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Biology

एक्सॉन कैद और व्यापक समानांतर अनुक्रमण द्वारा ट्यूमर नमूनों में दैहिक आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगा

Published: October 18, 2013 doi: 10.3791/50710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

Summary

हम बारकोड वाले डीएनए पुस्तकालयों और व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण द्वारा नैदानिक ​​ट्यूमर नमूनों में प्रमुख कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का पता लगाने के लिए बाद में संकरण आधारित एक्सॉन कब्जा की तैयारी का वर्णन है. लक्षित एक्सॉन अनुक्रमण इस प्रकार कम आवृत्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता उपज, उच्च throughput, कम लागत, और गहरी अनुक्रम कवरेज का लाभ प्रदान करता है.

Abstract

कुंजी oncogenic परिवर्तन का पता लगा और जांच करने के प्रयासों के कैंसर के रोगियों के लिए उचित उपचार की सुविधा के लिए मूल्यवान साबित किया है. उच्च throughput की स्थापना, व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण कई तरह के परिवर्तन की खोज सहायता प्राप्त की है. इस तकनीक के नैदानिक ​​और translational उपयोगिता बढ़ाने के लिए, प्लेटफार्मों उच्च throughput, लागत प्रभावी, और अपमानित या क्षतिग्रस्त डीएनए की छोटी मात्रा में उपज सकता है कि (FFPE) ऊतकों के नमूनों एम्बेडेड formalin-तय आयल के साथ संगत होना चाहिए. यहाँ, हम व्यापक समानांतर अनुक्रमण द्वारा ताजा जमे हुए और FFPE ट्यूमर में कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का पता लगाने के लिए लक्षित एक्सॉनों के संकरण के आधार पर कब्जा द्वारा पीछा बारकोड वाले और मल्टिप्लेक्स डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी का वर्णन है. इस विधि, अनुक्रम म्यूटेशन की पहचान के लिए सक्षम बनाता संख्या परिवर्तन की नकल, और सभी लक्षित जीन शामिल संरचनात्मक rearrangements का चयन करें. लक्षित एक्सॉन अनुक्रमण टी प्रदान करता हैवह इस प्रकार कम आवृत्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान करने, उच्च throughput, कम लागत, और गहरी अनुक्रम कवरेज के लाभ.

Introduction

कुंजी ओंकोजीन और ट्यूमर शमन जीनों में "ड्राइवर" ट्यूमर आनुवंशिक घटनाओं की पहचान कई तरह के कैंसर 1 के निदान और उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. व्यापक समानांतर "अगली पीढ़ी" अनुक्रमण का उपयोग बड़े पैमाने पर अनुसंधान के प्रयासों से हाल के वर्षों 2 में कई तरह के कैंसर से जुड़े जीन की पहचान के लिए सक्षम है. हालांकि, इन अनुक्रमण प्लेटफार्मों आम तौर पर इस प्रकार इस तरह के (FFPE) ट्यूमर के नमूनों एम्बेडेड formalin-तय आयल के रूप में संरक्षित ऊतकों से डीएनए उत्परिवर्तन निस्र्पक और विश्लेषण करने में एक प्रमुख सीमा खड़ी, ताजा जमे हुए ऊतकों से अलग डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. कुशलतापूर्वक और मज़बूती से FFPE ट्यूमर के नमूनों से "कार्रवाई योग्य" जीनोमिक जानकारी के लिए चिह्नित करने के लिए सुधार के प्रयासों को पहले से बैंकिंग नमूनों की पूर्वव्यापी विश्लेषण कर सकें और आगे कैंसर के प्रबंधन के लिए व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए प्रोत्साहित करेंगे.

परंपरागत रूप से, आणविक डीiagnostic प्रयोगशालाओं में इस तरह के डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए सेंगर अनुक्रमण और रियल टाइम पीसीआर के रूप में समय लेने वाली, कम throughput के तरीके पर भरोसा किया है. हाल ही में, मल्टिप्लेक्स पीसीआर या बड़े पैमाने पर spectrometric जीनोटाइपिंग उपयोग उच्च तरीकों कुंजी कैंसर जीन 3-5 में बारम्बार दैहिक परिवर्तन की जांच के लिए विकसित किया गया है. इन तरीकों, तथापि, केवल predesignated "हॉटस्पॉट" परिवर्तन ट्यूमर शमन जीनों में निष्क्रिय परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त कर उन्हें, assayed रहे हैं कि में सीमित कर रहे हैं. व्यापक समानांतर अनुक्रमण आम और दुर्लभ दोनों परिवर्तन के लिए पूरे एक्सॉनों पूछताछ करने की क्षमता है, इस तरह की नकल संख्या लाभ और हानि के रूप में जीनोमिक परिवर्तन की अतिरिक्त कक्षाएं प्रकट करने की क्षमता है, और विषम नमूने 6, में अधिक से अधिक संवेदनशीलता का पता लगाने सहित इन रणनीतियों पर कई लाभ प्रदान करता है 7 . यह सापेक्ष है, हालांकि पूरे जीनोम अनुक्रमण, उत्परिवर्तन की खोज के लिए सबसे व्यापक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता हैly महंगी और डेटा विश्लेषण और भंडारण के लिए बड़े कम्प्यूटेशनल मांगों incurs.

जीनोम का केवल एक छोटा सा अंश नैदानिक ​​ब्याज की हो सकती है, जहां नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए, अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में दो विशेष नवाचारों परिवर्तनकारी किया गया है. सबसे पहले, संकरण आधारित एक्सॉन कब्जा के माध्यम से, एक, लक्षित उत्परिवर्तन रूपरेखा 8 कुंजी कैंसर से जुड़े जीन को इसी डीएनए को अलग कर सकते हैं. दूसरा, आणविक बारकोड (यानी डीएनए अनुक्रम की लंबाई में 6-8 nucleotides) के बंधाव के माध्यम से, एक अनुक्रमण रन प्रति नमूने के सैकड़ों पूल सकते हैं और पूरी तरह से व्यापक समानांतर अनुक्रमण यंत्र 10 की बढ़ती क्षमता का लाभ ले. संयुक्त, इन नवाचारों छोटे कम्प्यूटेशनल जरूरतों 11 के साथ, कम लागत के लिए प्रोफाइल किए गए ट्यूमर सक्षम और उच्च throughput पर. इसके अलावा, विशेष रूप से आवेदन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है केवल उन जीनों को अनुक्रम कवरेज redistributing द्वारा, एक achie कर सकते हैंकम एलील की आवृत्ति की घटनाओं के लिए उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए अधिक से अधिक अनुक्रमण गहराई लिया.

यहाँ हम (सभी प्रोटीन कोडिंग exons कब्जा और 279 कुंजी कैंसर से जुड़े जीन का इंट्रोन्स चयन करने के लिए कस्टम oligonucleotides का उपयोग संकरण द्वारा बारकोड वाले अनुक्रम पुस्तकालय ताल पर एक्सॉन कब्जा इस्तेमाल करता है जो हमारे प्रभाव परख (कार्रवाई कैंसर लक्ष्य की एकीकृत उत्परिवर्तन रूपरेखा), वर्णन तालिका 1 ). इस रणनीति के म्यूटेशन, indels, प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन की पहचान के लिए सक्षम बनाता है, और इन 279 जीनों को शामिल संरचनात्मक rearrangements का चयन करें. हमारे विधि ताजा जमे हुए और FFPE ऊतक के रूप में अच्छी तरह से ठीक सुई रेस्पायरेट्रस और अन्य कोशिका विज्ञान नमूनों दोनों से अलग डीएनए के साथ संगत है.

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Protocol

1. डीएनए और अभिकर्मक तैयार

नोट: इस प्रोटोकॉल 24 नमूने (जैसे 12 ट्यूमर / सामान्य जोड़े) के एक साथ प्रोसेसिंग और विश्लेषण का वर्णन करता है लेकिन छोटे और बड़े समूहों के लिए अनुकूलित किया जा सकता. डीएनए के नमूने FFPE या ताजा जमे हुए ऊतक, कोशिकाविज्ञान नमूनों, या रक्त से प्राप्त कर सकते हैं. आमतौर पर, एक ही रोगी से ट्यूमर और सामान्य ऊतकों दोनों विरासत में मिला बहुरूपताओं से दैहिक परिवर्तन भेद करने के क्रम में एक साथ profiled किया जाएगा. प्रोटोकॉल तुरंत डीएनए निकासी के बाद शुरू होता है.

  1. विभाज्य 50-250 एनजी 1x Tris-EDTA में पतला नमूना प्रति निकाले डीएनए, (8.0 पीएच) अलग Covaris दौर नीचे ट्यूबों में, 50 μl के अंतिम मात्रा के लिए बफर के (250 की सिफारिश की एनजी).
  2. 10 कर्तव्य कारक, 175 रंज, और फट प्रति 200 चक्र में 360 सेकंड: निम्नलिखित कतरनी सेटिंग्स पर Covaris E220 साधन पर डीएनए कतरनी.
  3. कमरे के तापमान को AMPure XP मोती (तालिका 2) पिघलना. सभी बू पिघलनापिछले उचित कदम को बर्फ पर ffers और एंजाइमों.

2. पुस्तकालय तैयारी - अंत मरम्मत मॉड्यूल

  1. नमूना प्रति निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग कर एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में अंत मरम्मत मास्टर मिश्रण तैयार: 10x NEBNext अंत मरम्मत प्रतिक्रिया बफर (तालिका 2) के 10 μl, 5 μl NEBNext समाप्ति एनजाइम मिक्स (तालिका 2) मरम्मत, 35 μl बाँझ nuclease मुक्त एच 2 ओ
  2. एक 96 अच्छी तरह से थाली की अलग कुओं में प्रत्येक sheared डीएनए के 50 μl विभाज्य. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए तैयार अंत मरम्मत मास्टर मिश्रण के 50 μl जोड़ें. 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक thermocycler में सेते

3. पोस्ट समाप्ति मरम्मत क्लीन अप

  1. प्रत्येक नमूने के AMPure XP मोती (तालिका 2) की 2x मात्रा (200 μl) जोड़ें और धीरे से एक multichannel pipettor का उपयोग ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट. 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  2. चुंबकीय स्टैंड (2 टेबल पर रखें
  3. धीरे हटाने और मोती को परेशान करने की नहीं स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला देखभाल त्यागें. कुछ तरल कुओं में रह सकती है.
  4. स्टैंड पर ट्यूबों के साथ, धीरे प्रत्येक नमूने के हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने के लिए और 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं. ध्यान से, पिपेट द्वारा इथेनॉल हटा दें.
  5. 2 इथेनॉल washes के एक कुल के लिए, चरण 5 दोहराएँ. सुनिश्चित करें सभी इथेनॉल निकाल दिया गया है. चुंबकीय स्टैंड से निकालें और 5 मिनट के लिए आरटी पर सूखी.
  6. 44.5 μl बाँझ एच 2 ओ के साथ सूखे मोती Resuspend धीरे, पिपेट पूरी मात्रा ऊपर और नीचे 10x अच्छी तरह से मिश्रण. सुनिश्चित मोतियों को अब अच्छी तरह से पक्ष से जुड़े होते हैं.
  7. 2 मिनट के लिए आरटी पर resuspended मोती सेते हैं. नमूना स्पष्ट दिखाई देता है जब तक 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें.
  8. धीरे से एक नया अच्छी तरह से करने के लिए नमूना युक्त स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला के 42 μl हस्तांतरण.
    प्रक्रिया सुरक्षित रूप से इस सेंट पर रोका जा सकता हैईपी और अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों. , पुनः आरंभ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर जमे हुए नमूने पिघलना करने के लिए.

4. पुस्तकालय तैयारी - दा पीछा मॉड्यूल

  1. 10x NEBNext दा पीछा प्रतिक्रिया बफर (तालिका 2), 3 μl (3'-5 'Exo-) Klenow टुकड़ा (तालिका 2 की 5 μl: नमूना प्रति निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग कर एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में महंगाई भत्ते पीछा मास्टर मिश्रण तैयार ).
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से अंत मरम्मत डीएनए के 42 μl युक्त करने के लिए तैयार दा पीछा मास्टर मिश्रण 8 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक thermocycler में सेते
  3. दा पीछा एक के बाद प्रदर्शन करना साफ हुआ: दोहराएँ 33.75 μl के अंतिम मात्रा के लिए बाँझ एच 2 ओ में 2x मोतियों की मात्रा (100 μl), लेकिन resuspend का उपयोग 3.1-3.8 कदम.
    प्रक्रिया सुरक्षित रूप से इस कदम और अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों को रोका जा सकता है. , पुनः आरंभ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर जमे हुए नमूने पिघलना करने के लिए. </ ली>

5. पुस्तकालय तैयारी - एडाप्टर Ligation मॉड्यूल

  1. 5x NEBNext त्वरित Ligation प्रतिक्रिया बफर (न्यू इंग्लैंड Biolabs, तालिका 2), 5 μl त्वरित टी -4 डीएनए ligase (तालिका 2) के 10 μl: नमूना प्रति निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग कर एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में Ligation मास्टर मिश्रण तैयार करें.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से डीए पूंछ डीएनए युक्त करने के लिए Ligation मास्टर मिश्रण के 15 μl जोड़ें.
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए उपयुक्त 25 माइक्रोन NEXTflex बारकोड वाले अनुकूलक (तालिका 2) के 1.25 μl जोड़ें. प्रत्येक नमूना एक अलग बारकोड वाले एडाप्टर प्राप्त करना चाहिए. 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक thermocycler में सेते
  4. 50 μl के अंतिम मात्रा के लिए बाँझ एच 2 ओ में दोहराने मोतियों की 1x मात्रा (50 μl) का उपयोग करते हुए 3.1-3.8 कदम है, लेकिन resuspend: एक के बाद एडाप्टर बंधाव साफ हुआ प्रदर्शन करना.
  5. दोहराएँ एक दूसरे 1x मात्रा (50 μl) सफाई के लिए 3.1-3.8 कदम है, लेकिन एक बाँझ एच में Resuspend 2 हे23 μl के अंतिम मात्रा.
    प्रक्रिया सुरक्षित रूप से इस कदम और अप करने के लिए 7 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों को रोका जा सकता है. , पुनः आरंभ आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर जमे हुए नमूने पिघलना करने के लिए.

6. लाइब्रेरी प्रवर्धन

  1. 25 μl 2x KAPA HiFi एच एस आर एम (तालिका 2), 1 μl 100 माइक्रोन प्राइमर 1 और प्राइमर 2 (तालिका 3) के प्रत्येक: नमूना प्रति निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग कर एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में KAPA HiFi मास्टर मिश्रण तैयार करें.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से बंधाव उत्पाद युक्त करने के लिए मास्टर मिश्रण के 27 μl जोड़ें. 50 μl विंदुक सेट और धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट.
  3. निम्नलिखित पीसीआर चक्र के लिए thermocycler में जगह: 98 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड की प्रारंभिक विकृतीकरण, 98 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड में 15 सेकंड के 10 चक्र, 30 72 डिग्री सेल्सियस पर सेकंड, और 1 मिनट के अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस पर
  4. एक के बाद प्रवर्धन सफाई के लिए प्रदर्शन: दोहराएँ का उपयोग 3.1-3.8 कदमों1x AMPure XP मोती की मात्रा (50 μl), और 30 μl के अंतिम मात्रा के लिए बाँझ पानी में Resuspend.
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Qubit व्यापक रेंज परख (जीवन टेक्नोलॉजीज, 2 टेबल) का उपयोग करते हुए प्रत्येक पुस्तकालय की एकाग्रता यों.

7. Roche NimbleGen SeqCAP ईज़ी लाइब्रेरी संकरण, धो, और प्रवर्धन

  1. बर्फ पर पिघलना सार्वभौमिक और सूचकांक oligonucleotide ब्लॉकर्स (तालिका 3), SeqCap ईज़ी लाइब्रेरी, और NimbleGen कब्जा घटकों (खाट डीएनए, 2x संकरण बफर, और संकरण घटक ए, 2 टेबल). सभी oligonucleotide ब्लॉकर्स 1 मिमी का काम कर रहे शेयरों में जमा हो जाती है. हमारे SeqCap ईज़ी लाइब्रेरी अन्य कस्टम और सूची डिजाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है, 279 कैंसर से जुड़े जीन के सभी प्रोटीन कोडिंग exons को शामिल कब्जा जांच की एक कस्टम डिजाइन पूल है.
  2. विशिष्ट बारकोड वाले विज्ञापन को इसी सूचकांक oligonucleotide ब्लॉकर्स के एक 1 मिमी पूल तैयार करेंपुस्तकालय तैयारी में इस्तेमाल किया aptor दृश्यों. 1 प्रत्येक अवरोधक के μl, और भंवर का मिश्रण.
  3. एक नए बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में, 1mg/ml खाट डीएनए के 5 μl, 1 मिमी यूनिवर्सल अवरोधक के 2 μl और सूचकांक oligonucleotide ब्लॉकर्स के 1 मिमी पूल के 2 μl जोड़ें.
  4. एक ही प्रतिक्रिया में पूल 24 बारकोड वाले पुस्तकालयों. कब्जा मिश्रण करने के लिए (ऊपर) तैयार जमा, बारकोड वाले अनुक्रम पुस्तकालय की 1-3 ग्राम की कुल जोड़ें. 24 नमूने लिए, नमूना प्रति 100 एनजी की सिफारिश की है. ट्यूमर और मिलान सामान्य नमूनों को एकत्रित करते हैं, तो हम वे कवरेज के अधिक से अधिक गहराई तक अनुक्रम रहे हैं कि इतनी अधिक ट्यूमर पुस्तकालय (ट्यूमर और सामान्य प्रति 50 एनजी प्रति जैसे 100 एनजी) जोड़ने की सिफारिश की.
  5. ट्यूब की टोपी को बंद करें और एक 18-20 जी या छोटे सुई के साथ टोपी के शीर्ष में 15-20 छेद कर. स्पीड Vac उच्च गर्मी (60 डिग्री सेल्सियस) पर एक डीएनए शून्य concentrator में परिलक्षित नमूना पुस्तकालय / खाट डीएनए / oligos.
  6. एक बार पूरी तरह से नीचे सूखे, 2x hybridi के 7.5 μl के साथ rehydratezation बफर और संकरण घटक ए के 3 μl ट्यूब अब निम्न होना चाहिए: 5 ग्राम खाट डीएनए, चर ग्राम परिलक्षित नमूना पुस्तकालय, यूनिवर्सल और सूचकांक oligos के 1000 pmol, 7.5 μl 2x संकरण बफर, एक में 3 μl संकरण घटक एक 10.5 μl की कुल मात्रा.
  7. प्रयोगशाला टेप का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ टोपी में छेद को कवर. भंवर 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए नमूना.
  8. आरटी पर 10 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर centrifugation द्वारा पीछा डीएनए denature को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं.
  9. एक नया 0.2 मिलीलीटर पीसीआर पट्टी ट्यूब में, SeqCap ईज़ी लाइब्रेरी कब्जा जांच और बाँझ nuclease मुक्त एच 2 ओ के 2.25 μl के 2.25 μl विभाज्य तैयार करने और कदम 7.7 की सामग्री जोड़ें. धीरे से ऊपर और नीचे 10x पूरी मात्रा पिपेट.
  10. 48-96 घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल cycler में सेते हैं. सेट और 57 डिग्री सेल्सियस के थर्मल cycler के ढक्कन तापमान बनाए रखने के
  11. Folधोने और कब्जा कर लिया डीएनए की वसूली के लिए NimbleGen SeqCap EX लाइब्रेरी एसआर उपयोगकर्ता के गाइड v3.0 (तालिका 2) के अध्याय 6 में कम चरणों.
  12. निम्नलिखित संशोधनों के साथ कब्जा कर लिया डीएनए के प्रवर्धन के लिए Roche NimbleGen प्रोटोकॉल के अध्याय 7 में कदम इस प्रकार है:
    • बजाय Phusion उच्च फिडेलिटी पीसीआर मास्टर मिक्स की 2x KAPA HiFi पोलीमरेज़ (तालिका 2) का प्रयोग करें
    • 3 तालिका में सूचीबद्ध 100 माइक्रोन प्राइमर 1 और प्राइमर 2 का प्रयोग करें.
    • 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण, 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 11 चक्र, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार: निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों भागो . 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़
  13. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Qubit उच्च संवेदनशीलता परख (तालिका 2) का उपयोग परिलक्षित कब्जा कर लिया डीएनए की एकाग्रता यों.
  14. Agilent जैव का उपयोग कर लिया डीएनए गुणवत्ता का विश्लेषणविश्लेषक डीएनए एचएस चिप (तालिका 2) निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
    • पीसीआर उपज कम से कम 100 एनजी (रेंज 100-1,000 एनजी) होना चाहिए.
    • औसत टुकड़ा लंबाई 150-400 आधार जोड़े के बीच होना चाहिए.

8. Illumina हाय Seq अनुक्रमण

  1. दोपहर 2 बजे तक परिलक्षित कब्जा कर लिया डीएनए पतला, और एक Illumina HiSeq 2000 प्रवाह सेल का एक सिंगल लेन पर नमूना लोड. अनुक्रम बनती अंत में 75 आधार जोड़ी निर्माता के निर्देशों के अनुसार पढ़ता है. हमारे अनुभव में, एक लेन 24 नमूनों का एक पूल के लिए 279 जीनों भर नमूना प्रति 500-700x अद्वितीय अनुक्रम कवरेज का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है.
  2. Illumina सॉफ्टवेयर (रियल टाइम विश्लेषण) कॉल और गुणवत्ता स्कोर के आधार पर करने के लिए क्लस्टर तीव्रता को उच्च संकल्प छवियों में बदल जाएगा. बारकोड पहचान के अनुसार डेटा demultiplex और प्रत्येक नमूने के लिए व्यक्तिगत FASTQ फाइल उत्पन्न करने के casava का प्रयोग करें.

9. डाटा गुदाysis

  1. अनुक्रम के 3 'अंत से ट्रिम एडाप्टर दृश्यों Cutadapt (का उपयोग FASTQ फाइलों में पढ़ता http://code.google.com/p/cutadapt/ ). न्यूनतम ओवरलैप लम्बाई (हे) 1% की एक त्रुटि दर (ए) के साथ 3 है. बनती की अवधारण के लिए न्यूनतम आधार लंबाई 25 है trimming के बाद पढ़ता है.
  2. संरेखित अनुक्रम बिल व्हीलर Aligner उपकरण (बीडब्ल्यूए) 12 का उपयोग संदर्भ मानव जीनोम hg19 को पढ़ता है. उनके मानक सर्वोत्तम प्रथाओं के अनुसार (जीनोम विश्लेषण टूलकिट (GATK) का उपयोग अंकन डुप्लिकेट, स्थानीय कई अनुक्रम फिर से संगठित करना, और आधार गुणवत्ता स्कोर recalibration सहित बाद के प्रसंस्करण के चरणों को पूरा http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? = सर्वोत्तम प्रथाओं का नाम ) 13. एक ही रोगी से कई नमूने (जैसे मिलान किया ट्यूमर और सामान्य) जब रूपरेखा, स्थानीय कई अनुक्रम फिर से संगठित करना कामकाज होना चाहिएसंयुक्त रूप से मेड. इन पोस्ट प्रसंस्करण कदम का उत्पादन सभी अनुक्रम, गुणवत्ता, और संरेखण जानकारी होती है और पढ़ता है और अनुक्रम 14 वेरिएंट के दृश्य के लिए एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (IGV) में सीधे लोड किया जा सकता है, जो प्रत्येक नमूने, के लिए एक अलग बेम फ़ाइल है.
  3. पिकार्ड उपकरण का उपयोग कर अनुक्रम प्रदर्शन मीट्रिक की गणना ( http://picard.sourceforge.net/ ). जानकारीपूर्ण मेट्रिक्स संरेखण दर, टुकड़ा आकार के वितरण, जीसी सामग्री जुड़े कवरेज पूर्वाग्रह, पर लक्ष्य कब्जा विशिष्टता, पीसीआर नकल दर, पुस्तकालय जटिलता, और लक्ष्य कवरेज मतलब शामिल हैं. प्रतिनिधि मूल्यों चित्र 1 में प्रदर्शित कर रहे हैं. GATK से DepthOfCoverage उपयोग कर की गणना आम बहुरूपता स्थलों पर एलील आवृत्तियों असंबंधित डीएनए से संदूषण की निगरानी करने के लिए और कहा कि मिलान कर नमूने एक ही रोगियों से आया था सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    निम्नलिखित कम्प्यूटेशनल विश्लेषण मिलान किया की उपस्थिति पर निर्भरदैहिक आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के लिए ट्यूमर और सामान्य नमूनों. बेजोड़ ट्यूमर भी एक अलग सामान्य नियंत्रण नमूना उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन सबसे दैहिक परिवर्तन आसानी से विरासत में मिला अनुक्रम वेरिएंट से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है.
  4. ऐसे muTect 15, SomaticSniper 16, या Strelka 17 के रूप में एक दैहिक उत्परिवर्तन कॉलर, का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूमर सामान्य जोड़ी के लिए दैहिक एकल nucleotide वेरिएंट (SNVs) को बुलाओ. हम कम (गैर शून्य) एलील सामान्य नमूने में गिना जाता है, जब तक कि एलील की आवृत्ति ट्यूमर में कम से कम 5x अधिक है के रूप में साथ वेरिएंट के लिए अनुमति देता है, संशोधित फ़िल्टरिंग मापदंड साथ muTect का उपयोग करें. खरीदे सामान्य DNAs के एक पैनल में कहा जाता वेरिएंट अनुक्रमण या संरेखण की संभावना व्यवस्थित कलाकृतियों के रूप में निकाल रहे हैं. फिल्टर गुजर प्रत्येक SNV तो ध्यान IGV का उपयोग कर समीक्षा की जाती है.
  5. ऐसे SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 के रूप में एल्गोरिदम का उपयोग प्रत्येक ट्यूमर सामान्य जोड़ी के लिए दैहिक indels कॉल या SOAPindel 19
  6. लक्ष्य एक्सॉनों पर अनुक्रम कवरेज से नकल संख्या स्थिति एक्सट्रपलेशन. प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए, सभी लक्ष्य एक्सॉनों, जीसी प्रतिशत से अधिक प्रतिगमन के लिए मतलब अनुक्रम कवरेज की एक लेस सामान्यीकरण प्रदर्शन करते हैं. लेस फिट घटाकर और नमूना चौड़ा मंझला कवरेज जोड़कर unnormalized कवरेज मूल्यों को समायोजित. ट्यूमर सामान्य जोड़े के लिए सभी लक्ष्य एक्सॉनों भर सामान्यीकृत अनुक्रम कवरेज में अनुपात की गणना. एक मिलान सामान्य नमूना और / या शोर कम करने के लिए, अन्य लिंग मिलान द्विगुणित के अभाव मेंgermline प्रतिलिपि संख्या वेरिएंट की कमी सामान्य नियंत्रण किया जा सकता है. कवरेज अनुपात में बढ़ जाती है या कम हो जाती है पर आधारित दैहिक प्रतिलिपि संख्या लाभ और हानि का निर्धारण करते हैं.
  7. कम से कम एक जीनोमिक ब्रेकपाइंट जीनोम का एक लक्षित अंतराल के भीतर या आसपास गिर जाता है जहां कैंसर जीन को शामिल दैहिक rearrangements बुलाओ. सुझाव एल्गोरिदम GASV 20, breakdancer 21, शिखा 22, और dRanger 23 में शामिल हैं. Intrachromosomal व्युत्क्रम, हटाना, और मिलकर duplications समर्थन के रिश्तेदार की स्थिति और अभिविन्यास बेताल जोड़े में पढ़ता के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है. सभी उम्मीदवार rearrangements मैन्युअल रूप IGV का उपयोग कर समीक्षा की जानी चाहिए. हम ख्यात पुनर्व्यवस्था ब्रेकप्वाइंट भर पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रयोगात्मक सत्यापन की सलाह देते हैं.

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Representative Results

24 बारकोड वाले अनुक्रम पुस्तकालयों (12 ट्यूमर सामान्य जोड़े) का एक पूल 279 कैंसर जीन के सभी प्रोटीन कोडिंग exons को इसी जांच का उपयोग कर लिया और 2 एक्स 75 बी पी एक HiSeq 2000 प्रवाह सेल का एक सिंगल लेन पर पढ़ता के रूप में अनुक्रम गया था. ट्यूमर और सामान्य पुस्तकालयों एक 2:1 के अनुपात में जमा थे. जमे हुए ट्यूमर डीएनए नमूनों का एक पूल के लिए नमूना प्रदर्शन मेट्रिक्स संरेखण दर, टुकड़ा आकार के वितरण, पर लक्ष्य कब्जा विशिष्टता, और लक्ष्य कवरेज मतलब सहित, चित्रा 1 में दिखाया गया. उदाहरण के दैहिक परिवर्तन, सम्मिलन, हटाना, और प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन आंकड़े 2-4 में दिखाया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. अनुक्रम प्रदर्शन मेट्रिक्स के प्रतिनिधि के आंकड़े. एक) क्लस्टर घनत्व और संरेखण दर, ख) लक्ष्य कवरेज मतलब है, > ग) आकार वितरण डालें, और डी) विशिष्टता कब्जा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एक फेफड़ों के कैंसर (ऊपर) में EGFR का एक्सॉनों और मिलान सामान्य ऊतक (नीचे) पर अनुक्रम कवरेज की विशिष्टता दिखा एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (IGV) छवि. ग्रे सलाखों अद्वितीय अनुक्रम पढ़ता का प्रतिनिधित्व करते हैं. सही में, एक विषमयुग्मजी टी> जी उत्परिवर्तन ट्यूमर में पढ़ता है और 0% यह एक दैहिक L858R एमिनो एसिड प्रतिस्थापन है यह दर्शाता है कि सामान्य में पढ़ता के 24% में मौजूद है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

3 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 6in "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "चौड़ाई =" 600px "/>
चित्रा 3. एक कोलोरेक्टल कैंसर ट्यूमर सामान्य जोड़ी में indels के उदाहरण हैं:.. एपीसी में एक) दैहिक frameshift प्रविष्टि ख) TP53 में 7 आधार जोड़े की दैहिक frameshift विलोपन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. एक ट्यूमर सामान्य जोड़ी में प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन. प्रत्येक डेटा बिंदु. नकल संख्या लाभ और हानि बढ़ता से inferred रहे 279 लक्ष्य जीन से एक एक्सॉन का प्रतिनिधित्व करता है और ट्यूमर अनुक्रम कवरेज में कम हो जाती है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तालिका 1: जांच डिजाइन लक्ष्य पर कब्जा के लिए सुविधाओं.

कुल एक्सॉनों 4,535
कुल इंट्रोन्स 14
SNPs * 1042
कुल लक्ष्य क्षेत्र 879,966 basepairs
कुल जांच क्षेत्र 1,400,415 basepairs

तालिका 2. अभिकर्मकों और किट.

का नामअभिकर्मक / सामग्री कंपनी सूची संख्या
NEBNext अंत मरम्मत मॉड्यूल न्यू इंग्लैंड Biolabs E6050L
NEBNext दा पीछा मॉड्यूल न्यू इंग्लैंड Biolabs E6053L
NEBNext त्वरित Ligation मॉड्यूल न्यू इंग्लैंड Biolabs E6056L
Agencourt AMPure XP Beckman कल्टर जीनोमिक्स
एनEXTflex पीसीआर मुफ्त बारकोड - 24 Bioo वैज्ञानिक 514,103
HiFi लाइब्रेरी प्रवर्धन किट KAPA Biosystems KK2612
खाट मानव डीएनए, fluorometric ग्रेड रॉश निदान 05 480 647 001
NimbleGen SeqCap ईज़ी संकरण और धोने किट Roche NimbleGen 05 634 261 001
SeqCap ईज़ी लाइब्रेरी फँसाना चाहे Roche NimbleGen
QIAquick पीसीआर शोधन किट क्विएज़न 28,104
Qubit dsDNA ब्रॉड रेंज (बीआर) परख किट जीवन टेक्नोलॉजीज Q32850
Qubit dsDNA उच्च संवेदनशीलता (एचएस) परख किट जीवन टेक्नोलॉजीज Q32851
Agilent डीएनए एच एस किट टेक्नोलॉजीज 5067-4626, 4627
Agilent 2100 Bioanalyzer टेक्नोलॉजीज
Covaris E220 Covaris
चुंबकीय स्टैंड-96 Ambion AM10027
Illumina हाय Seq 2000 Illumina

तालिका 3. सूचकांक Oligo ब्लॉकर्स और प्राइमर दृश्यों.

टीएस INV वह सूचकांक 2 अवरोधक
टीएस वह यूनिवर्सल अवरोधक AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 1 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 3 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 4 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 5 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 6 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 7 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 8 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 9 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 10 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 11 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 12 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 13 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 14 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 15 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 16 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 18 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 19 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 20 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 21 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 22 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 23 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 25 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
टीएस INV वह सूचकांक 27 अवरोधक CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
प्राइमर 1 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT -3 '
प्राइमर 2 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3 '

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Discussion

हमारे प्रभाव परख एक उच्च संरेखण दर, उच्च पर लक्ष्य की दर, उच्च लक्ष्य कवरेज, और पता लगाने के म्यूटेशन, indels, और संख्या परिवर्तन की नकल के लिए उच्च संवेदनशीलता पैदा करता है. हम ताजा जमे हुए दोनों से अनुक्रम डीएनए के लिए अपने प्रभाव को परख की क्षमता का प्रदर्शन किया है और कम डीएनए इनपुट के FFPE नमूने संग्रहीत है. कुंजी कैंसर से जुड़े जीन की लक्षित एक्सॉन अनुक्रमण प्रदर्शन करके, एक जिससे कम आवृत्ति म्यूटेशन पता लगाने की क्षमता को अधिकतम करने के लिए इन सबसे महत्वपूर्ण जीनों के एक्सॉनों के लिए बहुत गहरी अनुक्रम कवरेज हासिल कर सकते हैं. बारकोडिंग और बहुसंकेतन का उपयोग उच्च throughput, नमूना प्रति कम लागत, और डीएनए की कम इनपुट मात्रा में सक्षम बनाता है.

लक्षित दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह सब एक्सॉनों उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए समान रूप से और पर्याप्त कवर कर रहे हैं कि कब्जा जांच में इस तरह के अनुकूलन करने के लिए संभव है. तालिका 1 में दिखाया गया है, हमारे डिजाइन 279 जीनों में 4,535 exons शामिल हैं. तक चलने सुधार के बादहमारे डिजाइन, एक ठेठ अनुक्रमण प्रयोग पूरे नमूना के लिए बीच का कवरेज के कम से कम 20% पर एक्सॉनों की अधिक नहीं 2% उत्पादन करता है. इस प्रकार, 500x अनुक्रम कवरेज (चित्रा 1 में प्रदर्शित के रूप में एक रूढ़िवादी अनुमान) करने के लिए अनुक्रम एक ट्यूमर के लिए,> एक्सॉनों के 98% कम आवृत्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए उच्च संवेदनशीलता गारंटी> 100x गहराई से शामिल किया जाएगा. कवरेज का इस एकरूपता बड़े पैमाने पर जांच अलग न्यूक्लियोटाइड रचना के क्षेत्रों में अलग अलग लंबाई को संश्लेषित किया जा सकता है, जहां NimbleGen SeqCap प्रणाली के लचीलेपन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. हम भी सफलतापूर्वक हमारे पैनल के लिए नई सामग्री जोड़ने के लिए और कब्जा है और / या अनुक्रम करना मुश्किल है कि क्षेत्रों की कवरेज को बढ़ावा देने के लिए एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजी (IDT) से व्यक्तिगत रूप से संश्लेषित biotinylated oligonucleotides का इस्तेमाल किया है. भी खरीदे पुन: व्यवस्थित जीन का चयन करें इंट्रोन्स पर कब्जा करके, हम संलयन जीन उत्पादन संरचनात्मक rearrangements की पहचान करने में सक्षम हैं, तब भी जब केवल एक FUSIOn साथी कब्जा कर लिया है.

यह लक्षित अनुक्रमण दृष्टिकोण ट्यूमर में "ड्राइवर" आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता में दो मुख्य सीमाओं के अधिकारी करता है. सबसे पहले, जीनोम का एक अंश ही पूछताछ की है. लक्षित अनुक्रमण, स्वभाव से, सीमित है. नए कैंसर के जीन व्यवस्थित जीनोमिक्स प्रयासों से उभरने के रूप में, वे तेजी से एक पर कब्जा पैनल में जोड़ा जा सकता है, लेकिन कार्यात्मक महत्वपूर्ण म्यूटेशन पूरे जीनोम या पूरे exome अनुक्रमण द्वारा पता लगाया जाएगा कि याद किया जा सकता. दूसरा, यह डीएनए आधारित परिवर्तन तक ही सीमित है. aberrantly व्यक्त टेप, उपन्यास ब्याह isoforms, और जीन fusions का पता लगाने आरएनए Seq या इसी तरह की तकनीक 24 की आवश्यकता है. ऐसे chromatin संशोधन और डीएनए मेथिलिकरण के रूप में epigenetic परिवर्तन भी tumorigenesis और ट्यूमर प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में सुधार जारी है, एक पूरे जीनोम अनुक्रमण, आरएनए Seq और पूरक approa रोजगार एकीकृत रणनीति कल्पना कर सकते हैंches व्यापक एक नियमित आधार पर 25 व्यक्ति ट्यूमर के आनुवंशिक और epigenetic मेकअप चिह्नित करने के लिए. के रूप में पूर्ण एकीकृत रणनीति लागत और computationally निषेधात्मक, लक्षित अनुक्रमण नैदानिक ​​और translational अनुप्रयोगों के लिए सबसे प्रमुख जीनोमिक सुविधाओं पर कब्जा करने के लिए एक व्यावहारिक विकल्प प्रस्तुत करता है वर्तमान में कर रहे हैं.

हमारे प्रोटोकॉल ट्यूमर एक ही रोगी से लिया मिलान कर सामान्य ऊतकों के साथ अनुक्रम रहे हैं रखती है. यह सामान्य नियंत्रण के उद्देश्य के ट्यूमर में पाया अनुक्रम वेरिएंट विरासत में मिला या somatically अर्जित कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए है. एक मिलान सामान्य के अभाव में, एक कि उत्परिवर्तनीय आकर्षण के केंद्र (अन्य कैंसर में आवर्तक दैहिक परिवर्तन यानी साइटों) पर होने वाली दैहिक होने की संभावना है वेरिएंट अनुमान कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रतिलिपि संख्या लाभ और हानि के विश्लेषण एक गैर आनुवंशिक रूप से मिलान कर द्विगुणित सामान्य नमूना के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. अन्य सभी उपन्यास आनुवंशिक परिवर्तन के लिए, simultaneमिलान कर सामान्य ऊतकों के ous विश्लेषण बहुत परिणामस्वरूप उत्परिवर्तन डेटा की व्याख्या सरल और अत्यधिक की सिफारिश की है.

यहाँ वर्णित प्रभाव प्रोटोकॉल जमे हुए नमूने के लिए स्थिरता और उच्च गुणवत्ता के प्रदर्शन को दर्शाता है. FFPE नमूनों के साथ काम कर रहा है जब हम हालांकि, सामयिक परिवर्तनशीलता मनाया है. FFPE नमूने की उम्र और गुणवत्ता पर निर्भर करता है, डीएनए गंभीर रूप से अपमानित या रासायनिक संशोधित किया जा सकता है, और एक परिणाम के रूप में अनुक्रमण और विश्लेषण 26 मुश्किल प्रस्तुत करना हो सकता है. यह कहा जा रहा है, हम FFPE नमूनों की बड़ी संख्या के लिए विश्वसनीय होने के लिए इन प्रयोगात्मक शर्तों पाया है. हम भी सफलतापूर्वक ऐसी बायोप्सी, ठीक सुई रेस्पायरेट्रस, और कोशिकीय नमूनों के रूप में अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक नमूनों को चिह्नित करने के लिए इस प्रोटोकॉल लागू किया है. यह इस विधि निदान एक प्रभाव के लिए खड़ा है इस कारण चर गुणवत्ता, मात्रा, और विविधता है कि के नमूनों के विभिन्न प्रकारों को समायोजित करने के लिए लचीलापन के लिए हैनैदानिक ​​क्षेत्र में कैंसर के रोगियों के डी इलाज.

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Disclosures

डा. बर्जर फाउंडेशन चिकित्सा, एक कैंसर निदान कंपनी से शुल्क परामर्श और अनुसंधान धन प्राप्त हुआ है.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ. एग्नेस Viale और MSKCC जीनोमिक्स कोर प्रयोगशाला धन्यवाद. इस प्रोटोकॉल जेफ्री Beene कैंसर रिसर्च सेंटर और किसान परिवार फाउंडेशन की सहायता से विकसित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBNext End Repair Module New England Biolabs E6050L  
NEBNext dA-Tailing Module New England Biolabs E6053L  
NEBNext Quick Ligation Module New England Biolabs E6056L  
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter Genomics  
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 Bioo Scientific 514103  
HiFi Library Amplification Kit KAPA Biosystems KK2612  
COT Human DNA, Fluorometric Grade Roche Diagnostics 05 480 647 001  
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit Roche NimbleGen 05 634 261 001  
SeqCap EZ Library Baits Roche NimbleGen  
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104  
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit Life Technologies Q32850  
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Life Technologies Q32851  
Agilent DNA HS Kit Agilent Technologies 5067-4626, 4627  
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies  
Covaris E220 Covaris  
Magnetic Stand-96 Ambion AM10027  
Illumina Hi-Seq 2000 Illumina  

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References

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Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing. J. Vis. Exp. (80), e50710, doi:10.3791/50710 (2013).

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