Summary
Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.
Abstract
La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na + e 3 1 H + e la contro-trasporto di K + 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L'andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d'onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.
Introduction
Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti 1,2. Membrana cellulare Le astrociti 'è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici 3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare 4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocitici sottili adiacenti eccitatori sinapsi sono in posizione ottimale per legare il glutammato rilasciato durante gli eventi sinaptici come si diffonde lontano dalla fessura sinaptica. In questo modo, i trasportatori limitano anche spillover glutammato verso e peri-regioni extra-sinaptici e sulla sinapsi vicine, riducendo la diffusione spaziale del segnale eccitatorios nel cervello 5-7.
Trasporto di glutammato è un processo elettrogenico stechiometricamente accoppiato al movimento di 3 Na + e 1 H + lungo il loro gradiente elettrochimico e alla contro-trasporto di K + 1 8. Trasporto di glutammato è associata con (ma non stechiometricamente accoppiata a) una conduttanza anionica permeabile SCN - (tiocianato)> NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, non a CH 3 SO 3 - (metano sulfonato) e C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Entrambe le correnti (stechiometrico e non stechiometrico) possono essere registrati mediante l'ottenimento di cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti, identificati visivamente sotto illuminazione Dodt o infrarossi contrasto di interferenza differenziale (IR-DIC) in acutposta del cervello fette 12. La componente stechiometrica della corrente associata trasporto di glutammato attraverso la membrana può essere isolato utilizzando CH 3 SO 3 -, o H 11 O 7 C 6 - soluzioni intracellulari based e può essere evocato dal glutammato flash-uncaging sugli astrociti 13,14, o attivando il rilascio di glutammato da sinapsi vicine, sia elettricamente 12 o con un controllo optogenetic mirato.
L'andamento temporale della componente stechiometrica della corrente trasportatore è modellato dalla durata del profilo di concentrazione glutammato in astrociti membrane (cioè clearance della glutammato), la cinetica di trasportatori del glutammato, le proprietà di membrana passivi di astrociti, e durante stimolazioni sinaptiche, dal sincronicità del rilascio di glutammato attraverso le sinapsi attivate 13. Qui si descrive in dettaglio: (1) un appr sperimentaleoach di isolare la componente stechiometrica delle correnti trasportatore del glutammato da cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti utilizzando acute del mouse fettine di ippocampo come esempio la preparazione sperimentale, (2) un approccio analitico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da queste registrazioni 13, 14. Questi metodi possono essere usati per registrare e analizzare le correnti trasportatore del glutammato dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale.
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Protocol
1. Fetta di preparazione
- Preparare 500 ml di soluzione di affettare / archiviazione contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26,2 NaHCO 3, 1 NaH 2 PO 4, e 22 di glucosio, 320 mOsm, pH 7.4
- Utilizzare un bicchiere da 250 ml per preparare una camera di immersione per le fette, riempirlo con 200 ml di soluzione di affettare / archiviazione, scaldarlo a bagnomaria a 34 ° C e la bolla con il 95% di O 2, 5% di CO 2.
- Mantenere il restante affettatura soluzione / memorizzazione in una bottiglia di vetro a 4 ° C.
- Utilizzare un adesivo cianoacrilato per fissare un piccolo blocco di agar (6%, preparato in ACSF) sul supporto del campione vibratome e conservarlo a 4 ° C.
- 30 minuti prima di iniziare il taglio, posizionare la bottiglia di vetro contenente la soluzione di affettare / storage in un secchio pieno di ghiaccio e la bolla con il 95% di O 2, 5% di CO 2.
2. Identificazione astrociti e Registrazioni 3. PharmacIsolamento ological del sostenuta K +-corrente 4. Isolation della quota agevolata delle Correnti Transporter sinapticamente-attivati (fSTCs) 5. Sottrazione del residuo zdustained K +-corrente da fSTCs 6. Isolamento delle Correnti Transporter Flash-attivati (FTC) 7. Analisi Deconvoluzione
Nota: per ottenere le fette più alta qualità, è importante che le due parti del cervello sono saldamente incollati alla piastra di base vibratome. Per fare questo, utilizzare un adesivo cianoacrilato che non sia troppo liquido e che non si asciughi troppo in fretta.
Nota: se tutto è orientato correttamente, il vibratome opportuno taglio fette parasagittali dalla dorsale verso il ventrale e dalla mediale verso il lato laterale del cervello.
Nota: Gli astrociti hanno tipicamente basso resistanc ingressoe (~ 10 MW), hyperpolarized potenziale di membrana a riposo (~ -90 mV), e nessuna attività di tiro. Gli astrociti sono conservati presso il suo potenziale di membrana a riposo durante gli esperimenti in modalità voltage-clamp (cioè la corrente di mantenimento dovrebbe leggere 0 Pa). Prima di ogni stimolazione, a 10 ms hyperpolarizing gradino di tensione (-3 mV) viene utilizzato per monitorare la serie e resistenza di ingresso dello astrociti. 
Nota: il componente TBOA-insensitive (cioè quella che viene registrato in presenza di TBOA (50 - 100 mM)) rappresenta la costante K +-corrente. Suo sviluppo nel tempo è approssimata dalla funzione mono-esponenziale descritto sopra.
Nota: Nelle condizioni di registrazione qui descritto (cioè intracellulare CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 -), stimoli sinaptici di assoni eccitatori generano correnti astrociti con forme d'onda complesse costituite da un rapido aumento transitorio verso l'interno corrente stechiometrica e una lenta -aumento, sostenuto verso l'interno K + corrente riflette K + riequilibrio nello spazio extracellulare a seguito dell'azione potenziale propagazione lungo gli assoni vicini. E 'fondamentale per rimuovere questo sostenuta K +-corrente, come ogni corrente residua determinerebbe unsovrastima della vita glutammato.
Nota: ricordate che l'analisi descritto 4,7-4,10 deve essere eseguita sulle tracce medi ottenuti in condizioni di controllo e in TBOA (10 micron).
Nota: nelle condizioni di registrazione qui descritto (cioè intracellulare CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 -), Flash stimoli generano correnti astrocitiche costituiti unicamente il rapido aumento transitorio stechiometrico corrente verso l'interno.
Nota: l'analisi descritta in 6.7 deve essere eseguita sulle tracce medi ottenuti in condizioni di controllo e in TBOA (10 micron). 
eche meglio descrive la fase di decadimento della corrente trasportatore registrato nel TBOA (10 micron) (Figura 3b).
Nota: la funzione descritta al 7.2 (cioè H (t)) rappresenta l'andamento nel tempo della clearance glutammato dagli astrociti in presenza di TBOA (10 mM).
Nota: deconvoluzione è una operazione matematica inclusa in molti pacchetti software di analisi come (ad esempio Matlab, Python). In IgorPro, il codice di programmazione che noi di solito usiamo per eseguire questo tipo di analisi, l'operazione di deconvoluzione può essere efficacemente calcolato come descritto di seguito, utilizzando Fourier veloce discreto trasforma. Prima, utilizzare l'operazione per calcolare la FFT discrete veloce trasformata di Fourier della funzione di mono-esponenziale ottenuto in 7.2 e del fit della corrente trasportatore registrato in TBOA ottenuto in 7.1. Successivamente, utilizzare l'operazione IFFT calcolarne l'inversa discreta trasformata rapida di Fourier del rapporto delle due funzioni FFT. La funzione risultante I (t) può essere descritto come segue: 
Il passo descritto in 7.3 permette derivare il filtro della corrente trasportatore in TBOA (10 mM) (Figura 3c destra). Il filtro rappresenta i fattori di distorsione che convertono la durata del glutammato a membrane di astrociti nella corrente trasportatore isolato in sezioni di 4-6 (cioè il FSTC o FTC).
Nota: questo passaggio consente derivante l'andamento nel tempo della clearance di glutammato dagli astrociti in condizioni di controllo (Figura 3d a destra). Il presupposto fondamentale di questa fase deconvoluzione è che il profilo temporale del filtro rimane inalterata in condizioni di controllo e in TBOA (10 mM).
dove G (t) è la forma d'onda ottenuta nella fase 7.1. Nell'equazione di cui sopra descritto, il termine t corrisponde alla finestra di tempo in cui l'integrale è calcolato.
Nota: quando il metodo è stato stabilito in primo luogo,<t> è stato calcolato su finestre temporali che sono stati lasciati senza vincoli 13. Questo approccio può essere utilizzato fintanto che la finestra di integrazione è impostato per essere più largo della durata di liquidazione glutammato e le forme d'onda di liquidazione decadimenti completamente nuovo al basale. Se questo non è il caso, tuttavia, questo metodo di stima <t> incontra alcune limitazioni. Ad esempio, se la forma d'onda di liquidazione non decade esattamente sulla linea di base, poi <t> aumenta con la larghezza della finestra di integrazione. Per evitare qualsiasi potenziale fonte di imprecisione per la stima di <t>, ora calcoliamo sopra una finestra temporale corrispondente al 10% del picco della corrente trasportatore, prima e dopo l'esordio 14. Quest'ultimo approccio migliora la coerenza con cui <t> si misura attraverso le cellule. Questo è utile soprattutto quando si analizzano piccoli effetti dei trattamenti farmacologici in corso di tempo di gioco.
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Representative Results
Il successo di questo approccio analitico descritto qui dipende criticamente ottenere registrazioni elettrofisiologiche alta qualità delle correnti Trasportatori dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale. In acute del mouse fettine di ippocampo, astrociti possono essere facilmente identificati sotto Dodt illuminazione o IR-DIC causa del loro piccolo corpo cellulare (Ø = 10 micron) e nucleo prominente (Figura 1). Loro caratteristico morfologia a stella può essere apprezzato con epifluorescenza, confocale, o due fotoni microscopia a scansione laser, quando si aggiunge un fluoroforo come Alexa 594 (50 mM) alla soluzione intracellulare, (Figura 1). A livello di elettrofisiologia, astrociti sono caratterizzati da una bassa resistenza di ingresso, il potenziale di membrana hyperpolarized (~ -90 mV) e l'incapacità di generare potenziali d'azione. Astrociti generano correnti in risposta alla stimolazione elettrica o optogenetic di neuroni vicini e fotolisi UV di cacomposti ged come MNI-L-glutammato.
Correnti trasportatore astrociti possono essere registrati utilizzando Cs soluzioni interne basate su + o K +. Si noti che Cs +, un popolare K + sostituto, supporta il trasporto di glutammato, ma rallenta la velocità ciclistica trasportatore del glutammato 16,17 (perché i trasportatori del glutammato legano e / o traslocare Cs + attraverso la membrana più lentamente di K +). Se Cs + riduce significativamente il numero di trasportatori per il glutammato vincolante, ma conduce anche a correnti trasportatori più piccoli / più lento rispetto a quelli registrati con K + soluzioni interne basate 16,17.
Quando si utilizza CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 - come il principale anione intracellulare, la corrente generata dal trasportatori del glutammato negli astrociti è dovuto al movimento stechiometricamente-accoppiata del glutammato 1, 3 Na
La corrente registrata negli astrociti quando evocando rilascio sinaptico di glutammato ha una forma d'onda più complessa. Esso è composto da un rapido aumento, transitorio componente verso l'interno a causa del glutammato corrente trasportatore stechiometricamente-accoppiato sopra descritta. Inoltre, comprende un lento-aumentante, sostenuta attivo K +-corrente dovuta al flusso di K + accumulata nello spazio extracellulare dopo potenziale d'azionepropagazione lungo gli assoni vicini. Un approccio farmacologico può essere utilizzata per isolare la corrente dalla costante K +-corrente trasportatore e richiede l'uso di alte concentrazioni di un ampio spettro glutamato trasportatore antagonista TBOA (100 mM) alla fine dell'esperimento 12. Il metodo qui descritto utilizza un approccio puramente analitico per isolare il glutammato corrente dal K +-sostenuta corrente e perciò permette per esperimenti più brevi (Figura 2) trasportatore.
Come primo passo, abbiamo interleave stimoli singoli e in coppia impulsi sinaptici (100 msec a parte), ogni 10-20 sec e media un numero uguale dei spazza ottenuti con stimoli singoli e in coppia-pulse. L'ampiezza della prima corrente evocata da stimoli doppio potrebbe corrispondere l'ampiezza della corrente evocata dal singolo stimolo. Iniziamo questa analisi sottraendo la corrente evocata dal singolo stimolo da quella evocata dagli stimoli appaiati. Questa sottrazione permette isolando la risposta al secondo stimolo, anch'esso composto da un rapido aumento, transitorio glutammato corrente trasportatore e un lento-aumentante, sostenuta K +-corrente (Figura 2a a destra). Prossimo, spostiamo la risposta al singolo stimolo da un intervallo di tempo corrispondente all'intervallo tra impulsi degli stimoli accoppiati, in modo che il tempo di comparsa della singola risposta corrisponde l'ora di inizio della seconda risposta isolata sopra (Figura 2b ). Sottraendo queste due correnti, isoliamo la quota agevolata della corrente trasportatore, che qui chiamiamo FSTC (Figura 2c). La cinetica della FSTC sono simili alla cinetica della corrente trasportatore sinapticamente-attivata (STC) isolato farmacologicamente con alte concentrazioni di glutamato trasportatore antagonista TBOA (100 mM) 13. Per questo motivo e per semplicità, nel lavoro precedente, si è fatto riferimento alla FSTCcome STC 13,14. Nonostante sia correnti con proprietà simili, e fSTCs STC non sono la stessa corrente. Per questo motivo e per la precisione, in questo lavoro, si farà riferimento a loro in modo esplicito come fSTCs e CCS. Il metodo di sottrazione qui descritto permette di preciso isolamento di fSTCs nella maggior parte delle registrazioni. Tuttavia, in alcuni casi, un residuo sostenuta K +-corrente è ancora presente. In questo caso, è necessario isolare il K +-corrente sostenuta in esperimenti separati utilizzando alte concentrazioni di TBOA (50 - 100 mM). L'andamento temporale della farmacologicamente isolato sostenuta K +-corrente può essere descritto da una funzione mono-esponenziale nella forma:
Con la registrazione di correnti di astrociti in celle diverse, stimiamo il valore medio di Τ aumento. Abbiamo poi creatEA funzione mono-esponenziale come quella sopra descritta, nella quale luogo Τ corrisponde al valore medio del Τ aumento misurata sperimentalmente in diversi astrociti e A corrisponde all'ampiezza del residuo sostenuta K +-corrente che vogliamo rimuovere (figura 2d ).
Il metodo che abbiamo appena descritto per isolare fSTCs funziona bene quando evoca rilascio di glutammato dalle sinapsi facilitando e può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di glutammato dalle sinapsi che subiscono la depressione accoppiato-pulse. Tuttavia, è di scarsa utilità quando le sinapsi glutamatergiche in fase di studio non mostrano alcuna forma chiara di facilitazione a breve termine o di depressione. In questo caso, l'isolamento farmacologico di correnti trasportatore con elevata concentrazione di TBOA (100 mM) rimane la soluzione più fattibile per isolare la corrente di trasportatore del glutammato stechiometricamente-accoppiato, sinapticamente-evocata.
(cioè senza bloccare tutto). L'obiettivo qui è quello di rallentare in modo significativo l'andamento nel tempo della corrente di trasportatore senza perdere la capacità di distinguere dal rumore delle registrazioni. L'ipotesi sottostante è che in presenza di una piccola concentrazione di TBOA, quando la capacità di assorbimento degli astrociti è diminuita, il fattore principale plasmare il decadimento della corrente trasportatore è la graduale diminuzione della concentrazione glutammato alla membrana astrocitaria 12,18. Allestiamo la corrente trasportatore in condizioni di controllo e in TBOA (10 micron) con la funzione multi-esponenziale:
(Figura 3a). Abbiamo approssimato il gioco glutammato in TBOA (10 micron) con una funzione istantaneamente-aumento con decadimento mono-esponenziale (Figura 3b) e noi deconvolve dalla funzione multi-esponenziale che descrive la corrente di trasportatore in TBOA (10 micron; figura 3c). La forma d'onda risultante è il "filtro", e rappresenta la combinazione di fattori che distorcono (cioè filtro) il profilo di concentrazione glutammato nella corrente trasportatore (figura 3c). Deconvolving il filtro dal fit multi-esponenziale della corrente trasportatore in condizioni di controllo consente di stimare l'andamento temporale del profilo di concentrazione di glutammato al astrociti registrato in condizioni di controllo (Figura 3d). Per questa analisi deconvoluzione, assumiamo che la cineticadel filtro rimangono inalterati in assenza e in presenza di TBOA (10 mM). Questa è un'ipotesi ragionevole, perché tutti i fattori che contribuiscono al filtro (cioè cinetica transporter, filtraggio elettrotoniche, e durante stimoli sinaptici, rilascio asincrono di glutammato attraverso le sinapsi), è improbabile che siano influenzate dalla presenza di TBOA, un composto che riduce il numero di di trasportatori per il glutammato vincolante.
Usiamo il baricentro (Of T) come misura della vita glutammato a membrane astrociti in celle diverse. <t> Rappresenta il "centro di massa" della forma d'onda di liquidazione, ed è sensibile ai cambiamenti sia tempo di salita e di decadimento delle la forma d'onda di liquidazione glutammato. Il baricentro è espressa come:
e 1 "fo: contenuti-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figura 1. Identificazione degli astrociti in fettine di ippocampo acuti. (Ab) immagini DODT di astrociti ippocampali in CA1 strato radiatum. Sotto Dodt illuminazione e IR-DIC, astrociti possono essere identificati dal loro piccolo corpo cellulare e nucleo prominente. Le frecce rosse indicano molteplici astrociti che possono essere identificati nella preparazione fette. La freccia gialla indica la astrociti che è stato patchato e riempito con un colorante fluorescente (vedi sotto). (Cd) rivestito immagine Dodt delle fettine di ippocampo e due fotoni delle astrociti rattoppate, evidenziati con una freccia gialla in (ab). Per questo esperimento, gli astrociti sono patchati e riempiti con un KCH 3 SO 3 - soluzione interna basata aggiunto con Alexa 594 (50 micron). I processi astrocitici estendono a poche decine di micron distanti tegli cellula del corpo. Le annotazioni della sinistra identificano le tre principali strati cellulari della formazione CA1 dell'ippocampo che può essere riconosciuto nelle fette.
Figura 2. Isolamento di fSTCs da correnti transporter sinapticamente attivati registrati negli astrociti. (Ac) Schema dei passaggi analitici richiesti per isolare i fSTCs da correnti transporter sinapticamente attivati registrati negli astrociti. (D) metodo di analisi usato per rimuovere il residuo costante K +-corrente dalle fSTCs (vedi sezione 5). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 3. Analisi deconvoluzione utilizzata per ricavare l'andamento temporale della clearance glutammato dagli astrociti (a) Mono-fit esponenziale del FSTC / FTC isolato in condizioni di controllo (sinistra) e in presenza di TBOA (10 mM; destra).. (B) Il corso di tempo della clearance di glutammato in TBOA (10 micron) è approssimata da una funzione istantaneamente-aumento con decadimento mono-esponenziale. (C) Deconvolving l'andamento temporale della clearance di glutammato in TBOA (10 pM) dal fit multi-esponenziale del trasportatore della corrente in TBOA (10 mM) consente di stimare il filtro. (D) Deconvolving il filtro dal fit multi-esponenziale della corrente trasportatore in condizioni di controllo consente di stimare l'andamento nel tempo della clearance glutammato dagli astrociti in condizioni di controllo.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti.
Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento utilizzati per descrivere le correnti trasportatore. L'analisi di deconvoluzione si basa sui seguenti due ipotesi. (1) I più processi che distorcono l'andamento nel tempo della clearance di glutammato nella corrente trasportatore sperimentalmente-registrati possono essere rappresentati come un sistema lineare. Sebbene in termini assoluti, molti dei fattori che le correnti trasportatore forma sono sistemi non lineari (in linea di principio vincolante glutammato e di trasporto possono subire sia saturazione), la prova sperimentale indicaTES che il loro regime lineare è ampio. Di conseguenza, la durata di correnti trasportatore e della clearance glutammato rimane la stessa su una vasta gamma di forza stimolo, probabilità di rilascio, e concentrazioni di glutammato 13,14,18. Sebbene questa approssimazione appare legittima per le nostre condizioni sperimentali, esso dovrebbe essere convalidato prima di ripetere questa analisi in diverse preparazioni sperimentali. (2) Le caratteristiche dei filtri non sono influenzati dalla presenza di TBOA (10 mM). Questa ipotesi sembra ragionevole, perché tutti i fattori che contribuiscono al filtro (cioè cinetica transporter, filtraggio elettrotoniche, e durante stimoli sinaptici, rilascio asincrono di glutammato attraverso le sinapsi), è improbabile che siano influenzate dalla presenza di TBOA.
Derivando la clearance forma d'onda da glutammato fSTCs e FTCS, si ottengono due diversi tipi di informazioni. Analizzando fSTCs, misuriamo il tempo che astrocymembrane tic sono esposti a glutammato rilasciato dalla sinapsi. Evocando FTCs con piena illuminazione UV campo (cioè uncaging glutammato su tutta la superficie astrociti), si misura il tempo che le membrane astrociti sono esposti a glutammato Uncaged. In questi esperimenti uncaging tutte le molecole di glutammato vengono rilasciati (cioè uncaged) allo stesso tempo e tutti i trasportatori vengono attivati contemporaneamente, per la stessa concentrazione di glutammato. Pertanto, analizzando FTCs, siamo in grado di ottenere una lettura indiretta della astrociti capacità di assorbimento glutammato.
È importante notare che i metodi qui descritti permettono stimare l'andamento nel tempo della clearance glutammato, non il valore effettivo della concentrazione glutammato evocando le correnti trasportatore. Il corso di tempo stimato è una misura media del corso di tempo della clearance di glutammato in tutte le aree della membrana astrociti a cui abbiamo accesso elettrofisiologico: non èt sensibile alle eterogeneità nella diffusione del glutammato in siti diversi all'interno della membrana astrociti 19. Questa informazione è più probabile che sia ottenuto con la microscopia ad alta risoluzione di reporter fluorescenti glutammato sensibili 20. Tuttavia, i giornalisti glutammato sensibili attualmente disponibili presentano gamme dinamiche relativamente ristretti. Questo può introdurre distorsioni non lineari tra il profilo di concentrazione di glutammato e il segnale fluorescente, limitando l'uso di queste sonde per estrarre informazioni temporali sulla concentrazione glutammato transitoria. Pertanto, è probabilmente combinando tutti questi diversi approcci che si può ottenere la comprensione più completa della dinamica dei segnali glutamatergiche a membrane astrociti.
In sintesi, i metodi qui presentati possono essere usati per stimare l'andamento nel tempo di liquidazione dei sinapticamente rilasciato o flash-Uncaged glutammato a membrane astrociti. Essi forniscono preziosi strumenti che can essere utilizzato per stimare la durata di glutammato nello spazio extracellulare a diversi stadi di sviluppo 13 in una varietà di specie animali 14 e regioni cerebrali in condizioni fisiologiche e patologiche 21.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke del programma di ricerca intramurale (NS002986). Come ha scritto il manoscritto e implementato l'analisi di deconvoluzione. JSD ha sviluppato la versione iniziale dell'analisi deconvoluzione e commentato il testo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
