Summary
Biz astrositlerde glutamat taşıyıcı akımların elektrofizyolojik kayıtları astrositik membranların de glutamat ömrünü tahmin etmek için analitik bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Beyinde glutamat taşıyıcıları en yüksek yoğunluğu astrositlerde bulunmuştur. 3 Na +, 1 H, CO-kamyonu + ve 1 K karşı taşıma zarından glutamat glutamat taşıyıcılarının çift hareket +. Taşıma işlemi tarafından oluşturulan stoikiometrik mevcut astrositlerden tam hücre patch-clamp kayıtları ile izlenebilir. Kaydedilen akımın zaman ders astrositler maruz kaldığı glutamat konsantrasyonu profil, glutamat taşıyıcı kinetiği ve astrositik membranların pasif elektrotonik özelliklerinin zaman ders şekillenir. Burada astrositlerde glutamat taşıyıcı akımları kaydetmek ve astrositik taşıyıcı akımların dalga şekli tüm diğer faktörlerden glutamat açıklık zaman ders izole etmek için kullanılabilecek deneysel ve analitik yöntemleri açıklar. Burada açıklanan yöntemlerle kullanım süresi o tahmin etmek için de kullanılabilirf flash Uncaged ve sağlık ve hastalık sırasında merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositik membranlar de glutamat synaptically-yayınladı.
Introduction
Astrositler yıldız şeklinde morfolojisi ve nöropil boyunca uzanır ve komşu sinaptik iletişim 1,2 ulaşmak, ince zar çıkıntıları olan beyinde en bol hücre tipleri vardır. Astrositler 'hücre zarı yoğun glutamat taşıyıcı moleküllerin 3 ile doludur. Fizyolojik koşullar altında, glutamat taşıyıcıları hızla zarın hücre dışı glutamat tarafında bağlanır ve hücre sitoplazması aktarın. Böyle yaparak, nakil dışı alan 4 glutamat düşük bazal konsantrasyonu korumak. Sinaps eksitatör bitişik ince astrositik süreçlerinde glutamat taşıyıcılarının ideal uzak sinaptik yarık gelen yayılır olarak sinaptik olaylar sırasında serbest glutamat bağlamak için konumlandırılmış. Böyle yaparak, taşıyıcılar da uyarıcı sinyal mekansal yayılmasının azaltılmasında, peri-ve ekstra-sinaptik bölgelere doğru ve komşu sinaps üzerine glutamat yayılma sınırı5-7 beyinde n.
Glutamat taşıma stokiyometrik 3 hareketine bağlı olan bir süreçtir Elektrojenik Na + ve 1H bunların elektrokimyasal gradyan boyunca + K + 1 ve 8 arasında karşı taşıma. (Tiyosiyanat)> NO - 3 - (nitrat) ≈ Cıo 4 - (perklorat)> I -> Br -> Cl -> F - değil, glutamat taşıma SCN geçirgen (ancak stokiyometrik olarak birleştirilmiş olmayan) anyonik bir iletkenlik ile ilişkili (metan sülfonat) ve C 6 H 11 O 7 - - (glukonat) 9-11 CH 3 SO 3. Her iki akımları (stokiyometrik ve olmayan stokiyometrik) görsel olarak akut olarak Dodt aydınlatma veya kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (IR-DIC) kapsamında belirlenen astrositlerden, gelen tam hücreli yama-kelepçe kayıtları alarak kaydedilebilirE beyin dilimleri 12. Zarından glutamat taşıma ile ilişkili geçerli stoikiometrik bileşeni CH3 SO 3 kullanılarak izole edilebilir - ya da C 6H 11 O - 7 dayalı hücre içi solüsyon ve astrositler 13,14 üzerinde flaş-Uncaging glutamat tarafından uyarılmış olabilir, veya komşu sinaps gelen glutamat serbest etkinleştirerek, ya elektriksel 12 veya hedeflenen optogenetic kontrol.
Taşıyıcı akım stokiyometrik bileşeninin zaman ders astrositik membran (yani glutamat boşluk) de glutamat konsantrasyonu profili ömrü ile şekillenir, glutamat taşıyıcıları, astrositlerde pasif membran özelliklerinin kinetik ve sinaptik uyarımlar, sırasında aktive sinaps 13 arasında glutamat serbest eşzamanlılık. Burada tam ayrıntılı olarak açıklar: (1) deneysel yakörnek deneysel hazırlık olarak akut fare hipokampal dilimleri kullanarak astrositlerden tam hücreli yama-kelepçe kayıtları glutamat taşıyıcı akımların stokiyometrik bileşeni izole etmek için oach, (2) analitik bir yaklaşım bu kayıtları 13, gelen glutamat açıklık zaman ders türetmek için 14. Bu yöntemler, kayıt ve merkezi sinir sistemine ait herhangi bir bölgede astrositlerden glutamat taşıyıcı akımları analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dilim Hazırlık
- 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O, 4 MgCl2, 26.2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, ve 22 glukoz, 320: içeren / depolama çözümü (mM) dilimleme 500 ml hazırlayın mOsm, pH 7.4,
- Dilimleri için bir batma odası hazırlamak için 250 ml beher kullanın, / depolama çözümü dilimleme 200 ml ile doldurun, 34 de bir su banyosunda sıcak ° C ve% 95 O 2,% 5 CO 2 ile balonu bu.
- 4 bir cam şişede kalan dilimleme / depolama çözümü ° C tutun
- Vibratome numune tutucu küçük bir agar blok (% 6, ACSF hazırlanan) ekleyin ve 4 ° C'de saklamak için bir siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın
- 30 dakika dilimleme başlamadan önce, buz ve% 95 O 2,% 5 CO 2 ile kabarcık onunla dolu bir kova dilimleme / depolama çözümü içeren cam şişe yerleştirin.
2. Astrosit Kimlik ve Kayıtlar 3. PharmacSürekli K +-akım ological izolasyonu 4. Bensynaptically-Aktif Transporter Akımlar Kolaylaştırılmış kısmı (fSTCs) bir solation 5. Artık zdustained K çıkarma fSTCs gelen + akım 6. Flash aktive Transporter Akımlar izolasyonu (FTCs) 7. Dekonvolüsyon analizi
Not: yüksek kalitede dilimler elde etmek için, bu beynin iki parça sıkıca vibratome taban plakasına yapıştırılmış olması önemlidir. Bunu yapmak için, çok sıvı ve çok hızlı kurumasına olmadığını olmayan bir siyanoakrilat yapışkan kullanın.
Not: her şeyin doğru yönlendirilmiş ise, vibratome beynin yan tarafına doğru ventral doğru dorsal gelen ve medial gelen parasagital dilimleri kesme edilmelidir.
Not: Astrositler genellikle düşük giriş dayanımı vare (~ MQ 10), hiperpolarize istirahat membran potansiyeli (~ -90 mV), ve hiçbir ateş aktivite. Astrositler gerilim-kelepçe modu (yani tutma akımı 0 pA okumalısınız) en deneyler genelinde istirahat membran potansiyeli tutulur. Her stimülasyon önce, gerilim adım (-3 mV) hiperpolarizan bir 10 ms astrosit dizi ve giriş direnci izlemek için kullanılır.
Not: TBOA-duyarlı bileşen (yani TBOA varlığında (50 kayıtlı olan bir - 100 uM)) + akım sürekli K temsil eder. Onun zaman tabii ki yukarıda açıklanan mono-üstel fonksiyonu ile tahmin edilir.
Not: Kayıt koşullarında (yani hücre içi CH 3 SO 3 - veya C 6 H 11 O 7 -) Burada anlatılan, eksitatör akson sinaptik uyarılar mevcut bir hızla yükselen geçici içe stokiyometrik ve yavaş oluşan karmaşık dalga şekilleri ile astrositik akımları oluşturur -Yükselen, içe K sürekli + akım K + yeniden dengeleme komşu akson boyunca aksiyon potansiyeli yayılma takip eden hücre dışı alanda yansıtan. Herhangi bir kaçak akım olarak, +-akım bu sürekli K kaldırmak için kritik bir yol açacakglutamat ömür boyu abartma.
Not: 4,7-4,10 açıklanan analiz kontrolü koşullarda ve TBOA (10 mcM) elde edilen ortalama izleri üzerinde yapılması gerektiğini unutmayın.
Not: Kayıt koşullarında (yani hücre içi CH 3 SO 3 - veya C 6 H 11 O 7 -) Burada anlatılan, flaş uyarı hızla yükselen geçici stokiyometrik içe akım sadece oluşan astrositik akımları oluşturur.
Not: 6.7 'de tarif edilen analiz kontrol şartlarında ve TBOA (10 uM)' de elde edilen ortalama izleri gerçekleştirilmelidir.
Şekil 3d) bıraktı.
veBu TBOA (10 mcM) (Şekil 3b) kaydedilen taşıyıcı akımın çürüyen aşamasında iyi açıklar.
Not: 7.2 (yani H (t)) 'de tarif edilen işlevi TBOA (10 uM) mevcudiyetinde astrositlerden glutamat açıklık zaman süreci temsil eder.
Not: deconvolution (örneğin Matlab, Python) gibi birçok analiz yazılım paketleri dahil matematiksel bir işlemdir. IgorPro, biz genellikle bu tür bir analiz gerçekleştirmek için kullandığınız programlama kodu, deconvolution çalışma verimli ayrık hızlı Fourier dönüşümleri kullanılarak, aşağıda açıklandığı gibi hesaplanabilir. İlk olarak, di hesaplamak için FFT işlemini kullanınscrete hızlı Fourier 7.2 'de elde edilen mono-üstel fonksiyonu ve 7.1 elde TBOA kaydedilen taşıyıcı akım uyum dönüşümü. Sonra, iki FFT fonksiyonların oranı ters ayrık hızlı Fourier dönüşümü hesaplamak için IFFT işlemi kullanır. Elde edilen fonksiyonu I (t), aşağıdaki gibi tarif edilebilir:
7.3 açıklanan adım TBOA (10 mcM) (Şekil 3c sağ) mevcut taşıyıcı filtre kaynaklanan sağlar. 6 (yani FSTC veya FTC) - Filtre bölümlerde 4 izole taşıyıcı mevcut içine astrositik membran de glutamat ömrü dönüştürmek bozulma faktörleri temsil eder.
Not: Bu adım kontrol koşullarda astrositlerde (Şekil 3d sağ) glutamat açıklık zaman ders kaynaklanan sağlar. Bu deconvolution adım altında yatan varsayım, filtrenin zamansal profil kontrolü koşullarda ve TBOA (10 mcM) içinde değişmeden kalmasıdır.
burada G (t), dalga biçimi adım 7.1 'de elde edilir. Yukarıdaki denklem tarif terimi, t tamamlayıcı hesaplanan zaman penceresini karşılık gelir.
Not: yöntem ilk kurulduğu zaman,<t> 13 serbest bırakıldı zaman pencereler üzerinde hesaplandı. Entegrasyon pencere tamamen geri başlangıca glutamat açıklık ve boşluk dalga bozunur süreleri daha geniş olarak ayarlanır gibi bu yaklaşım sürece kullanılabilir. Bu durum bu değilse, ancak, <T> tahmin Bu yöntem, bazı sınırlamalar karşılaşır. Açıklık dalga formu için tam olarak geri temel çürük etmez, örneğin, daha sonra <T> birleştirme penceresinin genişliği artar. <t> Ve tahmin için yanlışlık herhangi bir potansiyel kaynak önlemek için, şimdi başlangıcından 14 öncesi ve sonrası, mevcut taşıyıcı zirvesinde% 10 tekabül eden bir zaman penceresi üzerine hesaplamak. İkinci yaklaşım, <t> hücreler boyunca ölçüldüğü ile tutarlılık artırır. Boşluk sırasında ders farmakolojik tedavilerin küçük etkileri analiz bu özellikle kullanışlı oluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analitik yaklaşımın başarısı kritik merkezi sinir sisteminin herhangi bir bölgesinde astrositlerden taşıyıcı akımların yüksek kaliteli elektrofizyolojik elde bağlıdır Burada anlatılan. Akut fare hipokampal dilimleri, astrositlerde kolayca nedeniyle küçük hücre gövdesi (Ø = 10 mikron) ve belirgin çekirdeği (Şekil 1) Dodt aydınlatma veya IR-DIC altında tespit edilebilir. Hücre içi bir çözüm, (Şekil 1) Alexa 594 (50 mcM) gibi bir fluorofor eklerken kendi ayırt edici yıldız şeklinde morfoloji, konfokal Epifloresans, veya iki foton lazer tarama mikroskobu ile takdir edilebilir. Elektrofizyoloji düzeyde, astrositlerde düşük giriş direnci, hiperpolarize membran potansiyeli (~ -90 mV) ve aksiyon potansiyelleri oluşturmak için yetersizlik ile karakterizedir. Astrositler komşu nöronların elektriksel veya optogenetic stimülasyon ve ca UV fotoliz yanıt olarak akımları oluşturmakMNI-L-glutamat gibi GED bileşikler.
Astrositik taşıyıcı akımları Cs + veya K + tabanlı iç çözümleri kullanılarak kaydedilebilir. Cs +, popüler bir K + yerine, glutamat ulaşım destekler, ancak glutamat taşıyıcı bisiklet oranı 16,17 yavaşlatır unutmayın (çünkü glutamat taşıyıcı bağlama ve / veya translocate Cs + zarından daha yavaş K +). Cs + önemli ölçüde bağlama glutamat için kullanılabilir taşıyıcılar sayısını azaltır, bu da K + tabanlı dahili çözümler 16,17 ile kaydedilen göre daha küçük / yavaş taşıyıcı akımların yol açar.
Veya C 6 H 11 O 7 - - Ana hücre içi anyon olarak, astrositlerde glutamat taşıyıcılar tarafından üretilen akım, 1 glutamat stokiyometrik-birleştiğinde hareketi nedeniyle 3 Na CH 3 SO 3 kullanırken + ve zarından 1 K +. Bu stokiyometrik mevcut photolysis deneylerde astrositlerden kaydedilen tek ve MTK olarak bakın. Photolysis deneyler yaparken, açık ve bloke ışık yolu ile elde edilen alternatif UV uyarılara tavsiye edilir. Engellenmiş ışık yolu ile elde izleri flaş lambası tarafından üretilir ve mükemmel FTC izole etmek için açık bir ışık yolu ile elde edilenler çıkarılır edilebilir uyaran dışlayıcı izole etmek için yararlıdır.
Glutamat sinaptik serbest çağrıştıran zaman astrositler kaydedilen akım daha karmaşık bir dalga formuna sahiptir. Bu, yukarıda tarif edilen stokiyometrik-birleştiğinde glutamat taşıyıcı akımı nedeniyle bir hızla artan, geçici içe doğru bileşeni oluşmaktadır. Buna ek olarak, K akını nedeniyle yavaş yükselen, sürdürülen içe K + akımı + aksiyon potansiyeli ardından hücre dışı alanda biriken içermektedirkomşu akson boyunca yayılması. Bir farmakolojik yaklaşım, sürekli K + akımı akım taşıyıcı izole etmek için kullanılmıştır ve deney 12 sonunda, geniş spektrumlu glutamat taşıyıcı antagonisti TBOA (100 uM), yüksek konsantrasyonlarda kullanımını gerektirir. Burada tarif edilen yöntem + akım ve bu nedenle daha kısa deneyleri (Şekil 2) için izin sürekli K mevcut glutamat taşıyıcı izole etmek için saf bir analitik yaklaşımı kullanır.
20 saniye, ve tek ve çift-darbe uyaranlara elde edilen temizleyicileri ortalama eşit sayıda - İlk adım olarak, biz tek ve çift-darbe sinaptik uyaranlar (dışında 100 msn), her 10 Interleave. Eşleştirilmiş bir uyarıya cevabın birinci akımın genliği, tek bir uyarıcı tarafından uyarılmış akımın genliği uygun olmalıdır. Biz tarafından uyarılmış bundan tek bir uyarıcı tarafından uyarılmış mevcut çıkarılarak bu analizi başlareşleştirilmiş uyaranlara. Bu çıkarma ayrıca geçerli hızlı yükselen, geçici glutamat taşıyıcı ve yavaş yükselen, sürekli K +-akım (Şekil 2a sağda). Oluşan ikinci uyaran, yanıtı izole sağlar Sonra, tek bir yanıtın oluşması sırasında Yukarıda geçen izole edilmiş ikinci cevabın başlangıç zamanı eşleşen, böylece eşleştirilmiş uyaranların pulsasyonlar aralığına karşılık gelen bir zaman aralığı ile bir uyarıcıya tepki kayması (Şekil 2b .) Bu iki akım çıkararak, biz FSTC (Şekil 2c) arayın burada taşıyıcı akım, en kolaylaştırdı kısmı izole. FSTC kinetiği glutamat taşıyıcı antagonisti TBOA (100 mcM) 13 konsantrasyonu yüksek olan farmakolojik izole mevcut synaptically-aktive taşıyıcı (STCS) kinetiği benzer. Bu nedenle ve basitlik için, daha önceki çalışmalarında, biz FSTC sevkSTC 13,14 olarak. Benzer özelliklere sahip akımları olmasına rağmen, fSTCs ve STCS aynı geçerli değildir. Bu nedenle ve doğruluk için, bu çalışmada, biz fSTCs ve STCS olarak açıkça onları sevk edecektir. Burada açıklanan çıkarma yöntemi en kayıtları fSTCs doğru izolasyonu sağlar. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bir kalıntı sürekli K + akımı hala mevcuttur. Bu durumda, bu TBOA yüksek konsantrasyonlarda (- 100 uM 50) kullanıldığı ayrı deneylerde + akım sürekli K izole etmek için gereklidir. Farmakolojik olarak izole sürekli K + akımının zaman süreci biçiminde bir mono-üstel fonksiyon ile tarif edilebilir:
Farklı hücrelerde astrositik akımları kaydederek, biz Τ artış ortalama değerini tahmin. Gelecek creatgibi adet mono-üstel fonksiyonu Τ artış farklı astrositlerde deneysel olarak ölçülen Τ artış ortalama değerine karşılık ve bir biz kaldırmak istediğiniz + akım olduğunu artık sürekli K genliği (Şekil 2d karşılık gelir, yukarıda açıklanan .)
Sinaps kolaylaştırılması gelen glutamat serbest çağrıştıran ve eşleştirilmiş-darbe depresyon tabi sinaps gelen glutamat serbest incelemek için kullanılabilir zaman biz sadece fSTCs izole etmek için açıklanan yöntem güzel çalışıyor. Çalışılan glutamaterjik sinaps kısa vadeli kolaylaştırma ya da depresyon net bir şekilde görünmüyor Ancak, çok az faydası yoktur. Bu durumda, TBOA yüksek konsantrasyonda (100 mcM) ile taşıyıcı akımların farmakolojik izolasyonu stokiyometrik-birleştiğinde, synaptically-uyarılmış glutamat taşıyıcı akımı izole etmek için en uygun çözüm.
yani). Burada amaç kayıtların gürültü ayırmak için yeteneğini kaybetmeden mevcut taşıyıcı önemli ölçüde zaman ders yavaşlatmak için. Bunun altında yatan astrositler alım kapasitesi azalır TBOA, küçük bir konsantrasyonu varlığında, taşıyıcı akımın çürüme şekillendirme ana faktör astrositik membran 12,18 da glutamat konsantrasyonu kademeli bir düşüş olmasıdır. Biz çok üstel fonksiyonu ile (10 mcM) kontrolü koşullarda ve TBOA olarak taşıyıcı akım uygun:
(Şekil 3a). Bu yaklaşık olarak mono-üssel bir azalma (Şekil 3b) ve TBOA (10 uM; Şekil 3c) akım taşıyıcı açıklayan çok üstel fonksiyon dan deconvolve bir anında yükselen TBOA fonksiyonu ile (10 uM) 'de glutamat açıklık. Ortaya çıkan dalga "filtre", ve faktörlerin kombinasyonu temsil ettiği deforme (yani filtre) akım taşıyıcı (Şekil 3c) içine glutamat konsantrasyonu profili. Kontrol koşulları mevcut taşıyıcı çok üstel uygun gelen filtre Deconvolving kontrolü koşullarda kaydedilen astrosit (Şekil 3d) de glutamat konsantrasyonu profili zaman ders tahmin sağlar. Bu deconvolution analizi için, varsayalım ki kinetikbir filtre yokluğunda ve TBOA (10 uM) varlığında, değişmeden kalır. (Yani taşıyıcı kinetik, Elektronik filtreleme ve sinaptik uyarımlar esnasında, sinaps arasında glutamat asenkron sürümü) filtre katkıda bulunan tüm faktörlerin TBOA varlığı, sayısını azaltan bir bileşik etkisinde olası değildir çünkü bu makul bir varsayım bağlama glutamat için kullanılabilir taşıyıcılar.
Farklı hücrelerde astrositik zarları de glutamat ömür boyu bir ölçüsü olarak ağırlık merkezi (<t>) kullanın. <t> Boşluk dalga "kütle merkezi" temsil eder, ve yükselme zamanı ve çürüme hem de değişikliklere duyarlıdır glutamat boşluk dalga. Ağırlık merkezi olarak ifade edilir:
class = "jove_content"> Bu ifadenin pay ve payda da integral hesaplayabilir, üzerinde zaman aralığını karar vermek için iki yol vardır. Boşluk dalga arkasından ve bozunur sıfıra yükselir, çünkü, yöntemi ilk kurulduğu, orada entegrasyon pencere ayarlama konusunda yapılan herhangi bir özellikleri olduğunu, ve aslında bu oldukça gevşek 13 yapıldı. Bu soruna bir yolu,% 10, örneğin, bu FTC / fstc tepe rasgele bir oranda ulaşmak için geçen zaman 14 birleştirme penceresi sınırlamaktır. Bu basit kriter farklı hücrelerde bu analizi yaparken tutarlı olmak sağlar, boşluk dalga sıfıra mükemmel çürümez <t> en tahminlerindeki doğruluk artırır ve boşluk dalga küçük farklılıklar analiz hassasiyeti geliştirir olabilir farklı hücre grupları meydana gelmektedir.
e 1 "fo: içerik-width =" 3in "fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/ files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg>
Şekil 1. Akut hipokampal dilimleri içinde astrositler belirlenmesi. (Ab) CA1 stratum radiatum hipokampal astrositlerde Dodt görüntüleri. Dodt aydınlatma ve IR-DIC altında, astrositlerde kendi küçük hücre gövdesi ve önde gelen çekirdek tarafından tespit edilebilir. Kırmızı oklar dilim hazırlanmasında tespit edilebilir birden fazla astrositler işaret. Sarı ok (bkz. aşağıda) bir floresan boya ile yamalı ve doluydu astrosit gösterir. Hipokampal dilimleri ve sarı bir ok (ab) ile vurgulanan yamalı astrositlerin, iki-foton (cd) Overlaid Dodt görüntü. Alexa 594 (50 mcM) ile ilave bir dahili çözüm - Bu deneme için, astrositlerde bir KCH 3 SO 3 ile yamalı ve doldurulmuştur. Astrositik süreçleri uzak t mikron birkaç on uzatmako hücre gövdesi. Solun açıklamalar dilimler halinde tanınabilir hipokampal CA1 oluşumunun üç ana hücre tabakaları belirlemek.
Şekil 2. Astrositler kaydedilen sinaptik-aktive taşıyıcı akımlarından fSTCs izolasyonu. Astrositler Kaydedilen sinaptik-aktive taşıyıcı akımlardan fSTCs izole etmek için gerekli olan analitik adımlar (AC) Şema. (D) (bkz. Bölüm 5) fSTCs gelen + akım artık sürekli K kaldırmak için kullanılan analitik yaklaşım. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
ent-width = "6.5in" fo: src = src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" / "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg">
Şekil 3,. Için kullanılan Dekonvolüsyon analiz astrositlerden glutamat açıklık zaman ders elde kontrol koşulları (solda) ve TBOA varlığı (10 mcM, sağ) izole FSTC / MTK (a) Mono-üstel uyum.. (B) TBOA glutamat açıklık (10 mcM) zaman ders mono-üstel bozulma ile bir anında yükselen fonksiyonu ile tahmin edilir. (C) TBOA mevcut taşıyıcı çok üstel uyum (10 mcM) den TBOA glutamat açıklık (10 mcM) zaman ders Deconvolving filtre tahmin sağlar. (D) kontrol koşulları mevcut taşıyıcı çok üstel uygun gelen filtre Deconvolving kontrolü koşullarda astrositlerden glutamat açıklık zaman ders tahmin sağlar.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada astrositlerden elektrofizyolojik elde etmek için deneysel bir yaklaşım tanımlamak, astrositlerde glutamat taşıyıcı akımlar izole etmek için analitik bir protokol ve bir matematiksel yöntem astrositik taşıyıcı akımlardan glutamat açıklık zaman ders elde.
Analizin başarısı astrositlerden yüksek kaliteli yama kelepçe kayıtları elde etmek için yeteneği ve taşıyıcı akımları tanımlamak için kullanılan uydurma algoritmaları doğruluğunu dayanır. Deconvolution analizi aşağıdaki iki varsayımlara dayanır. (1) deneysel olarak kaydedilmiş taşıyıcı akım içine glutamat temizlenmesi zaman ders deforme birden çok işlem bir lineer sistem olarak temsil edilebilir. Mutlak olarak da şekil taşıyıcı akım doğrusal olmayan sistemleri (ilke glutamat bağlama ve taşıma hem de doygunluk tabi olabilir), deneysel kanıtlar göstergesi olduğu faktörlerin çokkendi doğrusal rejim geniş olduğunu tes. Buna göre, taşıyıcı akımların ve glutamat temizlenmesi zaman ders uyarıcı gücü, serbest olasılık ve glutamat konsantrasyonları 13,14,18 geniş bir aralığında aynı kalır. Bu yaklaşım bizim deneysel koşulları için meşru gibi görünüyor olsa da, farklı deneysel hazırlıklar bu analizi tekrar önce valide edilmelidir. (2) Filtrenin özellikleri TBOA (10 mcM) varlığı ile etkilenmez. (Yani taşıyıcı kinetik, Elektronik filtreleme ve sinaptik uyarımlar esnasında, sinaps arasında glutamat asenkron sürümü) filtre katkıda bulunan tüm faktörlerin TBOA varlığı etkilendiği olası değildir çünkü bu varsayım makul görünüyor.
FSTCs ve FTCs gelen glutamat boşluk dalga kaynaklanan, biz bilgi iki farklı edinin. FSTCs analiz ederek, biz zaman ölçmek olduğunu astrocytik membran sinaps serbest glutamat maruz kalmaktadır. Tam saha UV aydınlatma ile FTCs çağrıştıran tarafından (tüm astrositik yüzey üzerinde glutamat uncaging tarafından yani), biz astrositik membranlar Uncaged glutamat maruz kaldığı zaman ölçmek. Bu deneylerdeki tüm uncaging glutamat moleküllerinin aynı zamanda (yani Uncaged) serbest bırakılır ve tüm taşıyıcıları aynı glutamat konsantrasyonu ile aynı anda aktif hale gelir. Bu nedenle, FTCs analiz ederek, biz astrositik glutamat alımı kapasitesinin dolaylı bir okuma elde edebilirsiniz.
Bu yöntemleri glutamat boşluk değil, taşıyıcı akımları çağrıştıran glutamat konsantrasyonunun gerçek değerinin zaman ders tahmin izin burada açıklanan dikkat etmek önemlidir. Tahmini süre Tabii biz elektrofizyolojik erişim için astrositik membran tüm alanlarda glutamat boşluk sırasında tabii ki ortalama bir ölçü var, ne hiçbirastrositik zar 19 içinde farklı bölgelerde glutamat alımını heterojenite duyarlı t. Bu bilgiler, glutamat-duyarlı floresan gazetecilere 20 yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile elde edilecek daha olasıdır. Ancak, mevcut glutamat duyarlı gazetecilere nispeten dar dinamik aralıkları sergiliyorsa. Bu geçici glutamat konsantrasyonuna zamansal bilgileri ayıklamak için bu probların kullanımını sınırlayan, glutamat konsantrasyonu profili ve floresan sinyal arasında doğrusal olmayan bozulmalara neden olabilir. Bu nedenle, bir astrositik membran de glutamaterjik sinyallerin dinamiklerinin en kapsamlı anlayış alabilirsiniz tüm bu farklı yaklaşımları birleştirerek muhtemelen.
Özet olarak, burada sunulan yöntemleri astrositik membranlar de synaptically yayımlanan veya flash-Uncaged glutamat boşluk zaman ders tahmin etmek için kullanılabilir. Onlar değerli araçları sağlamak olduğunu caN, fizyolojik ve patolojik koşullar altında 21 hayvan türlerinin 14 ve beyin bölgelerinde, çeşitli gelişme 13 farklı aşamalarında hücre dışı alanda glutamat süresi tahmin etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme İntramural Araştırma Programı (NS002986) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. AS el yazması yazdı ve deconvolution analizi uygulanmıştır. JSD deconvolution analizi ilk versiyonunu geliştirdi ve metin yorumladı.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CGP52432 | Tocris | 1246 | |
(R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
DPCPX | Tocris | 439 | |
LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
MSOP | Tocris | 803 | |
NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).