssen auf den durchschnittlichen Spuren im Kontrollbedingungen und in TBOA (10 pM) erhalten durchgeführt werden.
Abbildung 3d).
unddas beschreibt am besten die abklingende Phase des Transporters in aktuellen TBOA (10 uM) (Abbildung 3b) aufgezeichnet.
Hinweis: Die Funktion in 7.2 (dh H (t)) beschrieben sind, den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten in Gegenwart von TBOA (10 uM).
Hinweis: Entfaltung ist eine mathematische Operation in vielen Analyse-Software-Pakete wie (zB Matlab, Python) enthalten. In IgorPro, der Programmiercode, dass wir in der Regel verwenden, um diese Art von Analyse durchführen, können die Entfaltungsoperation effizient berechnet werden, wie unten beschrieben, durch diskrete schnelle Fourier-Transformationen. Erstens verwenden die FFT-Operation, um den di berechnenscrete schnelle Fourier-Transformation der mono-exponentiellen Funktion in 7.2 erhalten und der Passung des Transporters in aktuellen TBOA aufgezeichnet in 7.1-Transformation. Als nächstes verwendet der IFFT Operation der inversen diskreten schnellen Fourier-Transformation des Verhältnisses der beiden FFT-Funktionen berechnen. Die resultierende Funktion I (t) kann wie folgt beschrieben werden:
Der Schritt in 7.3 erlaubt die Ableitung der Filter des aktuellen Transporters in TBOA (10 uM) (Abbildung 3c rechts). Der Filter stellt die Verzerrung Faktoren, die die Lebensdauer von Glutamat in Astrozyten umwandeln Membranen in der aktuellen Transporter in den Abschnitten 4 getrennt - 6 (dh die FSTC oder FTC).
Anmerkung: Dieser Schritt ermöglicht die Ableitung des zeitlichen Verlaufs der Glutamat-Clearance von Astrozyten in Kontrollbedingungen (Abbildung 3d rechts). Die zugrunde liegende Annahme dieses Entfaltung Schritt ist, dass der zeitliche Verlauf des Filters unverändert unter Kontrolle und Bedingungen in TBOA (10 uM) bleibt.
wobei G (t) wird die Wellenform in Schritt 7.1 erhalten. In der obigen Gleichung beschrieben, entspricht der Ausdruck t das Zeitfenster über die das Integral berechnet.
Hinweis: Wenn das Verfahren wurde zunächst festgestellt,<t> wurde im Laufe der Zeit, die Fenster links ungezwungen 13 berechnet wurden. Dieser Ansatz kann so lange verwendet werden, wie die Integration Fenster wird auf breiter sein als die Dauer der Glutamat-Clearance und der Clearance Wellenform zerfällt vollständig zurück zu den Ausgangswerten. Ist dies nicht der Fall ist, trifft jedoch auf dieses Verfahren zur Abschätzung <t> einige Einschränkungen. Zum Beispiel, wenn der Abstand Wellenform nicht exakt wieder zerfallen Grundlinie, dann <t> nimmt mit der Breite des Integrationsfensters. Um potentielle Quelle der Ungenauigkeit der Abschätzung der <t> zu vermeiden, wird nun berechnet wird über ein Zeitfenster, entsprechend 10% der Peak des Transporters Strom vor und nach dem Ausbruch 14. Der letztere Ansatz verbessert die Konsequenz, mit der <t> über Zellen gemessen wird. Das ist praktisch, vor allem bei der Analyse von kleinen Effekten von pharmakologischen Behandlungen auf den zeitlichen Verlauf der Clearance.
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Representative Results
Der Erfolg der analytischen hier beschriebene Ansatz hängt entscheidend von hoher Qualität zu erhalten elektrophysiologischen Ableitungen von Transporter Ströme von Astrozyten in jeder Region des zentralen Nervensystems. In akuten Maus Hippocampus kann Astrozyten leicht unter Dodt Beleuchtung oder IR-DIC werden wegen ihrer kleinen Zellkörper (Ø = 10 um) und prominente Kern (Abbildung 1) identifiziert. Ihre markante sternförmige Morphologie mit Epifluoreszenz, konfokale oder Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie geschätzt werden, beim Hinzufügen eines Fluorophor wie Alexa 594 (50 uM) an die intrazelluläre Lösung (Abbildung 1). An der Elektrophysiologie Ebene sind Astrozyten durch niedrige Eingangswiderstand, hyperpolarisierte Membranpotential (~ -90 mV) und die Unfähigkeit, Aktionspotentiale zu generieren ist. Astrozyten generieren Ströme in Reaktion auf eine elektrische Stimulation oder optogenetische von benachbarten Neuronen und UV-Photolyse von ca.ged Verbindungen wie MNI-L-Glutamat.
Astrozytäre Transporter Ströme aufgezeichnet mit Cs + oder K + basierte interne Lösungen werden. Beachten Sie, dass Cs +, K + ein beliebter Ersatz, Glutamat Transport unterstützt aber verlangsamt die Glutamat-Transporter Taktrate 16,17 (weil Glutamattransporter binden und / oder translocate Cs + durch die Membran langsamer als K +). Wenn Cs + reduziert signifikant die Anzahl von Transportern für verbindlich Glutamat, es führt auch zu kleineren / langsamere Transporter Ströme als die mit K + basierte interne Lösungen 16,17 aufgezeichnet.
Bei der Verwendung von CH 3 SO 3 - oder C 6 H 11 O 7 - als die intrazelluläre Anion ist der Strom durch Glutamat in Astrozyten, die aufgrund der stöchiometrisch gekoppelte Bewegung von 1 Glutamat, 3 Na + und K + 1 über die Membran. Diese stöchiometrischen aktuelle ist die einzige von Astrozyten in Photolyseexperimenten aufgezeichnet und wir bezeichnen es als die FTC. Bei der Durchführung Photolyseexperimenten ist es, alternative UV Stimulationen mit dem Lichtweg geöffneter und erhalten empfohlen. Die Spuren der Lichtweg blockiert erhältlich sind nützlich, um die Reizartefakt durch die Blitzlampe erzeugt werden und bei denen mit dem Lichtweg geöffnet erhalten einwandfrei isolieren FTC abgezogen isolieren.
Der Strom in Astrozyten erfasst, wenn evozieren synaptische Freisetzung von Glutamat hat eine komplexe Wellenform. Es besteht aus einem schnell wachsenden, nach innen transiente Komponente aufgrund der stöchiometrisch gekoppelt Glutamattransporter aktuellen oben beschrieben zusammengesetzt. Darüber hinaus umfasst es ein langsam steigend, nachhaltige innen K +-Strom aufgrund Zustrom von K + in den extrazellulären Raum nach Aktionspotential angesammeltAusbreitung entlang benachbarten Axonen. Eine pharmakologische Ansatz kann verwendet werden, um den Transporter von der anhaltend aktuellen K +-Strom zu isolieren und erfordert den Einsatz von hohen Konzentrationen des breiten Spektrums Glutamattransporter Antagonist TBOA (100 pM) am Ende des Experiments 12. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine rein analytische Herangehensweise, um die Glutamattransporter Strom von der anhaltenden K +-Strom und damit ermöglicht kürzere Experimente (Abbildung 2) zu isolieren.
In einem ersten Schritt, verschachteln wir Einzel-und Paired-Puls synaptische Stimulation (100 ms auseinander), jede 10 - 20 sec, und eine gleiche durchschnittliche Zahl der Durchläufe mit Einzel-und Paired-Puls Impulse erhalten. Die Amplitude des ersten Stroms durch die gepaarten Reize hervorgerufen sollte mit der Amplitude des Stroms durch den einzigen Reiz ausgelöst. Wir beginnen diese Analyse, indem die aktuelle durch den einzigen Reiz evozierten aus, dass durch evoziertedie gepaarten Stimuli. Diese Subtraktion ermöglicht Isolieren der Reaktion auf den zweiten Stimulus, die ebenfalls aus einem schnell wachsenden, vorübergehende Glutamattransporter Strom und einer langsam ansteigenden, anhaltende K +-Strom (Fig. 2a rechts). Besteht Als nächstes verschieben wir die Antwort auf die einzelnen Stimulus durch ein Zeitintervall entsprechend dem Intervall zwischen den Pulsen der gepaarten Stimuli, so dass der Zeitpunkt des Beginns der einzige Antwort der Zeitpunkt des Beginns der zweiten Reaktion isoliert oben übereinstimmt (Abbildung 2b ). Durch Subtraktion dieser beiden Ströme, isolieren wir den erleichterten Teil des Transporters Strom, der hier nennen wir FSTC (Abbildung 2c). Die Kinetik der FSTC sind ähnlich wie die Kinetik der synaptisch-activated Transporter Strom (AGB) pharmakologisch mit hohen Konzentrationen des Antagonisten Glutamattransporter TBOA (100 pM) 13 isoliert. Aus diesem Grund und aus Gründen der Einfachheit, in früheren Arbeiten haben wir auf der FSTCals STC 13,14. Trotz der Ströme mit ähnlichen Eigenschaften sind fSTCs und STCs nicht der gleiche Strom. Aus diesem Grund und für die Richtigkeit, die in dieser Arbeit, werden wir sie explizit beziehen, wie fSTCs und STCs. Die Subtraktion hier beschriebene Methode ermöglicht eine genaue Trennung von fSTCs in den meisten Aufnahmen. In einigen Fällen ist ein Rest anhaltende K +-Strom noch vorhanden. In diesem Fall ist es notwendig, die anhaltende K +-Strom zu isolieren in getrennten Versuchen mit hohen Konzentrationen von TBOA (50 - 100 uM). Der zeitliche Verlauf der pharmakologisch isoliert aufrechterhalten K +-Strom kann durch einen mono-exponentiellen Funktion in der Form beschrieben werden:
Durch die Aufzeichnung astrozytären Ströme in verschiedenen Zellen, schätzen wir den Mittelwert der Τ Vormarsch. Wir nächsten createa mono-exponentiellen Funktion wie die oben beschriebenen, in denen die zu den Τ Mittelwert Τ Anstieg experimentell in verschiedenen Astrozyten gemessen entspricht und A entspricht der Amplitude der verbleibenden anhaltenden K +-Strom, den wir zu entfernende (2d ).
Die Methode, die wir gerade beschrieben zu isolieren fSTCs funktioniert gut, wenn evozieren Freisetzung von Glutamat aus Erleichterung Synapsen und kann auch verwendet werden, um Freisetzung von Glutamat aus Synapsen, gepaart Puls-Depression durchmachen zu studieren. Allerdings ist es von geringem Nutzen, wenn die glutamatergen Synapsen unter Studie nicht zeigen keine klare Form der kurzfristigen Erleichterung oder Depression. In diesem Fall bleibt die pharmakologische Isolation Transporter Ströme mit hohen Konzentrationen von TBOA (100 uM) die praktikabelste Lösung zu isolieren die stöchiometrisch gekoppelt, synaptisch-evozierte Glutamattransporter Strom.
(dh ohne Blockierung ihn gänzlich). Das Ziel hier ist es, deutlich verlangsamen den zeitlichen Verlauf des Transporters Strom ohne Verlust der Fähigkeit, sie vom Lärm der Aufnahmen unterscheiden. Die zugrunde liegende Annahme ist, dass in der Gegenwart einer geringen Konzentration von TBOA, wenn die Aufnahmekapazität der Astrozyten vermindert wird, der wichtigste Faktor der Gestaltung der Zerfall des Transporters Strom der allmählichen Rückgang des Glutamat-Konzentration an der Membran astrozytären 12,18 ist. Wir passen die aktuellen Transporter in Kontrollbedingungen und in TBOA (10 uM) mit dem Multi-Exponentialfunktion:
(Abbildung 3a). Wir approximieren die Glutamat-Clearance in TBOA (10 uM) mit einer momentan steigenden Funktion mit mono-exponentiellen Abfall (3b) und wir entfalten, es aus dem multi-exponentiellen Funktion beschreiben den Transporter in aktuellen TBOA (10 uM; Abbildung 3c). Die resultierende Wellenform ist der "Filter", und steht für die Kombination von Faktoren, die verzerren (dh Filter) die Glutamatkonzentration Profil in der aktuellen Transporter (Abbildung 3c). Entfalten des Filters aus dem multi-exponentielle Anpassung des Transporters Strom im Kontrollbedingungen ermöglicht Schätzen der zeitliche Verlauf der Glutamat-Konzentrationsprofil im aufgezeichnet Astrozyten in Kontrollbedingungen (Fig. 3d). Aus diesem Dekonvolutionsanalyse, vermuten wir, dass die Kinetikdes Filters bleiben in Abwesenheit und in Gegenwart von TBOA (10 uM) unverändert. Dies ist eine vernünftige Annahme, da alle Faktoren, die mit dem Filter (dh Transporter Kinetik elektrotonischen Filterung und während der synaptischen Stimulationen, asynchrone Freisetzung von Glutamat über Synapsen) beitragen unwahrscheinlich, durch die Anwesenheit von TBOA, eine Verbindung, die die Anzahl reduziert beeinflusst werden von Transportern für verbindlich Glutamat.
Wir verwenden den Schwerpunkt (<t>) als Maß für die Lebensdauer bei Glutamat astrozytären Membranen in verschiedenen Zellen. <t> Stellt die "Mitte der Masse" des Spiels Wellenform und ist empfindlich gegenüber Veränderungen sowohl Anstiegszeit und Zerfall die Glutamat-Clearance Wellenform. Der Schwerpunkt wird ausgedrückt als:
class = "jove_content"> Es gibt zwei Möglichkeiten, um das Zeitintervall, über die wir die Integrale im Zähler und Nenner dieses Ausdrucks berechnen kann entscheiden. Weil der Abstand Wellenform steigt aus und zerfällt wieder auf Null, wenn das Verfahren zunächst gegründet wurde, gab es keine Angaben darüber, wie die Integration Fenster gesetzt hat, und in der Tat war dies eher lose 13 getan. Eine Möglichkeit, um dieses Problem ist es, die Integration Fenster in die Zeit es braucht, um einen beliebigen Anteil der FTC / FSTC Gipfel erreichen zu begrenzen, z. B. 10% 14. Dies ermöglicht einfaches Kriterium konsequent, wenn die Durchführung dieser Analyse in verschiedenen Zellen, verbessert die Genauigkeit der Schätzungen von <t> wenn der Zwischenraum Wellenform nicht perfekt zerfallen auf Null, und verbessert die Empfindlichkeit der Analyse, um kleine Unterschiede in der Clearance Wellenformen, die möglicherweise treten in den verschiedenen Gruppen von Zellen.
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Abbildung 1. Identifizierung von Astrozyten in akuten Schnitten des Hippocampus. (Ab) Dodt Bilder von Hippocampus-Astrozyten in CA1 Stratum radiatum. Unter Dodt Beleuchtung und IR-DIC, können Astrozyten durch ihre kleinen Zellkörper und prominente Kern identifiziert werden. Die roten Pfeile zeigen auf mehreren Astrozyten, die in den Scheiben Herstellung identifiziert werden können. Der gelbe Pfeil zeigt die Astrozyten, die gepatcht und mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefüllt wurde (siehe unten). (Cd) Overlaid Dodt Bild der Hippocampus und Zwei-Photonen der gepatchten Astrozyten, mit einem gelben Pfeil in (ab) hervorgehoben. Für dieses Experiment wurden Astrozyten ausgebessert und mit einem KCH 3 SO 3 gefüllt - basierte interne Lösung mit Alexa 594 (50 uM) zugegeben. Die Astrozytenfortsätze ragen einige zehn um weg von ter Zellkörper. Die Anmerkungen des linken identifizieren die drei Zellschichten der hippocampalen CA1-Bildung, die in den Scheiben erkannt werden kann.
Abbildung 2. Isolation von fSTCs von synaptisch-aktivierte Ströme in Astrozyten-Transporter erfasst. (Ac) Schema der analytischen Schritte erforderlich, um die von fSTCs synaptisch-aktivierte Ströme in Astrozyten-Transporter erfasst isolieren. (D) Analytische Ansatz verwendet, um die restliche nachhaltige K +-Strom zu entfernen von den fSTCs (siehe Abschnitt 5). Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 3. Dekonvolutionsanalyse zur Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten (a) Mono-exponentielle Anpassung der FSTC / FTC in Kontrollbedingungen (links) und in Gegenwart von TBOA (10 uM; rechts) isoliert.. (B) Der zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance in TBOA (10 pM) durch eine sofort steigenden Funktion mit mono-exponentiellen Abfall angenähert. (C) Entfalten den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance in TBOA (10 uM) von der multi-exponentielle Anpassung des Transporters in aktuellen TBOA (10 uM) erlaubt Bestimmung der Filter. (D) Entfalten Sie den Filter von der multi-exponentielle Anpassung des Transporters in aktuellen Kontrolle Bedingungen ermöglicht Schätzung der zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten in Kontrollbedingungen.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier haben wir einen experimentellen Ansatz zur elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten erhalten beschreiben, leiten ein analytisches Protokoll Glutamattransporter Ströme in Astrozyten isolieren und eine mathematische Methode, um den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten-Transporter Ströme.
Der Erfolg der Analyse beruht auf der Fähigkeit, hochwertige Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten zu erhalten und auf die Genauigkeit der Anpassungsalgorithmen verwendet, um die Transporter Ströme beschreiben. Die Dekonvolutionsanalyse stützt sich auf die folgenden zwei Annahmen. (1) Die mehrere Prozesse, die den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Spiel in der experimentell-recorded Transporter aktuellen verzerren als ein lineares System dargestellt werden können. Obwohl in absoluten Zahlen viele der Faktoren, die die Transporter Ströme nichtlinearer Systeme (im Prinzip Glutamat binden und transportieren kann sowohl unterziehen Sättigung), experimentelle Beweise indica sindtes, dass ihre linearen Bereich ist breit. Dementsprechend bleibt der zeitliche Verlauf der Ströme und Transporter von Glutamat Clearance gleich über einen breiten Bereich von Reizstärke, Release-Wahrscheinlichkeit und Glutamatkonzentrationen 13,14,18. Obwohl diese Annäherung scheint legitim zu sein für unsere experimentellen Bedingungen, sollte es vor der Wiederholung dieser Analyse in verschiedenen experimentellen Präparaten validiert werden. (2) Die Eigenschaften der Filter nicht durch das Vorhandensein von TBOA (10 um). Diese Annahme scheint vernünftig, weil alle Faktoren, die mit dem Filter (dh Transporter Kinetik elektrotonischen Filterung und während der synaptischen Stimulationen, asynchrone Freisetzung von Glutamat über Synapsen) beitragen unwahrscheinlich, durch die Anwesenheit von TBOA beeinflusst werden sollen.
Durch die Ableitung des Glutamat-Clearance Wellenform von fSTCs und FTCs, so erhalten wir zwei verschiedene Arten von Informationen. Durch die Analyse fSTCs, messen wir die Zeit, die astrocytic Membranen ausgesetzt sind, von Synapsen freigesetzt Glutamat. Durch evozieren FTCs mit vollem Feld UV-Beleuchtung (dh durch Uncaging Glutamat über die gesamte Oberfläche Astrozyten), messen wir die Zeit, die Astrozyten Membranen uncaged Glutamat ausgesetzt sind. In diesen Experimenten Uncaging alle Moleküle Glutamat freigesetzt werden (dh uncaged) in der gleichen Zeit und alle Transporter werden gleichzeitig aktiviert, um den gleichen Glutamatkonzentration. Daher wird durch die Analyse FTCs, erhalten wir einen indirekten Auslesen des astrozytären Glutamat saugstark.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Methoden hier beschrieben erlauben die Schätzung der zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance, nicht der tatsächliche Wert der Glutamat-Konzentration erinnern an die Transporter Ströme. Die voraussichtliche Kurs ist ein Maß für die durchschnittliche zeitliche Verlauf der Glutamat-Clearance bei allen Bereichen des astrozytären Membran, an denen wir elektrophysiologische Zugang: es ist keint empfindlich auf Heterogenitäten in Glutamataufnahme an verschiedenen Standorten innerhalb des astrozytären Membran 19. Diese Informationen sind eher mit der hochauflösenden Mikroskopie von Glutamat-sensitive fluoreszierende Reporter 20 erhalten werden. Allerdings weisen die derzeit verfügbaren Glutamat-sensitive Reportern relativ engen dynamischen Bereichen. Dies kann nichtlineare Verzerrungen zwischen dem Glutamat Profil und dem Fluoreszenzsignal einzuführen, wodurch die Verwendung dieser Sonden zeitliche Informationen über die Glutamat-Konzentration vorübergehend zu extrahieren. Daher ist es wahrscheinlich durch die Kombination all dieser verschiedenen Ansätze, dass man die meisten umfassendes Verständnis der Dynamik von glutamatergen Signale an astrozytären Membranen zu erhalten.
Zusammenfassend können die hier vorgestellten Methoden verwendet werden, um den Abstand Zeitverlauf synaptisch-Freigabe oder Flash-uncaged Glutamat an astrozytären Membranen zu schätzen. Sie bieten wertvolle Tools, die ca.n verwendet, um die Lebensdauer von Glutamat in den extrazellulären Raum in verschiedenen Stadien der Entwicklung schätzen 13 in einer Vielzahl von Tierarten 14 und Gehirnregionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen 21 werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Neurological Disorders and Stroke Interne Research Program (NS002986) unterstützt. AS schrieb das Manuskript und umgesetzt Dekonvolutionsanalyse. JSD entwickelte die erste Version des Dekonvolutionsanalyse und kommentiert den Text.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CGP52432 | Tocris | 1246 | |
(R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
DPCPX | Tocris | 439 | |
LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
MSOP | Tocris | 803 | |
NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).