Summary
Vi beskriver fremstillingen af stregkode DNA-biblioteker og efterfølgende hybridisering-baserede exon capture til påvisning af vigtige cancer-associerede mutationer i kliniske tumor prøver af massivt parallelle "næste generation" sekventering. Målrettet exon sekventering tilbyder fordelene ved høj kapacitet, lave omkostninger, og dyb sekvens dækning, hvilket således giver høj følsomhed til at detektere lavfrekvente mutationer.
Abstract
Bestræbelserne på at afsløre og efterforske vigtige onkogene mutationer har vist sig værdifuldt at lette den rette behandling til kræftpatienter. Etableringen af high-throughput, har massivt parallelle "næste generation" sekventering hjulpet opdagelsen af mange sådanne mutationer. For at forbedre klinisk og translationel nytte af denne teknologi, skal platforme være high-throughput, omkostningseffektive og forenelige med formalin-fikseret paraffin indlejret (FFPE) vævsprøver, der kan give små mængder af nedbrudt eller beskadiget DNA. Her beskriver vi udarbejdelse af stregkode og multiplexede DNA-biblioteker efterfulgt af hybridisering-baserede fangst af målrettede exons til påvisning af kræft-associerede mutationer i friske frosne og FFPE tumorer ved massivt parallel sekventering. Denne metode gør det muligt at identificere sekvensmutationer, antal kopier ændringer, og vælg strukturelle omlejringer involverer alle målrettede gener. Målrettet exon sekventering tilbyder tnyder godt af høj kapacitet, lave omkostninger, og dyb sekvens dækning og derved giver høj følsomhed til at detektere lavfrekvente mutationer.
Introduction
Identifikationen af "Driver" tumor genetiske hændelser i vigtige onkogener og tumor suppressor gener spiller en afgørende rolle i diagnosticering og behandling af mange kræftformer 1. Storstilet forskningsindsats udnytte massivt parallelle "næste generation" sekventering har gjort det muligt at identificere mange af disse kræft-associerede gener i de seneste år 2. Men disse sekventering platforme kræver typisk store mængder af DNA isoleret fra friske frosne væv, og dermed udgør en stor begrænsning i karakterisere og analysere DNA-mutationer fra bevarede væv, såsom formalin-fikseret paraffin indlejret (FFPE) tumor prøver. Forbedret indsats for effektivt og pålideligt kendetegner "handlingsrettede" genomisk information fra FFPE tumor prøver vil muliggøre retrospektiv analyse af tidligere opsparede prøver og yderligere at fremme individualiserede tilgange til kræft ledelse.
Traditionelt molekylær diagnostic laboratorier har påberåbt sig tidskrævende, lav-throughput metoder såsom Sanger sekventering og real-time PCR til DNA-mutation profilering. For nylig er der udviklet højere throughput metoder, der udnytter multiplex PCR eller massespektrometrisk genotypebestemmelse at undersøge tilbagevendende somatiske mutationer i vigtige cancer gener 3-5. Disse fremgangsmåder er imidlertid begrænset, idet kun predesignated "hotspot" mutationer analyseres, hvilket gør dem uegnede til detektering inaktiverende mutationer i tumorsuppressorgener. Massivt parallel sekventering giver flere fordele i forhold til disse strategier, herunder evnen til at afhøre hele exons for både almindelige og sjældne mutationer, evnen til at afsløre yderligere klasser af genomiske ændringer såsom kopiere antal gevinster og tab, og større følsomhed i heterogene prøver 6, 7 . Hele genomsekvensering repræsenterer den mest omfattende tilgang til mutation opdagelse, selvom det er relativtly dyrt og pådrager sig store beregningsmæssige krav til dataanalyse og opbevaring.
Til kliniske anvendelser, hvor kun en lille brøkdel af genomet kan være af klinisk interesse, har to særlige nyskabelser i sekventering teknologi været transformative. Dels gennem hybridisering-baserede exon capture, kan man isolere DNA svarende til vigtige cancer-associerede gener for målrettet mutation profilering 8. Dels ved ligatur af molekylære stregkoder (dvs. DNA-sekvenser 6-8 nukleotider i længden), kan man samle hundredvis af prøver pr sekventering løbe og fuldt ud at drage fordel af den stadigt stigende kapacitet på massivt parallelle sekventering instrumenter 10. Når de kombineres, disse nyskabelser muligt tumorer skal profileres for lavere omkostninger og ved højere gennemløb, med mindre beregningsmæssige krav 11. Yderligere, ved at omfordele sekvens dækning til kun de gener mest kritiske til den særlige anvendelse, kan man Achieve større sekventering dybde for højere følsomhed for lav allelfrekvens begivenheder.
Her beskriver vi vores påvirkning assay (Integrated Mutation profilering Actionable Cancer Mål), som udnytter exon fange på stregkode sekvens bibliotekspuljer ved hybridisering hjælp af brugerdefinerede oligonukleotider at indfange alle protein-kodende exons og vælg introns af 279 vigtige cancer-associerede gener (tabel 1 ). Denne strategi gør det muligt at identificere mutationer, indels, kopi nummer ændringer, og vælg strukturelle omlejringer involverer disse 279 gener. Vores metode er kompatibelt med DNA isoleret fra både frisk frosset og FFPE væv samt finnåls-aspirater og andre cytologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. DNA og Reagensforberedelse
Bemærk: Denne protokol beskriver den samtidige behandling og analyse af 24 prøver (fx 12 tumor / normal par), men kan tilpasses til mindre og større partier. DNA-prøver kan stamme fra FFPE eller frisk frosset væv, cytologiske prøver, eller blod. Typisk vil både tumor og normale væv fra den samme patient skal profileres sammen for at skelne mellem somatiske mutationer fra nedarvede polymorfier. Protokollen begynder umiddelbart efter DNA-ekstraktion.
- Afmål 50-250 ng (250 ng anbefales) af ekstraheret DNA per prøve fortyndet i 1x Tris-EDTA (pH 8,0)-buffer til et endeligt volumen på 50 ul, i separate Covaris rundbundede rør.
- Shear DNA på Covaris E220 instrument på følgende shear indstillinger: 360 sek ved 10 pligt faktor, 175 PIP, og 200 cykler pr brast.
- Optø AMPure XP Beads (tabel 2) til stuetemperatur. Optø alle buffers og enzymer på is før det relevante trin.
2. Bibliotek Forberedelse - End Repair Module
- Forbered enden reparation mester mix i et sterilt mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder pr prøve: 10 pi 10x NEBNext End Repair Reaction Buffer (tabel 2), 5 pi NEBNext End Reparation Enzyme Mix (tabel 2), 35 ul sterilt nukleasefrit H 2 O.
- Afmål 50 ul af hver klippet DNA i separate brønde i en 96-brønds plade. Tilsættes 50 ul af den forberedte ende reparation mester mix til hver reaktion. Inkuber i en thermocycler i 30 min ved 20 ° C.
3. Indlæg End Repair Clean-up
- Tilføj 2x volumen (200 ul) af AMPure XP Beads (tabel 2) til hver prøve og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x ved hjælp af en multikanal pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Placer den magnetiske stativ (tabel 2
- Fjern forsigtigt og kassér klar supernatant pas på ikke at forstyrre perlerne. Nogle væske kan forblive i brøndene.
- Med rør på stativet forsigtigt tilsættes 200 pi af frisk fremstillet 80% ethanol til hver prøve og inkuber pladen ved stuetemperatur i 30 sek. Forsigtigt, ethanolen fjernes med pipette.
- Gentag trin 5, for i alt 2 ethanol vaske. Sørg for at alt ethanol er blevet fjernet. Fjern fra den magnetiske stativet og lad tørre ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Resuspender tørrede perler med 44,5 ul sterilt H 2 O. Forsigtigt, pipette hele mængden op og ned 10x blande grundigt. Sørg perler er ikke længere knyttet til side af brønden.
- Inkuber resuspenderede kugler ved stuetemperatur i 2 min. Placer om magnetisk stativ til 5 min, indtil prøven vises klart.
- Overfører forsigtigt 42 pi klar supernatant indeholder prøven til et nyt godt.
Proceduren kan sikkert stoppes på denne mep og prøver opbevaret ved -20 ° C i op til 7 dage. For at genstarte, optø frosne prøver på is, før du fortsætter.
4.. Bibliotek Forberedelse - dA-hale modul
- Forbered dA-hale mester mix i et sterilt mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder pr prøve: 5 pi 10x NEBNext dA-Haledannelsesreaktionen Buffer (tabel 2), 3 pi (3'-5 'exo-) Klenow Fragment (tabel 2 ).
- Tilføj 8 pi af den forberedte dA-hale mester mix til hver brønd med 42 pi udgangen repareret DNA. Inkuber i en thermocycler i 30 min ved 37 ° C.
- Udfør en post dA-hale oprydning: Gentag trin 3,1-3,8 hjælp 2x volumen (100 ul) af perler, men resuspender i sterilt H 2 O til et endeligt volumen på 33,75 gl.
Proceduren kan sikkert stoppes på dette trin og prøver opbevaret ved -20 ° C i op til 7 dage. For at genstarte, optø frosne prøver på is, før du fortsætter. </ Li>
5.. Bibliotek Forberedelse - Adapter æggelederne Module
- Forbered æggelederne mester mix i et sterilt mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder pr prøve: 10 pi 5x NEBNext Quick ligeringsreaktion Buffer (New England Biolabs, tabel 2), 5 mikroliter Quick T4 DNA ligase (Tabel 2).
- Tilføj 15 ul af æggelederne mester mix til hver brønd, der indeholder dA-tailed DNA.
- Tilføj 1,25 pi af den passende 25 uM NEXTflex barcoded adapter (tabel 2) til hver brønd. Hver prøve skal modtage en separat barcoded adapter. Inkuber i en thermocycler i 15 minutter ved 20 ° C.
- Udfør en post adapter ligatur oprydning: Gentag trin 3,1-3,8 bruge 1x volumen (50 ul) af perler, men resuspender i sterilt H 2 O til et endeligt volumen på 50 ul.
- Gentag trin 3,1-3,8 for en anden 1x volumen (50 ul) oprydning, men resuspender i sterilt H 2 O til enslutvolumen på 23 ul.
Proceduren kan sikkert stoppes på dette trin og prøver opbevaret ved -20 ° C i op til 7 dage. For at genstarte, optø frosne prøver på is, før du fortsætter.
6.. Library Amplification
- Forbered KAPA HiFi mester mix i et sterilt mikrocentrifugerør ved hjælp af følgende mængder per prøve: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (tabel 2), 1 ml hver af 100 uM Primer 1 og Primer 2 (tabel 3).
- Tilføj 27 ul af master mix til hver brønd indeholdende ligeringsproduktet. Indstil pipette til 50 ul og pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x.
- Anbringes i thermocycler for følgende PCR-cykler: indledende denaturering 45 sekunder ved 98 ° C, 10 cykler af 15 sekunder ved 98 ° C, 30 sek ved 60 ° C, 30 sek ved 72 ° C, og den endelige forlængelse af 1 min ved 72 ° C.
- Udfør en post forstærkning oprydning: Gentag trin 3,1-3,8 hjælp1x volumen (50 ul) af AMPure XP perler, og resuspender i sterilt vand til et samlet volumen på 30 ul.
- Kvantificere koncentrationen af hvert bibliotek ved hjælp Qubit Broad Range Assay (Life Technologies, tabel 2) i henhold til producentens anvisninger.
7.. Roche NimbleGen SeqCAP EZ Bibliotek Hybridization, Wash, og Amplification
- Optø universelle og indeksere oligonucleotid blokkere (tabel 3), SeqCap EZ Bibliotek, og NimbleGen capture komponenter (COT DNA, 2x hybridiseringsbufferkomponenterne, og hybridisering komponent A, tabel 2) på is. Alle oligonucleotid blokkere gemmes i arbejdsgrupper lagre af 1 mM. Vores SeqCap EZ Bibliotek er et specialdesignet pulje af indfangningsprober omfatter alle protein-kodende exons af 279 kræft-associerede gener, selv om andre brugerdefinerede og katalog design kan anvendes.
- Forbered en 1 mM pulje af indeks oligonukleotid blokkere svarende til de specifikke barcoded annonceaptor sekvenser anvendes i biblioteket forberedelse. Kombiner 1 pi af hver blocker, og vortex.
- I en ny steril 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsættes 5 ul 1mg/ml COT DNA, 2 pi 1 mM universel blokker og 2 pi af 1 mM pulje af indeks oligonukleotid blokkere.
- Pool 24 stregkodede biblioteker i en enkelt reaktion. Tilføj alt 1-3 ug samlet, barcoded sekvens bibliotek (fremstillet ovenfor) til opsamling blanding. For 24 prøver, anbefales 100 ng per prøve. Når pooling tumorer og matchede normale prøver, anbefalede vi tilføje flere tumor bibliotek (fx 100 ng pr tumor og 50 ng pr normal), så de bliver sekventeret til større dybde i dækningen.
- Glasset lukkes kasket og gøre 15-20 huller i toppen af låget med en 18-20 G eller mindre nål. Speed Vac de amplificerede prøve Bibliotek / COT DNA / oligoer i en DNA vakuum koncentrator på (60 ° C), høj varme.
- Endnu en helt tørret ned, rehydrere med 7,5 ul 2x hybridining buffer og 3 pi hybridisering komponent A. Røret skal nu indeholde følgende: 5 ug COT DNA, variabel ug forstærket prøve bibliotek, 1000 pmol af Universal og indeks Oligos, 7,5 ul 2x hybridiseringspuffer, 3 pi hybridisering komponent A i en samlet volumen på 10,5 pl.
- Dæk hullerne i hætten med et lille stykke af laboratorie tape. Vortex prøven til 10 sekunder og centrifugeres ved maksimal hastighed i 10 sek.
- Prøven inkuberes ved 95 ° C i 10 minutter for at denaturere DNA'et, efterfulgt af centrifugering ved maksimal hastighed i 10 sekunder ved stuetemperatur.
- I et nyt 0,2 ml PCR-bånd rør, forberede 2,25 pi alikvot af SeqCap EZ Bibliotek indfangningsprober og 2,25 pi sterilt nukleasefrit H2O og føje indholdet i trin 7.7. Pipettér forsigtigt hele mængden op og ned 10x.
- Inkuber i en thermocycler ved 47 ° C i 48-96 timer. Indstille og opretholde den termiske cykler låg temperatur til 57 ° C.
- Follave trin i kapitel 6 NimbleGen SeqCap EX Library SR Brugervejledning v3.0 (tabel 2) til vask og genopretning af den erobrede DNA.
- Følger trin i kapitel 7 i Roche NimbleGen protokol til forstærkning af den erobrede DNA med følgende ændringer:
- Brug 2x KAPA HiFi Polymerase (tabel 2) i stedet for Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
- Brug 100 uM Primer 1 og Primer 2 opført i tabel 3.
- Kør følgende PCR-betingelser: indledende denaturering ved 98 ° C i 30 sekunder, 11 cykler af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder, og den endelige forlængelse ved 72 ° C i 5 min . Hold ved 4 ° C.
- Kvantificere koncentrationen af det amplificerede fanget DNA under anvendelse Qubit høj følsomhed assay (tabel 2) i henhold til producentens anvisninger.
- Analyser erobrede DNA ved hjælp af Agilent Bio kvalitetanalysator DNA HS chip (tabel 2) i henhold til producentens anvisninger.
- PCR udbytte skal være mindst 100 ng (interval 100-1.000 ng).
- Den gennemsnitlige længde fragment bør være mellem 150-400 basepar.
8.. Illumina Hi-Seq sekventering
- Fortynd den forstærkede fanget DNA til 14:00, og indlæse prøven på en enkelt bane af en Illumina HiSeq 2000 flow celle. Sequence parret ende 75 basepar læser ifølge producentens anvisninger. Det er vores erfaring, én vognbane er tilstrækkelig til at producere 500-700x unik sekvens dækning per prøve tværs 279 gener for en pulje af 24 prøver.
- Illumina software (Real Time Analysis) vil omdanne billeder i høj opløsning til klynge intensiteter at basere opkald og kvalitetsresultater. Brug casava at demultiplex data i henhold til stregkode identitet og generere individuelle FASTQ filer for hver prøve.
9.. Oplysninger Analradiokemiske analyser
- Trim adapter sekvenser fra 3 'enden af sekvens læser i FASTQ filer ved hjælp Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). Den mindste overlap længde (-O) er 3 med en fejlprocent (-e) på 1%. Den mindste basis længde for fastholdelse af parret læser efter beskæring er 25.
- Juster sekvens læser til reference menneskelige genom hg19 vha. Burrows-Wheeler Aligner værktøj (BWA) 12.. Udføre efterbehandling trin, herunder eksemplarer mærkning, lokal multipel sekvens kursjustering, og base kvalitet score rekalibrering hjælp Genome Analysis Toolkit (GATK) i henhold til deres standard bedste praksis ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = bedste praksis ) 13.. Når profilering flere prøver fra samme patient (f.eks matchede tumor og normal), bør lokal multipel sekvens kursjustering være udøvetMED fællesskab. Produktionen af disse post-procestrin er en separat BAM fil for hver prøve, som indeholder alle sekvens, kvalitet og information tilpasning og kan indlæses direkte i Integrativ Genomics Viewer (IGV) til visualisering af læser og sekvensvarianter 14.
- Beregn sekvens effektivitetsmålinger hjælp Picard værktøj ( http://picard.sourceforge.net/ ). Informativ målinger omfatter tilpasning sats, fragment størrelse distribution, GC-indhold er forbundet dækning bias, on target capture specificitet, PCR duplikere rate, bibliotek kompleksitet og betyde target dækning. Repræsentative værdier er vist i figur 1. Allelhyppigheder ved de fælles polymorfi sites beregnet ved DepthOfCoverage fra GATK anvendes til at overvåge forureningen fra uafhængige DNA og sikre, at matchede prøver kom fra de samme patienter.
De følgende beregningsmæssige analyser afhænger af tilstedeværelsen af matchedetumor og normale prøver til påvisning af somatiske genetiske forandringer. Uovertruffen tumorer kan også analyseres ved hjælp af en særskilt normal kontrolprøve, men de fleste somatiske mutationer ikke let kan skelnes fra nedarvede sekvens varianter. - Ring somatiske enkelt nukleotid varianter (SNVs) for hver tumor-normal par ved hjælp af en somatisk mutation ringer, såsom muTect 15. SomaticSniper 16 eller Strelka 17.. Vi bruger muTect med modificerede filtrering kriterier, der giver mulighed for varianter med lav (nul) allel tæller i normal prøve, så længe Allelfrekvensen mindst 5x større i tumor. Varianter gentagne kaldes i et panel af normale DNA fjernes som sandsynlige systematiske artefakter af sekventering eller justeringen. Hver SNV passerer filtre derefter nøje gennemgået hjælp IGV.
- Ring somatiske indels for hver tumor-normal par hjælp algoritmer såsom SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 eller SOAPindel 19
- Ekstrapolere antal kopier status fra sekvensen dækning på target exons. For hver enkelt prøve, skal du udføre en Løss normalisering af gennemsnitlig sekvens dækning for alle målgrupper exons, regression løbet GC procent. Juster unnormalized dækning værdier ved at trække Løss pasform og tilføje prøven hele median dækning. Beregn forholdet i normaliseret sekvens dækning på tværs af alle målgrupper exons for tumor-normal par. I mangel af et matchet normal prøve og / eller for at mindske støj, andre kønsmatchet diploidnormale kontroller mangler kimlinie kopital varianter kan anvendes. Bestem somatiske kopi nummer gevinster og tab på grundlag af stigninger eller fald i dækningsgraden.
- Ring somatiske omarrangeringer involverer kræft gener, hvor mindst én genomisk breakpoint falder inden for eller i nærheden af en målrettet interval af genomet. Foreslåede algoritmer omfatter GASV 20 Breakdancer 21. CREST 22 og Dranger 23. Intrakromosomal inversioner, deletioner og tandemduplikationer kan skelnes baseret på den relative position og orientering af støtte læser i diskordante par. Alle ansøgerlande rearrangements skal manuelt gennemgået hjælp IGV. Vi anbefaler eksperimentel validering af PCR og Sanger sekventering på tværs af de formodede omlejring breakpoints.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En pulje på 24 stregkodede sekvens biblioteker (12 tumor-normal par) blev fanget ved hjælp af sonder, der svarer til alle protein-kodende exons af 279 kræft gener og sekventeret som 2 x 75 bp læser på en enkelt bane i en HiSeq 2000 flow-celle. Tumor og normale biblioteker blev samlet i forholdet 2:1. Prøve performancemetrikker for en pulje af frosne DNA-prøver tumor er vist i figur 1, herunder tilpasning rate, fragment størrelsesfordeling på target capture specificitet og betyder target dækning. Eksempel somatiske mutationer, er insertioner, deletioner og kopital ændringer er vist i figur 2-4.
Figur 1. Repræsentative tal af sekvensen effektivitetsmålinger. a) klynge tæthed og tilpasning rate, b) betyder target dækning,
Figur 2. Integrative Genomics Viewer (IGV) billede, der viser specificitet sekvens dækning på exons af EGFR i et lungekræft (øverst) og matchede normale væv (nederst). Grå søjler repræsenterer unik sekvens læser. Til højre, en heterozygot T> G mutationen er til stede i 24% af læser i tumoren og 0% af læser i den normale, hvilket indikerer, at det er en somatisk L858R aminosyresubstitution. Klik her for at se større billede .
3 "fo: content-width =" 6tommer "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Eksempler på indels i en kolorektal cancer tumor-normal par:.. A) Somatisk læserammeforskydning indsættelse i APC b) Somatisk læserammeforskydningssted sletning af 7 basepar i TP53 Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Kopier nummer ændringer i en tumor-normal par. Hvert datapunkt repræsenterer et enkelt exon fra 279 target gener. Kopiér nummer gevinster og tab udledes stigninger og fald i tumor sekvens dækning. Klik her for at se større billede .
Tabel 1: Probe Design Egenskaber for Target Capture.
| Samlet exons | 4.535 |
| Samlet introns | 14 |
| SNPs * | 1042 |
| Samlet mål område | 879.966 basepar |
| Samlet sonde område | 1.400.415 basepar |
Tabel 2. Reagenser og Kits.
| NavnReagens / Material | Firma | Catalog Number |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-hale Module | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Quick æggelederne Module | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free Stregkoder - 24 | Bioo Scientific | 514.103 |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 |
| COT menneskelige DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ hybridisering og vask kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| SeqCap EZ Bibliotek Lokkemad | Roche NimbleGen | |
| QIAquick PCR oprensningskit | Qiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit dsDNA Høj følsomhed (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Tabel 3. Indeks Oligo blokkere & Primere sekvenser.
| TS-HE Universal Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE indeks 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE indeks 5 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 6 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE indeks 7. Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE indeks 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 10 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 11 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 12 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 13 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 14 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 15 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 16 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 20 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 25 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Primer 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores IMPACT assay giver en høj tilpasning, høj on target rate, højt mål dækning og høj følsomhed til påvisning af mutationer, indels, og eksemplarnummer ombygninger. Vi har demonstreret evnen til vores IMPACT assay til DNA-sekvens fra både frisk frosset og arkiveres FFPE prøver af lav DNA input. Ved at udføre målrettet exon sekventering af vigtige cancer-associerede gener, kan man opnå meget dyb sekvens dækning for exons af disse mest kritiske gener dermed maksimere evnen til at detektere lavfrekvente mutationer. Brugen af stregkoder og multiplexing giver højere overførselshastighed, lavere omkostninger pr prøve, og lavere input mængder af DNA.
En fordel ved den målrettede metode er, at det er muligt at optimere indfangningsprober, således at alle exoner er dækket ensartet og tilstrækkelig til mutationsdetektion. Som vist i tabel 1, vores design omfatter 4.535 exons i 279 gener. Efter iterative forbedringervores design, et typisk sekventering eksperiment producerer ikke mere end 2% af exoner på mindre end 20% af medianen dækning for hele prøven. Således for en tumor sekventeret til 500x sekvens dækning (et konservativt skøn, som vist i figur 1),> 98% af exons vil blive dækket af> 100x dybde, der garanterer høj følsomhed til at identificere lavfrekvente mutationer. Denne ensartethed af dækning kan i vid udstrækning tilskrives den fleksibilitet NimbleGen SeqCap-systemet, hvor sonder kan syntetiseres til forskellige længder i regioner med forskellig nukleotid sammensætning. Vi har også med succes brugt individuelt syntetiserede biotinylerede oligonukleotider fra integrerede DNA Technologies (IDT) at tilføje nyt indhold til vores panel og at øge dækningen af de regioner, der er vanskelige at indfange og / eller sekvens. Ved også at indfange udvalgte introns af gentagne omarrangerede gener, vi er i stand til at identificere strukturelle omarrangeringer producerer fusion gener, selv når kun én fusion partner er fanget.
Denne målrettede sekventering tilgang er i besiddelse to største begrænsninger i evnen til at opdage "fører" genetiske ændringer i tumorer. Først er det kun en brøkdel af genomet udspørges. Målrettet sekventering er i sagens natur begrænset. Som nye kræft gener frem fra systematiske genomics indsats, kan de hurtigt tilsat til en opsamling panel, men funktionelt vigtige mutationer kan blive savnet der vil blive detekteret af hele genomet eller hele exome sekventering. For det andet, det er begrænset til DNA-baserede ændringer. Påvisning af afvigende udtrykte udskrifter, nye splejsningsisoformer og genfusioner kræver RNA-Seq eller lignende teknikker 24. Epigenetiske ændringer såsom kromatin modifikationer og DNA-methylering kan også spille centrale roller i tumorigenese og tumor progression. Som sekventering teknologier fortsætte med at forbedre, kan man forestille integrerede strategier beskæftiger hele genomet sekventering, RNA-Seq og supplerende ApproaChes at omfattende karakterisere den genetiske og epigenetiske make-up af individuelle tumorer på en rutinemæssig basis 25. Som komplette integrerede strategier er i øjeblikket omkostnings-og beregningsmæssigt uoverkommelige, målrettet sekventering præsenterer en praktisk alternativ til at fange de mest iøjnefaldende genomiske funktioner til kliniske og translationelle applikationer.
Vores protokol forudsætter, at tumorer er sekventeret parallelt matchede normale væv taget fra den samme patient. Formålet med denne normale kontrol er at fastslå, om sekvensvarianterne detekteret i tumoren er nedarvede eller somatisk erhvervet. I mangel af et matchet normal, kan man udlede, at varianter forekommer på mutationsstudier hotspots (dvs. steder af tilbagevendende somatiske mutationer i andre kræftformer) er tilbøjelige til at være somatisk. Endvidere kan der udføres analyse af kopital gevinster og tab med en ikke-genetisk matchede diploide normal prøve. For alle andre nye genetiske ændringer, den samtiskellige analyser af matchede normale væv forenkler fortolkning af de resulterende mutationsdata og kan varmt anbefales.
IMPACT-protokollen beskrevet her demonstrerer ensartethed og høj kvalitet ydeevne for frosne prøver. Vi har observeret lejlighedsvise variabilitet når du arbejder med FFPE prøver, selv om. Afhængigt af alder og kvaliteten af FFPE prøven kan DNA være stærkt nedbrudte eller kemisk modificeret, og som et resultat kan gøre sekventering og analyse vanskelig 26. Det er sagt, har vi fundet disse eksperimentelle betingelser for at være pålidelige, når det store flertal af FFPE prøver. Vi har også med succes anvendt denne protokol til at karakterisere andre klinisk relevante prøver såsom biopsier, fine nål aspirater og cytologiske prøver. Det er af denne grund, fleksibilitet til at rumme forskellige typer af enheder af varierende kvalitet, mængde og heterogenitet-at denne metode står til at påvirke diagnosen end behandling af kræftpatienter i den kliniske arena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Berger har modtaget konsulenthonorar og forskningsstøtte fra Foundation Medicine, en kræftdiagnostik selskab.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Agnes Viale og MSKCC Genomics Core Laboratoriet for teknisk bistand. Denne protokol blev udviklet med støtte fra Geoffrey Beene Cancer Research Center og Farmer Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
