Summary
Мы описывают получение штрих библиотек ДНК и последующей гибридизации на основе захвата экзона для обнаружения ключевых связанных с раком мутаций в клинических образцах опухолей по массовым параллелизмом секвенирования "следующего поколения". Целевые экзон последовательности предлагает преимущества высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, что позволит обеспечить высокую чувствительность для обнаружения низкие мутации частот.
Abstract
Усилия по выявлению и расследованию ключевые онкогенные мутации оказались ценными для облегчения соответствующее лечение для больных раком. Установление высокой пропускной, массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения" помог открытие многих таких мутаций. Для повышения клинической и поступательное полезность этой технологии, платформы должны быть высокой пропускной, экономически эффективной, и совместимо с формалином фиксированной парафин (FFPE) образцы тканей, которые могут дать малое количество деградированных или поврежденной ДНК. Здесь мы описываем подготовку штрих и мультиплексированных библиотек ДНК с последующей гибридизацией на основе захвата целевых экзонов для обнаружения связанных с раком мутаций в свежезамороженных и FFPE опухолей по массовым параллелизмом секвенирования. Этот метод позволяет выявить мутации последовательности, скопируйте номер изменения, и выберите структурные перестройки с участием всех целевых генов. Целевые экзон последовательности предлагает тон приносит пользу высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, таким образом, присвоении высокой чувствительностью для обнаружения низкие мутации частот.
Introduction
Идентификация "водитель" опухолевых генетических событий в ключевых онкогенов и генов-супрессоров опухолей играет существенную роль в диагностике и лечении многих видов рака 1. Крупномасштабные научно-исследовательских работ, использующие массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения", позволили выявить многих таких раковых генов, ассоциированных в последние годы 2. Тем не менее, эти платформы секвенирования как правило, требуют больших количеств ДНК, выделенные из свежезамороженных тканей, что создает серьезную проблему, при характеристике и анализа мутаций ДНК из сохранившихся тканей, таких как фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) образцов опухолей. Улучшенные усилия для эффективного и надежного характеризуют "действенные" геномной информации из образцов опухолевых FFPE позволит ретроспективный анализ ранее накренился образцов и далее поощрять индивидуальные подходы к лечению рака.
Традиционно, молекулярная гiagnostic лаборатории полагались на трудоемких, с низким уровнем пропускной методологий, таких как Sanger секвенирования и ПЦР в реальном времени для мутаций ДНК профилирования. Совсем недавно, методы выше пропускной использующие мультиплексированный ПЦР или масс-спектрометрический генотипирование были разработаны, чтобы исследовать текущие соматические мутации в ключевых генов рака 3-5. Эти подходы, однако, ограничиваются тем, что только predesignated "горячих точек" мутации анализировали, что делает их непригодными для обнаружения инактивирующие мутации в генах супрессоров опухолей. Солидная параллельная последовательность предлагает несколько преимуществ по сравнению с этих стратегий, включая возможность запрашивать целые экзоны для обоих распространенных и редких мутаций, возможность выявления дополнительных классов геномных изменений, таких как число копий прибылей и убытков, а также большей чувствительностью обнаружения в гетерогенных образцов 6, 7 . Всего секвенирование генома представляет собой наиболее комплексный подход к открытию мутации, хотя это относительнолы дорогой и несет большие вычислительные мощности для анализа и хранения данных.
Для клинического применения, где только небольшая часть генома могут представлять клинический интерес, два конкретных инновации в технологии последовательности были преобразующей. Во-первых, через гибридизации на основе захвата экзона, можно выделить ДНК, соответствующий ключевых связанных с раком генов целевой мутации профилирования 8,. Во-вторых, через перевязкой молекулярных штрих-кодов (т.е. последовательности ДНК 6-8 нуклеотидов в длину), можно объединить сотни образцов в секвенирования перспективе и полностью воспользоваться все возрастающей мощностью массовым параллелизмом инструментов секвенирования 10. В сочетании, эти нововведения позволяют опухоли для профилирования для более низкой стоимости и в более высокой пропускной способности, с меньшими вычислительными требованиями 11. Кроме того, путем перераспределения покрытие только последовательности этих генов наиболее важных для конкретного применения, можно достижимве большую глубину секвенирования повышенной чувствительностью обнаружения для низких событий частот аллелей.
Здесь мы опишем наше воздействие анализа (Integrated Мутация профилирования мишеней Осуществимое рака), которая использует захват экзона на штрих бассейнов библиотечных последовательность путем гибридизации с использованием пользовательских олигонуклеотиды, чтобы захватить все белок-кодирующих экзонов и выберите интронов из 279 ключевых раковых генов, ассоциированных (Таблица 1 ). Эта стратегия позволяет выявить мутации, вставкам, количество копию изменений и выберите структурные перестройки, связанные с эти 279 генов. Наш метод совместим с ДНК, выделенной из обоих свежезамороженной и FFPE ткани, а также мелких аспиратов игл и других цитологических образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ДНК и подготовке реагентов
Примечание: Этот протокол описывает одновременную обработку и анализ 24 образцов (например, 12 опухолевые / нормальные пары), но могут быть адаптированы для малых и больших партий. Образцы ДНК может происходить от FFPE или свежезамороженной ткани, цитологических образцов, или крови. Как правило, оба опухолевых и нормальных тканей от того же самого пациента будет профилированного вместе, чтобы отличить от соматических мутаций, унаследованных полиморфизмов. Протокол начинается сразу же после извлечения ДНК.
- Аликвоты 50-250 нг (250 нг рекомендуется) из экстрагированной ДНК в пробе, разбавленного в 1x Трис-ЭДТА (рН 8,0) буфера до конечного объема 50 мкл, в отдельные Covaris круглым дном трубки.
- На сдвиг ДНК на инструменте Covaris E220 в следующих сдвига настройками: 360 сек при 10 скважностью, 175 ПГИ, и 200 циклов в пакете.
- Оттепель AMPure XP бисер (табл. 2) до комнатной температуры. Оттепель все буffers и ферменты на льду до соответствующего этапа.
2. Библиотека Подготовка - Конец Ремонт Модуль
- Подготовьте конец ремонта мастер смеси в стерильной трубки микроцентрифужных используя следующие объемы на образец: 10 мкл 10Х NEBNext End Ремонт реакционного буфера (табл. 2), 5 мкл NEBNext Конец ремонта смеси ферментов (табл. 2), 35 мкл стерильной нуклеазы бесплатно Н 2 О.
- Аликвотировать 50 мкл каждой фрагментированной ДНК на отдельные лунки 96-луночного планшета. Добавить 50 мкл подготовленного конца ремонта мастер-микс для каждой реакции. Выдержите в амплификаторе в течение 30 мин при 20 ° C.
3. Сообщение Конец Ремонт Очистка
- Добавить 2x объем (200 мкл) AMPure XP Beads (табл. 2) для каждого образца и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз с помощью многоканальной пипетки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Место на магнитной подставке (Таблица 2
- Аккуратно снимите и выбросьте четкое уход супернатант брать, чтобы не нарушить бусы. Некоторые жидкость может оставаться в скважинах.
- С трубок на стенде, осторожно добавить 200 мкл свежеприготовленного 80%-ного этанола к каждому образцу и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 сек. Осторожно, удаления этанола с помощью пипетки.
- Повторите шаг 5, в общей сложности 2 этанола стирок. Убедитесь, что все этанол был удален. Удалить из магнитного стенда и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Ресуспендируют высушенные шарики с 44,5 мкл стерильной H 2 O. Осторожно, пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз смешивания тщательно. Обеспечить бусы больше не прикреплены к стороне скважины.
- Выдержите ресуспендировали бусы при комнатной температуре в течение 2 мин. Место на магнитной подставке в течение 5 мин, пока образец не представляется очевидным.
- Аккуратно перенести 42 мкл прозрачного супернатанта, содержащего образец новой скважины.
Эта процедура может быть безопасно остановились в этом улEP и образцов, хранящихся при -20 ° С в течение 7 дней. Чтобы перезапустить, размораживайте образцы на льду, прежде чем приступить.
4. Библиотека Подготовка - DA-Tailing Модуль
- Подготовьте DA-хвостохранилища основной смеси в стерильной трубки микроцентрифужных используя следующие объемы на образец: 5 мкл 10Х NEBNext DA-Tailing реакционного буфера (табл. 2) 3 мкл (3'-5 'экзо-) фрагмент Кленова (табл. 2 ).
- Добавить 8 мкл подготовленной DA-хвостохранилища мастер-микс в каждую лунку, содержащую 42 мкл конечного-ремонт ДНК. Инкубировать в амплификаторе в течение 30 мин при 37 ° С
- Выполните пост DA-хвостохранилища очистки: Повторите шаги 3.1-3.8 используя 2x объем (100 мкл) из бисера, но ресуспендируют в стерильной H 2 O в конечном объеме 33,75 мкл.
Эта процедура может быть безопасно остановлен на этой стадии и образцы хранили при -20 ° С в течение до 7 дней. Чтобы перезапустить, размораживайте образцы на льду, прежде чем продолжить. </ Li>
5. Библиотека Подготовка - адаптер Лигирование Модуль
- Подготовьте Ligation основной смеси в стерильной трубки микроцентрифужных используя следующие объемы на образец: 10 мкл 5x NEBNext Быстрый Ligation реакционного буфера (New England Biolabs, таблица 2), 5 мкл Быстрый Т4 ДНК-лигазы (табл. 2).
- Добавить 15 мкл Ligation мастер-микс в каждую лунку, содержащую DA-белохвост ДНК.
- Добавить 1,25 мкл соответствующей 25 мкМ NEXTflex штрих адаптера (табл. 2) в каждую лунку. Каждый образец должен получить отдельный штрих-кодом адаптера. Выдержите в амплификаторе в течение 15 мин при 20 ° C.
- Выполните сообщение адаптер перевязки очистку: Повторите шаги 3.1-3.8 с помощью 1x объем (50 мкл) из бисера, но ресуспендируют в стерильной H 2 O до конечного объема 50 мкл.
- Повторите шаги 3.1-3.8 для второго тома 1x (50 мкл) зачистке, но ресуспендируют в стерильной H 2 O вКонечный объем 23 мкл.
Эта процедура может быть безопасно остановлен на этой стадии и образцы хранили при -20 ° С в течение до 7 дней. Чтобы перезапустить, размораживайте образцы на льду, прежде чем приступить.
6. Библиотека Усиление
- Подготовьте основной смеси KAPA HiFi в стерильной трубки микроцентрифужных, используя следующие объемы по образцу: 25 мкл 2x KAPA HiFi УГ RM (табл. 2), 1 мкл каждого из 100 мкМ праймера 1 и Primer 2 (табл. 3).
- Добавить 27 мкл мастер-смеси в каждую лунку, содержащую продукт лигирования. Установите пипеткой 50 мкл и осторожно пипеткой весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Место в амплификатор для следующих циклов ПЦР: первоначальная денатурация 45 сек при 98 ° С, 10 циклов 15 сек при 98 ° С, 30 сек при 60 ° С, 30 сек при 72 ° С, и окончательное расширение 1 мин при 72 ° С
- Выполните сообщение усиления очистку: Повторите шаги 3.1-3.8 помощьюОбъем 1x (50 мкл) AMPure XP бусы, и ресуспендируют в стерильной воде до конечного объема 30 мкл.
- Количественная концентрацию каждой библиотеки, используя кубита широкий спектр анализа (Life Technologies, таблица 2) в соответствии с инструкциями изготовителя.
7. Рош NimbleGen SeqCap EZ Библиотека Гибридизация, стирка, и Усиление
- Оттепель универсальные и индексировать олигонуклеотидных блокаторы (табл. 3), SeqCap EZ Библиотека и компоненты захвата NimbleGen (СОТ ДНК, 2x буферные гибридизация и гибридизация компонент A, Таблица 2) на льду. Все олигонуклеотидные блокаторы хранятся в рабочих запасов 1 мМ. Наша SeqCap EZ библиотека является специально разработанный пул захватывающих зондов, охватывающих все белок-кодирующих экзонов 279 раковых генов, ассоциированных с, хотя можно использовать и другие Каталог обычаи и конструкций.
- Подготовка бассейн на 1 мм индекс олигонуклеотидных блокаторов, соответствующих конкретной штрих объявлениеaptor последовательности, используемые в библиотеке подготовки. Объедините 1 мкл каждого блокатора и вихрь.
- В новом стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки, добавляют 5 мкл 1mg/ml СОТ ДНК, 2 мкл 1 мМ универсального блокатора и 2 мкл 1 мМ пула индекс олигонуклеотидных блокаторы.
- Бассейн 24 Barcoded библиотеки в одной реакции. Добавить в общей сложности 1-3 мкг объединенной, штрих библиотеки последовательности (полученный выше) в смеси захвата. Для 24 образцов, 100 нг на пробу рекомендуется. Когда опухоли и объединения соответствующих нормальных выборок, рекомендуется добавить больше библиотеку опухоли (например, 100 нг на опухоли и 50 нг на нормальное) так, что они секвенировали для большей глубины охвата.
- Закройте крышку трубки и сделать 15-20 отверстий в верхней части крышки с 18-20 G или меньшей иглы. Скорость переменного тока усиленные Sample Library / раскладушка ДНК / олигонуклеотиды в ДНК вакуумной концентратора на высокой температуре (60 ° C).
- После полного высыхания вниз, увлажняет с 7,5 мкл 2х hybridiзация буфер и 3 мкл гибридизации компонента А. трубка должна теперь содержать следующие сведения: 5 мкг СОТ ДНК, переменная мкг усиливается библиотеки сэмплов, 1000 пмоль Вселенской и Index олигонуклеотидов, 7,5 мкл 2x гибридизации буфер, 3 мкл гибридизации компонент в Общий объем 10,5 мкл.
- Обложка отверстия в крышке с маленькой частью лабораторного ленты. Vortex образец в течение 10 сек и центрифуге при максимальной скорости в течение 10 сек.
- Инкубируйте образца при 95 ° С в течение 10 мин для денатурации ДНК с последующим центрифугированием при максимальной скорости в течение 10 сек при комнатной температуре.
- В новом 0,2 мл ПЦР-полосками, подготовить 2,25 мкл аликвоты SeqCap EZ Библиотека захвата зондов и 2,25 мкл стерильной нуклеазы бесплатно H 2 O и добавить содержимое шагом 7,7. Аккуратно пипетки весь объем вверх и вниз 10 раз.
- Инкубировать в термоциклере при 47 ° С в течение 48-96 часов. Установить и поддерживать температуру крышки термоциклер к 57 ° С.
- Фолнизкие шаги в главе 6 Руководства SR NimbleGen SeqCap EX библиотека пользователя v3.0 (табл. 2) для мытья и восстановления захваченного ДНК.
- Следует шаги в главе 7 протокола Рош NimbleGen для амплификации захваченного ДНК со следующими изменениями:
- Используйте 2x KAPA HiFi-полимеразы (табл. 2) вместо Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
- С помощью 100 мкМ праймер 1 и праймер 2, перечисленных в таблице 3.
- Выполните следующие ПЦР-условия: начальная денатурация при 98 ° С в течение 30 сек, 11 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек, 72 ° C в течение 30 сек, и конечным удлинением при 72 ° С в течение 5 мин . Держите при 4 ° С.
- Количественная концентрацию усиленного захваченного ДНК с использованием кубита Высокая чувствительность анализа (табл. 2) в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Анализ захваченного качество ДНК, используя Agilent BioАнализатор ДНК УГ чип (табл. 2) в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выход ПЦР должна быть не менее 100 нг (диапазон 100-1000 нг).
- Средняя длина фрагмент должен быть между 150-400 пар оснований.
8. Illumina Привет-Seq Секвенирование
- Развести усиленный захватили ДНК до 2 часов, и загрузить образец на одной полосе в проточной ячейке Illumina HiSeq 2000 года. Последовательность в паре-конец 75 пар оснований читает в соответствии с инструкциями изготовителя. По нашему опыту, одна полоса, достаточно для получения 500-700X уникальное освещение последовательности на отсчет по 279 генов для пула 24 образцов.
- Программное обеспечение Illumina (Real Time анализ) будет конвертировать изображения с высоким разрешением до интенсивностей кластера основывать звонки и показатели качества. Использование CASAVA для демультиплексирования данных в соответствии с идентичностью штрих-кода и генерировать отдельные файлы FASTQ для каждого образца.
9. Данные Анальныйлиз
- Фальш последовательности адаптер от 3 'конца последовательности считывает FASTQ файлов с помощью Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). Минимальная длина перекрытия (-О) 3 с частотой ошибок (-е) 1%. Минимальная длина базой для удержания в паре читает после обрезки составляет 25.
- Совместите последовательность читает с эталонными hg19 генома человека с помощью инструмента Берроуз-Уилер Aligner (BWA) 12. Действия, выполняемые после обработки в том числе двух экземплярах маркировки, местного перестройки множественной последовательности, и база Показатель качества калибровки с помощью Геном Analysis Toolkit (GATK) в соответствии с их стандартными передовой практики ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? назвать = передовом опыте ) 13. При профилировании несколько образцов из того же пациента (например соответствует опухолевые и нормальные), местные перестройка несколько последовательность должна быть PerforMED совместно. Выход из этих шагов постобработки представляет собой отдельный файл БАМ для каждого образца, который содержит всю последовательность, качество и информацию выравнивания и могут быть загружены непосредственно в интегративной геномики Viewer (ВНА) для визуализации читает и варианты 14 последовательность.
- Рассчитать показатели производительности последовательности с помощью Пикара инструменты ( http://picard.sourceforge.net/ ). Информационные показатели включают выравнивания скорости, распределение по размерам фрагмент, GC-контента, связанного уклон покрытия, на-мишени специфику захват, ПЦР дублировать скорость, библиотека сложности и означает целевой охват. Представительства значения отображаются на рисунке 1. Частот аллелей в общих сайтов полиморфизма, рассчитанных с помощью DepthOfCoverage от GATK используются для мониторинга загрязнения от неродственного ДНК и гарантировать, что подобранные образцы пришли от тех же пациентов.
Следующие вычислительные анализы зависят от наличия соответствуетобразцов опухолей и нормальных для обнаружения соматических генетических изменений. Несогласованные опухоли также могут быть проанализированы с помощью отдельного образца нормальной контрольной, но большинство соматические мутации не может быть легко отличить от унаследованных вариантов последовательностей. - Позвоните соматические одиночные варианты нуклеотидных (SNVs) для каждой пары опухоли обычно, с помощью соматической мутации абонента, например muTect 15 SomaticSniper 16 или Стрелке 17. Мы используем muTect с измененными критериями фильтрации, что позволяет вариантах с низким (не ноль) аллелей пунктам в нормальном образца тех пор, пока частота аллеля, по крайней мере 5x больше в опухоли. Варианты периодически называемые в панели нормальных ДНК удаляются как вероятных систематических артефактов последовательности или выравнивания. Каждый СНВ прохождения фильтры затем тщательно рассмотрены с использованием IGV.
- Позвоните соматические индели для каждой пары опухоли обычно, используя алгоритмы, такие как SomaticIndelDetector 13 Dindel 18 или SOAPindel 19
- Экстраполируйте копирования Статус артикула из сферы последовательности в целевых экзонов. Для каждого отдельного образца, выполнить Лессовому нормализации среднего покрытия последовательности для всех целевых экзонов, регрессии над процентах GC. Отрегулируйте ненормализованные значения охвата путем вычитания посадку лессовых и добавив охват средний образец миру. Рассчитать отношение в нормализованной покрытия последовательности во всех целевых экзонов для опухолевых нормальное пар. При отсутствии согласованного нормальной образца и / или для уменьшения шума, другие соответствующего пола диплоидноммогут быть использованы обычные средства управления, не имеющие зародышевой линии варианты в количестве копий. Определите соматические прибыли и убытки в количестве копий на основе увеличения или сокращения коэффициента покрытия.
- Позвоните соматические перестройки, связанные гены рака, где по крайней мере один геномной останова подпадает или рядом с адресной интервале генома. Предлагаемые алгоритмы включают GASV 20, брейк 21 CREST 22 и dRanger 23. Внутрихромосомные инверсии, делеции и тандемные дупликации можно выделить на основе относительное положение и ориентация поддержки читает в противоречивых пар. Все кандидаты перестановки следует вручную отзывы помощью IGV. Мы рекомендуем экспериментальную проверку с помощью ПЦР и Sanger секвенирования через предполагаемых перегруппировки останова.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Один бассейн из 24 библиотек штрих последовательности (12 опухолевые-нормальный пар) был взят в плен, используя зонды, соответствующие всем белок-кодирующих экзонов 279 генов рака и секвенировали, как 2 х 75 б.п. читает на одной полосе в проточной ячейке HiSeq 2000 года. Опухолевых и нормальных библиотеки были объединены в соотношении 2:1. Показатели эффективности Образец для бассейна замороженных образцов ДНК опухолевых показаны на рисунке 1, в том числе скорости выравнивания, распределения по размерам фрагмент, по-мишень специфики захвата, и значит, целевой охват. Пример соматические мутации, вставки, удаления и номер копии изменения показаны на рисунках 2-4.
Рисунок 1. Представительства фигуры показателей производительности последовательность. а) плотность кластера и скорость выравнивание, б) означает целевую охват,
Рисунок 2. Интегративной геномики просмотра (ВНА) изображение, показывающее специфику освещения последовательности в экзонов EGFR в рак легких (вверху) и согласованной нормальной ткани (внизу). Серые полосы представляют уникальная последовательность читает. Справа, гетерозиготных мутаций T> G присутствует в 24% читает в опухоли и 0% читает в нормальном, указывая, что это соматическая замена L858R аминокислоты. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
3 "FO: контент-ширины =" 6 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 3. Примеры вставкам в колоректального рака опухоли обычно, пара:..) Соматических вставки рамки считывания в АПК б) соматических рамки считывания удаление из 7 пар оснований TP53 Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Скопировать номер изменения в паре с опухолью нормально. Каждая точка данных представляет один экзон из 279 генов-мишеней. Номер копии прибыли и убытки, выводятся из увеличивается и уменьшается в освещении последовательности опухоли. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Таблица 1: Зонд Конструктивные особенности для Target Capture.
| Всего экзоны | 4535 |
| Всего интронов | 14 |
| ОНП * | 1042 |
| Общую территорию | 879966 пар оснований |
| Общая территория зонд | 1400415 пар оснований |
Таблица 2. Реагенты и наборы.
| НазваниеРеагент / Материал | Компания | Номер по каталогу |
| NEBNext Конец Ремонт Модуль | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext DA-хвостохранилище Модуль | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Быстрый Лигирование Модуль | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex ПЦР-Free штрих-кодов - 24 | Bioo Научно | 514103 |
| HiFi Библиотека Усиление Комплект | KAPA биосистем | KK2612 |
| СОТ ДНК человека, Флуорометрический класс | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ гибридизации и отмывки комплект | Рош NimbleGen | 05 634 261 001 |
| Приманки SeqCap EZ Библиотека | Рош NimbleGen | |
| QIAquick ПЦР Очистка Комплект | Qiagen | 28104 |
| Кубит днДНК Широкий диапазон (BR) Анализ Комплект | Life Technologies | Q32850 |
| Кубит днДНК Высокая чувствительность (УГ) Анализ Комплект | Life Technologies | Q32851 |
| Agilent ДНК УГ Комплект | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Магнитный стенд-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Привет-Seq 2000 | Illumina |
Таблица 3. Индекс Oligo блокаторы и Грунты Последовательности.
| TS-ОН Универсальный Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 5 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 6 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 10 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 11 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 12 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 13 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 14 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 15 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 16 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 18 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 19 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 20 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 21 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 22 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 23 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 25 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-ИНВ-HE Индекс 27 окон | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Грунтовка 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Праймер 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша ВЛИЯНИЕ анализ производит высокую скорость выравнивания, высокую ставку по-цели, высокую целевую охват и высокую чувствительность для обнаружения мутаций, вставкам и скопировать номер изменения. Мы продемонстрировали способность нашего IMPACT анализе для последовательности ДНК из обоих свежемороженая и архивируются образцы FFPE низкого входа ДНК. Выполняя целевой экзона последовательности ключевых раковых генов, ассоциированных с, можно добиться очень глубокий охват последовательности для экзонов этих наиболее важных генов, тем самым максимизируя способность обнаруживать низкие мутации частот. Использование штрих-кодирования и мультиплексирования обеспечивает более высокую пропускную способность, низкая стоимость образца, и более низкие объемы ввода ДНК.
Преимущество целевого подхода состоит в том, что это возможно, чтобы оптимизировать захватывающих зондов, что все экзоны покрыты равномерно и достаточно для обнаружения мутаций. Как показано в таблице 1, наш дизайн охватывает 4535 экзонов в 279 генах. После итерационные улучшения внаш дизайн, типичный эксперимент последовательности производит не более 2% от экзонов менее 20% от среднего покрытия для всей выборки. Таким образом, для опухоли секвенированной к освещению 500x последовательности (консервативная оценка, как показано на рисунке 1),> 98% экзонов будут покрыты за счет> 100x глубине, гарантируя высокую чувствительность для выявления низкие мутации частот. Эта однородность освещения может быть в значительной степени отнести к гибкости системы NimbleGen SeqCap, где зонды могут быть синтезированы в разной длины в регионах разного нуклеотидного состава. Мы также успешно использоваться по отдельности синтезированные биотинилированных олигонуклеотидов из интегрированных ДНК технологий (IDT), чтобы добавить новый контент на нашей панели и повысить охват регионов, которые трудно захватить и / или последовательность. По также захвата выберите интронов периодически перестроенных генов, мы можем определить структурные перестройки, производящих слитых генов, даже если только один Fusioн партнер в плен.
Эта целенаправленная последовательность подход действительно обладает двумя основными ограничения в способности обнаружить "водитель" генетические изменения в опухолях. Во-первых, только часть генома опрашивается. Целевые последовательности, по своей природе, ограничено. Поскольку новые гены рака выйти из систематических геномики усилия, они могут быть быстро добавляют к панели захвата, но функционально важные мутации могут быть пропущены, которые будут обнаружены целого генома или всей ExoME секвенирования. Во-вторых, оно ограничено изменений на основе ДНК. Обнаружение аберрантно выраженных транскриптов, новых сплайсинга изоформ, и генных слияния требуется РНК-Seq или аналогичные методы 24. Эпигенетические изменения, такие как хроматина модификаций и метилирования ДНК может также играют ключевую роль в развитии опухолей и прогрессирования опухоли. Как секвенирования технологии продолжают улучшаться, можно представить себе комплексные стратегии использования весь секвенирование генома, РНК-Seq и дополнительное подхочес всесторонне характеризуют генетические и эпигенетические макияж отдельных опухолей на регулярной основе 25. Как полные комплексные стратегии в настоящее время экономически и вычислительно-непомерно, целевой последовательности представляет практическую альтернативу, чтобы захватить наиболее важные геномные особенности для клинических и трансляционных приложений.
Наш протокол предполагает, что опухоли последовательность наряду согласованной нормальной ткани, взятой из того же пациента. Цель этого нормального контроля, чтобы определить, является ли варианты последовательности, обнаруженные в опухоли унаследованы или приобретены соматически. При отсутствии соответствует норме, можно сделать вывод, что варианты расположены на мутационных горячих точек (т.е. сайтов из повторяющихся соматических мутаций в других раковых заболеваний), вероятно, будут соматических. Кроме того, анализ количества копий прибылей и убытков могут быть выполнены с негенетически согласованной диплоидной нормальной образца. Для всех других новых генетических изменений, одновреПодразделения анализ согласованной нормальной ткани значительно упрощает интерпретацию полученных данных мутаций и настоятельно рекомендуется.
Протокол ВЛИЯНИЕ описано здесь демонстрирует последовательность и высокое качество исполнения для замороженных образцов. Мы наблюдали случайные изменчивость при работе с образцами FFPE, однако. В зависимости от возраста и качества образца FFPE, ДНК может быть серьезной деградации или химически модифицированные, и в результате может привести последовательности и анализ трудную 26. Это, как говорится, мы нашли эти экспериментальные условия, чтобы быть надежным для подавляющего большинства образцов FFPE. Мы также успешно применяется этот протокол для характеристики других клинически значимых образцов, таких как биопсия, тонких аспиратов игл и цитологических образцов. Именно по этой причине-гибкость для размещения различных типов образцов различного качества, количества и неоднородность-что этот метод стоит воздействовать диагнозомд лечение онкологических больных в клинической арене.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Бергер получил консультационные услуги и финансирование научных исследований из Фонда медицины, диагностики рака компании.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Агнес Виале и центральной лаборатории MSKCC геномики для технической помощи. Этот протокол был разработан при поддержке Бин онкологический научный центр Джеффри и Фермер Семейства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
