Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

Published: October 18, 2013 doi: 10.3791/50710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

Summary

אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

Abstract

מאמצים כדי לאתר ולחקור מוטציות בשעור מפתח הוכיחו יקרים כדי להקל על הטיפול המתאים לחולי סרטן. הקמתה של תפוקה גבוהה, רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי סייעה גילוי מוטציות רבות כאלה. כדי לשפר את התועלת הקלינית וtranslational של טכנולוגיה זו, פלטפורמות חייבת להיות תפוקה גבוהה, יעיל וחסכוני, ותואם עם פרפין קבוע פורמלין המוטבע (FFPE) דגימות רקמה שעשויה להניב כמויות קטנות של DNA המושפל או פגום. כאן, אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ומרובבים ואחרי לכידה המבוססת על הכלאה של אקסונים ממוקדים לזיהוי של המוטציות סרטניות הקשורים בגידולי מזון קפואים וטריים FFPE ידי רצף מקביל מסיבי. שיטה זו מאפשרת זיהוי של מוטציות ברצף, להעתיק שינויי מספר, ובחר שחלופים מבניים המערבים את כל הגנים הממוקדים. רצף אקסון ממוקד מציע tהוא נהנה מתפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מקנה רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.

Introduction

זיהוי של אירועים הגנטיים של גידול "נהג" באונקוגנים מרכזיים וגני מדכאי סרטן ממלא תפקיד חיוני באבחון וטיפול בסוגי הסרטן רבים 1. מאמצי מחקר בקנה מידה גדול, תוך ניצול רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי אפשרו זיהוי של גנים הקשורים לסרטן רבים כאלה בשנים האחרונות 2. עם זאת, פלטפורמות רצף אלה בדרך כלל דורשות כמויות גדולות של DNA שבודדו מרקמות קפואים, ובכך פוזות מגבלה עיקריות באפיון וניתוח מוטציות דנ"א מרקמות השתמרו, כגון פרפין קבוע פורמלין המוטבע (FFPE) דגימות גידול. מאמצים השתפרו אמינות וביעילות כדי לאפיין מידע "תביעה" גנומי מדגימות גידול FFPE יאפשר הניתוח רטרוספקטיבי של דגימות בעבר הפקידה ועוד יותר לעודד גישות אישיות של ניהול בסרטן.

באופן מסורתי, ד המולקולרימעבדות iagnostic יש לסמוך על זמן רב, מתודולוגיות נמוכה תפוקה כגון סנגר רצף וזמן אמת PCR לאפיון המוטציה בדנ"א. לאחרונה, שיטות גבוהה יותר תפוקה ניצול PCR המרובב או גנוטיפ ספקטרומטריה פותחו כדי לחקור מוטציות סומטיות חוזרות בגנים סרטניים מפתח 3-5. גישות אלה, עם זאת, מוגבלות בכי רק מוטציות "נקודה חמה" predesignated הם assayed, מה שהופך אותם מתאימים לאיתור מוטציות inactivating בגנים מדכאי סרטן. ריצוף מקביל מסיבי מציע מספר יתרונות על פני אסטרטגיות אלה כוללים את היכולת לחקור כל אקסונים למוטציות הן נפוצות ונדירות, היכולת לחשוף שיעורים נוספים של שינויים גנומיים כגון רווחים של מספר עותקים והפסדים, ורגישות גילוי גדולה יותר בדגימות הטרוגנית 6, 7 . רצף הגנום כולו מייצג את הגישה המקיפה ביותר לגילוי מוטציה, למרות שזה יחסיly יקר וכרוך בדרישות חישובית גדולות לניתוח ואחסון נתונים.

ליישומים קליניים, שבו רק חלק קטן של הגנום עשוי להיות עניין קליני, שני חידושים מסוימים ברצף טכנולוגיה היו טרנספורמטיבי. ראשית, דרך לכידת אקסון מבוסס הכלאה, אפשר לבודד DNA מתאים לגנים סרטניים הקשורים מפתח לפרופיל מוטציה ממוקד 8,. שנית, באמצעות קשירה של ברקודים המולקולריים (רצפי DNA כלומר 6-8 נוקלאוטידים באורך), אחד יכול בריכה מאות דגימות לריצת רצף ולקחת באופן מלא את יתרון של היכולת ההולכת והגוברת של מכשירי רצף מקבילים מסיבי 10. כאשר הוא משולב, חידושים אלו מאפשרים גידולים להיות צדודית עבור עלות נמוכה יותר ובתפוקה גבוהה יותר, עם דרישות חישובית קטנות 11. יתר על כן, על ידי חלוקה מחדש של כיסוי רצף רק לגנים הקריטיים ביותר ליישום המסוים, אפשר achieיש עומק רצף גדול יותר לגילוי רגישות גבוהות יותר לאירועים בתדירות אלל נמוכים.

כאן אנו מתארים assay שלנו IMPACT (Integrated מוטצית פרופיל של מטרות שניתן לפעול למלחמה בסרטן), אשר מנצל לכידת אקסון על בריכות ספריית רצף המינימרקטים על ידי הכלאה באמצעות oligonucleotides המותאמת אישית כדי ללכוד את כל אקסונים המקודדים החלבונים ובחר אינטרונים של 279 גנים סרטניים הקשורים מפתח (טבלת 1 ). אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי של מוטציות, indels, שינויי עותק מספר, ובחר שחלופים מבניים מעורבים 279 הגנים האלה. השיטה שלנו היא בקנה אחד עם DNA שבודד משני רקמות קפואים וFFPE כמו גם aspirates מחט הדק ודגימות ציטולוגיה אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ה-DNA ומגיב הכנה

הערה: פרוטוקול זה מתאר את העיבוד וניתוח סימולטני של 24 דגימות (גידול למשל 12 / זוגות רגילים), אך יכול להיות מותאם לקבוצות קטנות יותר וגדולות יותר. דגימות ה-DNA יכולות לנבוע מFFPE או רקמות קפואים, דגימות ציטולוגית, או דם. בדרך כלל, שני גידול ורקמות נורמליות מאותו המטופל יהיה צדודית יחד על מנת להבחין בין מוטציות סומטיות מפולימורפיזם בירושה. הפרוטוקול מתחיל הבא מיצוי DNA באופן מיידי.

  1. Aliquot 50-250 ננוגרם (250 NG מומלץ) של ה-DNA שחולץ לדגימה, בדילול מלא 1x טריס-EDTA (pH 8.0) חיץ לנפח סופי של μl 50, לתוך צינורות תחתון נפרדים Covaris עגולים.
  2. הגזירה ה-DNA על מכשיר Covaris E220 בהגדרות הגזירה הבאה: 360 שניות ב10 גורם החובה, 175 PIP, ו200 מחזורים לפרץ.
  3. להפשיר חרוזים AMPure XP (טבלה 2) לטמפרטורת חדר. הפשירו כל buffers ואנזימים על קרח לפני הצעד המתאים.

2. מודול תיקון סוף - הכנת הספרייה

  1. מכין את תערובת מאסטר תיקון הסוף בצינור microcentrifuge סטרילי באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 10 μl של 10x תגובת תיקון הצפת NEBNext קצה (טבלה 2), 5 μl NEBNext סיום תיקון אנזים מיקס (טבלה 2), H nuclease ללא סטרילי 35 μl 2 א '
  2. Aliquot 50 μl של כל הדנ"א טעון לתוך בארות נפרדות מצלחת 96 היטב. הוסף 50 μl של מיקס מאסטר תיקון הסוף מוכן לכל תגובה. דגירה בthermocycler למשך 30 דקות ב20 ° C.

3. תיקון הודעה סוף נקי-up

  1. להוסיף נפח 2x (200 μl) של חרוזי AMPure XP (טבלה 2) לכל מדגם ועדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x באמצעות pipettor רבי ערוצים. לדגור על RT במשך 15 דקות.
  2. מניחים על הדוכן המגנטי (טבלה 2
  3. בעדינות להסיר ולסלק בלטפל supernatant ברור שלא להפריע חרוזים. נוזל מסוים עשוי להישאר בבארות.
  4. עם צינורות על דוכן העדים, בעדינות להוסיף 200 μl של מוכן טרי אתנול 80% לכל דגימה ודגירת צלחת בטמפרטורת חדר במשך 30 שניות. זהירות, להסיר אתנול על ידי פיפטה.
  5. חזור על שלב 5, עבור סכום כולל של 2 שטיפות אתנול. ודא כי כל אתנול הוסר. הסר מהדוכן המגנטי ולתת להתייבש על RT במשך 5 דקות.
  6. Resuspend חרוזים מיובשים עם 44.5 H μl סטרילי 2 O. בעדינות, בכל נפח פיפטה מעלה ומטה 10x מערבב היטב. חרוזים להבטיח כבר אינו מחוברים לצד השני של הבאר.
  7. דגירה חרוזים מושעים ב RT במשך 2 דקות. מניחים על דוכן מגנטי במשך 5 דקות עד המדגם מופיע ברור.
  8. בעדינות להעביר 42 μl של supernatant ברור המכיל את המדגם לבאר חדשה.
    ההליך עשוי להיפסק בבטחה ברחוב זהep ודגימות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים. כדי להפעיל מחדש, להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני שתמשיך.

4. הכנת ספרייה - מודול DA-עוקב

  1. מכין את תערובת מאסטר DA-עוקב בצינור microcentrifuge סטרילי באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 5 μl של 10x תגובת DA-עוקב NEBNext חוצץ (טבלה 2), 3 μl ('3'-5 Exo-) Klenow קטע (טבלה 2 ).
  2. הוסף 8 μl של מיקס מאסטר DA-עוקב מוכן לזה המכיל גם 42 μl של ה-DNA-תיקון הסוף. דגירה בthermocycler ל30 דקות ב 37 ° C.
  3. בצע הודעה DA-עוקב לנקות: חזור על שלבים 3.1-3.8 באמצעות נפח 2x (100 μl) של חרוזים, אבל resuspend ב סטרילי H 2 O לנפח סופי של μl 33.75.
    ההליך עשוי להיפסק בבטחה בכל צעד ודגימות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים זה. כדי להפעיל מחדש, להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני שימשיך. </ Li>

5. הכנת ספרייה - מתאם קשירת מודול

  1. מכין את תערובת מאסטר קשירת בצינור microcentrifuge סטרילי באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 10 μl של תגובת הצפת 5x NEBNext מהירה קשירת (ניו אינגלנד Biolabs, טבלת 2), 5 μl מהיר אנזים T4 DNA (טבלה 2).
  2. הוסף 15 μl של מיקס מאסטר קשירת לזה המכיל את ה-DNA זנב-DA כן.
  3. הוסף 1.25 μl של המתאם המתאים 25 מיקרומטר NEXTflex המבורקד (טבלת 2) זה טוב. כל דגימה צריכה לקבל מתאם המינימרקטים נפרד. דגירה בthermocycler ל15 דקות ב 20 ° C.
  4. לבצע ניקוי קשירת הודעה מתאם: חזור על שלבים 3.1-3.8 באמצעות נפח 1x (50 μl) של חרוזים, אבל resuspend ב סטרילי H 2 O לנפח סופי של μl 50.
  5. חזור על שלבים 3.1-3.8 לשנייה 1x לנקות נפח (50 μl), אבל resuspend ב סטרילי H 2 Oנפח סופי של μl 23.
    ההליך עשוי להיפסק בבטחה בכל צעד ודגימות מאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים זה. כדי להפעיל מחדש, להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני שתמשיך.

6. הגברה ספרייה

  1. מכין את תערובת KAPA HiFi השנייה בצינור microcentrifuge סטרילי באמצעות הכרכים הבאים לדגימה: 25 μl 2x KAPA HiFi HS RM (טבלה 2), 1 μl כל אחד מ100 מיקרומטר פריימר 1 ופריימר 2 (טבלה 3).
  2. הוספת 27 μl של מיקס מאסטר היטב כל אחד שמכיל את מוצר קשירה. הגדר פיפטה 50 μl ופיפטה בעדינות מעלה ומטה 10x כל הנפח.
  3. הנח בthermocycler למחזורי PCR הבאים: denaturation הראשוני של 45 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 10 מחזורים של 15 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב60 ° C, 30 שניות ב72 מעלות צלזיוס, וסיומת סופית של 1 דקות ב72 ° C.
  4. בצע לנקות הודעה הגברה: חזור על שלבים 3.1-3.8 באמצעות1x נפח (50 μl) של חרוזי XP AMPure, ו resuspend במים סטריליים לנפח סופי של μl 30.
  5. לכמת את הריכוז של כל ספרייה באמצעות קיוביט הרחב טווח Assay (Life Technologies, טבלה 2) בהתאם להוראות היצרן.

7. רוש NimbleGen SeqCAP EZ ספריית הכלאה, לשטוף, והגברה

  1. חוסמי הפשרה אוניברסליים ומדד oligonucleotide (לוח 3), ספריית EZ SeqCap, ורכיבי לכידת NimbleGen (DNA COT, חיץ הכלאת 2x, ומרכיב הכלאה, טבלת 2) על קרח. כל חוסמי oligonucleotide מאוחסנים במניות חוזרות בסך של 1 מ"מ. ספריית EZ SeqCap שלנו היא בריכה אישית מעוצב בדיקות ללכוד המקיפות את כל אקסונים המקודדים החלבונים של 279 גנים הקשורים לסרטן, אם כי ניתן להשתמש בעיצובים מותאמים אישית וקטלוג אחרים.
  2. הכן את בריכת מ"מ 1 של חוסמי oligonucleotide המדד המקבילים למודעה המינימרקטים הספציפיתרצפי aptor משמשים בהכנת ספרייה. שלב μl 1 של כל חוסם, ומערבולת.
  3. בצינור סטרילי חדש 1.5 מיליליטר microcentrifuge, להוסיף 5 μl של ה-DNA COT 1mg/ml, 2 μl של 1 חוסם אוניברסלי מ"מ ו2 μl של בריכת 1 מ"מ של חוסמי oligonucleotide המדד.
  4. בריכת 24 ספריות המינימרקטים לתגובה אחת. להוסיף סך של 1-3 מיקרוגרם של נקוותה ספריית רצף המינימרקטים, (הכין לעיל) לתערובת ללכוד. ל24 דגימות, לדגימה 100 ng מומלץ. כאשר איגום גידולים ודגימות נורמליות מתאימים, המלצנו להוסיף עוד ספריית גידול (לגידול ו50 ng לנורמלי למשל 100 ng), כך שהם רצף לעומק רב יותר של כיסוי.
  5. סגור הכובע של הצינור ולעשות 15-20 חורים בחלק העליון של הכובע עם G 18-20 או מחט קטנה יותר. המהירות Vac הספרייה / COT-DNA / oligos המדגם המוגבר ברכז ואקום-DNA על חום גבוה (60 מעלות צלזיוס).
  6. ברגע שהתייבש לגמרי, רעננות עם 7.5 μl של hybridi 2xzation חיץ ו3 μl של א 'רכיב הכלאת הצינור צריך עכשיו להכיל את הדברים הבאים: 5 DNA מיקרוגרם COT, ספריית מדגם מוגברת מיקרוגרם משתנה, 1000 pmol של יוניברסל והאינדקס oligos, חיץ 7.5 μl 2x הכלאה, 3 מרכיב הכלאת μl ב נפח כולל של 10.5 μl.
  7. לכסות את החורים במכסה עם חתיכה קטנה של סרט במעבדה. ורטקס המדגם עבור 10 שניות ו צנטריפוגות במהירות המרבית ל10 שניות.
  8. דגירה המדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל-DNA, ואחריו צנטריפוגה במהירות המרבית ל10 שניות ב RT.
  9. בתוך צינור רצועה חדש 0.2 מיליליטר PCR, להכין 2.25 aliquot μl בדיקות ללכוד ספריית SeqCap EZ ו2.25 μl של H nuclease החופשי סטרילי 2 O ולהוסיף את התוכן של צעד 7.7. בעדינות פיפטה כל הנפח למעלה ולמטה 10x.
  10. דגירה בCycler תרמית ב47 מעלות צלזיוס במשך 48-96 שעה. להגדיר ולשמור על טמפרטורת המכסה של Cycler התרמי ל57 ° C.
  11. תחשיב היחסיםצעדים נמוכים בפרק 6 של v3.0 משתמש SR ספריית EX SeqCap NimbleGen המדריך (טבלה 2) לשטיפה ושחזור של ה-DNA שנתפס.
  12. להלן שלבים בפרק 7 של פרוטוקול רוש NimbleGen להגברה של ה-DNA שנתפס בשינויים הבאים:
    • השתמש 2x KAPA HiFi פולימראז (טבלה 2) במקום Phusion גבוהים פידליטי PCR מיקס מאסטר
    • השתמש 100 פריימר 1 מיקרומטר ופריימר 2 מופיע בטבלה 3.
    • הפעל את תנאי PCR הבאים: denaturation הראשוני ב98 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 11 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, והרחבה סופית 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות . תחזיק ב 4 ° C.
  13. לכמת את הריכוז המוגבר DNA שנתפס באמצעות קיוביט הרגישות גבוהה Assay (טבלה 2) בהתאם להוראות היצרן.
  14. לנתח את איכות ה-DNA שנתפס באמצעות Agilent ביושבב ה-DNA המנתח HS (טבלה 2) על פי הוראות היצרן.
    • תשואת PCR צריכה להיות לפחות 100 ng (טווח 100-1,000 ng).
    • אורך הקטע הממוצע צריך להיות בין 150-400 זוגות בסיסים.

8. רצף Illumina Hi-Seq

  1. לדלל את המוגבר DNA שנתפס עד שעה 2, ולטעון את המדגם על נתיב יחיד של תא זרימת Illumina HiSeq 2000. קורא זוג 75 בסיס לזווג סוף הרצף בהתאם להוראות היצרן. מניסיוננו, נתיב אחד הוא מספיק כדי לייצר 500-700x כיסוי רצף ייחודי לדגימה פני 279 גנים לברכה של 24 דגימות.
  2. תוכנת Illumina (Real ניתוח זמן) תהיה להמיר תמונות ברזולוציה גבוהה לעוצמות אשכול לבסס את השיחות וציוני איכות. השתמש CASAVA לdemultiplex הנתונים לפי זהות ברקוד וליצור קבצי FASTQ בודדים עבור כל דגימה.

9. הנתונים אנאלייםיסיס

  1. רצפי מתאם לקצץ מקצה '3 של רצף קוראים בקבצי FASTQ באמצעות Cutadapt (http://code.google.com/p/cutadapt/). אורך החפיפה המינימאלי (-O) הוא 3 עם שיעור שגיאה (e-) של 1%. אורך הבסיס המינימאלי לשמירה של מותאמים קורא אחרי זמירה היא 25.
  2. יישרו רצף קורא לhg19 הגנום האנושי התייחסות שימוש באפשרות ורוז-ילר Aligner (BWA) 12. בצע את שלבים שלאחר העיבוד כוללים כפול סימון, התכנסות רצף מרובה מקומית, וrecalibration ציון איכות בסיס באמצעות הגנום ניתוח Toolkit (GATK) בהתאם לשיטות העבודה שלהם הסטנדרטי הטובות ביותר (http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = שיטות עבודה מומלצת) 13. כאשר פרופיל דגימות מרובות מאותו החולה (גידול ונורמלי לדוגמא תואמות), התכנסות רצף מרובה מקומית צריכה להיות perforמשותף מד. התפוקה של צעדים שלאחר העיבוד אלה היא קובץ BAM נפרד עבור כל מדגם, אשר מכיל את כל, ומידע יישור איכות רצף וניתן לטעון ישירות לתוך אינטגרטיבית ג'נומיקס Viewer (IGV) להדמיה של קורא ורצף גרסאות 14.
  3. חישוב מדדי ביצועי רצף תוך שימוש בכלים פיקארד (http://picard.sourceforge.net/). מדדים אינפורמטיבי כוללים שיעור יישור, התפלגות גודל שבר, הטיה הכיסוי קשורה GC-תוכן, ייחודי ללכוד על היעד, PCR לשכפל שיעור, מורכבות ספרייה, ומתכוון לכיסוי יעד. ערכי נציג מוצגים באיור 1. תדרי אלל באתרי פולימורפיזם נפוצים מחושבים באמצעות DepthOfCoverage מGATK משמשים לניטור זיהום מ-DNA שאינו קשור ועל מנת להבטיח כי דגימות התאימו באו מאותו החולים.
    הניתוחים חישוביים הבאים תלויים בנוכחותם של התאמהדגימות גידולים ורגילים לצורך זיהוי של שינויים גנטיים סומטיים. גידולים שאין כמוהו יכולים גם להיות מנותחים באמצעות מדגם נפרד שליטה רגילה, אבל לא יכולה בקלות להבחין מוטציות סומטיות ביותר מגרסות רצף בירושה.
  4. קורא גרסאות סומטיים נוקלאוטיד בודדים (SNVs) עבור כל זוג גידול נורמלי באמצעות מתקשר מוטציה גופני, כגון 15 muTect, SomaticSniper 16, או Strelka 17. אנו משתמשים muTect עם קריטריוני סינון שונה, המאפשרים לגרסות עם ספירת אלל הנמוך (שאינו אפס) במדגם הנורמלי כל עוד תדירות אלל היא לפחות פי 5 גדולה יותר בגידול. גרסאות נקראות שוב ושוב בפנל של DNAs הנורמלי יוסרו כחפצים שיטתיים סביר של רצף או יישור. כל SNV עובר מסננים לאחר מכן נבדק בקפידה באמצעות IGV.
  5. התקשר indels הגופני לכל זוג גידול רגיל באמצעות אלגוריתמים כגון 13 SomaticIndelDetector, Dindel 18, או SOAPindel 19
  6. להסיק מעמד מספר עותק מכיסוי הרצף באקסונים היעד. עבור כל דגימה בודדת, לבצע נורמליזציה לס כיסוי רצף ממוצע לכל אקסונים היעד, רגרסיה מעל אחוז GC. התאם את ערכי כיסוי unnormalized על ידי הפחתת כושר הלס והוספת המדגם רחב הכיסוי החציוני. לחשב את יחס כיסוי ברצף מנורמל על פני כל אקסונים היעד לזוגות גידולים רגילים. בהעדר מדגם רגיל מתאים ו / או להקטין את רעש דיפלואידי בהתאמה המין השני,פקדים רגילים חסרי גרסאות עותק מספר תאי מין עשויים לשמש. לקבוע רווחי עותק מספר סומטיים והפסדים המבוססים על עליות או ירידות ביחס הכיסוי.
  7. התקשר שחלופים גופניים כרוכים בגנים סרטניים שבו נקודת עצירה אחת לפחות הגנומי נופלת בתוך או בסמוך למרווח ממוקד של הגנום. אלגוריתמים הציעו לכלול 20 GASV, Breakdancer 21, 22 CREST, ודרנגר 23. תנוחות הפוכות intrachromosomal, מחיקות והכפלות בד בבד ניתן להבחין מבוססות על המיקום והכיוון היחסי של תמיכה קוראים בזוגות צורמים. כל שחלופי המועמד צריכים להיבדק באופן ידני באמצעות IGV. אנו ממליצים אימות ניסיוני על ידי רצף ה-PCR וסנגר על פני נקודות העצירה התארגנות המשוערות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בריכה אחת 24 ספריות המינימרקטים רצף (12 זוגות גידולים רגילים) נתפסה באמצעות בדיקות המתאימות לכל אקסונים המקודדים החלבונים של 279 גנים סרטניים ורצף כ2 x 75 נ"ב קורא בנתיב אחד של תא זרימת HiSeq 2000. גידול וספריות רגילות היו נקווים בביחס של 2:1. מדדי ביצועים לדוגמא עבור מאגר של דגימות DNA גידול קפוא מוצגים באיור 1, ובכלל זה שיעור יישור, התפלגות גודל שבר, סגוליות לכידה על היעד, ומתכוונים לכיסוי יעד. מוטציות סומטיות דוגמא, הוספות, מחיקות ושינויי עותק מספר מוצגים איורים 2-4.

איור 1
איור 1. דמויות מייצגות של מדדי ביצועי רצף. א) צפיפות אשכול ושיעור יישור, ב) אומר כיסוי היעד, > ג) להוסיף את התפלגות גודל, וד) ללכוד סגוליות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. תמונה אינטגרטיבית ג'נומיקס Viewer (IGV) מראה ספציפי של כיסוי רצף באקסונים של EGFR בסרטן ריאות (למעלה) ורקמות מתאימים נורמליות (למטה). פסים אפורים מייצגים רצף ייחודי קורא. בצד ימין, מוטציה T> G הטרוזיגוטיים נמצאת ב24% קורא בגידול ו0% מכלל קוראים ברגילים, מה שמעידים כי מדוברת בהחלפת חומצת אמינו L858R סומטיים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

3 "עבור: תוכן width =" "width =" "src =" 6in / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "/> 600px
איור 3. דוגמאות לindels בזוג גידולים רגילים סרטן מעי גס:..) הכנסת frameshift סומטי בAPC ב) מחיקת frameshift Somatic של 7 זוגות בסיסים בTP53 לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. שינויי מספר עותק בזוג גידולים רגילים. כל נקודת נתונים מייצגת אקסון אחת מ279 גנים המטרה. רווחי מספר העתק והפסדים המשתמעות מעליות וירידות בכיסוי רצף גידול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

gether.within-page = "תמיד"> טבלת 1: בדיקה תכונות עיצוב ללכידת יעד.

סה"כ אקסונים 4,535
סה"כ אינטרונים 14
SNPs * 1042
שטח יעד סה"כ 879,966 basepairs
שטח בדיקה סה"כ 1,400,415 basepairs

טבלה 2. ריאגנטים וערכות.

שםמגיב / חומרים חברה מס 'קטלוגי
מודול תיקון NEBNext End Biolabs ניו אינגלנד E6050L
NEBNext DA-עוקב מודול Biolabs ניו אינגלנד E6053L
NEBNext המהיר קשירת מודול Biolabs ניו אינגלנד E6056L
Agencourt AMPure XP Genomics קולטר בקמן
NEXTflex PCR-חינם ברקודים - 24 Bioo מדעי 514,103
ערכת HiFi ספריית ההגברה Biosystems KAPA KK2612
COT-DNA האנושי, fluorometric כיתה אבחון רוש 05 480 647 001
NimbleGen SeqCap EZ הכלאה וערכת שטפי רוש NimbleGen 05 634 261 001
פיתיונות ספריית EZ SeqCap רוש NimbleGen
ערכת טיהור QIAquick PCR Qiagen 28104
המגוון הרחב dsDNA קיוביט (BR) ערכת Assay טכנולוגיות חיים Q32850
קיוביט dsDNA רגישות גבוהה ערכת Assay (HS) טכנולוגיות חיים Q32851
ערכת Agilent DNA HS Agilent Technologies 5067-4626, 4627
2100 Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies
Covaris E220 Covaris
מגנטי Stand-96 Ambion AM10027
Illumina Hi-Seq 2000 Illumina

לוח 3. אוליגו חוסמי מדד ורצפי צבעי יסוד.

חוסם TS-INV-HE אינדקס 2
TS-HE האוניברסלי חוסם AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
חוסם אינדקס 1 TS-INV-HE CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
TS-INV-HE חוסם אינדקס 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE מדד 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
TS-INV-HE אינדקס 10 חוסם CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם 15 TS-INV-HE האינדקס CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
20 חוסם TS-INV-HE האינדקס CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
חוסם TS-INV-HE אינדקס 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
פריימר 1 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 "
פריימר 2 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 "

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

assay ההשפעה שלנו מייצר שיעור גבוה יישור, שיעור על היעד גבוה, כיסוי יעד גבוה, ורגישות גבוהה למוטציות איתור, indels, ולהעתיק את שינויי מספר. אנחנו הוכיחו את היכולת של assay ההשפעה שלנו ל-DNA רצף מקפוא והן בארכיון דגימות FFPE של קלט DNA הנמוך. על ידי ביצוע רצף אקסון ממוקד של גנים הקשורים לסרטן מפתח, אפשר להשיג כיסוי רצף עמוק מאוד לאקסונים של גנים הקריטיים ביותר אלה למקסם את היכולת לזהות מוטציות בתדר נמוכות ובכך. השימוש בbarcoding והריבוב מאפשר תפוקה גבוהה יותר, עלות נמוכה יותר לכל מדגם, וסכומי כניסה נמוכים יותר של ה-DNA.

יתרון של הגישה הממוקדות הוא שזה אפשרי כדי לייעל את בדיקות ללכוד כזה שכל האקסונים מכוסים באופן אחיד ומספיק לזיהוי מוטציה. כפי שניתן לראות בטבלה 1, העיצוב שלנו כולל 4,535 אקסונים ב279 גנים. בעקבות שיפורי איטרטיבי כדיהעיצוב שלנו, ניסוי רצף טיפוסי מייצר לא יותר מ -2% מאקסונים בפחות מ 20% מהכיסוי החציוני עבור כל מדגם. כך, לגידול ברצף לכיסוי 500x רצף (הערכה שמרנית כפי שהיא מוצגת באיור 1),> 98% מאקסונים יהיו מכוסים על ידי> 100x עומק, מבטיחים רגישות גבוהה לזיהוי מוטציות בתדירות נמוכה. אחידות זו של כיסוי ניתן לייחס במידה רבה לגמישות של מערכת NimbleGen SeqCap, שבו בדיקות עשויות להיות מסונתזת לאורכים שונים באזורים של הרכב נוקלאוטיד שונה. יש לנו גם השתמשו בהצלחה oligonucleotides biotinylated מסונתזת בנפרד מDNA משולב טכנולוגיות (IDT) כדי להוסיף תוכן חדש לפנל שלנו ולהגביר את הכיסוי של אזורים שקשה לתפוס ו / או רצף. גם על ידי לכידת אינטרונים נבחרים של גנים מחדש שוב ושוב, אנו מסוגלים לזהות שחלופים מבניים לייצר גנים היתוך גם כאשר רק אחד fusioשותף n הוא נתפס.

גישת רצף ממוקד זה עושה יש שתי מגבלות עיקריות ביכולת לזהות שינויים גנטיים "נהג" בגידולים. ראשית, רק חלק קטן של הגנום הוא נחקר. רצף ממוקד הוא, מטבעו, מוגבל. כגנים סרטניים חדשים לצוץ ממאמצי גנומיקה שיטתיים, הם עשויים להתווסף במהירות לפנל לכידה, אבל מוטציות חשובות ופונקציונליות עשויות לפספס שיזוהה על ידי גנום שלם או רצף exome כולה. שנית, הוא מוגבל לשינויים המבוסס על ה-DNA. זיהוי של תמלילים הביעו aberrantly, isoforms אחוי רומן, והתכת גן דורש RNA-Seq או בטכניקות דומות 24. שינויים אפיגנטיים כגון שינויי הכרומטין ומתילציה דנ"א עשויים גם לשחק תפקיד מפתח בהיווצרות גידול והתקדמות גידול. כפי טכנולוגיות רצף להמשיך ולשפר, אפשר לדמיין אסטרטגיות משולבות העסקת רצף הגנום כולו, RNA-Seq וapproa משליםצ 'ס מקיף כדי לאפיין את ההרכב הגנטי ואפיגנטיים של גידולים בודדים על בסיס שגרתי 25. אסטרטגיות משולבות כמלאות כרגע עלות ורצף המחשוב אוסרני, ממוקד מציגה חלופה מעשית כדי ללכוד את התכונות גנומית המובהקות ביותר ליישומים קליניים translational.

הפרוטוקול שלנו מבוסס על ההנחה כי גידולים רצף לצד הרקמות מתאימים שנלקחו מאותו החולה. המטרה של שליטה נורמלית זה כדי לקבוע אם גרסאות רצף זוהו בגידול עוברות בירושה או רכשו גופני. בהעדר התאמה רגיל, ניתן להסיק כי גרסאות המתרחשות בנקודות חמות מוטאציות (כלומר אתרים של מוטציות סומטיות חוזרות בסוגי סרטן אחרים) עשוי להיות גופני. יתר על כן, ניתוח של רווחים של מספר עותקים והפסדים יכול להתבצע עם מדגם רגיל דיפלואידי מתאים שאינו גנטי. לכל שינויים הגנטיים הרומן השני, העת ובעונהניתוח היחידות הארגוניות של רקמה נורמלית מתאים מאוד מפשט את הפרשנות של נתוני מוטציה וכתוצאה מכך, והוא מומלץ ביותר.

פרוטוקול IMPACT המתואר כאן מדגים עקביות וביצועים באיכות גבוהה לדגימות קפואות. אנו צפינו מדי פעם השתנות בעבודה עם דגימות FFPE, אם כי. בהתאם לגיל והאיכות של מדגם FFPE, ה-DNA יכול להיות חמור מושפלת או כימי שונה, וכתוצאה מכך עלול להפוך את רצף וניתוח קשה 26. עם זאת, מצאנו תנאי ניסוי אלה להיות אמינים עבור רוב הגדולים של דגימות FFPE. יש לנו גם מיושמים בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לאפיין דגימות רלוונטיות קליני אחרות כגון ביופסיות, aspirates מחט דק, ודגימות ציטולוגיה. זה מסיבה זו, הגמישות כדי להתאים לסוגים שונים של דגימות באיכות משתנה, כמות, וההטרוגניות-כי שיטה זו עומדת להשפיע על האבחוןטיפול ד של חולי סרטן בזירה הקלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר ברגר קיבל דמי ייעוץ ומימון מחקר מהקרן לרפואה, חברת אבחון הסרטן.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אגנס ויאלה ומעבדת Core ג'נומיקס MSKCC לקבלת סיוע טכני. פרוטוקול זה פותח בתמיכת המרכז לחקר סרטן Beene ג'פרי וקרן פארמר המשפחה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBNext End Repair Module New England Biolabs E6050L  
NEBNext dA-Tailing Module New England Biolabs E6053L  
NEBNext Quick Ligation Module New England Biolabs E6056L  
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter Genomics  
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 Bioo Scientific 514103  
HiFi Library Amplification Kit KAPA Biosystems KK2612  
COT Human DNA, Fluorometric Grade Roche Diagnostics 05 480 647 001  
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit Roche NimbleGen 05 634 261 001  
SeqCap EZ Library Baits Roche NimbleGen  
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104  
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit Life Technologies Q32850  
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Life Technologies Q32851  
Agilent DNA HS Kit Agilent Technologies 5067-4626, 4627  
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies  
Covaris E220 Covaris  
Magnetic Stand-96 Ambion AM10027  
Illumina Hi-Seq 2000 Illumina  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
  2. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  3. Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
  4. Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
  5. Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
  6. Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
  7. Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
  8. Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
  9. Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  10. Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
  11. Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
  12. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  13. Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
  14. Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  15. Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
  16. Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
  17. Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  18. Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
  19. Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
  20. Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
  21. Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
  22. Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
  23. Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
  24. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  25. Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
  26. Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 80 טכניקות לאבחון מולקולריות תפוקה גבוהה נוקלאוטיד רצף גנטיקה שאתות אבחון ריצוף מקביל מסיבי רצף אקסון ממוקד לכידת הכלאה סרטן FFPE מוטציות DNA
זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Won, H. H., Scott, S. N., Brannon,… More

Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing. J. Vis. Exp. (80), e50710, doi:10.3791/50710 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter