Summary
Se presenta un ensayo in vivo la migración ex célula que permite la cuantificación precisa de los nervios potencial de migración de células de la cresta entérica en la presencia de varios factores de crecimiento.
Abstract
Células de la cresta neural (CCN) son una población de células multipotentes transitoria y que se origina en el tubo neural dorsal y migra extensamente por todo el embrión de los vertebrados en desarrollo. Además de proporcionar la glía y neuronas periféricas, NCC generar los melanocitos, así como la mayor parte del esqueleto cráneo-facial. NCC la migración y la diferenciación está controlada por una combinación de su origen axial a lo largo del tubo neural y su exposición a las señales extracelulares regionalmente distintas. Tal contribución de ligandos extracelulares es especialmente evidente durante la formación del sistema nervioso entérico (ENS), una compleja red interconectada de los ganglios nerviosos que controla localmente (entre otras cosas) el movimiento del músculo intestinal y la motilidad intestinal. La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo inicial de NCC que emprenda un largo viaje con el fin de colonizar - en una rostral caudal a la moda - la longitud completa del intestino prospectivo. Entre varias vías de señalización que se sabe queinfluir en la colonización entérica NCC, GDNF señalización / RET es reconocido como el más importante. De hecho, la secreción espaciotemporalmente controlada del ligando RET GDNF por el mesénquima intestinal es el principal responsable de la atracción y la orientación de RET-expresando entérica NCC hacia y dentro del intestino embrionario. Aquí, se describe un ensayo ex vivo la migración celular, haciendo uso de una línea de ratón transgénico que posee la etiqueta fluorescente NCC, que permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, incluyendo el GDNF.
Introduction
Células de la cresta neural (CCN) son un tipo de célula transitoria única de vertebrados que forma muchos derivados durante el desarrollo embrionario. Surge Esta población de células en la frontera de la placa neural, adyacente al ectodermo no neurales 1. Durante la neurulación, la flexión de los lugares placa neural NCC lo largo del borde dorsal del tubo neural formando. NCC luego se someten a una transición epitelio-mesenquimal, segregar y migrar lejos del tubo neural. NCC colonizar diversas estructuras embrionarias, incluyendo el tracto digestivo donde forman todo el sistema nervioso entérico (ENS), una red interconectada de los ganglios nerviosos incrustado en la pared intestinal. Tan recientemente revisado 2,3, muchos genes han sido implicados en el desarrollo de esta intrincada estructura.
La mayor parte de la ENS se deriva de un pequeño grupo de NCC procedente del tubo neural vagal (es decir, en torno al límite prospectivo posterior del cerebro / médula espinal) 4.Estos progenitores neurales llegan al intestino anterior alrededor del día embrionario (e) 9.0 en ratones y luego migran caudalmente en el mesénquima intestinal hasta aproximadamente e15.0 colonizar todo el intestino embrionarias. Un subconjunto menor de progenitores neurales de colon también es proporcionada por sacra NCC, que invaden el intestino posterior en la dirección opuesta hasta el ciego 4. Tanto vagal y sacral NCC requiere múltiples migración, proliferación, supervivencia y diferenciación de las señales promotoras para asegurar la formación completa de la ENS. En este sentido, los modelos animales - especialmente ratones genéticamente modificados - han sido fundamentales para la identificación de varios ligandos extracelulares esenciales: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales), la endotelina-3, la neurotrofina-3, (proteínas morfogenéticas óseas) BMP, Netrina , así como Sonic y erizo indio (Shh y Ihh) 5-10. De éstos, el GDNF señalización a través de la RET receptor transmembrana tirosina quinasa (Reordenación durante la transfección) se reconoce como the vía más importante para la atracción y la orientación de NCC y dentro del intestino embrionario. GDNF es secretada por el mesénquima intestino y forma un gradiente de rosrrocaudal espaciotemporalmente controlado que es directamente quimioatrayentes para entérico NCC, que expresan RET 11,12.
Entre otras funciones, la ENS regula el movimiento en el tracto digestivo a través de su interacción con el músculo liso de la pared intestinal. Ausencia de los ganglios de los nervios en la región terminal de los resultados del intestino en la enfermedad de Hirschsprung: contracción tónica del segmento afectado conduce a la obstrucción, la acumulación de aguas arriba del material digerido y distensión masiva del intestino y el abdomen. La enfermedad de Hirschsprung ocurre aproximadamente uno de cada 5.000 nacidos vivos. Se cree que el patrón de migración rostro-caudal del entérica NCC siendo el principal factor que contribuye a la etiología de la enfermedad de Hirschsprung. El colon, más alejado de la fuente de la migración de NCC y última porción del bowel ser colonizado, es más susceptible a defectos en la formación ENS. De acuerdo con su papel crucial en la migración NCC entérica, la alteración de la señalización de GDNF / RET es la principal causa genética conocida de la enfermedad de Hirschsprung 13.
Para un mejor estudio de NCC y desarrollo ENS, hemos generado una línea de ratones transgénicos - llamado Gata4p [5 kb]-GFP 14 - en la que NCC migratoria están etiquetados con la proteína verde fluorescente (GFP). A continuación perfeccionado un ensayo ex vivo la migración celular, adaptado a partir de los trabajos publicados por otros grupos 11,12,15, que ahora permite la cuantificación precisa de entérica potencial de migración NCC en la presencia de varios factores de crecimiento, tales como el GDNF.
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Protocol
Declaración de Ética
Los experimentos con ratones se realizaron siguiendo Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices para el cuidado y la manipulación de los animales utilizados en la investigación médica. Protocolos que implican la manipulación de los animales fueron aprobados por el comité de ética institucional de la Universidad de Quebec en Montreal (Comité de Protección Institutionnel des Animaux; número de referencia 0512-R3-650-0513).
1. Preparación de geles de colágeno
Trabajar de forma estéril, bajo una campana de cultivo de tejidos.
- Preparar completa 5x DMEM (medio esencial modificado de Eagle) incluyendo antibióticos estándar. Disolver 3,37 g de polvo de DMEM y 0,925 g de NaHCO3 en 20 ml de agua. Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras. Añadir 2,5 ml de penicilina estéril 100x / estreptomicina y 25 ml de suero bovino fetal inactivado por calor estéril. Almacenar a 4 ° C.
- En el hielo, mezclar 800 lde la solución de colágeno I (3,77 mg / ml en 0,02 N de ácido acético, esterilizada por filtración), 600 l de DMEM completo 5x y 17 l de 1 N de NaOH. Se diluye con agua estéril a un volumen final de 3 ml. Incluya factores de crecimiento apropiados en la mezcla. Utilizamos típicamente GDNF a 10 ng / ml para estimular la migración NCC entérico.
- Depósito de unos 480 l en cada pocillo de una sola fila de una placa de 24 pocillos. Evite las burbujas. Las filas restantes se pueden utilizar para probar el efecto de otros factores de crecimiento sobre la migración celular.
- Deje que el colágeno se polimeriza al menos 1 hora en un incubador estéril a 37 ° C.
2. Disección de animales 16
- Configure los apareamientos y compruebe si hay tapones vaginales a la mañana siguiente. E0.5 Día siendo el mediodía del día en que el tapón vaginal se encuentra, aislar a la hembra y esperar 12 días hasta E12.5.
- Anestesie ratones preñados con isoflurano y la eutanasia por inhalación de CO2.
- Rocíe el ratón con etanol al 70%. Levante las s abdomenparientes y abrir la cavidad abdominal con tijeras de disección.
- Extirpar el útero en una placa de Petri de vidrio lleno de helado de PBS (solución salina tamponada con fosfato). Cortar el útero transversalmente entre hinchazones deciduum individuales para aislar cada sitio de la implantación del embrión.
- El trabajo en cada lugar de la implantación por separado en otra placa Petri de vidrio lleno de helado de PBS. Bajo un microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para eliminar la capa muscular del útero.
- Abra el saco vitelino visceral y amnios para revelar el embrión. Tener cuidado al cortar los vasos sanguíneos de unirse al embrión a la placenta / visceral del saco vitelino, a medida que se entrelazan con los intestinos en desarrollo.
- Cortar la cabeza del embrión en el cuello.
- Inserte un fórceps cerrados en la cavidad abdominal de un embrión, justo por encima del hígado y de color rojo oscuro y dejar que el fórceps abierto de sí mismo (dejar de aplicar presión) para hacer una abertura transversal en la cavidad abdominal. Saque las pinzas abiertas hacia abajoel extremo posterior del embrión para abrir el abdomen completamente.
- Coge el tejido conectivo detrás del hígado y tire de las tripas del abdomen, con cuidado de no romper el intestino (colon se une al ano).
- Cortar el colon para liberar las agallas del resto del embrión. El corte puede hacerse en cualquier lugar a lo largo del colon. Reserve la parte de cola para más adelante.
- Desentrañar el tejido conectivo desde el ciego, a continuación, el resto de los intestinos. Tenga cuidado de no herir los intestinos mientras lo hace.
- Cortar el hígado y el estómago (en el extremo rostral del intestino delgado), así como los mesonefros y crestas genitales si algunos son presente.
- Aislar el intestino delgado. Una vez más, tenga cuidado de no cortar el intestino. A partir de ahora, la orientación rosrrocaudal del tejido intestinal se puede seguir utilizando la fuerte curvatura presente en el extremo rostral. Deje el intestino delgado en PBS a temperatura ambiente durante un tiempo tan corto como sea posible antes de emRopa de cama (vea el paso 3.3).
- Por último, anote el número de somitas cola para cada embrión para determinar con precisión la etapa de desarrollo embrionario.
3. La sección del embrionarias Intestinos
- Antes de proceder con disecciones de embriones, se funden 1,5 g de agarosa en 100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y mantenga a 50 ° C.
- Vierta agarosa derretida en un molde de inclusión (por ejemplo, un tubo de microcentrífuga cerrado 2 ml que ha sido cortado a lo largo de extirpar aproximadamente 1/4 de la pared del tubo). Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 42-45 ° C, debe ser sólo ligeramente caliente al tacto.
- Incrustar el intestino embrionario justo antes de que se solidifique agarosa (esto se puede evaluar con fórceps consejos y 36-38 ° C ocurrir alrededor). Sosteniendo el intestino con fórceps por el extremo rostral plegada, tire de ella muy lentamente a través de la agarosa a lo largo de la longitud del molde. Esto ayuda a mantener el intestino recto, mientras que los conjuntos de agarosa. Suelte el temitir tan pronto como comienza a resistirse a ser movido. No pierda de vista la orientación rostral-caudal del intestino.
- Ponga el molde en la nevera 2-3 minutos, para asegurar que la agarosa se ha establecido por completo.
- Saque la agarosa del molde (deslizándolo fuera del tubo Eppendorf abierto). Con una hoja, sacar el exceso de agarosa en ambos extremos, haciendo cortes perpendiculares al intestino.
- Pegue el extremo rostral del intestino / agarosa bloquear abajo en la escena del metal de un microtomo con cuchilla vibrante. Recorte el exceso de agarosa de los lados del bloque delgado / agarosa.
- Montar el escenario de metal en la cámara de microtomo vibrante. Si es necesario, ajuste el ángulo del escenario para que el intestino es tan vertical como sea posible (por lo tanto perpendicular a la hoja). Cubra la muestra con helado de PBS. Traiga la hoja microtomo hasta unos pocos milímetros bajo la superficie de amortiguación.
- Hacer 200 micras vibratome transversales cortes de intestino-caudal más pequeño, lo que garantiza que el correoach rodaja de agarosa contiene una sección intestinal completa.
4. Cultura de intestinal explantes
- Depositar suavemente el rodajas delgado / agarosa recién cortadas plana sobre los geles de colágeno con pinzas, colocar una rebanada a la mitad de cada bien.
- Incubar 3 días a 37 ° C, en una atmósfera húmeda al 5% de CO 2, para permitir la migración de NCC fuera del explante.
- Tomar las rodajas delgado / agarosa el gel de colágeno muy suavemente con fórceps. Tenga cuidado de no dañar el gel a continuación.
- Evitar tocar el gel de colágeno directamente durante la incubación y de lavado de los pasos subsiguientes con el fin de garantizar que el patrón de la migración de células no sea perturbada. Fijar con 500 l de 4% de PFA (paraformaldehído) (en PBS) por pocillo 1 hora a temperatura ambiente.
- Reemplazar el fijador con 500 l de DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol) solución (5 mg / ml en PBS) por pocillo e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar cada pocillo 3xcon 500 l de PBS durante 5 min.
- Fotografía las células fluorescentes (canales GFP y DAPI) incrustados en el gel de colágeno dentro de cada pocillo.
5. Análisis de Imagen
Hemos hecho un amplio uso de ImageJ 17 para procesar y cuantificar las imágenes generadas después del cultivo de explante.
- Comience por imágenes de un micrómetro de diapositivas con la misma ampliación que las fotografías de células fluorescentes. Medir la longitud de una micra en píxeles (con la función Straight Line).
- Establecer la escala (Analizar / Set Escala; número de entrada de píxeles / micras).
- Para cada fotografía la fluorescencia de GFP, cambiar el formato de la imagen a escala de grises de 8 bits (Image/Type/8-bit).
- Ajusta la intensidad de la señal (Imagen / Ajustar / Brillo / Contraste).
- Reste el ruido de fondo si es necesario (Proceso / Restar fondo, ajustar el radio de la esfera rodante).
- Establecer un umbral para resaltar las celdas y los grupos de células (Imagen / Ajustar / Umbral), lan aplicar una cuenca para dividir a los grupos (Proceso / Binary / Cuenca).
- Analizar las partículas para especificar las regiones de interés (ROI) y generar estadísticas de número de células (Analizar / Analizar Partículas; mínimo el tamaño del conjunto de excluir píxeles restantes).
- Establecer opciones de medición para incluir el diámetro de Feret (Analizar / Medidas Set).
- Grupo ROI y medir en su conjunto para determinar el diámetro de la Feret, una indicación de la propagación de células (Analizar / Herramientas / ROI Gerente / Más / O, entonces Director de ROI / Agregar y ROI Gerente / Measure).
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Representative Results
Los siguientes resultados son representativos de lo que se puede obtener con la técnica descrita aquí (Figura 1). El uso de factores de crecimiento (es decir, GDNF) estimula la migración de expresión de GFP-entérica NCC fuera del explante intestinal y en el gel de colágeno (Figura 2). Aunque algunas células salen del explante en ausencia de factores de crecimiento, éstos en su mayoría no son GFP-etiquetados y representan la entrada pasiva. Es necesario quitar la rebanada intestinal desde el gel de colágeno con el fin de registrar los resultados, ya que este tejido es todavía muy poblada por células fluorescentes y de otro modo ocultar las células que se encuentran en el colágeno debajo. La cuantificación de estos resultados muestra que muchas más células se encuentran dentro del gel de colágeno cuando el GDNF está presente, y que la migración activa se lleva a cabo (Figura 3). De hecho, las células pasivas se encuentran inmediatamente debajo de los explantes, dentro del diámetro de una rodaja intestinal, dondequiera células eas que invaden activamente el gel de colágeno se alejan de su punto de origen y se extendió aún más.
Figura 1. Descripción general de la técnica de cultivo de explantes. Una) población uniforme de fluorescente entérico NCC dentro de la pequeña región intestino caudal usado para hacer 200 explantes μ de espesor. Barra de escala:. 200 m B) El medio de cultivo que contiene colágeno se deposita en placas de 24 pocillos y se deja endurecer durante 1 hora. Vibratome rebanadas de intestinos embrionarias de agarosa-incrustado se depositan sobre los geles (una rebanada por pocillo), y fluorescente entérico NCC se les permite migrar fuera de los explantes durante 3 días. Las rodajas son llevados antes de imágenes de las células que invadieron los geles de colágeno.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. La migración celular a cabo del explante intestinal y en el gel de colágeno. Las células que migraron de un explante intestinal durante la incubación de 3 días en la ausencia o presencia de 10 ng / ml de GDNF se fijaron, se tiñeron con DAPI (azul) y fotografiado a mostrar GFP-etiquetados entérica NCC (verde). Magnificación 70X. Barra de escala: 100 m. La línea de puntos representa el tamaño aproximado y la ubicación del explante antes de que fuera retirado del gel. Haga clic aquí para ver más grande la figura. clic here para ver la imagen más grande.
Figura 3. La cuantificación de la potencial migración entérica NCC. El número y la extensión (diámetro de Feret) de las células que expresan GFP que migran fuera de explantes intestinales después de 3 días se cuantificó utilizando el software ImageJ 17. En ambos casos, existe una diferencia significativa entre las condiciones de tratados y tratados con GDNF de acuerdo con la prueba de la t de Student (p <0,001, *). El diámetro medio de las rebanadas intestinales (Línea de puntos negro: 260 micras) se incluyó para distinguir entre la entrada pasiva y la migración activa. Nt: sin tratamiento, n:. Número de explantes transformados Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
Mostramos cómo nuestro vivo técnica de cultivo ex explante se puede utilizar para cuantificar con precisión entérica potencial de migración NCC en presencia de GDNF. Dicha cuantificación exacta es facilitada en gran medida por el uso de 200 micras de espesor secciones intestinales vibratome lugar de grandes piezas de tamaño aproximado, como se describe anteriormente 11,12,15. De hecho, esto nos permite trabajar con un número razonable de las células en un entorno altamente reproducible. De nota, la distribución uniforme de fluorescente entérico NCC dentro de la región-caudal mayor parte del intestino delgado a partir del cual se cortan las rebanadas de explantes también permite el análisis de múltiples secciones de un solo intestino (Figura 1A). Por otra parte, dado que tanto entérica NCC y axones pueden salir del tejido en tales ensayos 11, la retirada de los explantes al final del período de la cultura nos permite centrarnos exclusivamente en los NCC migratoria.
La mayoría de los pasos críticos se describen en el texto del protocolo, sin embargo, como la wBienestar del explante intestinal es fundamental para la obtención de sana NCC migración, en particular se debe tener cuidado. Evitar someter a los tejidos embrionarios a los cambios bruscos de temperatura, en particular cuando el intestino está incrustado en agarosa (paso 3.3). Asegúrese de que el intestino esté a temperatura ambiente y la agarosa lo más fresco posible (y aún así derretida) para evitar "cocinar" el tejido. El explante intestinal debe prosperar en el gel de colágeno lleno de medio de cultivo, a menudo aumentan de tamaño y se derrama de la rodaja de agarosa. Si el explante parece poco saludable o para mal, tiende a perecer durante la incubación, intente reemplazar el PBS con medios de cultivo a temperatura ambiente (por ejemplo, HEPES buffer M2 o DMEM suplementado con 10% FBS) para ayudar a sostener que durante la disección.
Una limitación importante de nuestro enfoque es que se basa en la disponibilidad de una línea de ratón que confiere un marcador fluorescente a la migración de NCC. En la ausencia de un recurso tal, un anticuerpo contra migrating NCC (por ejemplo, anti-Ret o anti-Sox10) se puede utilizar para marcar las células que invadieron el gel de colágeno. Por otra parte, dado que el intestino micro-medio ambiente es mucho más complejo que un gel de colágeno simple, los resultados obtenidos con este ensayo in vitro pueden no reflejar totalmente la conducta de los entérica NCC in vivo. Se recomiendan experimentos adicionales que implican imágenes de células vivas para evaluar este comportamiento. También es digno de mención que, además de su papel como un quimioatrayente, el GDNF es conocido por promover la proliferación de migrar entérico NCC 4. Nuestra medida de entérica potencial de migración NCC en presencia de GDNF es, pues, probablemente una mezcla de la verdadera migración celular y la proliferación celular, similar a los mecanismos in vivo que conducen a NCC colonización de los intestinos. Si se desea una clara distinción entre estos dos procesos, la adición de un bloqueador del ciclo celular (por ejemplo AZD 5438 18) en los medios de cultivo puede restringir el análisis a migratio celularn.
Esta técnica se puede ampliar para probar varios otros ligandos extracelulares, así como inhibidores de las vías de señalización específicas, y cualquier combinación de los mismos. Otros tejidos también pueden potencialmente ser disecados y seccionados, lo que permite el estudio de la migración NCC en muchas estructuras embrionarias. Combinado con novedoso y / o cepas de ratón mutantes no caracterizados con posibles defectos en el desarrollo del NCC, nuestra técnica se puede aplicar para detectar rápidamente las deficiencias en el comportamiento de la migración en respuesta a eventos de señalización específicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Denis Flipo consejo de procesamiento de imágenes y análisis, y David W. Silversides en cuyo laboratorio se generó la línea de ratón Gata4p [5 kb]-GFP. La investigación en el laboratorio Pilon es financiado por CIHR, NSERC, FRQS y FRQNT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Table of specific reagents and equipment. |
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References
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