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Neuroscience

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

doi: 10.3791/50709 Published: September 18, 2013

Summary

Presentiamo un ex vivo delle cellule saggio di migrazione che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione delle cellule della cresta neurale in presenza di vari fattori di crescita.

Abstract

Cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione transitoria e multipotenti cellule che proviene dal tubo neurale dorsale e migra ampiamente in tutto il vertebrato sviluppo dell'embrione. Oltre a fornire glia e neuroni periferici, NCC generare melanociti nonché la maggior parte dello scheletro cranio-facciale. Migrazione NCC e la differenziazione è controllata da una combinazione della loro origine assiale lungo il tubo neurale e la loro esposizione ai segnali extracellulari regionale distinti. Tale contributo di ligandi extracellulari è particolarmente evidente durante la formazione del sistema nervoso enterico (ENS), una complessa rete interconnessa di gangli neurale che controlla localmente (tra le altre cose) movimento intestinale muscolare e la motilità intestinale. La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina iniziale di NCC che intraprendere un lungo viaggio per colonizzare - in un rostrale alla moda caudale - l'intera lunghezza del futuro dell'intestino. Tra le varie vie di segnalazione noti perinfluenza enterico colonizzazione NCC, GDNF segnalazione / RET è riconosciuto come il più importante. Infatti, la secrezione controllata spatiotemporally della RET ligando GDNF dal mesenchima intestino è principalmente responsabile per l'attrazione e la guida di-RET esprimere enterico NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. Qui, descriviamo un ex vivo saggio migrazione cellulare, facendo uso di una linea di topi transgenici in possesso fluorescente NCC, che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, tra GDNF.

Introduction

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Cellule della cresta neurale (NCC) sono un tipo di cellula transitoria unica di vertebrati che si forma molti derivati ​​durante lo sviluppo embrionale. Questa popolazione di cellule si pone al confine della placca neurale, adiacente al ectoderma non-neurale 1. Durante neurulazione, piegatura dei luoghi placca neurale NCC lungo il bordo dorsale del tubo neurale formatura. NCC poi subire una transizione epitelio-mesenchimale, segregazione e la migrazione dal tubo neurale. NCC colonizzare varie strutture embrionali compresi il tratto digestivo dove formano l'intero sistema nervoso enterico (ENS), una rete interconnessa di gangli nervosi incorporato nella parete intestinale. Come recentemente rivisto 2,3, molti geni sono stati coinvolti nello sviluppo di questa intricata struttura.

La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina di NCC provenienti dal tubo neurale vagale (ossia circa il limite prospettico hindbrain / midollo spinale) 4.Questi progenitori neurali raggiungono il foregut intorno al giorno embrionale (e) 9.0 nei topi e poi migrano caudale all'interno del mesenchima intestino fino a circa e15.0 a colonizzare l'intero intestino embrionali. Un sottoinsieme minore di progenitori neurali colon è fornito anche da sacrale NCC, che invadono l'intestino posteriore in direzione opposta fino al cieco 4. Sia vagale e sacrale NCC richiedere più migrazione, proliferazione, sopravvivenza e spunti-differenziazione promuovere per garantire la formazione completa della ENS. A questo proposito, i modelli animali - topi geneticamente modificati, in particolare - sono state fondamentali per l'identificazione dei vari ligandi extracellulari essenziali: GDNF (glial cellule fattore neurotrofico derivato), dell'endotelina-3, neurotrofina-3, (proteine ​​morfogenetiche dell'osso) BMP, Netrin , così come Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Di questi, GDNF segnalazione attraverso il RET recettore transmembrana tirosin chinasi (Risistemato durante la transfezione), è riconosciuto come esimoe percorso più critico per l'attrazione e la guida di NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. GDNF è secreto dal mesenchima intestino e forma un gradiente rosrrocaudal controllato spatiotemporally che è direttamente chemoattractive a enterico NCC, che esprimono RET 11,12.

Fra le altre funzioni, l'ENS regola il movimento all'interno del tubo digerente attraverso la sua interazione con la muscolatura liscia della parete intestinale. Assenza di gangli nervosi nella regione terminale dei risultati intestinali nella malattia di Hirschsprung: contrazione tonica del segmento interessato conduce al blocco, l'accumulo a monte del materiale digerito e massiccia distensione dell'intestino e dell'addome. La malattia di Hirschsprung si verifica circa uno su 5.000 nati vivi. Il modello migratorio rostro-caudale enterico NCC si crede di essere il principale fattore che contribuisce alla eziologia della malattia di Hirschsprung. Il colon, più lontana dalla fonte di migrazione NCC e ultima porzione di bowel ad essere colonizzato, è più suscettibile a difetti nella formazione ENS. In conformità con il suo ruolo cruciale nella migrazione enterico NCC, interruzione del segnale GDNF / RET è la principale causa conosciuta genetica della malattia di Hirschsprung 13.

Per studiare meglio NCC e sviluppo ENS, abbiamo generato una linea di topi transgenici - chiamato Gata4p [5kb]-GFP 14 - in cui migratori NCC sono etichettati con la Green Fluorescent Protein (GFP). Abbiamo poi messo a punto un saggio ex vivo migrazione cellulare, adattato dal lavoro pubblicato da altri gruppi 11,12,15, che ora consente una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, quali GDNF.

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Protocol

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Dichiarazione etica

Gli esperimenti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti a seguito Canadian Consiglio di linee guida per la cura degli animali per la cura e la manipolazione di animali utilizzati nella ricerca medica. Protocolli che comportano la manipolazione di animali sono stati approvati dal comitato etico istituzionale dell'Università del Quebec a Montreal (Comité de Protection des institutionnel Animaux, il numero di riferimento 0512-R3-650-0513).

1. Preparazione di Collagene Gel

Lavorare in modo sterile, sotto una cappa di coltura tissutale.

  1. Preparare completa 5x DMEM (mezzo essenziale modificata di Eagle), compresi gli antibiotici standard. Sciogliere 3,37 g di polvere DMEM e 0,925 g di NaHCO3 in 20 ml di acqua. Sterilizzare passando attraverso un filtro di 0,22 micron. Aggiungere 2,5 ml di sterile 100x penicillina / streptomicina e 25 ml di siero fetale bovino sterile calore-inattivato. Conservare a 4 ° C.
  2. Sul ghiaccio, mescolare 800 mldi soluzione di collagene I (3,77 mg / ml in 0,02 N di acido acetico, sterilizzata per filtrazione), 600 ml di DMEM completo 5x e 17 ml di 1 N NaOH. Diluire con acqua sterile fino ad un volume finale di 3 ml. Includere i fattori di crescita rilevanti nel mix. Usiamo tipicamente GDNF a 10 ng / ml per stimolare la migrazione enterico NCC.
  3. Deposito di circa 480 microlitri in ciascun pozzetto di una singola riga in una piastra da 24 pozzetti. Evitare le bolle. Le righe rimanenti possono essere utilizzati per verificare l'effetto di altri fattori di crescita sulla migrazione cellulare.
  4. Sia il collagene polimerizzare almeno 1 ora in un incubatore sterile a 37 ° C.

2. Dissezione degli animali 16

  1. Impostare accoppiamenti e controllare i tappi vaginali la mattina successiva. Giorno E0.5 essendo mezzogiorno del giorno la spina vaginale si trova, isolare la femmina e attendere 12 giorni fino E12.5.
  2. Anestetizzare topi incinta con isoflurano e eutanasia da CO 2 inalazione.
  3. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Sollevare le s addomekin e aprire la cavità addominale con le forbici dissezione.
  4. Rimuovere l'utero in una piastra di Petri di vetro riempita con PBS freddo (soluzione salina tamponata con fosfato). Tagliare l'utero trasversalmente tra i singoli gonfiori deciduum per isolare ogni sito di impianto dell'embrione.
  5. Lavorare su ciascun sito separatamente impianto in un altro Petri piatto di vetro riempito con ghiaccio-freddo PBS. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sottile per rimuovere lo strato muscolare dell'utero.
  6. Aprire il sacco vitellino viscerale e amnion per rivelare l'embrione. Fare attenzione quando recidere i vasi sanguigni che unisce l'embrione alla placenta / viscerale sacco vitellino, in quanto si intrecciano con l'intestino in via di sviluppo.
  7. Tagliare la testa dell'embrione al collo.
  8. Inserire una pinza chiuse nella cavità addominale di un embrione, appena sopra il fegato di colore rosso scuro e lasciare le pinze aperto di sé (interrompere l'applicazione di pressione) per fare un'apertura trasversale nella cavità addominale. Tirare le pinze aperte versol'estremità posteriore dell'embrione per aprire completamente l'addome.
  9. Afferra il tessuto connettivo dietro il fegato e tirare le budella dell'addome, facendo attenzione a non rompere l'intestino (il colon è collegato al ano).
  10. Tagliare il colon per liberare le viscere dal resto dell'embrione. Il taglio può essere effettuato in qualsiasi posizione lungo il colon. Prenota la porzione di coda per più tardi.
  11. Giro fuori il tessuto connettivo dal cieco, poi il resto degli intestini. Fare attenzione a non ferire l'intestino, mentre farlo.
  12. Tagliare il fegato e stomaco (all'estremità rostrale del piccolo intestino), così come le mesonefro e creste genitali se alcuni sono presenti.
  13. Isolare l'intestino tenue. Anche in questo caso, fare attenzione a non stroncare l'intestino. Da ora in poi, l'orientamento rosrrocaudal del tessuto intestinale può essere rintracciato tramite la curvatura tagliente presente sulla fine rostrale. Lasciare il piccolo intestino in PBS a temperatura ambiente per il minor tempo possibile prima emBiancheria da letto (vedi punto 3.3).
  14. Infine, registrare il numero di somiti coda per ogni embrione per determinare con precisione lo stadio di sviluppo embrionale.

3. Sezionamento dei embrionali Intestino

  1. Prima di procedere con dissezioni embrione, sciogliere 1,5 g di agarosio in 100 ml di PBS (tampone fosfato salino) e mantenerlo a 50 ° C.
  2. Versare agarosio fuso in uno stampo embedding (ad esempio un chiuso 2 ml provetta che è stato tagliato longitudinalmente per asportare circa 1/4 della parete del tubo). Lasciare che il agarosio raffreddare a circa 42-45 ° C, dovrebbe essere solo leggermente caldo al tatto.
  3. Incorporare l'intestino embrionale poco prima delle solidifica agarosio (questo può essere valutata con una pinza punte e si verifica intorno a 36-38 ° C). Tenendo l'intestino con una pinza per la fine rostrale piegata, tirare molto lentamente attraverso l'agarosio lungo la lunghezza dello stampo. Ciò contribuisce a mantenere l'intestino diritto mentre i set di agarosio. Rilasciare il temettere appena comincia a resistere spostato. Tenere traccia dell'orientamento rostrale-caudale dell'intestino.
  4. Mettete lo stampo in frigorifero 2-3 minuti, al fine di garantire l'agarosio si è completamente impostato.
  5. Estrarre il agarosio dallo stampo (facendola scorrere fuori dal tubo Eppendorf aperto). Con una lama, estrarre l'agarosio eccesso ad entrambe le estremità, tagli perpendicolari per l'intestino.
  6. Incollare la fine rostrale dell'intestino / agarosio bloccare giù sul palco di metallo di un microtomo con lama vibrante. Tagliare il agarosio eccesso sui lati del blocco dell'intestino / agarosio.
  7. Montare la fase metallica sulla camera microtomo vibrante. Se necessario, regolare l'angolo della fase così l'intestino è più verticale possibile (quindi perpendicolare alla lama). Coprire il campione con PBS freddo. Portare la lama microtomo fino a pochi millimetri sotto la superficie buffer.
  8. Rendere 200 micron vibratome tagli trasversali dell'intestino caudale più a piccolo, assicurando che l'each fetta agarosio contiene una sezione intestinale completa.

4. Cultura intestinale espianti

  1. Depositare delicatamente il fresco tagliato a fette intestino / agarosio piatto sul gel di collagene con una pinza, ponendo una fetta verso la metà di ogni bene.
  2. Incubare 3 giorni a 37 ° C, in un umido 5% CO 2 atmosfera, per consentire la migrazione di NCC fuori l'espianto.
  3. Prendete le fette di intestino / agarosio il gel di collagene molto delicatamente con una pinza. Fate attenzione a non danneggiare il gel sotto.
  4. Evitare di toccare il gel di collagene direttamente durante le successive fasi di incubazione e lavaggio, al fine di assicurare che il modello migrazione cellulare non è disturbato. Fissare con 500 ml di 4% PFA (paraformaldeide) (in PBS) per pozzetto 1 ora a temperatura ambiente.
  5. Sostituire il fissativo con 500 ml di DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindolo) Soluzione (5 pg / ml in PBS) per pozzetto ed incubare 10 min a temperatura ambiente.
  6. Lavare ogni pozzetto 3xcon 500 microlitri di PBS per 5 min.
  7. Fotografare le cellule fluorescenti (canali GFP e DAPI) incorporati nel gel di collagene in ogni pozzetto.

5. Image Analysis

Abbiamo fatto ampio uso di ImageJ 17 per elaborare e quantificare le immagini generate dopo coltura espianto.

  1. Inizia l'immagine di un vetrino micrometrico allo stesso ingrandimento come le fotografie di cellule fluorescenti. Misurare la lunghezza di un micron in pixel (utilizzando lo strumento linea retta).
  2. Impostare la scala (Analyze / Set Scala, il numero di ingresso di pixel / micron).
  3. Per ogni fotografia fluorescenza GFP, modificare il formato dell'immagine a 8-bit in scala di grigi (Image/Type/8-bit).
  4. Regolare l'intensità del segnale (Foto / Regola / Luminosità / Contrasto).
  5. Sottrarre il rumore di fondo, se necessario (Process / Sottrarre sfondo, regolare il raggio della sfera di rotolamento).
  6. Impostare una soglia per evidenziare cellule e grumi di cellule (Immagine / Regola / Threshold), iln applicare uno spartiacque per dividere i cespi (Process / Binario / Watershed).
  7. Analizzare le particelle di specificare regioni di interesse (ROI) e generare statistiche numero di cellulare (Analizza / Analizza particelle; dimensione minima set di escludere pixel rimanenti).
  8. Impostare le opzioni di misura per includere il diametro di Feret (Analyze / Set Misure).
  9. Gruppo ROI e misurare nel suo complesso per determinare il diametro della Feret, un'indicazione di spread cella (Analisi / Strumenti / ROI Gestore / info / O, quindi il ROI Gestore / Aggiungi, e il ROI Gestore / Measure).

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Representative Results

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I seguenti risultati sono rappresentativi di quello ottenibile con la tecnica descritta qui (Figura 1). L'impiego di fattori di crescita (cioè GDNF) stimola la migrazione di GFP che esprimono enterico NCC dal espianto intestinale e nel gel di collagene (Figura 2). Sebbene alcune cellule escono espianto in assenza di fattori di crescita, questi non sono per lo GFP-etichettata e rappresentano entrata passiva. È necessario rimuovere la fetta intestinale dal gel di collagene per registrare i risultati, come questo tessuto è ancora fortemente popolata da cellule fluorescenti e altrimenti nascondere le cellule che si trovano nel collagene sotto. La quantificazione di questi risultati dimostrano che molte più cellule si trovano all'interno del gel di collagene quando GDNF è presente, e che la migrazione attiva avviene (Figura 3). Infatti, le cellule passivi si trovano immediatamente sotto gli espianti, all'interno del diametro di una fetta intestinale, wher cellule EAS che invadono attivamente il gel di collagene si allontanano dal loro punto di origine e diffondere ulteriormente.

Figura 1
Figura 1. Panoramica della tecnica cultura espianto. A) la popolazione uniforme della fluorescenza enterico NCC all'interno del piccolo intestino tenue regione caudale utilizzata per effettuare espianti 200 μ di spessore. Scale bar:. 200 micron B) Il mezzo di coltura contenente collagene è depositato in piastre da 24 pozzetti e lasciato indurire per 1 hr. Vibratome fette di intestini embrionali agarosio-embedded si depositano sulle gel (una fetta per pozzetto), e fluorescente enterico NCC possono uscire dalle espianti per 3 giorni. Le fette vengono poi tolti prima di imaging delle cellule che hanno invaso il gel di collagene.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Migrazione cellulare su espianto intestinale e nel gel di collagene. Celle migrato su un espianto intestinale durante l'incubazione di 3 giorni in assenza o in presenza di 10 ng / ml GDNF sono stati fissati, colorati con DAPI (blu) e fotografato per mostra GFP-etichettata enterica NCC (verde). 70X di ingrandimento. Scala bar: 100 micron. La linea tratteggiata rappresenta la dimensione approssimativa e la posizione del espianto prima che fosse tolto il gel. Clicca qui per ingrandire la figura. Clicca here per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Quantificazione del enterico potenziale migrazione NCC. Il numero e la diffusione (diametro di Feret) di cellule GFP che esprimono migrano su espianti intestinali dopo 3 giorni è stata quantificata utilizzando il software ImageJ 17. In entrambi i casi, vi è una differenza significativa tra le condizioni non trattati e GDNF trattati secondo il test t di Student (p <0,001; *). Il diametro medio di fette intestinali (linea tratteggiata nera: 260 micron) è stato incluso per distinguere tra voce passiva e migrazione attiva. Nt: non trattata, n. Numero di espianti trasformati Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

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Mostriamo come il nostro ex vivo espianto cultura tecnica può essere utilizzata per quantificare con precisione enterico migrazione potenziale NCC in presenza di GDNF. Tale quantificazione precisa è notevolmente semplificata ricorrendo a 200 micron di spessore sezioni vibratome budello invece di grandi pezzi di dimensioni approssimative, come descritto in precedenza 11,12,15. In effetti, questo ci permette di lavorare con un numero ragionevole di cellule in un ambiente altamente riproducibile. Da notare che la distribuzione uniforme della fluorescenza enterico NCC all'interno della regione caudale più a dell'intestino tenue da cui le fette sono tagliate espianto permette anche l'analisi di sezioni multiple da un singolo budello (Figura 1A). Inoltre, dato che sia enterico NCC e assoni possono uscire dal tessuto in tali dosaggi 11, il ritiro degli espianti al termine del periodo di coltura ci permette di concentrarci esclusivamente sul migratori NCC.

La maggior parte dei passaggi critici sono stati illustrati nel testo del protocollo, tuttavia, come il welfare della espianto intestinale è fondamentale per ottenere salute migrazione NCC, particolare attenzione dovrebbe essere presa. Evitare di sottoporre tessuti embrionali a sbalzi di temperatura, in particolare quando l'intestino è incorporato in agarosio (punto 3.3). Assicurarsi che l'intestino è a temperatura ambiente e l'agarosio più fresco possibile (ma ancora sciolto) per evitare di "cottura" il tessuto. L'espianto intestinale dovrebbe prosperare su gel di collagene medio riempito coltura, spesso aumentando in dimensioni e fuoriuscita della fetta agarosio. Se l'espianto appare malsano o, peggio, tende a perire durante l'incubazione, provare a sostituire il PBS con la cultura dei media a temperatura ambiente (ad esempio HEPES-buffered M2 o DMEM supplementato con 10% FBS) per contribuire a sostenere durante la dissezione.

Una limitazione importante del nostro approccio è che si basa sulla disponibilità di una linea di topi che conferisce un marcatore fluorescente per la migrazione NCC. In assenza di tale risorsa, un anticorpo contro migrating NCC (ad esempio anti-Ret o anti-Sox10) può essere utilizzato per etichettare le cellule che hanno invaso il gel di collagene. Inoltre, dato che l'intestino micro-ambiente è molto più complesso di un semplice gel di collagene, i risultati ottenuti con questo test in vitro potrebbe non riflettere interamente il comportamento di enterico NCC in vivo. Ulteriori esperimenti che coinvolgono live-cell imaging sono raccomandati per valutare questo comportamento. Si osserva inoltre che, oltre al suo ruolo di fattore chemiotattico, GDNF è noto per promuovere la proliferazione di migrazione enterico NCC 4. La misura dello enterico potenziale migrazione NCC in presenza di GDNF è quindi probabilmente un mix di vera migrazione e proliferazione cellulare, simile ai meccanismi in vivo portano alla NCC colonizzazione dell'intestino. Se una chiara distinzione tra questi due processi è desiderato, l'aggiunta di un inibitore del ciclo cellulare (ad es AZD 5438 18) in terreni di coltura può limitare l'analisi a migratio cellan.

Questa tecnica può essere espansa a testare vari altri ligandi extracellulari e inibitori di vie di segnalazione specifici, e qualsiasi combinazione di questi. Altri tessuti possono potenzialmente essere sezionati e sezionati, permettendo lo studio della migrazione NCC in molte strutture embrionali. Combinato con nuovi e / o non caratterizzate ceppi mutanti di topo con possibili difetti di sviluppo NCC, la nostra tecnica può essere applicata per lo screening rapido per carenze nel comportamento di migrazione in risposta ad eventi di segnalazione specifici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Denis Flipo per consigli elaborazione delle immagini e analisi, e David W. Silversides nel cui laboratorio è stata generata la linea di topi Gata4p [5kb]-GFP. La ricerca in laboratorio Pilon è finanziato dal CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM powder Wisent 219-010-XK  
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525  
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL  
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236  
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305  
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047  
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515  
Glass Petri dish VWR 89000-306  
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21  
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824  
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110  
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148  
DAPI Sigma-Aldrich D9564  

Table of specific reagents and equipment.

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References

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Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).More

Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

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