Summary
Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.
Abstract
Anahtar onkojenik mutasyonları tespit ve araştırmak için çabalar kanser hastaları için uygun tedaviyi kolaylaştırmak değerli kanıtlanmıştır. Yüksek verimlilik kurulması, kitlesel paralel "yeni nesil" dizileme gibi pek çok mutasyonların keşif destekli vardır. Bu teknolojinin klinik ve yorumsal programını geliştirmek için, platformlar, yüksek verimlilik, maliyet-etkin, ve bozulmuş veya hasar görmüş DNA'nın küçük miktarlarda verim olabilir (FFPE) doku örnekleri gömülü formalin ile fikse parafin ile uyumlu olmalıdır. Burada, büyük ölçüde paralel dizilemesi ile taze, dondurulmuş ve FFPE tümörlerde kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için hedeflenen eksondan olan hibridizasyon-bazlı yakalama ardından Barkodlanan ve birden fazla mesaj göndermiş DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını tarif etmektedir. Bu yöntem, dizi mutasyonların tanımlanmasını sağlayan numara değişiklikleri kopyalamak ve hedeflenen tüm genleri içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Hedefli ekson dizileme t sunuyorO nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık kazandırmak, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama yararlanır.
Introduction
Anahtar onkogenler ve tümör baskılayıcı genler "sürücü" tümör genetik olayların tanımlanması birçok kanser 1'in tanı ve tedavisinde önemli bir rol oynar. Kitlesel paralel "yeni nesil" sıralamasını kullanan büyük ölçekli araştırma çabaları son yıllarda 2 gibi pek çok kanser ilişkili genlerin belirlenmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, bu dizilim, genellikle bu nedenle bu tür platformlar (FFPE) tümör örnekleri gömülü formalinle sabitlenmiş parafin gibi korunmuş dokulardan DNA mutasyonlarının karakterize ve analiz önemli bir sınırlama poz dondurulmuş dokulardan izole DNA büyük miktarlarda gerektirir. Verimli ve güvenilir FFPE tümör örneklerinden "eyleme" genomik bilgilerini karakterize etmek için geliştirilmiş çabalar önceden saklanmış örneklerin retrospektif analizini sağlayacak ve daha fazla kanser yönetimine bireysel yaklaşımları teşvik edecektir.
Geleneksel olarak, moleküler diagnostic laboratuarlar, DNA mutasyon profilleme için Sanger dizileme ve gerçek-zamanlı PCR gibi zaman alıcı, düşük hacimli metodolojileri yararlanmıştır. Daha yakın bir zamanda, çok katlı PCR veya kütle spektroskopisi genotipleme kullanan daha verimli yöntemler anahtar kanser genlerinin 3-5 tekrarlayan somatik mutasyonları incelemek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, ancak, sadece önceden belirlenmiş bir "sıcak nokta" mutasyonlar tümör baskılayıcı genlerin in etkisiz mutasyonları tespit etmek için uygun olmayacak hale getirmeyecek, tahlil edilir olması ile sınırlıdır. Devasa paralel dizilim yaygın ve nadir iki mutasyonlar için tüm eksonları sorgulamak için yeteneği, böyle bir kopya sayısı karı ve zararı olarak genomik değişiklikler ek sınıfları ortaya çıkarmak için yetenek ve heterojen örnekleri 6, daha yüksek algılama hassasiyeti dahil olmak üzere bu stratejileri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor 7 . Göreceli olsa tüm genom dizileme, mutasyon keşif için en kapsamlı yaklaşımı temsilly pahalı ve veri analizi ve depolama için büyük hesaplama talepleri doğurur.
Genomunun sadece küçük bir kısmı klinik ilgisini çekebilir klinik uygulamalar için, dizileme teknolojisindeki iki özel yenilikler dönüştürücü olmuştur. İlk olarak, hibridizasyon-bazlı exon yakalama ile, bir, hedefli mutasyon profil 8 için önemli kanserle ilişkili genlere karşı gelen DNA izole edebilir. İkincisi, moleküler barkod (yani DNA dizileri uzunluğunda 6-8 nükleotid) ligasyonu ile, bir sıralama çalışma başına örneklerin yüzlerce havuz ve tam kitlesel paralel dizilim araçların 10 artan kapasitesi yararlanmak. Kombine edildiğinde, bu yenilikler küçük hesaplamalı gereksinimleri 11 ile, düşük maliyet için profilli olması tümörleri sağlamak ve daha yüksek debisinde. Bundan başka, özel bir uygulama için en önemli yalnızca genlerle olan sekans kapsama tekrar dağıtarak, tek bir achie olabilirdüşük allel sıklığı olaylar için daha yüksek algılama hassasiyeti için daha fazla sıralama derinliği ettik.
İşte biz (tüm protein kodlayan ekzon yakalamak ve 279 anahtar kanserle ilişkili genlerin intronlan seçmek için özel oligonükleotidler kullanarak melezleme ile barkodlu sıra kütüphane havuzları ekson yakalama kullanır bizim ETKİ tahlili (Actionable Kanser Hedefler Entegre Mutasyon profil), tarif Tablo 1 .) Bu strateji mutasyonlar, indellerin, kopya sayısı değişikliklerin belirlenmesini sağlar ve bu 279 geni içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Bizim yöntem taze, dondurulmuş ve FFPE dokusu yanı sıra ince iğne aspiratları ve diğer sitoloji örneklerinde hem de izole edilen DNA ile uyumludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. DNA ve Reaktif Hazırlama
Not: Bu protokol, 24 numune (örneğin, 12, tümör / normal çifti), eş zamanlı olarak işleme ve analizi tarif etmektedir, ancak daha küçük ve daha büyük kümeler için uyarlanabilir. DNA örnekleri FFPE veya taze dondurulmuş doku, sitolojik örnekler, veya kan kaynaklanıyor olabilir. Tipik olarak, aynı hastadan alınan tümör ve normal doku her iki kalıtsal polimorfizmlerinin somatik mutasyonlar ayırmak için birlikte profilli olacaktır. Protokol hemen DNA ekstraksiyonu takip başlar.
- Kısım 50-250 ng 1x Tris-EDTA içerisinde seyreltilmiş numune başına edilen DNA, (pH 8.0), ayrı Covaris yuvarlak tabanlı tüp içine, 50 ul'lik nihai bir hacme kadar tampon (250 ng önerilir).
- 10 görev faktörü, 175 PIP, ve patlama başına 200 devirde 360 sn: Aşağıdaki kesme ayarlarında Covaris E220 cihaz üzerinde DNA Kayma.
- Oda sıcaklığına AMPure XP Boncuklar (Tablo 2) çözülme. Tüm met Çözülmeönce uygun aşamasından buz üzerinde ffers ve enzimler.
2. Kütüphane Hazırlık - End Tamir Modülü
- Örnek başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü uç onarım ana karışım hazırlayın: 10x NEBNext End tamir Reaksiyon Tamponu (Tablo 2) 10 ul, 5 ul NEBNext End Enzim Mix (Tablo 2) tamir, 35 ul steril nükleaz free H 2 O.
- 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı ayrı her bir kesilen DNA 50 ul kısım. Her reaksiyona hazırlanan uç onarım ana karışımı 50 ul ekleyin. 20 ° C'de 30 dakika boyunca bir PCR inkübe
3. Mesaj sonu Onarım Temizlik-up
- Her bir örnek için AMPure XP Boncuk (Tablo 2) 2x hacmi (200 ul) ekleyin ve hafifçe bir çok kanallı pipet kullanarak yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Manyetik stand (Tablo 2 yerleştirin
- Hafifçe kaldırın ve boncuk rahatsız etmemek için açık yüzer özen göstererek atın. Bazı sıvı kuyularda kalabilir.
- Standında borular ile, yavaşça, her numune için taze hazırlanmış% 80 etanol içinde 200 ul ekleyin ve 30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Dikkatle, pipetle etanol çıkarın.
- 2 etanol yıkar, toplam 5. adımı tekrarlayın. Emin, tüm etanol kaldırıldı. Manyetik standından çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- 44.5 ul steril H 2 O. ile kurutulmuş boncuk tekrar Yavaşça, pipet tüm hacmi yukarı ve aşağı 10x iyice karıştırma. Emin boncuk artık kuyunun tarafına bağlıdır.
- 2 dakika boyunca oda sıcaklığında süspanse boncuk inkübe edin. Numune berrak görünene kadar 5 dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirin.
- Yavaşça yeni bir kuyuya örnek içeren berrak süpernatant 42 ul aktarın.
Prosedür güvenle bu st durdu olabilirep ve 7 güne kadar -20 ° C'de saklanır örnekleri. , Yeniden başlamadan önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme.
4. Kütüphane Hazırlık - dA-atık Modülü
- 10x NEBNext dA-atık Reaksiyon Tamponu (Tablo 2), 3 ul (3'-5 '-ekzo) Klenow Fragment (Tablo 2 5 ul: örnek için, aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde dA-atık ana karışımı hazırlayın .)
- Her iyi son tamir DNA 42 ul içeren için hazırlanan dA-atık ana karışımı 8 ul ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir PCR inkübe
- DA-atık bir yayın gerçekleştirmek temizlik: Tekrar 33.75 ul'lik nihai bir hacme kadar steril H2O içinde 2x boncuk hacim (100 ul), fakat tekrar süspansiyon kullanılarak 3,1-3,8 adımları tekrarlayın.
Bu işlem güvenli bir şekilde bu aşamada ve 7 güne kadar -20 ° C'de saklanan numunelerde durdurulabilir. , Yeniden devam etmeden önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme. </ Li>
5. Kütüphane Hazırlık - Adaptör ligasyon Modülü
- 5x NEBNext Quick Ligation Reaksiyon Tamponu (New England Biolabs, Tablo 2), 5 ul T4 DNA ligaz Quick (Tablo 2) 10 ul: örnek için, aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde Ligation ana karışımı hazırlayın.
- Her iyi dA-Kuyruklu DNA içeren için ligasyon ana karışımı 15 ul ekleyin.
- Her bir oyuğa, uygun 25 uM NEXTflex Barkodlanan adaptörü (Tablo 2), 1.25 ul ekleyin. Her örnek ayrı bir barkodlu adaptörü almak gerekir. 20 ° C'de 15 dakika boyunca bir PCR inkübe
- 50 ul bir son hacme kadar steril H2O içinde tekrar boncuk 1x hacmi (50 ul) kullanılarak 3,1-3,8 adımları, ancak tekrar süspansiyon: sonrası bir adaptör ligasyon clean-up yapın.
- Tekrar ikinci bir 1x hacmi (50 ul) temiz-up için 3,1-3,8 adımları, ancak steril H 2 O tekrar süspansiyon23 ul nihai hacim.
Bu işlem güvenli bir şekilde bu aşamada ve 7 güne kadar -20 ° C'de saklanan numunelerde durdurulabilir. , Yeniden başlamadan önce buz üzerinde donmuş örnekleri çözülme.
6. Kütüphane Amplifikasyon
- 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tablo 2), 1 ul 100 uM kapsül 1 ve kapsül 2 (Tablo 3) her biri: örnek başına aşağıdaki miktarlar kullanılarak steril mikrosantrifüj tüpü içinde KAPA HiFi ana karışımı hazırlayın.
- Her bir ligasyon ürünü ihtiva etmek için ana karışımı 27 ul ekle. 50 ul pipet seti ve yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle.
- Aşağıdaki PCR döngü PCR in yerleştirin: 98 ° C'de 45 saniye ilk denatürasyon, 98 ° C, 60 ° C'de 30 saniye 15 saniye 10 döngü, 30 ° C'de 72 saniye, 1 dakika ve son uzatma 72 ° C'de
- Bir post amplifikasyon temiz-up gerçekleştirin: yineleyin kullanarak 3,1-3,8 adımları1x AMPure XP Boncuk hacmi (50 ul), 30 ul bir son hacme kadar steril su içinde tekrar süspansiyon.
- Üreticinin talimatlarına göre Qubit Broad Range Assay (Life Technologies, Tablo 2) kullanılarak her bir kütüphane konsantrasyonunu ölçmek.
7. Roche NimbleGen SeqCAP EZ Kütüphane Hibridizasyon, Yıkama ve Amplifikasyon
- Buz üzerinde Çözülme genel ve dizin oligonükleotid blokerleri (Tablo 3), SeqCap EZ Kütüphane ve NimbleGen yakalama parçaları (COT DNA, 2 x hibridizasyon tampon maddesi, ve hibridizasyon bileşen A, Tablo 2). Bütün oligonükleotit bloke 1 mM'lik çalışma stokları saklanır. Bizim SeqCap EZ Kütüphane diğer özel ve katalog tasarımları kullanılabilir olsa, 279 kanser-ilişkili genlerin tümü protein kodlama eksonları kapsayan yakalama probları özel tasarlanmış yüzme havuzu bulunmaktadır.
- Özel barkodlu reklama karşılık endeks oligonükleotid bloker 1 mM havuzu hazırlayınKütüphane hazırlanmasında kullanılan aptor dizileri. 1. Her bloker ul ve vorteks birleştirin.
- Yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde, 1mg/ml COT DNA 5 ul, 1 mM evrensel bloker 2 ul ve endeks bloker oligonükleotid havuzu 1 mM 2 ul ekle.
- Tek bir reaksiyon içine Pool 24 barkodlu kütüphaneler. Yakalama karışımına (yukarıda hazırlanan) bir araya getirilmiş, barkodlu dizisi kütüphanesi 1-3 ug toplam ekleyin. 24 örnekleri için, örnek başına 100 ng önerilir. Tümör ve karşılık gelen normal örnekleri havuzu, biz bu kapsama daha derin için dizilenmiştir, böylece daha fazla tümör kütüphanesi (tümör ve normal başına 50 ng örneğin 100 ng) eklenmesi tavsiye edilir.
- Tüpün kapağını kapatın ve bir ya da daha küçük 18-20 G iğne ile başlığın üst 15-20 delik açın. Speed Vac yüksek ısıda (60 ° C) üzerinde bir DNA vakum yoğunlaştırıcısında güçlendirilmiş örnek kütüphane / TIK DNA / oligolar.
- Kez tamamen aşağı kurutulmuş, 2x hybridi 7.5 ul rehydratekıymetleştirme tampon ve melezleme bileşen A. 3 ul tüpü şimdi aşağıdaki içermelidir: 5 ug TIK DNA, değişken ug güçlendirilmiş örnek kütüphane, Universal ve Endeks Oligos 1000 pmol, 7.5 ul 2x melezleme tamponu, bir 3 ul melezleme A bileşeni 10.5 ul toplam hacmi.
- Laboratuvar bant küçük bir parça ile kapağı delikleri örtün. Vortex 10 saniye boyunca en yüksek hızda 10 sn için ve santrifüj için örnek.
- Oda sıcaklığında 10 saniye boyunca en yüksek hızda santrifüjleme ve ardından DNA'yı denatüre etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C 'de örnek inkübe edin.
- Yeni bir 0.2 ml PCR strip tüpünde, SeqCap EZ Kütüphane yakalama prob ve steril nükleaz ücretsiz H 2 O 2.25 ul 2.25 ul kısım hazırlamak ve adım 7.7 içeriğini ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı 10x tüm hacmi pipetle.
- 48-96 saat boyunca 47 ° C'de bir termal döngüleyici içinde inkübe edin. Ayarlamak ve 57 ° C'ye kadar termal döngü kapağının ısısını korumak
- Folyıkama ve yakalanan DNA kurtarma için NimbleGen SeqCap EX Kütüphanesi SR Kullanım Kılavuzu v3.0 (Tablo 2) Bölüm 6 düşük adımlar.
- Şu değişiklikler ile çekilen DNA'nın amplifikasyonu için Roche NimbleGen protokol Bölüm 7 adımlar takip eder:
- Yerine Phusion Yüksek Sadakat PCR Master Mix 2x KAPA HiFi Polimeraz (Tablo 2) kullanın
- Tablo 3'te listelenen 100 uM kapsül 1 ve kapsül 2 kullanın.
- 30 saniye boyunca 98 ° C de ilk denatürasyon, 10 saniye boyunca 98 ° C 11 döngü, 30 saniye için 60 ° C, 30 saniye için 72 ° C ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma: Aşağıdaki PCR koşulları çalıştırın . 4 ° C'de tutun
- Üreticinin talimatlarına göre Qubit Yüksek Hassasiyet Testi (Tablo 2) kullanılarak amplifiye çekilen DNA'nın konsantrasyonunu ölçmek.
- Agilent Bio kullanarak yakalanan DNA kalitesini analizDNA analiz HS yonga (Tablo 2), üretici talimatlarına göre.
- PCR verimi en az 100 ng (aralık 100-1.000 ng) olmalıdır.
- Ortalama fragman uzunluğu 150-400 baz çifti arasında olmalıdır.
8. Illumina Hi-Seq Sıralama
- 14:00 için büyütülmüş DNA yakalanan seyreltin ve bir Illumina HiSeq 2000 akış hücresinin bir tek şeritli örnek yükleyin. Dizi eşleştirilmiş uç 75 baz çifti, üreticinin talimatlarına uygun olarak okur. Deneyimlerimize göre, tek bir şerit 24 numune üzerinde havuzu için 279 genler arasında, örnek başına 500-700x benzersiz dizi kapsama üretmek için yeterlidir.
- Illumina yazılım (Gerçek Zamanlı Analizi) aramaları ve kalite puanları tabanına küme yoğunlukları yüksek çözünürlüklü görüntüleri dönüştürmek olacaktır. Barkod kimliğe göre veri çoklaması ve her numune için ayrı fastq dosyaları oluşturmak için casava kullanın.
9. Veri AnalYsis
- Dizisinin 3 'ucundan Trim adaptör dizileri Cutadapt (kullanarak fastq dosyaları okur http://code.google.com/p/cutadapt/ ). Minimum örtüşme uzunluğu (= O)% 1 hata oranına (-e) ile 3'tür. Eşleştirilmiş tutulması için asgari taban uzunluğu 25 olan kesme sonra okur.
- Hizalama dizisi Burrows-Wheeler Hizalayıcı aracını (BWA) 12 kullanılarak referans insan genomu hg19 okur. Kendi standart en iyi uygulamalar (göre Genom Analizi Toolkit (GATK) kullanarak işaretleme yinelenen, yerel birden dizisi yeniden düzenlenmesi ve baz kalite puanı kalibrasyon dahil olmak üzere post-processing adımları gerçekleştirin http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? = iyi uygulamaları isim ) 13. , Aynı hastadan alınan çok sayıda örneğin (örn. eşleşen tümör ve normal) profil zaman, lokal çoklu dizi yeniden düzenleme perfor olmalıdırortaklaşa Med. Bu post-processing adımları çıktısı tüm dizisi, kalite ve uyum bilgilerini içerir ve okur ve sıra 14 varyantları görselleştirme için Bütünleştirici Genomics Görüntüleyici (IGV) doğrudan yüklenebilir her numune için ayrı bir BAM dosyadır.
- Picard araçlarını kullanarak dizisi performans ölçümlerini hesaplayın ( http://picard.sourceforge.net/ ). Bilgilendirici ölçümleri uyum oranı, fragmanı boyut dağılımı, GC-içerik ilişkili kapsama önyargı, üzerinde hedef yakalama özgünlük, PCR çoğaltmak oranı, kütüphane karmaşıklığı ve hedef kapsama anlamına içerir. Örnek değerleri, Şekil 1 'de gösterilir. GATK ikinci DepthOfCoverage kullanılarak hesaplanmıştır ortak polimorfizm sitelerde alel frekansları olmayan DNA kontaminasyonu izlemek için ve bu eşleştirilmiş numuneler, aynı hastadan gelen sağlamak için kullanılır.
Aşağıdaki hesaplama analizler eşleştirilmiş varlığına bağlıdırsomatik genetik değişikliklerin saptanması için, tümör ve normal örnekleri. Eşsiz tümörler, aynı zamanda, ayrı bir normal bir kontrol numunesi kullanılarak analiz edilebilir, ama en çok somatik mutasyonlar kolay kalıtsal sekansı varyantları ayırt edilemez. - Böyle muTect 15, SomaticSniper 16 veya Strelka 17 gibi bir somatik mutasyon arayan kullanarak her tümör normal çifti için somatik tek nükleotid varyantları (SNVs) diyoruz. Bu düşük (sıfır olmayan) alel normal numunede sayısı sürece allel sıklığı tümörün en az 5x büyük olduğu gibi türevleri ile sağlayan, modifiye edilmiş filtre kriterlere muTect kullanın. Normal tekrarlı DNA'ların bir panel olarak adlandırılan varyantlar sekanslama ya da uyum muhtemel sistematik eşya olarak kaldırılır. Filtreleri geçen her SNV sonra dikkatlice IGV kullanılarak incelenir.
- Böyle SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 algoritmalar kullanarak her tümör normal çifti için somatik indels arayın veya SOAPindel 19
- Hedef ekzonlarıyla at dizisi kapsama kopya sayısı durumunu tahmin. Her bir örnek için, tüm hedef ekzonlarının, GC yüzdesi üzerinde regresyon için ortalama dizisi kapsama Lös normalleşme gerçekleştirin. Lös uyum çıkarılarak ve örnek çapında medyan kapsama ekleyerek normalleşmemiş kapsama değerlerini ayarlayın. Tümör, normal çiftleri için tüm hedef eksondan genelinde normalize dizisi kapsama oranını hesaplayın. Bir eşleştirilmiş normal numune ve / veya gürültü azaltmak için, diğer cinsiyet eşlemeli diploid yokluğundagerm kopya sayısı varyantlarını eksik normal kontroller kullanılabilir. Kapsama oranı artar veya azalır dayalı somatik kopya sayısı kazanç ve kayıpların belirlenmesi.
- En az bir genomik kesme genomunun bir hedef aralığı içinde veya yakınında düşen kanser genlerin somatik düzenlenmeleri diyoruz. Önerilen algoritmalar GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22 ve dRanger 23 içerir. Intrachromosomal inversiyon, silmeler ve tandem duplikasyonlar destek göreli konumu ve oryantasyonu, uyumsuz çift olarak okur göre ayırt edilebilir. Tüm aday düzenlenmeleri elle IGV kullanılarak gözden geçirilmelidir. Biz varsayılan yeniden düzenleme kesme noktaları arasında PCR ve Sanger dizileme tarafından deneysel doğrulama öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
24 Barkodlanan sekansı kütüphaneleri (12 tümör normal çifti), bir havuz 279 kanser genlerinin tüm protein kodlayıcı eksonlar için karşılık gelen problar kullanılarak yakalandı ve 2 x 75 bp bir HiSeq 2000 akış hücresi tek bir şerit üzerinde okur olarak dizilenmiştir. Tümör ve normal kütüphaneleri bir 2:1 oranında bir araya toplanmıştır. Dondurulmuş tümör DNA örneklerinin bir havuz için örnek performans ölçümleri hizalama hızı, parça büyüklüğü dağılımı, on-hedef yakalama özgüllük ve hedef kapsama ortalama de dahil olmak üzere Şekil 1 'de gösterilmiştir. Örnek somatik mutasyonları, girmeler, silmeler ve kopya sayısı değişiklikler, Şekil 2-4 de gösterilmektedir.
Şekil 1. Dizisi performans ölçümlerini Temsilcisi rakamlar. a) küme yoğunluk ve uyum oranı, b) hedef kapsama ortalama,
Şekil 2. Bir akciğer kanseri (üst) EGFR ekson ve eşleştirilmiş normal doku (alt) sekans kapsama özgüllüğünü gösteren Bütünleştirici Genomics Viewer (IGV) görüntü. Gri çubuklar eşsiz dizisi okur temsil eder. Sağda, bir heterozigot T> G mutasyonu tümör okur ve% 0 bir somatik L858R amino asit ikamesi olduğunu belirten, normal okur% 24 mevcuttur. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
3 "fo: İçerik-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 3,. Bir kolorektal kanser tümör, normal çifti indellerin örnekler:.. APC a) Somatik frameshift ekleme b) TP53 7 baz çifti somatik frameshift silinmesi büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Bir tümör, normal çift kopya sayısı değişiklikler. Her bir veri noktası. Kopya sayısı kazançlar ve kayıplar artar çıkarılmaktadır 279 hedef genlerin tek bir ekson temsil eder ve tümör dizisi kapsama azalır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Tablo 1: Probe Tasarım Hedef Yakalama için Özellikler.
| Toplam ekzonlar | 4.535 |
| Toplam intronlar | 14 |
| SNP * | 1042 |
| Toplam hedef bölge | 879.966 basepairs |
| Toplam sonda bölge | 1.400.415 basepairs |
Tablo 2. Reaktifler ve Setleri.
| AdıReaktif / Malzeme | Şirket | Katalog Numarası |
| NEBNext End Tamir Modülü | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-Tailing Modülü | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Hızlı ligasyon Modülü | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free Barkod - 24 | Bioo Bilimsel | 514103 |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biyosistem | KK2612 |
| COT İnsan DNA'sı, Florimetrik Sınıf | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ Hibritleşme ve Yıkama seti | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| SeqCap EZ Kütüphane Yemler | Roche NimbleGen | |
| QIAquick PCR Saflaştırma Kiti | Oiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Geniş Aralığı (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyet (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 |
| Agilent DNA HS Kiti | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Manyetik Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Tablo 3. Endeks Oligo blokerler ve astarlar Dizileri.
| TS-HE Evrensel Engelleyici | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 1 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 3 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 4 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 5 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 6 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 7 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 8 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 9 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 10 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 11 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 12 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeksi 13 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 14 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 15 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 16 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 18 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 19 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 20 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 21 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 22 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 23 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE endeksi 25 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Endeks 27 Engelleyici | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Primer 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim ETKİ tahlil yüksek uyum oranı, yüksek on-hedef oranı, yüksek hedef kapsama alanı ve algılama mutasyonlar, indellerin ve numara değişiklikleri kopyalamak için yüksek duyarlılık üretir. Biz taze dondurulmuş hem dizisi DNA'ya bizim ETKİ tahlil yeteneği gösterdi ve düşük DNA girdi FFPE örnekleri arşiv var. Anahtar kanserle ilişkili genlerin hedef sıralama yapılarak ekson, bir böylece alçak frekans mutasyonları tespit etmek için yeteneğini maksimize bu en önemli genin ekson dizisi için çok derin kapsama elde edebilirsiniz. Barkodlama ve çoğullama kullanımı, daha yüksek verim, numune başına düşük maliyet, ve DNA düşük girdi miktarlarda sağlar.
Hedeflenen yaklaşımın bir yararı her ekson mutasyon tespiti için muntazam ve yeterli kaplıdır yakalama sondaları, bu tür optimize etmek mümkün olmasıdır. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, tasarım 279 genlerinde 4535 eksonları kapsar. Yinelemeli gelişmeleri takiptasarım, tipik bir sıralama deneyi, tüm numune için ortalama kapsama az% 20 eksondan en fazla 2% üretir. Böylece, 500x dizisi kapsama (Şekil 1'de gösterildiği gibi muhafazakar bir tahmin) sıralı bir tümör için,> eksondan% 98 düşük frekanslı mutasyonların belirlenmesi için yüksek hassasiyet garanti,> 100x derinliği tarafından karşılanacaktır. Içerisinde bu homojenliği, büyük ölçüde farklı nükleotid sondaları bileşimin bölgelerinde farklı uzunluklara sentezlenebilir NimbleGen SeqCap sisteminin esnekliği atfedilebilir. Biz de başarıyla bizim panelinden yeni içerik eklemek ve yakalama ve / veya sıra zor olan bölgelerin kapsama artırmak için Integrated DNA Technologies (IDT) ayrı ayrı sentezlenen biyotinilatlı oligonükleotidler kullandık. Ayrıca tekrarlı yeniden düzenlenmiş genlerin seçin intronlarını yakalayarak, biz füzyon genleri üreten yapısal düzenlenmeleri tespit edebiliyoruz bile tek fusion ortak yakalanır.
Bu, hedeflenen dizileme yaklaşım tümörlerinde "sürücü" genetik değişiklikler tespit yeteneği iki ana sınırlamaları sahip yapar. İlk olarak, genomun sadece bir kısmını sorgulanırsa. Hedeflenen sıralama, doğası gereği, sınırlıdır. Yeni kanser genler genomik sistematik çabaları ortaya çıktıkça, bunlar hızlı bir şekilde bir yakalama paneline ilave edilebilir, fakat fonksiyonel olarak önemli mutasyonlar tüm genom ya da bütün exome dizileme ile tespit olacağını atlanabilir. İkinci olarak, bu DNA-bazlı değişikler sınırlıdır. Anormal şekilde ifade edilen transkriptleri, yeni uç uca eklenen izoformları, ve gen füzyonlarının tespiti RNA-Seq ya da benzer teknikler 24 gerektirir. Böyle kromatin modifikasyonları ve DNA metilasyonu gibi epigenetik değişiklikler de gelişiminden ve tümör gelişiminde anahtar rol oynayabilir. Dizileme teknolojileri geliştirmeye devam ederken, bir bütün genom sıralamasını, RNA-Seq ve tamamlayıcı arayışlara istihdam entegre stratejiler hayal edebilirsinizches kapsamlı bir rutin olarak 25 bireysel tümörlerin genetik ve epigenetik makyaj karakterize etmek. Gibi tam entegre stratejiler maliyet ve hesaplama-engelleyici, hedefli sıralama klinik ve yorumsal uygulamalar için en belirgin genomik özellikleri yakalamak için pratik bir alternatif sunuyor şu anda.
Bizim protokol tümörler, aynı hastadan alınan eşleştirilmiş normal dokuda birlikte dizilir varsayar. Bu normal kontrol amacı tümörde tespit sekansı varyantları, kalıtsal ya da somatik olarak kazanılmış olup olmadığını belirlemektir. Bir eşleştirilmiş normal yokluğunda, tek bir mutasyon bu noktaları (diğer kanserlerde tekrarlayan somatik mutasyonlar örneğin siteleri) meydana somatik olması muhtemel olan varyantları anlaması. Ayrıca, kopya sayısı kazanç ve kayıpların analizi olmayan bir genetik eşleştirilmiş diploid normal numune ile yapılabilir. Diğer tüm yeni genetik değişiklikler için, eşzamanlıeşleştirilmiş normal doku lı analizi büyük ölçüde çıkan mutasyon verilerin yorumlanmasını kolaylaştırır ve şiddetle tavsiye edilir.
Burada açıklanan IMPACT protokol donmuş numuneler için tutarlılık ve yüksek kaliteli performans gösteriyor. FFPE örnekleri ile çalışırken Gerçi, zaman zaman değişkenlik gözlemledik. FFPE örnek yaşına ve kalitesine bağlı olarak, DNA ciddi bozulmuş ya da kimyasal olarak modifiye edilmiş olabilir, ve bunun sonucu olarak sıralama analizi ve 26 güç hale gelebilir. Söyleniyor, biz FFPE örneklerin büyük çoğunluğu için güvenilir olması için bu deneysel koşullar bulduk. Biz de başarılı gibi biyopsi, ince iğne aspiratları ve sitolojik örneklerin gibi diğer klinik olarak ilgili örnekleri karakterize etmek için bu protokolü uyguladık. Bu yöntem tanı bir etki duruyor bu nedenle-değişken nitelik, nicelik ve heterojenlik-o örneklerinin farklı karşılamak için esneklik içinKlinik alanında kanserli hastaların tedavi d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Berger Vakfı Tıp, kanser teşhis şirketten danışmanlık ücretleri ve araştırma fonu aldı.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Dr Agnes Viale ve MSKCC Genomik Çekirdek Laboratuvarı teşekkür ederim. Bu protokol Geoffrey Beene Kanser Araştırma Merkezi ve Çiftçi Aile Vakfı desteği ile geliştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
