Summary
Mänskliga endogena retrovirus (HERV), som upptar 8% av det mänskliga genomet, behålla knappa kodning kapacitet men hundratusen långa terminala upprepningar (LTR). En anpassad Affymetrix microarray var utformad för att identifiera enskilda HERV locus uttryck och användes på prostatacancervävnad som ett proof of concept för framtida kliniska studier.
Abstract
Den prostataspecifikt antigen (PSA) är den viktigaste diagnostiska biomarkörer för prostatacancer i kliniskt bruk, men den saknar specificitet och känslighet, särskilt i låga doseringsvärden 1. "Hur du använder PSA" är fortfarande en aktuell fråga, antingen för diagnos som en gråzon som motsvarar en koncentration i serum av 2,5-10 ng / ml som inte tillåter en tydlig åtskillnad göras mellan cancer och noncancer 2 eller för patient uppföljning upp som analys av postoperativ PSA kinetiska parametrar kan innebära stora utmaningar för deras praktiska tillämpning 3,4. Alternativt är icke-kodande RNA (ncRNAs) fram som viktiga molekyler i mänsklig cancer, med potential att fungera som nya markörer för sjukdomen, t.ex. PCA3 i prostatacancer 5,6 och avslöja okarakteriserade aspekter av tumörbiologin. Dessutom data från KODA som publicerades under 2012 visade att olika RNA typer täcker cirka 62% av den genOMe. Det framgår också att den mängd av transkriptionella regulatoriska motiv är minst 4.5x högre än en motsvarande protein-kodande exoner. Således långa terminala upprepningar (LTR) av humana endogena retrovirus (HERV) utgör ett brett spektrum av förmodade / kandidattranskriptionsreglersekvenser, eftersom det är deras primära funktion i infektiösa retrovirus. HERV, som är spridda över hela det mänskliga genomet, kommer från släkt och oberoende infektioner i könsceller, följt av kopiera och klistra in spridningsprocesser och leder till Multicopy familjer ockuperar 8% av det mänskliga genomet (observera att exoner spänner över 2% av vår arvsmassa ). Vissa HERV loci ändå uttrycka proteiner som har förknippats med flera sjukdomar, inklusive cancer 7-10. Vi har utformat en hög densitet microarray, i Affymetrix-format, som syftar till att på bästa sätt karakterisera enskilda HERV loci uttryck, för att bättre förstå om de kan vara aktiva, om de kör ncRNA transkription eller modulate kodning genuttryck. Detta verktyg har tillämpats inom prostatacancerområdet (Figur 1).
Introduction
Mänskliga endogena retrovirus (även kallade HERV) är spridda över hela vår arvsmassa. De kommer från släkt och oberoende infektioner i könsceller, följt av kopiera och klistra in spridningsprocesser och leder till multikopie familjer. Idag är de inte mer smittsam, men de upptar 8% av det mänskliga genomet, som en jämförelsepunkt, exoner spänner 2% av det mänskliga genomet. Data från KODA som publicerades under 2012 visade att olika RNA typer täcker cirka 62% av genomet, varav en tredjedel i intergena regioner. Dessutom framgår det att mängden av transkriptionella regulatoriska motiv är minst 4.5x högre än en motsvarande protein-kodande exoner. HERV långa terminala upprepningar (LTR) representerar ett brett spektrum av potentiella transkriptionsreglerelement, eftersom det är deras vanliga funktion i infektiösa retrovirus. Historiskt, bortsett från några få loci uttryckt i moderkakan eller testiklar, allmänt troddes det att HERV är tysta på grund av epigenetic reglering. Därför har vi utformat en hög densitet microarray, i Affymetrix-format, som syftar till att på bästa sätt karakterisera enskilda HERV loci uttryck, för att bättre förstå om de är aktiva, om de kör lncRNA transkription eller modulera kodning genuttryck. Detta verktyg dubbade HERV-V2 Genechip integrerar 23.583 HERV probesets och kan diskriminera 5573 distinkta HERV element består av solo LTR samt kompletta och partiella pro-virus (Figur 2).
Diagnos, bedömning, och Plan:
Diagnos av prostatacancer är baserad på dosering av prostataspecifikt antigen (PSA) biomarkör i kliniskt laboratorium, en digital rektal undersökning för att utvärdera morfologiska förändring av prostatan och slutligen prostatabiopsier observeras av patologen. Bristen på tillräcklig specificitet och sensitivitet hos konventionella cancerbiomarkers såsom PSA för prostatacancer, har allmänt erkänts after flera decennier av kliniska implikationer 1. Inledningsvis var PSA föreslagits för diagnos och behandling av adenokarcinom av prostatan 11. Det var senare föreslås för cancerscreening och övervaka utvecklingen av sjukdomen 12. Det finns dock en fråga som regelbundet frågade: "hur man använder PSA". (I) En grå zon som motsvarar en koncentration i serum av 2,5-10 ng / ml inte tillåter en tydlig skillnad göras mellan cancer och noncancer 2, (ii) två stora kohortstudier skriva in sig hundratusentals människor i Europa och USA misslyckats med att komma till en tydlig slutsats om nyttan av screening i form av sjukdomsspecifik dödlighet 13,14, (iii) analys av postoperativa PSA kinetiska parametrar som PSA-clearance, PSA-hastighet och fördubbling tid, även om enkelt i teorin, kan innebära stora utmaningar i praktisk tillämpning 3,4. Vi kan förvänta oss att under de kommande åren, biomarkör applications kommer att stödja en klinisk val mellan vaksam väntan och mer eller mindre aggressiva behandlingar beroende på tumör fenotyp. När det gäller diagnos återges av patologen, kommer en första begränsande faktor från en 20% falskt negativ diagnos inom prostatabiopsier (många cancerformer är missas genom provtagning). En andra fråga handlar om behovet av en ytterligare biopsiförfarande efter en negativ, vilket kan medföra negativa effekter.
Radikal prostatektomi är idag en av de standardbehandlingar för prostatacancer. Det föreslås i friska patienter, åldrande 45-65 år, särskilt i fallet med aggressiva mönstren (Gleason 7-10), multifokal tumör eller palperbar tumör. Det görs nu i vår avdelning med hjälp av robot assisterad kirurgi. På grund av den växande bevis för att molekylära markörer kommer att ha avgörande betydelse under de kommande åren, beslutade vi att alla våra patienter att föreslå möjligheten att delta i ett program för prostatacancervävnadsbanker. Närmare bestämt har den expanderande molekylära forskningsprogram om prostatacancer medfört en ökande krav på tillgång till högkvalitativa färska tumörvävnader från prostatektomi prover. Denna forskning, i synnerhet de genomiska metoder, krävs stora prover av hög DNA / RNA kvalitet. Tumoral och angränsande "icke tumör" vävnad från samma patient behövs. Rekommendationer för hantering och bearbetning av radikala prostatectomies är utformade för att bevara patologiska funktioner som avgör stadiet och marginal status och därmed potentiell ytterligare behandling och prognos. Varje frisk vävnad provtagningsmetod, alltså, inte bör äventyra efterföljande patologiska bedömningar för att kunna godtas av diagnosen. Makroskopisk dissektion av prostatan är svår och stor uppmärksamhet måste ägnas åt marginal vävnader och kapsel invasion: någon dissektion för prostata bank bör alltid utföras av en utbildad uropathologist enligt en överensd-protokollet. Den etiska kommittén av den medicinska fakulteten och staten medicinska styrelsen kommit överens om att dessa undersökningar och informerat samtycke erhölls för samtliga patienter inkluderade i prostatavävnad bank.
Protocol
1. Kirurgi
När bort av kirurgen, hålla prostatan på is tills det tas hand om av en patolog.
2. Hantering av prostatavävnader
- Att respektera fördröjningen av perioperativ ischemi, överföra radikal prostatektomi prover på is till laboratoriet med engagerad personal inom 30 minuter efter kirurgisk ablation. Fördröjningen för frysning bör vara mindre än 20 till 30 min (figur 3A).
- Väg upp och ge fläckar prostatan enligt den vanliga protokoll (t.ex. grönt på höger sida, svart på vänster sida, se fig. 3B och 3C).
- Utför en stor tvärsektion av körteln på den bakre sidan (Figur 3D). Orientera prostata och lägga den på den främre sidan. Utför en stor tvärsektion av körteln på den bakre sidan med en steril kirurgisk kniv.
- Dissekera vävnadsbitar på övergångszonen,på vänster och höger perifera zoner, lämnar marginalerna intakta (figur 3E).
- Sätt kärnorna hos vävnad i ett Eppendorf-rör, snap frysa och lagra i flytande kväve (Fig. 3F). Om du inte gör biobank fortsätta direkt med steg 2.7.
- Utför prostata bank endast om den totala längden av cancer på biopsier är överlägsen 10 mm. Använd en sutur tråd att stänga prostatan och förhindra körtel distorsion och minimal störning av den kirurgiska marginalen (figur 3G). Sedan fixa radikal prostatektomi provet med formalin och bädda i paraffin enligt den vanliga proceduren för histologisk analys.
- Montera frysta vävnadskärnorna vertikalt på en liten kulle i oktober och gör avsnitt i en kryostat. Ta en första singel 5 um fryst avsnitt och fläcka den med blå toluidin.
- Utför en sammanfattning histologisk undersökning för att analysera typen av vävnad (dvs.. Benigna eller maligna). För tumörvävnad, uppskatta hur stor mängd tumörceller och välja endast kärnor med mer än 80% av tumörcellerna.
- Efter detta, gör en ny singel 5 um fryst avsnitt och fläcka den med hematoxylin, eosin och Safran. Sedan skär 15 sektioner x 30 ìm och placera den i en RNAse gratis Eppendorf-rör.
- Ta en sista 5 ìm fryst avsnitt för hematoxylin, eosin och Safran och färga den för att styra mängden tumörceller vid slutet av förfarandet.
- Sätt i Eppendorf-rör på torris och skicka provet till molekylärbiologi laboratorium.
3. RNA-extraktion, rening och kvalitetskontroll
- Homogenisering. Utför homogenisering i närvaro av en ml av Trizol/100 mg vävnad till dess att vävnaden är fullständigt upplöst i lösning. Lägg Trizol lösning gradvis och fortsätt med omsorg på is med hjälp av en handhållen slipmaskin. När väl homogeniserad, alikvot av lösningen till Eppendorf-rör och lämna i Trizol vid rumstemperatur underfem minuter.
- Fasseparation. Lägg till 300 l kloroform (eller 150 ^ BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sek lämnar därefter vid rumstemperatur under 2-3 min. Centrifugera vid 12.000 xg under 15 minuter vid 2-8 ° C.
- RNA-utfällningen. Överför försiktigt det övre vattenfasen till ett nytt rör. Lägg till 750 l isopropanol. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter (agitera med återföring). Inkubera 2 timmar vid -19 ° C/-31 ° C. Centrifugera proverna vid 12000 x g under 30 min vid 2-8 ° C.
- RNA-tvätt och fjädring. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten. Tvätta RNA pellets med 1 ml 80% EtOH (försiktigt vända rören). Centrifugera proverna vid 7500 xg under 10 min vid 2-8 ° C. Avlägsna supernatanten med användning av P1000 och P10. Tillåt Återstående EtOH för att lufttorka under 2-3 min. Tillsätt 100 ^ il RNas-fritt vatten, överförande rören till 70 ° C värmeblock och låt stå i 2-3 minuter för att lösa upp pelleten. Lägg sedan på is. Lagra vid -19 ° C/-31 ° C för korttidslagring och -80 ° C för långtidsförvaring.
- RNA-rening. Rena RNA med användning av RNeasy Mini Kit (Qiagen). Kortfattat, börja med att lägga 350 l buffert RLT till 100 ^ RNA-prov och blanda väl, följ sedan Qiagen proceduren. Slutligen tar en 3 | il (av 50 | il) alikvot av den renade produkten för kvalitetskontroller (steg 3,6). Butiks RNA vid -19 ° C/-31 ° C under en kortare period eller vid -80 ° C under en längre tids förvaring.
- RNA QC (Figur 4A). Kontrollera kvaliteten på RNA och RNA integritet med hjälp av en Bioanalyzer (Agilent) och en Nanodrop (Thermo), enligt tillverkarens instruktioner. RNA Integrity Number (RIN) används för att bedöma RNA kvalitet. Framför allt lyckas i upptäckten av 18S och 28S toppar rekommenderas starkt att använda proverna i ytterligare steg.
4. WT-ovation RNA-amplifiering
Rekommendationer för att utföra de amplifieringsstegen hjälp av WT-Ovation förstärkning kit i optimala förhållanden:
- Kör inte mindre än åtta förstärk prover i taget för att se pipetteringsprecision. Då svarar för 1 avfallsvolym vid beredning huvudmixar som kräver en uppdelning av satsen i 3 partier av 8 reaktioner.
- Ha alltid upptinade reagens och reaktionsrören på is, om inte annat anges.
- Använd endast en färsk 80% etanollösning för rening.
- Stanna inte i något skede av protokollet.
- Späd totalt RNA för att få en koncentration på 25 ng / | il. Process 2 ^ il av det utspädda provet.
- Förbered Poly-A-RNA-spike-kontroll lösning av en serieutspädning av poly-A-RNA lager med Poly-A Kontroll Dilution Buffer (Affymetrix), för att uppnå en 1:25,000 utspädning.
Steg 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. De reagenser som nämns refereras av leverantören enligt följande: A1 (First Strand primermix), A2 (First Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).
- Tina A1 och A2 vid rumstemperatur. Blanda genom att använda en vortex-blandare under 2 sek och centrifugera i 2 sek. Då, snabbt placera på is. Placera A3 på is.
- Sätt 2 ìl av total-RNA (50 ng) i en 0,2 ml PCR-rör och tillsätt 2 l av A1 (slutlig volym: 4 pl). Cap och snurra röret i 2 sek.
- Inkubera vid 65 ° C under 5 min, sedan placera röret på is.
- Förbered First Strand cDNA Master Mix enligt följande (ges för en enda reaktion). Blanda genom att pipettera och spinn ner en kort stund Master Mix. Omedelbart, lägg på is.
Reagens Volym First Strand Buffer Mix (A2) 5 ^ il Poly-A RNA Control (1:25,000) 0,5 ^ il First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 ^ il - Lägg till 6 & #181, l av Master Mix till RNA / Primer innehåller rör. Blanda genom att ställa röret, snurra i 2 sek och snabbt placera på is (slutlig volym: 10 pl).
- Inkubera vid 4 ° C under 1 min och därefter 25 ° C under 10 minuter, därefter 42 ° C under 10 min och sedan 70 ° C under 15 min. Förvaras svalt vid 4 ° C. Ta reaktionsröret från termocykler, snurra kort och hålla på is. Fortsätt omedelbart med andra Strand cDNA Synthesis steg.
Steg 2: Second Strand cDNA Synthesis 4,8-4,12. De reagenser som nämns refereras av leverantören enligt följande: B1 (Second Strand Buffer Mix) och B2 (Second Strand Enzyme Mix).
- Spinn ner B2 och B3 i 2 sekunder och snabbt placera på is. Tina B1 vid rumstemperatur. Blanda med hjälp av en vortex-blandare i 2 sekunder, snurra i 2 sek och snabbt placera på is.
- Förbered en andra Strand Master Mix enligt följande (ges för en enda reaktion). Blanda genom att pipettera och spinn ner Master Mix brieflyga. Omedelbart, lägg på is.
Reagens Volym Second Strand Buffer Mix (B1) 9,75 | il Second Strand Enzyme Mix (B2) 0,25 | il - Tillsätt 10 l av Master Mix till varje First Strand Reaction röret. Blanda genom att pipettera 3x, snurra i 2 sek och placera på is (slutlig volym: 20 pl).
- Inkubera vid 4 ° C under 1 min och därefter 25 ° C under 10 minuter, därefter 50 ° C under 30 min, och sedan 70 ° C under 5 min. Förvaras svalt vid 4 ° C. Ta reaktionsröret från termocykler, snurra kort och hålla på is. Fortsätt omedelbart med Post-Second Strand Enhancement steg.
Steg 3: Post-Second Strand Enhancement 4,13-4,15. De reagenser som nämns refereras av leverantören enligt följande: B1 (Second Strand Buffer Mix), B3 (Reaktion Enhancement Enzyme Mix).
- Förbered en Master Mix genom att kombinera B1 och B3 Mix enligt följande (ges för en enda reaktion). Blanda genom att pipettera och spinn ner en kort stund Master Mix. Omedelbart, lägg på is.
Reagens Volym Second Strand Buffer Mix (B1) 1,9 ^ il Reaktion Enhancement Enzyme Mix (B3) 0,1 ^ il - Tillsätt 2 l av Master Mix till varje Second Strand Reaction röret. Blanda genom att pipettera 3x, snurra i 2 sek och placera på is (slutlig volym: 22 pl).
- Inkubera vid 4 ° C under 1 min och därefter 37 ° C under 15 min, och sedan 80 ° C under 20 min. Förvaras svalt vid 4 ° C. Ta reaktionsröret från termocykler, snurra kort och placera på is. Fortsätt omedelbart med SPIA Amplification steget.
Steg 4: Sträng cDNA (sscDNA) syntes av SPIA proceduren från 4,16 -4,19. De reagenser som nämns refereras av leverantören enligt följande: C1 (SPIA primermix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
- Tina C1 och C2 vid rumstemperatur. Blanda med hjälp av en vortex-blandare, snurra i 2 sek och snabbt placera på is. Tina C3 på is. Blanda innehållet genom att försiktigt vända 5x. Se till att inte införa luftbubblor. Sedan snurra i 2 sek och lägg på is.
- Förbered en SPIA-Master Mix, som står för en 0,5 avfallsvolymen, enligt följande. Blanda genom att pipettera och spinn ner en kort stund Master Mix. Omedelbart, lägg på is.
Reagens Volym SPIA-buffert Mix (C2) 5 ^ il SPIA-primermix (C1) 5 ^ il SPIA-Enzyme Mix (C3) 10 | il - Tillsätt 20 ìl av SPIA Master Mix till Enhanced Second Strand Reaction tUbe. Blanda genom att pipettera 6-8x, spinn och snabbt placera på is (slutlig volym: 42 pl).
- Inkubera vid 4 ° C under 1 min och därefter 47 ° C under 60 min och sedan 95 ° C under 5 min. Förvaras svalt vid 4 ° C. Ta bort röret från termocykler, snurra kort och placera på is.
5. sscDNA Rening och kvalitetskontroll
- sscDNA rening. Rena sscDNA använder QIAquik PCR-reningskit (Qiagen). Kortfattat, börja med att lägga 200 l buffert PB till 42 l av förstärkt cDNA produkt, blanda och belastningen på kolonnen. Följ sedan den Qiagen proceduren. Slutligen tar en 3 | il (av 30 | il) alikvot av sscDNA renade produkten för kvalitetskontroller (steg 5,2).
- sscDNA erhållande och verifiering storleksfördelning (figur 4B). Kontrollera sscDNA utbytet och storleksfördelning med användning av en Bioanalyzer och en Nanodrop, enligt tillverkarens instruktioner. Storleken på fördelningen av förstärkta cDNA bör be vanligtvis ligger mellan 100 och 1500 baser lång med en topp runt 600 baser.
6. sscDNA Fragmentering
- Bered 2 pg av cDNA: t i 30 | il, justera volymen med nukleasfritt vatten.
- Bered 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), med utgångspunkt från en 10x OPA buffert PLUS lösning.
- Förbered 0,2 U / l DNas I (5-faldig utspädning av 1 U / l DNas I).
- Förbered en Fragmentering Master Mix enligt följande (ges för en enda reaktion):
Reagens Volym 10X One-Phor-All Buffer PLUS 3,6 ^ il DNas I (0,2 U / | il) 3 il - Lägg till 6.6 l av Fragmentering Mix till 30 l av sscDNA.
- Centrifugering och inkubera vid 37 ° C under 10 minuter, därefter inaktivera DNas I vid 95 ° C under 10 min och håll på is. Fördela 1 &# 181, l av den fragmenterade cDNA för verifiering Agilent baserad-storleksfördelning.
- sscDNA verifiering storleksfördelning (figur 4C). Kontrollera sscDNA storleksfördelning med användning av en Bioanalyzer (Agilent). Storleksfördelningen för fragmenterad cDNA bör typiskt innefattas mellan 35 och 200 baser.
7. Märkning av Fragmenterad sscDNA
- Späd DLR-1a 7,5 mM till 5 mM i DEPC-vatten.
- Förbered en märkning Master Mix enligt följande (ges för en enda reaktion):
Reagens Volym 5x TdT Reaction Buffer 14 | il CoCl 2 (25 mM) 14 | il DLR-1a (5 mM) 1 pl Terminal transferas (400 U / ^ il) 4,4 ^ il - Lägg till 33,4 l av mixen märkningtill var splittrad cDNA prov.
- Blanda genom att ställa röret, snurra snabbt och inkubera vid 37 ° C i 60 minuter, sedan hålla på is.
8. Hybridisering till HERV Chip Microarray
- Prewet den HERV Genechip med 200 | il förhybridisering Blanda (Affymetrix) och inkubera vid 50 ° C, 60 rpm, i 10 min.
- Förbered Hybridisering blandning enligt följande (ges för en enda reaktion):
Reagens Volym Kontroll Oligo B2 (3 nM) 3,3 ^ il 20x Eukaryotic Hybridisering Kontroll 10 | il 2x Hybridisering Mix 100 | il 99,9% DMSO 17,7 | il - Tillsätt 131 l av hybridisering Mix till 69 l av fragmenterad och märkt cDNA i rumstemperatur för att göra en slutlig volume av 200 | il.
- Blanda och denaturera under 2 minuter vid 95 ° C, sedan inkubera vid 50 ° C under 5 min och centrifugera vid maximal hastighet under 5 min.
- Töm förvätas HERV Genechip och ladda målet beredningen 200 pl. Applicera tuffa-spots på två septa.
- Hybridisera vid 50 ° C, 60 varv per minut, under 18 timmar.
- Efter 18 timmar, töm HERV Genechip och lagra insamlade hybridisering lösning vid 4 ° C. Fyll sondsystem med 250 pl tvättbuffert A. Om markerna inte omedelbart köra in på de flödeskunskap, lagras vid 4 ° C.
9. Tvättning och färgning
- Kör Fluidics från GCOS menyraden. I Fluidics dialogrutan väljer stationen i ränta (1 - 4), välj sedan Shutdown_450 för alla moduler, kör sedan. Sänk de 3 Fluidics aspirationslinjer i Milli-Q-vatten. Följ anvisningarna på LCD-skärmen.
- Applicera Prime_450 programmet till alla moduler. Placera slangen för tvättbufferten A ien flaska som innehåller 400 ml tvättbuffert A, och en för tvättbufferten B i en flaska som innehåller 200 ml tvättbuffert B. Då igen, följ instruktionerna på LCD-skärmen.
- Lyft upp nålar och placera 600 ul fläck cocktail 1 (SAPE Solution Mix) och 600 pl fläck cocktail 2 (Antibody Solution Mix) innehållande mikrocentrifugrör vid positionerna # 1 och # 2, och 800 pl array hålla buffertlösning vid position # 3 .
- Tilldela rätt chip för varje modul, markera FS450-004-protokollet och köra varje modul, följa anvisningarna på skärmen.
10. Scanning
- Värm upp GS3000 scannern. Den är redo att skanna när det blir grönt.
- Applicera tuffa-spots på septa för att undvika läckage sedan ladda chipet in i autoladdare eller alternativt direkt in i skannern. Starta skanning.
- Efter skanning chipet,. Cel filer skapas. Kontrollera bilden och rikta gallret till platsen för att identifiera de sond celler (<strong> Siffror 4D-F).
11. Dataanalys
- Kvalitetskontroll. Se standarden Affymetrix kontroller för att kontrollera att de HERV-V2 chip uppfyller QC kriterier. För detta ändamål följande utfästelser kan användas: log intensitetsvärdeöverföring (densitet tomter och lådagram), median absoluta avvikelsen (MAD) kontra intensiteten median (MAD-Med) tomter, bakgrunds tomter, den normaliserade oskalad standardfel (Nuse) tomter och den relativa log uttrycket (RLE) tomter.
- Normalisering. Dessutom bör det dataset undersökas för att lyfta fram oväntade satseffekter och rätta till dem innan statistisk analys. Data förbehandling inkluderar således en bakgrundskorrektion (t ex. Baserat på tryptofan sond utgångssignalen), följt av RMA normalisering och sammanfattas 15.
- Data mining och sökande efter differential uttryckta gener. Normalisera markerna och tillämpa en hierarkisk clustering metod att utforska dataset (figur 6A). Sedan, om du söker efter differentiellt uttryckta gener (DEG) med hjälp av en klassisk betydande analys av microarray (SAM) förfarande 16 följt av en falsk upptäckt ränta (FDR) korrektion 17. Observera att dessa åtgärder är helt integrerade i vissa programvaruanalyssviter som Partek GS men kan alternativt utföras med hjälp av R statistisk programvara 18 med paket från bioledare projektet 19. Efter den statistiska analysen, välja dataset för att utesluta de probesets för vilka uttrycksvärden är mindre än 2 6.
- Visualisering och tolkning. Tolka resultaten från HERV-V2 microarray på en dedikerad gränssnitt med hjälp av antecknings databaser.
Representative Results
Värdet av transcriptomic studier ligger främst i kvaliteten av utgångs biologiskt material. Om RNA-extraktion utförs under optimala förhållanden, är RNA Integrity Number (RIN) normalt 7 eller högre (Figur 4A). Behovet att hybridisera 2 pg av cDNA på Affymetrix HERV-V2 chip förutsätter användning av en förstärkningsprocess. En framgångsrik amplifiering steg leder till en klockformad fördelning (figur 4B). Därefter DNAse1 fragmentering utförs för att homogenisera distributionen cDNA storlek omkring 100 nukleotider före hybridisering (figur 4C). Efter hybridisering och skanning (Figur 4D), gör en visuell kontroll av bilden man att kontrollera om nätet är väl anpassad till de ställen (figur 4E) och om hybridisering kontrollerna är konsekventa (Figur 4F). Detta steg är också användbart för att utesluta microarrays där luftbubblor eller fel inträffade under experimentet.
När markerna har gått QC (Figur 5) och efter normalisering, den statistiska analysen av 5 match-pair tumör och normal prostata RNA-prover från Lyon-Sud sjukhuset ledde till identifiering av 207 HERV probesets med differentialuttrycksvärden (p.val <0,05) (figur 6A). För att stödja dessa register och för att få prostataspecifik information, har ytterligare 35 match-pair prover (kolon, äggstock, testikel-, bröst-, lung-och prostatacancer) läggs till i analysen och SAM-FDR förfarande (FDR = 20%) så småningom identifieras 44 prostataspecifika HERV probesets. Bland dessa är de mest relevanta 10 HERV strukturer beskrivs (figur 6B). Ytterligare kliniska studier kommer att krävas för att bedöma värdena för sensitivitet och specificitet för dessa kandidat biomarkörer.
pload/50713/50713fig1.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 1 Schema för den övergripande proceduren från kliniken (1: prostatektomi av läkaren och vävnaden förberedelse av patologen) till bänken (2-6: provberedning, mål förberedelser, microarray bearbetning) som leder till identifiering av kandidat biomarkörer (7: bioinformatik analys av HERV microarrays). Nukleinsyror som härrör från normal vävnad avbildas i orange, nukleinsyror som härrör från tumörområdet består av en blandning av normal (orange) och tumörspecifik (svart) nukleinsyror. Klicka här för att visa en större bild .
. Figur 2 Conception och innehåll HERV-V2 chip: HERV sekvenserhämtas från det mänskliga genomet lagras i en databas som heter HERV-gDB3, sedan 25-mer kandidat sonder passerar genom en särskild hybridisering modelleringsförfarande (EDA +) innan den slutligen syntetiseras på matrisen (de resulterande riktade delregioner skildras för varje familj). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Prostata hantering av patologen. (A) Färsk radikal prostatektomi provet har överförts till laboratoriet. (BC) Prostatan är färgade (grönt på höger sida, svart på vänster sida). (D) Stor tvärgående sektion av körteln på den bakre sidan. (E) Lämnar marginalerna intakta, pieces av vävnader dissekeras från olika områden i prostatakörteln. (F)-kärnor av vävnad placeras i ett Eppendorf-rör. (G) suturtråd används för att stänga prostatan och förhindra körtel distorsion och minimal störning av den kirurgiska marginalen. Då är det radikal prostatektomi provet klart för fastställande i formalin enligt den vanliga proceduren för histologisk analys. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Kvalitetskontroll av nukleinsyra förberedelse och hybridisering effektivitet. (A)-RNA-integritet, (B)-cDNA amplifierades mål och (C) fragmenterade mål som används vid hybridisering skede. These tre kvalitetskontroller erhölls med Bioanalyzer hjälp av RNA nanochips och Eukaryote Nano Serie II-analys. (D) Total bild av HERV-V2 microarray hybridisering område efter skanning, (E) förstoring av det övre vänstra hörnet som visar rutnät justeringskontroller och (F) förstoring av mittområdet visar spotting hybridisering kontroller. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Behandling av signaler. (A) Affymetrix polyA spik-i förstärk kontroller. Den polyA kontrollerar Dap, Thr, Phe och Lys avskrifter från B. subtilis gener spetsas i RNA-prov och användas för att bedöma den totala framgången av målarförberedelsesteg. Intensiteten bör upptäckas vid minskande värden bland dessa spik-in kontroller för att se till att det inte fanns någon partiskhet under WT-Ovation förstärkning mellan högt och lågt uttryckta gener. (B) Affymetrix spik-i hybridisering kontroller. Dessa mål som isolerats från E. coli och P1 bakteriofager är spetsade innan förfarandet märkning. Ökande värden från BioB, Bioc, biod och Cre ange totala framgången för hybridisering. (C) intensitetsfördelning hos chippet signaler efter RMA normalisering. De flesta av de probesets uppvisar signaler med värden som är lägre än 2 6 (bakgrund), vilket indikerar en övergripande uttryck i huvudsak begränsad till vissa specifika HERV loci. Klicka här för att visa en större bild .
ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "width =" 500px "/>
Figur 6. Dataanalys. (A) Hierarkisk klustring analys av normala och tumörprover. Partitione klustring tillämpades på de normaliserade uttrycksvärden med hjälp av ett euklidiskt avstånd funktion algoritm, gruppera probesets in upp (röd) - och ner (blå)-reglering mellan normala och tumörprover. (B) Val av de 10 HERV strukturer identifierats som kandidat biomarkör för prostatacancer. För varje HERV element tillhörande HERV familjen, är de genomiska koordinater (NCBI 36/hg18) och en kort beskrivning av HERV strukturen ges. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Den HERV repertoar. (A) Kartläggningen av människans arvsmassa avslöjade 25.000 protein-kodande gener (exoner, 2%) och en stor mängd överförbara element däribland 200.000 långa terminala upprepningen (LTR) retrotransposoner (HERV, 8%). (B) En extrapolering från HERV-V2 chip innehåll och tillhörande expressionsdata (79 prover med ursprung från 8 normala kontra tumörvävnadstyper) tyder på att en tredjedel av HERV repertoar är transkriptionellt aktiv. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 8. Funktions tolkning av signaler från chipet. (A) Promoter identifiering och epigenetisk kontroll: U3 negativ signal (röd sond, 5'LTR) Kontra R-U5 positiv signal (blå sond, 5'LTR) föreslår U3-driven transkription, med stöd av olika CpG-metylering (helt svarta cirklar) halt av U3 i peritumoral normala kontra tumörvävnad. (B) Skarv strategi: den förmodade 3.1 kb kuvert kodar mRNA uttryck uteslutande i tumören identifieras med hjälp SD1/SA2 skarv korsningen lappande sond. * Härledas genom en jämförelse med andra icke-moderkakan vävnad. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Under de senaste 10 åren, de flesta av försöken för HERV uttryck mätning har använt RT-PCR-teknik, antingen för att fokusera på ett specifikt locus 20-24 eller baserat på den relativa bevara de pol-generna för att utvärdera generella trender inom HERV släkten 25,26 . Dessutom PCR-amplifieringar med användning av starkt degenererade primrar i kombination med låg densitet microarrays som är avsedda att detektera och kvantifiera expressionen av HERV-familjer 27,28. För att spåra ett uttryck för individens locus inom en familj, strategier bygger på PCR-amplifiering av konserverade regioner i kombination med efterföljande kloning och sekvensering möjligtranskriptionellt aktiva olika delar av HML-2 29,30 eller HERV-E4.1 31 familjer till identifieras. Också slutar med kloning och sekvensesteg, genomet upprepa uttrycket övervakningsteknik som syftar till att identifiera tagare bland upprepningar identifierade aktiva HML-2 specifika humana ensamma LTRs
Denna metod är det första försöket att identifiera individuellt HERV locus uttryckmed hjälp av en egen hög densitet microarray baserad på Affymetrix teknologi. De klart identifierade fördelarna med microarray format för att dechiffrera HERV transcriptome bestående av (i) en samordnad undersökning av flera HERV familjer och (ii) den samtidiga och oberoende analys av de olika regionerna för varje locus, t ex. U3 och U5 domäner för solo och provirala LTR, gag-eller env regioner och eventuella skarvade korsningar i samband med provirala strukturer, utan på förhand funktionalitet HERV elementet. Utsikterna förlita sig på en förbättring av anteckningar i microarray-associerade Biocomputing verktyg. Detta skulle tillåta en att konvertera chip signaler till biologiska hypoteser som huruvida framgår aktiva HERV köra lncRNA transkription eller modulera mer eller mindre proximal kodning genuttryck. Faktum är sådant antagande stöds av nya studier som identifierade prostatacancer associerade ncRNA transkript som innehåller komponenter för viral ORF: er från HERV-K endogenous retrovirus familj eller delar av en viral LTR-promotor-regionen 37, samt två genfusion händelser nämligen HERV-K22q11-ETV1 och HERV-K17-ETV 38,39. Sammantaget kan hela detta tillvägagångssätt transcriptome kombinerat med LTR funktion och skarvning strategi identifieringar hjälpa till att dechiffrera markören kontra trigger komponenterna i HERV uttryck i kronisk 40,41 och infektionssjukdomar 42,43.
Disclosures
Detta arbete stöddes av bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon och den franska myndighet OSEO (Avancerad diagnostik för nya behandlingsmetoder, ett franskt statligt finansierade program tillägnad personlig medicin). PP, VC, GO, NM och FM är anställda i bioMérieux SA. PP, NM och FM har lämnat in patent för resultaten av detta papper.
Acknowledgments
Vi tackar Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali JAILLARD och Bertrand Bonnaud för deras bidrag till den inledande utvecklingen och optimering av HERV-V2-protokollet. Vi vill också tacka Hader Haidous för hans vägledning om etiska överväganden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
| DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
| Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
| DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
| Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
| GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
| 10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
| WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
| QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
| GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
| GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
| Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
| HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
| HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |
|||
References
- Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
- Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
- You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
- Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
- Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
- Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
- Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
- Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15 (2008).
- Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
- Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
- Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
- Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
- Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
- Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
- Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
- Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80 (2004).
- de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
- Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
- Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
- Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
- Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
- Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
- Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
- Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
- Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
- Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39 (2007).
- Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354 (2008).
- Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341 (2012).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67 (2006).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
- Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
- Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194 (2012).
- Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47 (2005).
- Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
- Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
- Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
- Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
- Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
- Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
- Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6 (2012).
- Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
- Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).
