Summary
Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.
Abstract
Les efforts visant à détecter et enquêter sur des mutations oncogènes clés sont révélés précieux pour faciliter le traitement approprié pour les patients atteints de cancer. La mise en place de haut-débit, le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" a aidé la découverte de beaucoup de ces mutations. Pour améliorer l'utilité clinique et translationnelle de cette technologie, les plates-formes doivent être à haut débit, le coût-efficace, et compatible avec de la paraffine fixés au formol (FFPE) intégré échantillons de tissus qui peuvent donner de petites quantités d'ADN dégradé ou endommagé. Ici, nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et multiplexés suivie d'une hybridation de capture sur la base-des exons ciblés pour la détection de mutations associées au cancer dans les tumeurs congelées et FFPE fraîches par séquençage massivement parallèle. Cette méthode permet l'identification de mutations de la séquence, le nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant tous les gènes ciblés. Séquençage de l'exon offres ciblées til bénéficie d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, conférant ainsi une haute sensibilité pour détecter des mutations de basse fréquence.
Introduction
L'identification des événements génétiques tumorales «driver» dans oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle essentiel dans le diagnostic et le traitement de nombreux cancers 1. Efforts de recherche à grande échelle en utilisant le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" ont permis l'identification de plusieurs de ces gènes associés au cancer au cours des dernières années 2. Cependant, ces plates-formes de séquençage nécessitent généralement de grandes quantités de l'ADN isolé à partir de tissus congelés frais, ce qui présente donc une limitation importante dans l'analyse et la caractérisation des mutations de l'ADN à partir de tissus conservés, tels que la paraffine fixés au formol noyé (FFPE) des échantillons de tumeurs. Amélioration des efforts pour caractériser efficacement et de manière fiable l'information génomique "action" d'échantillons tumoraux FFPE permettront l'analyse rétrospective d'échantillons précédemment mis en réserve et encourager davantage les approches individualisées à la gestion du cancer.
Traditionnellement, d moléculairelaboratoires iagnostic se sont appuyés sur fastidieuses, des méthodologies bas-débit telles que le séquençage Sanger et PCR en temps réel pour le profilage ADN mutation. Plus récemment, des méthodes plus-débit utilisant la PCR multiplex ou spectrométrie de masse génotypage ont été développées pour étudier des mutations somatiques récurrentes dans les gènes du cancer clés 3-5. Ces approches sont cependant limitées par le fait que seuls les "points chauds" mutations prédésignés sont dosés, ce qui les rend impropres à la détection de mutations d'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs. Séquençage massivement parallèle offre plusieurs avantages par rapport à ces stratégies, y compris la possibilité d'interroger les exons entiers pour les mutations à la fois communs et rares, la capacité de révéler d'autres catégories d'altérations génomiques tels que les gains et les pertes du nombre de copies, et une plus grande sensibilité de détection dans des échantillons hétérogènes 6, 7 . Séquençage du génome entier représente l'approche la plus complète pour la découverte de la mutation, si elle est relativement coûteux et encourt grandes exigences de calcul pour l'analyse des données et le stockage.
Pour les applications cliniques, où seule une petite fraction du génome peut être d'intérêt clinique, deux innovations particulières dans la technologie de séquençage ont eu un effet transformateur. Tout d'abord, à travers l'exon capture à base d'hybridation, on peut isoler l'ADN correspondant à des gènes associés au cancer clés de mutation ciblée profilage 8,. Deuxièmement, grâce à la ligature des codes-barres moléculaires (par exemple des séquences d'ADN 6-8 nucléotides de long), on peut regrouper des centaines d'échantillons par séquençage terme et profiter pleinement de la capacité croissante des instruments massivement parallèles de séquençage 10. Lorsqu'ils sont combinés, ces innovations permettent tumeurs être profilée pour un coût moindre et à un débit plus élevé, avec des exigences de calcul plus petits 11. En outre, par la redistribution de la couverture de séquence avec seulement les gènes les plus critiques pour l'application particulière, on peut Achieve plus grande profondeur de séquençage pour la sensibilité de détection plus élevé pour les événements de basse fréquence de l'allèle.
Nous décrivons ici notre test IMPACT (Mutation profilage intégrée des objectifs du cancer à une action), qui utilise l'exon capture sur un code à barres piscines de la bibliothèque de séquence par hybridation en utilisant personnalisés oligonucléotides pour capturer tous les exons codant pour des protéines et sélectionnez introns de 279 gènes associés au cancer clés (tableau 1 ). Cette stratégie permet l'identification de mutations, indels, nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant ces 279 gènes. Notre méthode est compatible avec l'ADN isolé à partir de deux tissus congelés et FFPE frais ainsi que de fines aspire à aiguilles et d'autres spécimens de cytologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Préparation des réactifs et de l'ADN
Remarque: Ce protocole décrit le traitement simultané et l'analyse des 24 échantillons (par exemple 12 paires tumeur / normal), mais peut être adaptée pour des lots plus petits et plus grands. échantillons d'ADN peuvent provenir de FFPE ou tissu frais congelé, les échantillons cytologiques, ou de sang. Typiquement, à la fois la tumeur et le tissu normal du même patient sont profilées conjointement de manière à distinguer les mutations somatiques de polymorphismes héritées. Le protocole commence immédiatement après l'extraction d'ADN.
- Aliquote de 50 à 250 ng (250 ng recommandé) de l'ADN extrait par échantillon, on le dilue dans 1 x Tris-EDTA (pH 8,0) tampon d'un volume final de 50 ul, dans des tubes à fond rond Covaris distinctes.
- Cisailler l'ADN sur l'instrument Covaris E220 dans les réglages de cisaillement suivants: 360 sec à 10 facteur de marche, 175 PIP, et 200 cycles par rafale.
- Décongeler AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS<__ tableau 2) à température ambiante. Décongeler tous buffre et enzymes sur la glace avant l'étape appropriée.
2. Module de réparation de fin - Préparation bibliothèque
- Préparez le mélange maître de réparation de fin dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 10x NEBNext Fin réparation Reaction Buffer (tableau 2), 5 pi NEBNext Fin enzyme de réparation Mix (tableau 2), 35 pl nucléase stérile libre H 2 O.
- Aliquoter les 50 ul de chaque ADN cisaillé dans des puits séparés d'une plaque à 96 puits. Ajouter 50 pi de mélange maître de réparation de fin prêts à chaque réaction. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 20 ° C.
3. Réparation Poster Fin Clean-up
- Ajouter 2x volume (200 pi) de AMPure Perles XP (__gVirt_NP_NN_NNPS<__ tableau 2) pour chaque échantillon et la pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x en utilisant une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Placez sur le support magnétique (tableau 2
- Retirez délicatement et jeter clairement la prise de surnageant soin de ne pas déranger les perles. Certains liquide peut rester dans les puits.
- Avec des tubes sur le support, ajouter doucement 200 ul de fraîchement préparée de 80% d'éthanol pour chaque échantillon et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 sec. Avec précaution, éliminer l'éthanol par pipette.
- Répétez l'étape 5, pour un total de deux lavages à l'éthanol. S'assurer que tous éthanol a été éliminée. Retirer du support magnétique et laisser sécher à température ambiante pendant 5 min.
- Reprendre billes séchées 44,5 M ul stérile 2 O. Doucement, toute pipette volume vers le haut et vers le bas 10x bien mélanger. S'assurer que les perles ne sont plus fixés sur le côté du puits.
- Incuber billes en suspension à température ambiante pendant 2 min. Placez sur support magnétique pendant 5 min jusqu'à ce que l'échantillon apparaît clairement.
- Transférer doucement 42 pi de surnageant clair contenant l'échantillon à un nouveau puits.
La procédure peut être arrêtée sans danger à ce step et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre.
4. Préparation Bibliothèque - Module dA-Tailing
- Préparer le mélange maître dA-Tailing dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 5 pi de 10x NEBNext réaction dA-Tailing tampon (tableau 2), 3 pi (3 '5' exo-) fragment de Klenow (tableau 2 ).
- Ajouter 8 pi du prêt master mix dA-Tailing à chaque puits contenant 42 ul d'ADN de fin réparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C.
- Effectuer un poste dA-Tailing nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 en utilisant 2x volume (100 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 33,75 pi.
La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre. </ Li>
5. Préparation Bibliothèque - Adapter Module ligature
- Préparer le mélange maître de ligature dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 10 pi de 5x NEBNext ligature rapide Reaction Buffer (New England Biolabs, tableau 2), 5 pi rapide ADN ligase de T4 (tableau 2).
- Ajouter 15 pi de mélange maître de ligature dans chaque puits contenant l'ADN dA à queue.
- Ajouter 1,25 ul de 25 uM NEXTflex l'adaptateur approprié à code-barres (tableau 2) à chaque puits. Chaque échantillon doit recevoir un code-barres adaptateur séparé. Incuber dans un thermocycleur pendant 15 min à 20 ° C.
- Effectuer un poste adaptateur ligature nettoyage: Répétez les étapes 3.1 au 3.8 en utilisant un volume 1x (50 pi) de perles, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à un volume final de 50 ul.
- Répétez les étapes 3.1 à 3.8 pour un second volume de 1x (50 pi) de nettoyage, mais remettre en suspension dans H 2 O stérile à unvolume final de 23 ul.
La procédure peut être arrêté en toute sécurité à cette étape et les échantillons conservés à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Pour redémarrer, dégeler les échantillons congelés sur glace avant de poursuivre.
6. Amplification bibliothèque
- Préparer le mélange maître KAPA HiFi dans un tube à centrifuger stérile en utilisant les volumes suivants par exemple: 25 pl 2x KAPA HiFi HS RM (tableau 2), 1 pl de chacune des 100 uM Primer 1 et Primer 2 (Tableau 3).
- Ajouter 27 pi de mélange maître à chaque puits contenant le produit de ligature. Régler la pipette à 50 pi et délicatement la pipette la totalité du volume de haut en bas 10x.
- Placez dans le thermocycleur pour les cycles de PCR suivantes: dénaturation initiale de 45 sec à 98 ° C, 10 cycles de 15 sec à 98 ° C, 30 secondes à 60 ° C, 30 secondes à 72 ° C, et l'extension finale de 1 min à 72 ° C.
- Effectuez une post-amplification de nettoyage: Répétez les étapes 3.1 à 3.8 à l'aide1x volume (50 ul) de AMPure XP Beads, et remettre en suspension dans de l'eau stérile jusqu'à un volume final de 30 ul.
- Quantifier la concentration de chaque bibliothèque à l'aide qubit Large gamme de dosage (Life Technologies, tableau 2) selon les instructions du fabricant.
7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Bibliothèque hybridation, lavage, et Amplification
- Dégel universelles et l'indice de blocage des oligonucléotides (tableau 3), SeqCap EZ bibliothèque, et NimbleGen composants de capture (ADN COT, tampons d'hybridation 2x, et composant hybridation A, tableau 2) sur la glace. Tous les inhibiteurs d'oligonucléotides sont stockés dans les stocks de travail de 1 mM. Notre SeqCap EZ Library est une piscine sur mesure de sondes de capture englobant tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes associés au cancer, mais d'autres dessins personnalisés et catalogue peuvent être utilisés.
- Préparer une piscine de 1 mM de bloqueurs indice d'oligonucléotides correspondant à l'annonce code-barres spécifiqueséquences Aptor utilisés dans la préparation bibliothèque. Mélanger 1 pi de chaque bloqueur, et vortex.
- Dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes stériles, ajouter 5 ul d'ADN COT 1mg/ml, 2 pi de 1 mM bloquant universel et 2 pi de la piscine 1 mM des inhibiteurs indice d'oligonucléotides.
- Piscine 24 bibliothèques à code-barres en une seule réaction. Ajouter un total de 1 à 3 ug de mise en commun, une bibliothèque de séquence à code à barres (préparé ci-dessus) au mélange de capture. Pour 24 échantillons, 100 ng par échantillon est recommandé. Lorsque la mise en commun des tumeurs et des échantillons normaux appariés, nous avons recommandé d'ajouter plus de bibliothèque de tumeurs (par exemple de 100 ng par la tumeur et 50 ng par normale) de sorte qu'ils sont séquencées à une plus grande profondeur de la couverture.
- Fermez le bouchon du tube et faire 15-20 trous dans le haut de la capsule avec un 18-20 G ou plus petite aiguille. Speed Vac les échantillons bibliothèque / COT ADN / à oligos amplifiés dans le vide concentrateur d'ADN sur feu vif (60 ° C).
- Une fois complètement sec vers le bas, réhydrater avec 7,5 ul de 2x hybridationtampon sation et 3 pi de composant hybridation A. Le tube doit maintenant contenir les éléments suivants: 5 pg d'ADN COT, pg la variable de bibliothèque de l'échantillon amplifié, 1000 pmol d'Universal et Index oligos, tampon 7,5 pi 2x d'hybridation, 3 pi hybridation composant A dans un volume total de 10,5 pi.
- Couvrez les trous dans le couvercle avec un petit morceau de ruban adhésif de laboratoire. Vortex l'échantillon pendant 10 secondes et centrifuger à la vitesse maximale pendant 10 s.
- Incuber l'échantillon à 95 ° C pendant 10 min pour dénaturer l'ADN, suivi par une centrifugation à vitesse maximale pendant 10 s à température ambiante.
- Dans un nouveau tube de PCR 0,2 ml de bande, préparer 2,25 pi aliquote de SeqCap EZ sondes de capture Bibliothèque et 2,25 pi de stérile nucléase libre H 2 O et ajouter le contenu de l'étape 7.7. Pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x.
- Incuber dans un cycleur thermique à 47 ° C pendant 48-96 h. Régler et maintenir la température du couvercle de l'appareil à cycles thermiques à 57 ° C.
- Folmarches basses dans le chapitre 6 du Guide de la v3.0 de la NimbleGen SeqCap EX Bibliothèque SR utilisateur (tableau 2) pour le lavage et la récupération de l'ADN capturé.
- Suit les étapes du chapitre 7 du protocole Roche NimbleGen pour l'amplification de l'ADN capturé avec les modifications suivantes:
- Utilisez 2x KAPA HiFi polymérase (tableau 2) au lieu de Phusion haute fidélité PCR Master Mix
- Utilisez 100 uM Primer 1 et 2 Primer énumérés dans le tableau 3.
- Exécuter les conditions de PCR suivantes: dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 sec, 11 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 30 secondes, et extension finale à 72 ° C pendant 5 min . Maintenir à 4 ° C.
- Quantifier la concentration de l'ADN amplifié à l'aide capturé qubit haute sensibilité Assay (tableau 2) selon les instructions du fabricant.
- Analyser la qualité de l'ADN capturée à l'aide Agilent BioAnalyseur puce ADN HS (tableau 2) selon les instructions du fabricant.
- Le rendement de la PCR doit être d'au moins 100 ng (gamme 100-1000 ng).
- La longueur des fragments de moyenne doit être comprise entre 150 à 400 paires de bases.
8. Illumina Salut-Seq séquençage
- Diluer l'ADN capturé amplifié à 14 heures, et de charger l'échantillon sur une seule voie d'une cellule de débit Illumina HiSeq 2000. Séquence appariée de gamme paire 75 but lit selon les instructions du fabricant. Dans notre expérience, une voie est suffisante pour produire une couverture de séquence unique de 500 700x par exemple sur 279 gènes pour une piscine de 24 échantillons.
- Logiciel Illumina (Real Time Analysis) permet de convertir des images haute résolution à des intensités de cluster de fonder des appels et des scores de qualité. Utilisation CASAVA pour démultiplexer les données en fonction de l'identité de code à barres et générer des fichiers de FASTQ individuels pour chaque échantillon.
9. Données Anallyse
- Garniture séquences d'adaptation à partir de l'extrémité 3 'de la séquence se lit en utilisant des fichiers FASTQ Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). La longueur minimale de chevauchement (-O) est égal à 3 avec un taux d'erreur (-e), de 1%. La longueur de la base minimale de conservation des apparié lit après la coupe est de 25.
- Alignez séquence lit les hg19 du génome humain de référence en utilisant l'outil de Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Exécutez les étapes de post-traitement y compris le marquage double, le réalignement de séquence multiple local, et le score de qualité de base recalibrage en utilisant l'analyse du génome Toolkit (GATK) en fonction de leurs meilleures pratiques standard ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = meilleures pratiques ) 13. Quand de multiples échantillons de profilage à partir du même patient (par exemple, identifié tumorales et normales), le réalignement de séquences multiples local devrait être perforMED conjointement. La sortie de ces étapes de post-traitement est un fichier de BAM pour chaque échantillon, qui contient toutes les séquences, de qualité, et des informations d'alignement et peut être chargé directement dans la génomique intégrative Viewer (IGV) pour la visualisation de lit et des variants de séquence 14.
- Calculer la séquence des mesures de performance en utilisant des outils Picard ( http://picard.sourceforge.net/ ). Mesures d'information comprennent le taux alignement, la distribution de la taille des fragments, GC-contenu biais de couverture associés, sur cible spécificité de capture, la PCR en double taux, la complexité bibliothèque, et signifier la couverture cible. Des valeurs représentatives sont affichées dans la figure 1. Les fréquences des allèles sur les sites de polymorphisme communs calculés en utilisant DepthOfCoverage de GATK sont utilisés pour surveiller la contamination de l'ADN non lié et de veiller à ce que les échantillons appariés provenaient des mêmes patients.
Les analyses informatiques suivants dépendent de la présence de appariéséchantillons tumoraux et normaux pour la détection d'altérations génétiques somatiques. Tumeurs inégalés peuvent également être analysées à l'aide d'un échantillon de contrôle normal séparé, mais la plupart des mutations somatiques ne peuvent être facilement distingués des variants de séquence héritées. - Appel variants nucléotidiques simples somatiques (SNVs) pour chaque paire de la tumeur à la normale à l'aide d'un appelant de la mutation somatique, comme muTect 15, SomaticSniper 16, 17 ou Strelka. Nous utilisons muTect avec des critères de filtrage modifiés, ce qui permet pour les variantes à faible (non nulle), chiffres d'allèles dans l'échantillon normal, tant que la fréquence de l'allèle est au moins 5 fois plus grande dans la tumeur. Des variantes appelées récurrente dans un panneau d'ADN normaux sont supprimés comme des artefacts systématiques susceptibles de séquençage ou l'alignement. Chaque SNV passant filtres est ensuite examiné avec soin en utilisant IGV.
- Appel indels somatiques pour chaque paire de la tumeur à la normale à l'aide d'algorithmes tels que SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, 19 ou SOAPindel
- Extrapoler copie statut de nombre de couverture de la séquence à exons cibles. Pour chaque échantillon, procéder à une normalisation Loess de la couverture de séquence moyenne de tous les exons cibles, régression sur le pourcentage de GC. Ajustez les valeurs de couverture non normalisées en soustrayant l'ajustement Loess et ajouter la couverture médiane échantillon entier. Calculer le ratio de la couverture de la séquence normalisée pour tous les exons cibles pour les paires de tumeurs à la normale. En l'absence d'un échantillon normal identifié et / ou pour diminuer le bruit, d'autre diploïde au genre identifiétémoins normaux dépourvus de variants du nombre de copies de la lignée germinale peuvent être utilisés. Déterminer somatiques gains et pertes de nombre de copies en fonction des augmentations ou diminutions du taux de couverture.
- Appelez réarrangements somatiques impliquant les gènes du cancer où au moins un point d'arrêt génomique tombe à l'intérieur ou à proximité d'un intervalle ciblée du génome. Algorithmes suggérés incluent GASV 20, breakdancer 21, CREST 22, et Dranger 23. Inversions intrachromosomiques, des suppressions et duplications en tandem peuvent être distingués en fonction de la position relative et l'orientation de soutenir lit en paires discordantes. Tous les réarrangements candidats devraient être examinées manuellement à l'aide IGV. Nous vous recommandons validation expérimentale par séquençage PCR et Sanger à travers les points d'arrêt de réarrangement putatifs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une piscine de 24 banques de séquences à code-barres (12 paires de tumeurs à la normale) a été capturée à l'aide des sondes correspondant à tous les exons codant pour des protéines de 279 gènes du cancer et séquencé comme 2 x 75 pb lit sur une seule voie d'une cellule d'écoulement HiSeq 2000. Tumeur et les bibliothèques normales ont été rassemblées dans un rapport de 2:1. des mesures de performance de l'échantillon pour un mélange d'échantillons d'ADN de tumeur congelés sont présentés sur la figure 1, y compris les taux d'alignement, la distribution de la taille des fragments, sur la spécificité de la cible d'acquisition, et signifie couverture cible. Exemple des mutations somatiques, des insertions, des suppressions et des modifications du nombre de copies sont présentés aux figures 2-4.
Figure 1. Chiffres représentatifs des mesures de performance de la séquence. a) la densité de la grappe et le taux d'alignement, b) signifie couverture cible,
Figure 2. Intégratif de génomique Viewer (IGV) image montrant la spécificité de la couverture de séquence à exons de l'EGFR dans un cancer du poumon (en haut) et les tissus normaux appariés (en bas). Barres grises représentent séquence unique lit. A droite, un T> G mutation hétérozygote est présent dans 24% des lit dans la tumeur et 0% de lit dans la normale, ce qui indique qu'il s'agit d'une substitution L858R d'acides aminés somatique. Cliquez ici pour agrandir l'image .
3 "fo: contenu width =" "width =" 6 po "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg 600px "/>
Figure 3. Exemples de indels dans une paire de tumeur à la normale cancer colorectal:.. A) insertion de cadre de lecture somatique dans APC b) la suppression du cadre de lecture somatique de 7 paires de bases TP53 Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. nombre de copies des modifications dans une paire de tumeur à la normale. Chaque point de données représente un seul exon de 279 gènes cibles. Copier les gains et les pertes sont déduites de nombre augmente et diminue dans la couverture de la séquence de la tumeur. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Tableau 1: Caractéristiques de la conception de la sonde pour la capture de cible.
| Total des exons | 4535 |
| Total des introns | 14 |
| SNP * | 1042 |
| Territoire cible totale | 879 966 paires de bases |
| Territoire total de la sonde | 1.400.415 paires de bases |
Tableau 2. Réactifs et kits.
| Nom d'Réactif / Matériel | Entreprise | Numéro de catalogue |
| Module de réparation NEBNext Fin | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext Module dA-Tailing | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext rapide Module ligature | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR sans codes barres - 24 | Bioo scientifique | 514103 |
| Kit HiFi Bibliothèque Amplification | KAPA Biosystems | KK2612 |
| COT ADN humain, Fluorometric année | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ hybridation et kit de lavage | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| Appâts SeqCap EZ Bibliothèque | Roche NimbleGen | |
| Un kit de purification PCR QIAquick | Qiagen | 28104 |
| Qubit ADNds Large gamme (BR) Kit de dosage | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit ADNds haute sensibilité (HS) Kit de dosage | Life Technologies | Q32851 |
| Kit Agilent ADN HS | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Salut-Seq 2000 | Illumina |
Tableau 3. Index Oligo-bloquants et Primaires séquences.
| TS-HE Universal Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Indice 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Indice 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 5 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 6 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 10 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 11 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 12 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 13 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 14 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 15 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 16 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 20 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE 25 Index Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Une amorce | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Notre essai IMPACT produit un taux élevé d'alignement, le taux sur la cible haut, couverture cible haute et haute sensibilité pour la détection des mutations, indels, et du nombre de copies des modifications. Nous avons démontré la capacité de notre essai IMPACT à l'ADN de séquence à la fois frais congelé et archivé échantillons FFPE de faible apport d'ADN. En effectuant le séquençage de l'exon ciblé de gènes associés au cancer principaux, on peut obtenir une couverture de séquence très profond pour les exons de ces gènes les plus critiques en maximisant de ce fait la capacité de détecter des mutations de basse fréquence. L'utilisation de codes-barres et de multiplexage permet un débit plus élevé, faible coût par échantillon, et les montants des intrants de l'ADN.
Un des avantages de l'approche ciblée est qu'il est possible d'optimiser les sondes de capture de telle sorte que tous les exons sont couvertes de manière uniforme et suffisamment pour la détection de mutations. Comme le montre le tableau 1, notre conception comprend 4535 à 279 exons des gènes. Après des améliorations itératives denotre conception, une expérience de séquençage typique produit pas plus de 2% des exons à moins de 20% de la couverture médiane de l'ensemble de l'échantillon. Ainsi, pour une tumeur séquencé pour la couverture de séquence 500x (une estimation prudente tel qu'il apparaît dans la figure 1),> 98% des exons sera couvert par> 100x profondeur, garantissant une haute sensibilité pour identifier les mutations de basse fréquence. Cette uniformité de la couverture peut être attribuée en grande partie à la flexibilité du système Nimblegen SeqCap, où les sondes peuvent être synthétisés à des longueurs différentes dans des régions de composition nucléotidique différente. Nous avons également utilisé avec succès oligonucléotides biotinylés synthétisés individuellement de Integrated DNA Technologies (IDT) pour ajouter de nouveaux contenus à notre panel et à renforcer la couverture des régions qui sont difficiles à capturer et / ou la séquence. En capturant également sélectionner des introns de gènes réarrangés de manière récurrente, nous sommes en mesure d'identifier les réarrangements structuraux produisant des gènes de fusion même si un seul fusion partenaire est capturé.
Cette approche de séquençage ciblé ne posséder deux principales limites dans la capacité à détecter les «pilotes» des altérations génétiques dans les tumeurs. Tout d'abord, seule une fraction du génome est interrogé. Séquençage ciblé est, par nature, limitée. Comme de nouveaux gènes du cancer émergent des efforts systématiques de la génomique, ils peuvent être ajoutés rapidement à un panneau de saisie, mais des mutations fonctionnellement importants peuvent être négligés qui serait détecté par l'ensemble du génome ou le séquençage de l'exome entier. En second lieu, elle est limitée à des modifications basées sur l'ADN. La détection de transcrits exprimés de façon aberrante, nouvelles isoformes d'épissage, et des fusions de gènes nécessite des techniques similaires 24 ARN-Seq ou. Altérations épigénétiques telles que des modifications de la chromatine et méthylation de l'ADN peuvent aussi jouer un rôle clé dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Comme les technologies de séquençage de continuer à améliorer, on peut envisager des stratégies intégrées utilisant le séquençage du génome entier, l'ARN-Seq et approa complémentaireches pour caractériser complètement le maquillage génétique et épigénétique des tumeurs individuelles sur une base régulière 25. Stratégies intégrées complets sont actuellement les coûts et de calcul prohibitif, le séquençage ciblé présente une alternative pratique pour capturer caractéristiques génomiques les plus saillants pour les applications cliniques et translationnelles.
Notre protocole suppose que les tumeurs sont séquencées à côté de tissus normaux appariés prélevé chez le même patient. Le but de cette commande normale est de déterminer si des variantes de séquences détectées dans la tumeur sont héritées ou acquises somatique. En l'absence d'une normale identifié, on peut en déduire que les variantes se produisant sur les hotspots de mutation (c'est à dire des sites de mutations somatiques récurrentes dans d'autres cancers) sont susceptibles d'être somatique. En outre, l'analyse des gains et pertes de nombre de copies peut être réalisée avec un échantillon normal diploïde non génétiquement identifié. Pour tous les autres altérations génétiques nouvelles, le simultanémentous analyse des tissus normaux appariés simplifie grandement l'interprétation des données de mutation résultant et est fortement recommandé.
Le protocole IMPACT décrite ici démontre la cohérence et la performance de haute qualité pour les échantillons congelés. Nous avons observé la variabilité occasionnelle lorsque vous travaillez avec des échantillons FFPE, cependant. En fonction de l'âge et de la qualité de l'échantillon FFPE, l'ADN peut être gravement dégradé ou modifié chimiquement, et par suite peut rendre difficile le séquençage et l'analyse 26. Cela étant dit, nous avons trouvé ces conditions expérimentales pour être fiable pour la grande majorité des échantillons FFPE. Nous avons également appliqué avec succès ce protocole pour caractériser d'autres spécimens cliniquement pertinents, comme les biopsies, ponctions fines aiguilles, et les échantillons cytologiques. C'est pour cette raison, la flexibilité nécessaire pour s'adapter à différents types d'échantillons de qualité variable, la quantité et l'hétérogénéité-que ce procédé se distingue de l'impact sur un diagnostic detraitement d de patients atteints de cancer dans le domaine clinique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Berger a reçu des honoraires de conseil et financement de la recherche de la Fondation de médecine, une société de diagnostic de cancer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Agnès Viale et le MSKCC génomique Laboratoire central d'assistance technique. Ce protocole a été élaboré avec le soutien du Centre de Cancérologie Geoffrey Beene et la Fondation fermier de famille.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
