Summary
אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.
Abstract
תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב - במקורי לאופנה הזנב - לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.
Introduction
תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי 1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר 2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה.
רוב ENS נגזר מברכה קטנה של מקור NCC מצינור מחנק העצבי (כלומר סביב הגבול למוח האחורי / חוט השדרה הפוטנציאלי) 4.אבות עצביים אלה מגיעים למעי הקדמי סביב היום העוברי (ה) 9.0 בעכברים ולאחר מכן להעביר caudally בתוך mesenchyme הבטן עד כ e15.0 ליישב את המעיים העובריים כולה. קבוצת משנה של קטין אבות עצביים במעי הגס הוא גם סיפקה ידי NCC עצם העצה, שיפלוש הבטן האחורית בכיוון ההפוך עד cecum 4. NCC שני מחנק ועצם העצה דורש מספר רב של הגירה, שגשוג, הישרדות ורמזי קידום בידול כדי להבטיח היווצרות של ENS מלא. בהקשר זה, מודלים של בעלי חיים - עכברים מהונדסים גנטי במיוחד - כבר סייעו בזיהוי של מספר ligands תאי החיוני: GDNF (גורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה),,, (חלבוני morphogenic עצם) BMPs אנדותלין-3 neurotrophin-3, Netrin , כמו גם סוניק וההודי קיפוד (ששש וIHH) 5-10. מתוכם, GDNF איתות דרך RET טירוזין קינאז רצפטור הטרנסממברני (Rearranged במהלך transfection) מוכר כהדואר נתיב הקריטי ביותר לאטרקציה והדרכתו של NCC ולבתוך הבטן העוברית. GDNF מופרש על ידי mesenchyme המעיים ויוצר שיפוע rosrrocaudal spatiotemporally מבוקר שהוא ישירות chemoattractive לNCC enteric, המבטא RET 11,12.
בין פונקציות אחרות, ENS מסדיר תנועה בתוך מערכת העיכול דרך האינטראקציה שלו עם שריר חלק שבדופן המעי. היעדרם של הגרעינים עצביים באזור הטרמינל של תוצאות המעי במחלת הירשפרונג: התכווצות טוניק של המגזר המושפע מוביל לחסימה, הצטברות במעלה הזרם של חומר מתעכל והתנפחות מסיבית של המעי והבטן. מחלת הירשפרונג מתרחשת כ אחד 5,000 לידה חי. דפוס הגירת rostro-הזנב של NCC enteric הוא האמין להיות הגורם העיקרי התורמים לאטיולוגיה של מחלת הירשפרונג. המעי הגס, הרחוק ביותר מהמקור הנודד NCC והחלק האחרון של bowel שאפשר לכבוש, הוא רגיש ביותר לפגמים בהיווצרות ENS. בהתאם לתפקיד המכריע שלה בהגירה NCC enteric, שיבוש איתות GDNF / RET הוא הגורם הגנטי הידוע העיקרי של מחלת הירשפרונג 13.
כדי ללמוד טוב יותר NCC ופיתוח ENS, אנחנו שנוצרנו קו מהונדס עכבר - בשם Gata4p [5KB]-GFP 14 - בי NCC נדידה מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בשלב הבא אנו שיכללתי לשעבר assay vivo נדידת תאים, מותאם מעבודה שפורסמה על ידי קבוצות אחרות 11,12,15, שכעת מאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כגון GDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שמירה על האתיקה
ניסויים מעורבים עכברים בוצעו בעקבות המועצה קנדית להנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולמניפולציה של בעלי חיים המשמשים במחקר רפואי. פרוטוקולים הנוגעים למניפולציה של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המוסד הרפואי מאוניברסיטת קוויבק במונטריאול (Comité Institutionnel דה ההגנה des ANIMAUX; מספר התייחסות 0512-R3-650-0513).
1. הכנת ג'לי קולגן
לעבוד בצורה סטרילית, מתחת למכסת מנוע בתרבית רקמה.
- הכן מלא 5x DMEM (המדיום החיוני שונה של הנשר) כולל אנטיביוטיקה סטנדרטית. ממיסים 3.37 גרם של אבקת DMEM ו0.925 גרם של NaHCO 3 ב20 מיליליטר מים. לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסף 2.5 מיליליטר של פניצילין 100x / סטרפטומיצין סטרילי ו25 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת סטרילי. חנות ב 4 ° C.
- על קרח, לערבב 800 μlשל קולגן פתרון (3.77 מ"ג / מיליליטר ב0.02 N חומצה אצטית, פילטר מעוקר), 600 μl של 5x DMEM המלא ו17 μl של 1 N NaOH. לדלל עם מים סטריליים כדי נפח סופי של 3 מיליליטר. כוללים גורמי גדילה רלוונטיים בתמהיל. אנו משתמשים בדרך כלל בGDNF 10 מיליליטר / ng כדי לעורר הגירת NCC enteric.
- הפקדה על 480 μl בכל טוב של שורה אחת בצלחת 24 גם. למנוע בועות. השורות שנותרו ניתן להשתמש כדי לבחון את השפעתם של גורמי גדילה אחרים על נדידת תאים.
- בואו קולגן פלמר שעה לפחות 1 בחממה סטרילית ב 37 ° C.
2. דיסקציה של בעלי חיים 16
- הגדרת הזדווגויות ולבדוק תקעי נרתיק למחרת בבוקר. E0.5 היום להיות בצהריים ביום תוסף הנרתיק נמצא, לבודד את הנקבה ולחכות 12 ימים עד E12.5.
- הרדימי עכברים בהריון עם isoflurane ולהרדים על ידי CO 2 שאיפה.
- לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את של הבטןקרובי משפחה ולפתוח את חלל הבטן עם מספריים לנתח.
- הסר את הרחם לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה קר כקרח PBS (פוספט שנאגרו מלוח). חותכים את הרחם באופן רוחבי בין נפיחויות deciduum פרט לבודד כל אתר השרשת עובר.
- עבודה על כל אתר השתלה בנפרד בצלחת פטרי עוד כוס מלאה PBS קר כקרח. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחי קנס כדי להסיר את שכבת השריר של הרחם.
- פתח את שק החלמון הקרביים וamnion כדי לחשוף את העובר. היזהר בעת ניתוק כלי הדם שהצטרף לעובר שק חלמון השליה / קרביים, כפי שהם שזורים במעיים מתפתחים.
- לנתק את ראשו של העובר בצוואר.
- הכנס מלקחיים סגורים בחלל הבטן של עובר, בדיוק מעל הכבד בצבע אדום הכהה ולתת את המלקחיים פתוחים של עצמו (להפסיק הפעלת לחץ) כדי להפוך את הפתיחה רוחבית בחלל הבטן. משוך כלפי מטה את המלקחיים נפתחו לעברהקצה האחורי של העובר כדי לפתוח את הבטן לחלוטין.
- תפוס את רקמת חיבור מאחורי הכבד ולמשוך את האומץ לצאת מהבטן, נזהר שלא לשבור את המעיים (המעי הגס מחובר אל פי הטבעת).
- חותכים את המעי הגס כדי לשחרר את האומץ משאר העובר. החתך יכול להיעשות בכל מקום לאורך המעי הגס. שומר לעצמנו את חלק הזנב למועד מאוחר יותר.
- להקניט את רקמת החיבור של cecum, ולאחר מכן את שאר קרבים. היזהר שלא לפצוע את המעיים תוך כדי כך.
- לחתוך את הכבד וקיבה (בסוף מקורי של המעי הדק), כמו גם את הכליה בינים ורכסים באיברי המין, אם חלקם בהווה.
- לבודד את המעי הדק. שוב, להיזהר שלא לקטוע את המעי. מעתה והלאה, את כיוון rosrrocaudal של רקמת המעי ניתן לעקוב באמצעות העקמומיות החדה ההווה בסוף מקורי. השאר את המעי הדק בPBS בטמפרטורת חדר למשך זמן קצר ביותר ככל האפשר לפניהםמצעים (ראה שלב 3.3).
- לבסוף, רשום את המספר של somites זנב לכל עובר כדי לקבוע את השלב של התפתחות עוברית באופן מדויק.
3. חתך של מעיים עובריים
- לפני שאמשיך עם ניתוחי עובר, להמס 1.5 agarose גרם ב100 מיליליטר PBS (פוספט שנאגרו מלוח) ולשמור ב50 ° C.
- יוצקים נמס agarose לתוך עובש הטבעה (למשל סגר 2 צינור microcentrifuge מיליליטר שנחתך לאורכו לבלו על 1/4 מהצינור בקיר). בואו agarose להתקרר כ 42-45 מעלות צלזיוס, זה צריך להיות חם מעט רק למגע.
- להטביע את המעי העוברי ממש לפני agarose מתמצק (זה יכול להיות מוערך עם טיפים מלקחיים ויתרחש סביב 36-38 מעלות צלזיוס). מחזיק את המעי עם מלקחיים עד הסוף מקורי המקופל, למשוך אותו באיטיות רבה דרך agarose לאורכו של העובש. זה עוזר לשמור על הבטן ישר ואילו ערכות agarose. שחרר את tלהנפיק ברגע שהיא מתחילה להתנגד מועברת. עקוב אחר הנטייה מקורי, הזנב של המעי.
- שים את התבנית במקרר 2-3 דקות, כדי להבטיח את agarose יש להגדיר לחלוטין.
- קח את agarose מהתבנית (על ידי הזזה מצינור Eppendorf פתח אותו). עם להב, להוציא את agarose העודף בשני הקצוות, ביצוע חתכים בניצב למעי.
- מדביקים את הסוף מקורי של המעי / agarose לחסום למטה על הבמה המתכת של microtome עם להב רוטט. חתוך את agarose העודף על הצדדים של בלוק המעי / agarose.
- עולה לבמת המתכת על חדר microtome הרוטט. במידת צורך, להתאים את הזווית של השלב כל כך המעי הוא אנכי ככל האפשר (ומכאן בניצב ללהב). כסה את הדגימה עם PBS קר כקרח. להביא את להב microtome עד כמה מילימטרים מתחת לפני שטח החיץ.
- הפוך 200 מיקרומטר vibratome רוחבי קיצוצים של מעי הזנב הכי קטן, על מנת להבטיח שדוארפרוסת agarose ach מכילה סעיף מעיים מלא.
4. תרבות של המעיים Explants
- בעדינות להפקיד את פרוסות מעי / agarose טרי חתוך שטוחות על גבי ג'ל קולגן עם מלקחיים, מניח פרוסה אחת לקראת אמצע היטב כל אחד.
- דגירה 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, ב5% CO 2 אווירה לחה, כדי לאפשר הגירה של NCC מתוך explant.
- קח את פרוסות המעי / agarose את ג'ל קולגן מאוד בעדינות עם מלקחיים. יש להיזהר שלא לגרום נזק לג'ל בהמשך.
- הימנע מלגעת בג'ל קולגן ישירות במהלך שלבי דגירה ולשטוף לאחר מכן על מנת להבטיח כי דפוס נדידת תאים אינו מופרע. לתקן עם 500 μl של PFA 4% (paraformaldehyde) (PBS) לכל שעה גם 1 בטמפרטורת חדר.
- החלף את מקבע עם 500 μl של DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS) לכל היטב דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף היטב כל אחד 3xעם 500 μl של PBS במשך 5 דקות.
- לצלם את תאי הניאון (ערוצי ה-GFP וDAPI) משובצים בג'ל קולגן בתוך היטב כל אחד.
5. ניתוח תמונה
אנחנו עשינו שימוש נרחב בImageJ 17 לעבד ולכמת את התמונות שנוצרו אחרי תרבות explant.
- התחל על ידי ההדמיה שקופית מיקרומטר בהגדלה זהה כמו תמונות תא ניאון. מדוד את אורכו של מיקרון אחד בפיקסלים (באמצעות כלי קו ישר).
- הגדר את קנה המידה (ניתוח / סט קנה מידה; קלט מספר הפיקסלים / מיקרון).
- לכל תצלום הקרינה ה-GFP, לשנות את פורמט תמונה לגוונים אפור 8 סיביות (Image/Type/8-bit).
- התאם עוצמת האות (תמונה / התאם / בהירות / ניגודיות).
- הפחת את רעשי רקע במידת צורך (תהליך / חיסור רקע; להתאים את רדיוס הכדור המתגלגל).
- הגדרת סף כדי להדגיש תאים וגושי תא (תמונה / התאם / סף),n להחיל קו פרשת מים לחלק את הגושים (תהליך / בינארי / פרשת מים).
- לנתח חלקיקים כדי לציין אזורים של עניין (ROI) וליצור סטטיסטיקות מספר התא (ניתוח / ניתוח חלקיקים; מינימום גודל קבוצה שלא לכלול פיקסלים שנותרו).
- להגדיר אפשרויות מדידה לכלול בקוטר של Feret (ניתוח / מדידות סט).
- קבוצת ROIs ולמדוד בכללותה כדי לקבוע בקוטר של Feret, אינדיקציה של תא התפשטות (ניתוח / כלים / מנהל ROI / מנהל ROI / למדוד יותר / או, אז מנהל ROI / הוסף ו).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הבאות הן נציג של מה שניתן להשיג עם הטכניקה שתוארה כאן (איור 1). השימוש בגורמי גדילה (כלומר GDNF) מגרה הגירה של NCC enteric מתוך explant המעיים ולג'ל קולגן-GFP-לבטא (איור 2). למרות שחלק מהתאים לצאת מexplant בהעדר גורמי גדילה, אלה הם בעיקר לא-GFP שכותרתו ויציינו את כניסתה הפסיבית. יש צורך להסיר את פרוסת המעיים מג'ל קולגן על מנת לרשום את התוצאות, כפי שהרקמה זו עדיין מאוכלסת בצפיפות על ידי תאי ניאון ואחרת היה להסתיר את התאים שוכבים בקולגן מתחת. כימות של תוצאות אלו מראה כי הרבה יותר תאים נמצאים בתוך ג'ל קולגן כאשר GDNF היא הווה, וכי הגירה פעילה מתרחשת (איור 3). אכן, תאים פסיביים נמצאים מייד מתחת explants, בקוטר של פרוסת מעיים, wher תאי EAS כי פעיל לפלוש ג'ל קולגן מתרחקים מנקודת המוצא שלהם ולהתפשט עוד יותר.
איור 1. סקירה של טכניקת תרבות explant.) אוכלוסייה אחידה של NCC enteric ניאון בתוך אזור המעי הדק הזנב משמש לייצור 200 explants μ-עבה. בר סולם:. 200 מיקרומטר ב ') בינוני התרבות המכיל קולגן מופקד ב24 גם צלחות והשאירו להתקשות במשך שעה 1. Vibratome פרוסות מעיים עובריים מוטבע agarose מופקדות על ג'לי (פרוסה אחת לכל היטב), וNCC enteric ניאון מותר להגר אל מחוץ לexplants במשך 3 ימים. פרוסות המריאו אז לפני ההדמיה התאים שפלשו לג'לי קולגן.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תא הגירה החוצה של explant המעיים ובתוך ג'ל קולגן. תאים שהגרו אל מחוץ לexplant מעיים במהלך הדגירה של 3 ימים בהעדר או הנוכחות של 10 ng / ml GDNF היו קבועה, מוכתמת בDAPI (כחול) וצילמה כדי להראות NCC-GFP שכותרתו enteric (ירוקה). הגדלה 70x. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. הקו המקווקו מייצג את הגודל המשוער ומיקום של explant לפני שהוא המריא ג'ל. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה. לחץ hבטרם לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. כימות של פוטנציאל הגירת NCC enteric. המספר וההתפשטות (בקוטר של Feret) של תאי GFP-לבטא הנודדים מתוך explants מעיים לאחר 3 ימים היה לכמת באמצעות תוכנת ImageJ 17. בשני המקרים, יש הבדל משמעותי בין תנאים שלא טופלו וטופלו GDNF לפי המבחן של סטודנט t (p <0.001; *). הקוטר הממוצע של פרוסות מעיים (קו שחור מנוקד: 260 מיקרומטר) נכלל להבחין בין כניסה הפסיבית והגירה פעילה. NT: שאינו מטופלים, n:. מספר explants מעובד לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר 11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפשר לנו לעבוד עם מספר סביר של תאים בסביבה מאוד לשחזור. ראוי לציין, ההתפלגות אחידה של NCC enteric ניאון בתוך אזור הזנב-ביותר של המעי הדק שממנו פרוסות explant נחתכות גם מאפשרת ניתוח של מספר מקטעים מבטן אחד (איור 1 א). יתר על כן, בהתחשב בכך ששניהם NCC ואקסונים enteric יכולים לצאת מהרקמה במבחנים כגון 11, נסיגה של explants בסוף תקופת התרבות מאפשר לנו להתמקד באופן בלעדי על NCC נודד.
רוב השלבים הקריטיים הותוו בטקסט הפרוטוקול, אולם כפי welfare של explant המעיים הוא בעל חשיבות עליונה לקבלת NCC הנודד בריא, טיפול מסוים יש לנקוט. אל תחשפו את הרקמות עוברי לשינויי טמפרטורה פתאומיים, במיוחד כאשר המעי מוטבע בagarose (שלב 3.3). ודא המעי הוא בטמפרטורת החדר וagarose מגניב ככל האפשר (אך עדיין נמס), כדי למנוע "בישול" הרקמה. Explant המעיים צריך לשגשג על ג'ל קולגן מלא מדיום התרבות, לעתים קרובות הגדלת גודל ונשפך החוצה של פרוסת agarose. אם explant מופיע לא בריא או גרוע מכך, נוטה למות במהלך דגירה, נסה להחליף את PBS עם תקשורת ותרבות בטמפרטורת חדר (M2 נאגר HEPES למשל או DMEM בתוספת 10% FBS) כדי לעזור לקיים אותו במהלך לנתיחה.
מגבלה העיקרית לגישה שלנו היא שהיא מסתמכת על הזמינות של קו עכבר הענקת תווית ניאון כדי נודדים NCC. בהיעדר משאבים כגון, נוגדנים נגד מ 'igrating NCC (למשל אנטי מיל או אנטי Sox10) יכול לשמש לתווית תאים שפלשו לג'ל קולגן. יתר על כן, בהתחשב בכך שמייקרו סביבת המעיים היא הרבה יותר מורכב מג'ל קולגן פשוט, תוצאות שהושגו עם במבחנה assay זה עלולות לחלוטין אינו משקפות את ההתנהגות של NCC enteric in vivo. ניסויים נוספים מעורבים הדמיה לחיות תאים מומלצים להעריך את ההתנהגות הזאת. זה גם ראוי לציין כי בנוסף לתפקידה כchemoattractant, GDNF ידוע כדי לקדם את ההתפשטות של נודדים 4 NCC enteric. המידה של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF שלנו היא בכך כנראה שילוב של נדידת תאים אמיתית והתפשטות תאים, בדומה לin vivo המנגנונים המובילים לקולוניזציה NCC של המעיים. אם הבחנה ברורה בין שני תהליכים אלה היא רצויה, התוספת של חוסם מחזור תא (לדוגמא 5438 AZD 18) בתקשורת ובתרבות יכולה להגביל את הניתוח לmigratio תאn.
טכניקה זו יכולה להיות מורחבת כדי לבדוק ligands השונים אחר תאי כמו גם מעכבים של מסלולי איתות ספציפיים, וכל צירוף בו. יכולות גם פוטנציאל להיות גזור רקמות אחרות ומחולק, המאפשרות המחקר של הגירת NCC במבנים רבים עובריים. בשילוב עם רומן ו / או זני עכבר מוטציה uncharacterized עם פגמים אפשריים בפיתוח NCC, ניתן ליישם הטכניקה שלנו במהירות מסך לליקויים בהתנהגות הגירה בתגובה לאירועי איתות ספציפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים דניס Flipo עצה עיבוד תמונה וניתוח, ודוד וו Silversides במעבדה שלו היה נוצר קו עכבר Gata4p [5KB]-GFP. מחקר במעבדה פילון ממומן על ידי CIHR, NSERC, FRQS וFRQNT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Table of specific reagents and equipment. |
|||
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
