Summary
Nous décrivons une méthode analytique pour estimer la durée de vie de glutamate au niveau des membranes astrocytes à partir d'enregistrements électrophysiologiques des courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes.
Abstract
La plus forte densité de transporteurs du glutamate dans le cerveau se trouve dans les astrocytes. Le glutamate en couple de transporteurs le mouvement du glutamate à travers la membrane avec le co-transport de Na + et 3 1 H + et le contre-transport de K + 1. Le courant stoechiométrique généré par le processus de transport peut être contrôlée au moyen d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières provenant astrocytes. L'évolution dans le temps du courant enregistré est façonné par l'évolution temporelle du profil de concentration de glutamate qui astrocytes sont exposées, la cinétique de transporteurs du glutamate, et les propriétés des membranes passives électrotoniques astrocytiques. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales et analytiques qui peuvent être utilisés pour enregistrer les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et isoler le cours du temps de jeu glutamate de tous les autres facteurs qui façonnent la forme d'onde des courants de transporteurs astrocytaires. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour estimer la durée de vie of flash-Uncaged et synaptiquement-glutamate libéré à membranes astrocytaires dans n'importe quelle région du système nerveux central pendant la santé et la maladie.
Introduction
Les astrocytes sont l'un des types cellulaires les plus abondants dans le cerveau avec une morphologie en forme d'étoile et des protubérances membranaires fines qui s'étendent tout au long de la neuropile et atteignent voisins contacts synaptiques 1,2. La membrane de la cellule Les astrocytes de forte densité est emballé avec des molécules d'transporteur du glutamate 3. Dans les conditions physiologiques, transporteurs du glutamate se lient rapidement glutamate sur le côté extracellulaire de la membrane et le transférer dans le cytoplasme de la cellule. Ce faisant, les transporteurs maintiennent bas la concentration basale de glutamate dans l'espace extracellulaire 4. Transporteurs du glutamate dans les processus astrocytaires fins adjacents à excitateurs synapses sont idéalement positionnés pour lier glutamate libéré lors d'événements synaptiques comme il diffuse loin de la fente synaptique. Ce faisant, les transporteurs limitent également les retombées glutamate vers et péri-régions extra-synaptiques et sur synapses voisines, ce qui réduit la dispersion spatiale du signal d'excitations dans le cerveau de 5 à 7.
Transport du glutamate est un processus électrogénique stoechiométrique couplé au mouvement de 3 Na + et H + 1 le long de leur gradient électrochimique et à la contre-transport de K + 1 8. Transport du glutamate est associée (mais pas stœchiométriquement couplé à) une conductance anionique perméable à la SCN - (thiocyanate)> NO 3 - (nitrate) ≈ ClO 4 - (perchlorate)> I -> Br -> Cl -> F -, pas de CH 3 SO 3 - (méthane sulfonate) et C 6 H 11 O 7 - (gluconate) 9-11. Les deux courants (stoechiométrique ou non stoechiométrique) peuvent être enregistrées par l'obtention d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes, identifiés visuellement sous un éclairage Dodt ou infra-rouge contraste d'interférence différentiel (IR-DIC) dans acute tranches de cerveau 12. La composante stoechiométrique du courant associé au transport du glutamate à travers la membrane peut être isolé en utilisant CH 3 SO 3 -, ou 11 C 6 H o 7 - solutions intracellulaires base et peut être provoquée par le glutamate flash-uncaging sur les astrocytes 13,14, ou en activant la libération de glutamate à partir de synapses voisines, soit électriquement ou 12 avec une commande de optogenetic ciblée.
L'évolution temporelle de la composante stoechiométrique du courant transporteur est façonnée par la vie du profil de concentration du glutamate au niveau des membranes astrocytaires (c.-garde au glutamate), la cinétique de transporteurs du glutamate, les propriétés des membranes passives des astrocytes, et au cours de stimulations synaptiques, par le synchronicité de la libération de glutamate dans les synapses activées 13. Nous décrivons ici en détail: (1) une appr expérimentaleOach d'isoler la composante stoechiométrique des courants de transporteur du glutamate à partir d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes en utilisant la souris coupes d'hippocampe aigus comme exemple la préparation expérimentale, (2) une approche analytique pour dériver le cours du temps de jeu glutamate à partir de ces enregistrements 13, 14. Ces méthodes peuvent être utilisées pour enregistrer et analyser les courants de transporteur du glutamate de astrocytes dans n'importe quelle région du système nerveux central.
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Protocol
1. Slice Préparation
- Préparer 500 ml tranchage solution / de stockage contenant (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 1,3 MgSO4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCO3, une NaH 2 PO 4, et 22, du glucose, 320 mOsm, pH 7,4
- Utilisez un bécher de 250 ml pour préparer une chambre submersion pour les tranches, remplissez-le avec 200 ml de tranchage solution / de stockage, le réchauffer dans un bain d'eau à 34 ° C et la bulle avec 95% d'O 2, 5% de CO 2.
- Maintenir la solution restante de tranchage / de stockage dans une bouteille en verre à 4 ° C.
- Utilisez un adhésif cyanoacrylate pour attacher un petit bloc d'agar (6%, établi en ACSF) sur le porte-échantillon vibratome et stocker à 4 ° C.
- 30 minutes avant de commencer le tranchage, de placer le flacon en verre contenant la solution de stockage / tranchage dans un seau rempli de glace et de la bulle avec 95% de O 2, 5% de CO 2.
2. Identification et enregistrements astrocytes 3. PharmacIsolation gique de la K soutenue + courant 4. Jeconsolation de la portion facilitée des courants Transporter synaptiquement-Activated (fSTCs) 5. Soustraction de la résiduelle zdustained K +-courant de fSTCs 6. Isolation des courants de Transporteur Flash activé (CDD) 7. analyse de déconvolution
Remarque: pour obtenir des tranches de très haute qualité, il est important que les deux parties du cerveau sont solidement collés à la plaque de base vibratome. Pour ce faire, utilisez une colle cyanoacrylate qui n'est pas trop liquide et qui ne sèche pas trop vite.
Remarque: si tout est correctement orienté, la vibratome faut couper des tranches à partir de la parasagittales dorsale vers la face ventrale et du médial vers le côté latéral du cerveau.
Note: Les astrocytes ont généralement faible resistanc d'entréee (~ 10 MQ), le potentiel de membrane au repos hyperpolarisé (~ -90 mV), et aucune activité de tir. Les astrocytes sont conservés à son potentiel de membrane au repos au cours des expériences en mode voltage-clamp (ie le courant de maintien doit indiquer 0 Pa). Avant chaque stimulation, une étape d'hyperpolarisation 10 ms tension (-3 mV) est utilisé pour surveiller la série et la résistance d'entrée de l'astrocyte. 
Remarque: Le composant TBOA insensible (celui qui est enregistré en présence de TBOA (50 - 100 pm)) représente le soutenue K +-courant. Son évolution dans le temps est approchée par la fonction mono-exponentielle décrit ci-dessus.
Note: Dans les conditions d'enregistrement décrite ici (ie intracellulaire CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 -), stimulations synaptiques des axones excitateurs génèrent des courants astrocytiques avec formes d'onde complexes constitués d'un courant stoechiométrique intérieur transitoire augmentation rapide et une lente -en hausse, soutenue intérieur K +-courant reflétant K + rééquilibrage dans l'espace extracellulaire après l'action propagation potentielle le long des axones voisins. Il est essentiel de supprimer ce soutenue K +-courant, comme tout courant résiduel qui conduirait à unesurestimer la durée de vie du glutamate.
Note: N'oubliez pas que l'analyse décrite dans 4.7 à 4.10 doit être effectuée sur les traces de moyennes obtenues dans des conditions de contrôle et TBOA (10 M).
Remarque: dans les conditions d'enregistrement décrite ici (ie intracellulaire CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 -), les stimuli Flash génèrent des courants astrocytiques composés uniquement de l'augmentation rapide transitoire stoechiométrique courant entrant.
Note: l'analyse décrite au point 6.7 doit être effectuée sur les traces moyennes obtenues dans des conditions de contrôle et TBOA (10 M). 
etqui décrit le mieux la phase de décomposition du courant transporteur enregistré dans TBOA (10 M) (Figure 3b).
Remarque: la fonction décrite au point 7.2 (ie H (t)) représente l'évolution temporelle de la clairance de glutamate astrocytes en présence de TBOA (10 M).
Note: déconvolution est une opération mathématique inclus dans de nombreux progiciels d'analyse comme (par exemple Matlab, Python). En IgorPro, le code de programmation que nous utilisons généralement pour effectuer ce genre d'analyse, l'opération de déconvolution peut être calculée efficacement que décrit ci-dessous, à l'aide discrète de Fourier rapide transforme. Tout d'abord, utiliser l'opération FFT pour calculer le discrete rapide de transformée de Fourier de la fonction mono-exponentielle obtenue en 7.2 et de l'ajustement du courant de transporteur enregistrée dans TBOA obtenu en 7.1. Ensuite, utiliser l'opération IFFT pour calculer la transformée de Fourier rapide discrète inverse du rapport des deux fonctions de FFT. La fonction I entraînant (t) peut être décrit comme suit: 
L'étape décrite au point 7.3 permet à dériver le filtrage du courant transporteur dans TBOA (10 pM) (figure 3c droite). Le filtre représente les facteurs de distorsion qui transforment la vie de glutamate au niveau des membranes astrocytaires dans le courant du transporteur isolé dans les sections 4-6 (ie le FSTC ou FTC).
Remarque: cette étape permet de dériver le cours du temps de jeu à partir de glutamate astrocytes dans des conditions de contrôle (Figure 3d droite). L'hypothèse sous-jacente à cette étape de déconvolution est que le profil temporel du filtre reste inchangée dans des conditions de contrôle et TBOA (10 M).
où G (t) est la forme d'onde obtenue à l'étape 7.1. Dans l'équation décrite ci-dessus, le terme t correspond à la fenêtre de temps pendant lequel l'intégrale est calculée.
Remarque: lorsque la méthode a été créé,<t> a été calculée sur des fenêtres de temps qui ont été laissés sans contrainte 13. Cette approche peut être utilisée tant que la fenêtre d'intégration est réglé pour être plus large que la durée de la clairance du glutamate et les désintégrations de forme d'onde de dégagement complètement revenue à la ligne de base. Si ce n'est pas le cas, cependant, cette méthode d'estimation <t> rencontre certaines limites. Par exemple, si le signal de dégagement ne se dégrade pas exactement retour à l'état initial, puis <t> augmente avec la largeur de la fenêtre d'intégration. Pour éviter toute source potentielle d'imprécision de l'estimation de <t>, nous calculons maintenant au-dessus d'une fenêtre de temps correspondant à 10% du pic du courant transporteur, avant et après son apparition 14. Cette dernière approche améliore la cohérence avec laquelle <t> est mesurée à travers les cellules. Cela est très pratique en particulier lorsque l'on analyse les petits effets des traitements pharmacologiques sur l'évolution dans le temps de dédouanement.
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Representative Results
Le succès de l'approche analytique décrite ici dépend de façon critique sur l'obtention des enregistrements électrophysiologiques haute qualité des courants de transporteur de astrocytes dans n'importe quelle région du système nerveux central. Dans des coupes d'hippocampe de souris aiguës, les astrocytes peuvent être facilement identifiés sous Dodt éclairage ou IR-DIC en raison de leur corps à petites cellules (Ø = 10 um) et le noyau de premier plan (Figure 1). Leur morphologie en forme d'étoile distinctif ne peut être apprécié avec épifluorescence, confocal, ou microscopie à balayage laser à deux photons, l'ajout d'un fluorophore comme Alexa 594 (50 M) à la solution intracellulaire, (Figure 1). Au niveau électrophysiologie, les astrocytes sont caractérisés par une faible résistance d'entrée, le potentiel de membrane hyperpolarisé (~ -90 mV) et l'incapacité de générer des potentiels d'action. Les astrocytes génèrent des courants en réponse à une stimulation électrique ou optogenetic de neurones voisins et la photolyse UV de cacomposés ged comme MNI-L-glutamate.
Courants de transporteurs astrocytaires peuvent être enregistrés en utilisant Cs + ou K + solutions internes basées. Notez que Cs +, une populaire K + substitut, prend en charge le transport du glutamate, mais ralentit le taux de recyclage de transporteur du glutamate 16,17 (parce que les transporteurs du glutamate se lient et / ou translocation Cs + à travers la membrane plus lentement que K +). Si Cs + réduit considérablement le nombre de transporteurs disponibles pour le glutamate contraignante, elle mène aussi à des courants de transporteurs plus petits / plus lentement que celles enregistrées avec K + solutions internes basées 16,17.
Lorsque vous utilisez CH 3 SO 3 - ou C 6 H 11 O 7 - comme le principal anion intracellulaire, le courant généré par les transporteurs du glutamate dans les astrocytes est due au mouvement stœchiométriquement couplé de 1 glutamate, 3 Na
Le courant enregistré dans les astrocytes en évoquant libération synaptique de glutamate a une forme d'onde plus complexe. Il est composé d'un composant actif transitoire rapide montante à cause du courant de transporteur du glutamate stœchiométriquement couplé décrit ci-dessus. En outre, il comprend une lente montante, K + vers l'intérieur soutenue de courant due à un afflux de K + accumulée dans l'espace extracellulaire après potentiel d'actionpropagation le long des axones voisins. Une approche pharmacologique peut être utilisé pour isoler le courant de la K soutenue + courant transporteur et nécessite l'utilisation de concentrations élevées de la large spectre glutamate transporteur antagoniste TBOA (100 M) à la fin de l'expérience 12. La méthode décrite ici utilise une approche purement analytique pour isoler le courant de la K soutenue +-courant et permet donc des expériences plus courtes (Figure 2) transporteur du glutamate.
Dans un premier temps, nous Interleave stimulations simples et double choc synaptiques (100 ms d'intervalle), toutes les 10 à 20 sec, et la moyenne d'un nombre égal des balayages obtenus avec des stimuli simples et double choc. L'amplitude du premier courant évoquée par les stimuli appariés doit correspondre à l'amplitude du courant évoquée par le stimulus unique. Nous commençons cette analyse en soustrayant le courant évoquée par le stimulus unique à partir de celle évoquée parles stimuli appariés. Cette soustraction permet d'isoler la réponse à la deuxième relance, qui est également composé d'un courant rapide montante, le transporteur du glutamate transitoire et un lent soulèvement, soutenue K +-courant (Figure droit 2a). Ensuite, on passe de la réponse au stimulus unique par un intervalle de temps correspondant à l'intervalle entre les impulsions des stimuli appariées, de sorte que le moment de l'apparition de la réponse unique correspond à l'heure de début de la deuxième réponse d'isolement ci-dessus (figure 2b ). En soustrayant ces deux courants, nous isolons la partie facilité du courant du transporteur, qui ici nous appelons FSTC (figure 2c). La cinétique de la FSTC sont similaires à la cinétique du courant transporteur synaptique activé (STC) pharmacologiquement isolé avec de fortes concentrations de l'antagoniste transporteur du glutamate TBOA (100 M) 13. Pour cette raison et pour plus de simplicité, dans le travail précédent, nous avons évoqué la FSTCcomme STC 13,14. En dépit d'être courants aux propriétés similaires, fSTCs et CTS ne sont pas le même courant. Pour cette raison et pour la précision, dans ce travail, nous allons vous y référer explicitement comme fSTCs et STC. La méthode de soustraction décrite ici permet une isolation précise de fSTCs dans la plupart des enregistrements. Toutefois, dans certains cas, un K soutenue résiduelle + courant est toujours présent. Dans ce cas, il est nécessaire d'isoler le soutenue K +-courant dans des expériences séparées en utilisant des concentrations élevées de TBOA (50 - 100 um). Le cours du temps de l'pharmacologiquement isolé soutenue K +-courant peut être décrite par une fonction mono-exponentielle de la forme:
En enregistrant les courants astrocytaires dans des cellules différentes, nous estimons que la valeur moyenne des Τ hausse. Nous creat prochaineEA fonction mono-exponentielle comme celui décrit ci-dessus, dans lequel montée Τ correspond à la valeur moyenne de Τ hausse mesurée expérimentalement dans différents astrocytes et A correspond à l'amplitude de la valeur résiduelle soutenue K +-courant que nous voulons supprimer (figure 2d ).
La méthode que nous venons de décrire pour isoler fSTCs fonctionne bien en évoquant la libération de glutamate de faciliter synapses et peut également être utilisée pour étudier la libération de glutamate de synapses qui subissent la dépression double choc. Cependant, il est de peu d'utilité lorsque les synapses glutamatergiques l'étude ne montrent aucune forme claire de la facilitation ou la dépression à court terme. Dans ce cas, l'isolement pharmacologique des courants de transporteurs avec de fortes concentrations de TBOA (100 M) reste la solution la plus faisable d'isoler courant du transporteur du glutamate stœchiométriquement-couplé, synaptiquement-évoquée.
(c'est à dire sans le bloquer totalement). Le but ici est de ralentir de manière significative au cours du temps du courant transporteur sans perdre la capacité à distinguer du bruit des enregistrements. L'hypothèse de base est que, en présence d'une faible concentration de TBOA, lorsque la capacité d'absorption d'astrocytes est diminuée, le principal facteur de mise en forme de la décroissance du courant de transporteur est la diminution progressive de la concentration de glutamate à la membrane astrocytaire 12,18. Nous ajustons le courant du transporteur dans des conditions de contrôle et TBOA (10 M) avec la fonction multi-exponentielle:
(Figure 3a). Nous rapprocher de la clairance de glutamate dans TBOA (10 M) avec une fonction instantanément-levant avec décroissance mono-exponentielle (Figure 3b) et nous déconvolutionner à partir de la fonction multi-exponentielle décrivant le transporteur actuel TBOA (10 um; figure 3C). Le signal résultant est le "filtre", et représente la combinaison de facteurs qui faussent (c.-à-filtre), le profil de concentration de glutamate dans le courant transporteur (figure 3C). Déconvoluer le filtre de la forme multi-exponentielle du courant transporteur dans les conditions de contrôle permet d'estimer l'évolution temporelle du profil de la concentration de glutamate dans l'astrocyte enregistrée dans des conditions de contrôle (figure 3d). Pour cette analyse de déconvolution, nous supposons que la cinétiquedes filtres restent inchangées en l'absence et en présence d'TBOA (10 pM). C'est une hypothèse raisonnable parce que tous les facteurs qui contribuent au filtre (c.-à-cinétique des transporteurs, le filtrage électrotoniques, et au cours de stimulations synaptiques, la libération asynchrone de glutamate dans les synapses) sont peu susceptibles d'être influencés par la présence de TBOA, un composé qui réduit le nombre des transporteurs disponibles pour le glutamate de liaison.
Nous utilisons le centre de gravité (<t>) comme une mesure de la durée de vie du glutamate au niveau des membranes astrocytaires dans des cellules différentes. <t> Représente le «centre de gravité» de la forme d'onde de dégagement, et il est sensible à l'évolution dans le temps de montée et la chute des la forme d'onde de décharge du glutamate. Le centre de gravité est exprimée en tant que:
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Figure 1. Identification des astrocytes dans des coupes d'hippocampe aiguë. (Ab) images Dodt des astrocytes dans l'hippocampe CA1 strate radiatum. Sous Dodt éclairage et IR-DIC, les astrocytes peuvent être identifiés par leur corps à petites cellules et du noyau proéminent. Les flèches rouges indiquent à plusieurs astrocytes qui peuvent être identifiés dans la préparation des tranches. La flèche jaune indique l'astrocyte qui a été patché et rempli d'un colorant fluorescent (voir ci-dessous). (Cd) image Dodt Overlaid des coupes d'hippocampe et à deux photons des astrocytes rapiécés, mis en évidence par une flèche jaune en (ab). Pour cette expérience, les astrocytes ont été corrigés et remplis de KCH 3 SO 3 - solution interne basée ajouté avec Alexa 594 (50 M). Les processus astrocytaires s'étendent de quelques dizaines de um loin de til cellule du corps. Les annotations de la gauche identifient les trois principales couches cellulaires de la formation hippocampique CA1 qui peut être comptabilisé dans les tranches.
Figure 2. Isolement de fSTCs des courants de transporteurs synaptiquement activés enregistrées dans les astrocytes. (Ca) Schéma des étapes analytiques nécessaires pour isoler les fSTCs des courants de transporteur synaptiquement activés enregistrées dans les astrocytes. (D) approche analytique utilisée pour enlever le résidu soutenue K +-courant des fSTCs (voir section 5). Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 3. analyse de déconvolution utilisée pour calculer le cours du temps de jeu à partir de glutamate astrocytes (a) ajustement mono-exponentielle de la FSTC / FTC isolé dans des conditions de contrôle (à gauche) et en présence de TBOA (10 um; droite).. (B) Le cours du temps de jeu glutamate dans TBOA (10 M) est approchée par une fonction instantanément-levant avec décroissance mono-exponentielle. (C) déconvolution le cours du temps de jeu glutamate dans TBOA (10 M) à partir de l'ajustement multi-exponentielle du transporteur actuel TBOA (10 M) permet d'estimer le filtre. (D) déconvolution le filtre de l'ajustement multi-exponentielle du courant transporteur dans des conditions de contrôle permet d'estimer l'évolution temporelle de la clairance de glutamate astrocytes dans des conditions de contrôle.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une approche expérimentale pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques des astrocytes, un protocole d'analyse pour isoler les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et une méthode mathématique pour calculer le cours du temps de jeu glutamate à partir des courants de transporteurs astrocytaires.
Le succès de l'analyse repose sur la capacité à obtenir des enregistrements de patch clamp haute qualité à partir des astrocytes et de la précision des algorithmes d'ajustement utilisés pour décrire les courants de transporteur. L'analyse de déconvolution repose sur les deux hypothèses suivantes. (1) Les processus multiples qui faussent le cours du temps de jeu glutamate dans le courant du transporteur expérimentalement enregistrée peuvent être représentées comme un système linéaire. Même si en termes absolus, de nombreux facteurs que les courants de transporteur de forme sont des systèmes non linéaires (dans la liaison du glutamate de principe et de transport peuvent tous deux subir saturation), preuve expérimentale indicateurstes que leur régime linéaire est large. En conséquence, l'évolution temporelle des courants de transporteur et de la clairance de glutamate reste le même sur une large plage de puissance du stimulus, la probabilité de libération, et les concentrations de glutamate 13,14,18. Bien que ce rapprochement semble être légitime pour nos conditions expérimentales, elle devrait être validée avant de répéter cette analyse dans différentes préparations expérimentales. (2) Les caractéristiques du filtre ne sont pas affectés par la présence de TBOA (10 M). Cette hypothèse semble raisonnable parce que tous les facteurs qui contribuent au filtre (c.-à-cinétique des transporteurs, le filtrage électrotoniques, et au cours de stimulations synaptiques, la libération asynchrone de glutamate dans les synapses) sont peu susceptibles d'être influencés par la présence de TBOA.
En dérivant le signal de dégagement glutamate de fSTCs et CDD, nous obtenons deux types d'informations. En analysant fSTCs, nous mesurons le temps que astrocymembranes tic sont exposés au glutamate libéré de synapses. En évoquant CDD avec la pleine illumination UV sur le terrain (par exemple en uncaging glutamate sur toute la surface astrocytes), nous mesurons le temps que les membranes astrocytaires sont exposés à glutamate uncaged. Dans ces expériences uncaging toutes les molécules de glutamate sont libérés (c. uncaged) en même temps et tous les transporteurs sont activés en même temps, par la même concentration de glutamate. Par conséquent, en analysant les CDD, nous pouvons obtenir une lecture indirecte de la capacité d'absorption de glutamate astrocytaire.
Il est important de noter que les méthodes décrites ici permettent d'estimer l'évolution temporelle de la clairance de glutamate, pas la valeur réelle de la concentration de glutamate évoquant les courants de transporteur. Le cours de l'heure est une mesure moyenne de l'évolution temporelle de la clairance de glutamate à tous les domaines de la membrane astrocytique à laquelle nous avons accès électrophysiologique: il n'est past sensible aux hétérogénéités de capture de glutamate sur différents sites au sein de la membrane astrocytique 19. Cette information est plus susceptible d'être obtenue par microscopie à haute résolution de reporters fluorescents sensibles au glutamate 20. Cependant, les journalistes glutamate sensibles actuellement disponibles présentent des dynamiques relativement étroites. Cela peut introduire des distorsions non linéaires entre le profil de la concentration de glutamate et le signal fluorescent, ce qui limite l'utilisation de ces sondes pour extraire l'information temporelle de la concentration de glutamate transitoire. Par conséquent, il est probablement en combinant toutes ces différentes approches que l'on peut obtenir la compréhension la plus complète de la dynamique des signaux glutamatergiques à membranes astrocytaires.
En résumé, les méthodes présentées ici peuvent être utilisés pour estimer l'évolution dans le temps de dédouanement des synaptiquement-liberté ou flash-uncaged glutamate au niveau des membranes astrocytaires. Ils constituent des outils précieux que can être utilisée pour estimer la durée de vie de glutamate dans l'espace extracellulaire à différents stades de développement 13 de diverses espèces animales et des régions 14 du cerveau dans des conditions physiologiques et pathologiques 21.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l'Institut national des troubles neurologiques et du programme de recherche intra-muros Course (NS002986). AS a écrit le manuscrit et mis en œuvre l'analyse de déconvolution. JSD développé la version initiale de l'analyse de déconvolution et commenté le texte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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