Summary
Menneske endogene retrovirus (Herv), som opptar 8% av det menneskelige genom, beholde knappe koding kapasiteter, men hundre tusen lange terminal gjentar (ltr). En tilpasset Affymetrix microarray er designet for å identifisere individuelle Herv locus uttrykk og ble brukt på prostata kreft vev som en proof of concept for fremtidige kliniske studier.
Abstract
Prostata-spesifikt antigen (PSA) er den viktigste diagnostiske biomarkører for prostatakreft i klinisk bruk, men det mangler spesifisitet og sensitivitet, spesielt i lave doser verdier en. 'Slik bruk PSA' forblir et nummer, enten for diagnose som en grå sone som svarer til en konsentrasjon i serum fra 2,5-10 ng / ml som ikke tillater et klart skille gjøres mellom kreft og noncancer 2 eller for pasienten å følge -up som analyse av postoperativ PSA kinetiske parametere kan utgjøre betydelige utfordringer for deres praktiske anvendelse 3,4. Alternativt blir noncoding RNA (ncRNAs) fremstår som viktige molekyler i menneskelig kreft, med potensial til å tjene som nye markører for sykdom, f.eks PCA3 i prostatakreft 5,6 og for å avdekke uncharacterized aspekter av tumorbiologi. Videre data fra ENCODE prosjekt som ble publisert i 2012 viste at ulike RNA-typer dekker ca 62% av genome. Det fremgår også at mengden av transkripsjonelle regulatoriske sekvensene er minst 4,5 ganger høyere enn den som svarer til protein-kodende eksoner. Således lange terminale repetisjoner (ltr) av human endogenous retrovirus (HERVs) utgjør et bredt spekter av putative / kandidat transkripsjonsregulerende sekvenser, som det er deres primære funksjon i infeksiøse retrovirus. HERVs, som er spredt over hele det menneskelige genom, stammer fra forfedrenes og selvstendige infeksjoner innenfor kjønnsceller, etterfulgt av copy-paste forplantning prosesser og fører til Multicopy familier opptar 8% av det menneskelige genom (merk at eksoner span 2% av genomet vårt ). Noen Herv loci fortsatt uttrykke proteiner som har vært forbundet med flere sykdommer, inkludert kreft 7-10. Vi har utviklet en high-density microarray, i Affymetrix format, med formål å optimalt karakterisere individuelle Herv loci uttrykk, for å bedre forstå om de kan være aktive, hvis de kjører ncRNA transkripsjon eller modulate koding genuttrykk. Dette verktøy har vært anvendt i prostata cancer felt (figur 1).
Introduction
Menneske endogene retrovirus (også kalt HERVs) er spredt over hele genomet vårt. De stammer fra forfedrenes og selvstendige infeksjoner innenfor kjønnsceller, etterfulgt av copy-paste forplantning prosesser og fører til multikopiplasmider familier. I dag er de ikke mer smittsomme men de opptar 8% av det humane genom, som et punkt i sammenligning eksoner span 2% av det humane genom. Data fra ENCODE prosjekt som ble publisert i 2012 viste at ulike RNA-typer dekker ca 62% av genomet, inkludert en tredjedel i intergenic regioner. Dessuten viser det seg at mengden av transkripsjonsregulerende motivene er minst 4,5 ganger høyere enn den som svarer til protein-kodende eksoner. HERVs lang terminal repetisjoner (Ltr) representerer et bredt spekter av potensielle transkripsjonsregulerende elementer, som det er deres vanlige funksjon i infeksjonsretrovirus. Historisk sett, bortsett fra noen få loci uttrykt i morkaken eller testikkel, det var vanlig å tro at Herv er tause på grunn av epigenetic regulering. Derfor har vi utviklet en high-density microarray, i Affymetrix format, med formål å optimalt karakterisere individuelle Herv loci uttrykk, for å bedre forstå om de er aktive, hvis de kjører lncRNA transkripsjon eller modulere koding genuttrykk. Dette verktøyet kalt Herv-V2 Genechip integrerer 23583 Herv probesets og kan diskriminere 5573 distinkte Herv elementer sammensatt av solo Ltrs samt komplette og partielle provirus (figur 2).
Diagnose, Assessment, og Plan:
Diagnostisering av prostatakreft er basert på dosering av prostata spesifikt antigen (PSA) biomarkør i klinisk laboratorium, en digital rektal undersøkelse for å evaluere morfologisk endring av prostata og til slutt prostatabiopsier observert av patologen. Mangelen på tilstrekkelig spesifisitet og sensitivitet hos konvensjonelle kreft biomarkører, slik som PSA til prostatakreft, er blitt anerkjent after flere tiår med kliniske implikasjoner en. Til å begynne med PSA ble foreslått for diagnostisering og behandling av adenokarsinom av prostata 11. Det sistnevnte ble foreslått for cancer screening og å følge utviklingen av sykdommen 12.. Men det er fortsatt et spørsmål som er jevnlig spurte: "hvordan å bruke PSA '. (I) En grå sone tilsvarer en konsentrasjon i serum av 2,5-10 ng / ikke ml ikke tillate en klar forskjell gjøres mellom kreft og noncancer 2, (ii) to store kohortstudier melde hundretusener av mennesker i Europa og USA ikke klarte å komme til en klar konklusjon om nytten av screening i form av sykdomsspesifikk dødelighet 13,14, (iii) analyse av postoperative PSA kinetiske parametre som PSA klaring, PSA velocity og dobling tid, men enkel i teorien, kan utgjøre betydelige utfordringer i praktisk anvendelse 3,4. Vi kan forvente at i de kommende årene, biomarkør applications vil støtte en klinisk valg mellom vaktsom venter og mer eller mindre aggressiv behandling avhengig av tumor fenotype. Når det gjelder diagnosen gjengis av patolog, kommer en første begrensende faktor fra en 20% falsk negativ diagnose innen prostatabiopsier (mange kreftformer er savnet etter prøvetaking). Et annet problem dreier seg om behovet for en ekstra biopsiprosedyre etter en negativ, noe som kan medføre skadelige virkninger.
Radikal prostatektomi er i dag en av de standard behandling for prostatakreft. Det er foreslått hos friske pasienter, aldring 45-65 år, særlig i tilfelle av aggressive mønstre (Gleason 7 til 10), multifokal tumor eller følbar tumor. Det er nå gjort i vår avdeling ved hjelp av robotassistert kirurgi. På grunn av den økende bevis for at molekylære markører vil ha avgjørende betydning i de kommende årene, har vi besluttet å foreslå for alle våre pasienter mulighet til å delta i et program for prostatavev bank. Mer presist, har de ekspanderende molekylære forskningsprogrammer på prostatakreft resultert i et økende behov for tilgang til høy kvalitet frisk tumorvev fra prostatektomi prøver. Denne forskning, særlig de genomiske nærmer seg, kreves store prøver med høy DNA / RNA kvalitet. Tumoral og tilgrensende 'ikke-tumoral' vev fra den samme pasienten er nødvendig. Anbefalinger for håndtering og behandling av radikale prostatectomies er utformet for å bevare patologiske funksjoner som bestemmer scenen og margin status og dermed potensial videre behandling og prognose. Enhver frisk vev utvalgsmetode, derfor bør ikke gå på akkord påfølgende patologiske undersøkelser for å være akseptabel for diagnosen. Makroskopisk disseksjon av prostata er vanskelig og stor oppmerksomhet må rettes mot margin vev og kapsel invasjon: noen disseksjon for prostata bank bør alltid utføres av en utdannet uropathologist henhold til en avtaled protokollen. Den etiske komiteen av det medisinske fakultetet og staten medisinske utvalget enige om å disse undersøkelsene og informert samtykke ble innhentet for alle pasienter inkludert i prostata vev bank.
Protocol
En. Kirurgi
Når fjernet av kirurgen, holde prostata på is inntil tatt ansvaret for av en patolog.
2. Håndtering av Prostata Vev
- Å respektere forsinkelsen av perioperative iskemi, overføre radikal prostatektomi prøver på is til laboratoriet etter engasjerte medarbeidere innen 30 min etter kirurgisk ablasjon. Forsinkelsen for frysing bør være mindre enn 20 til 30 minutter (figur 3A).
- Vei og beis prostata i henhold til den vanlige protokollen (f.eks grønt på høyre side, svart på venstre side, se figur 3B og 3C).
- Utføre et stort tverrsnitt av kjertelen på den bakre side (figur 3D). Orientere prostata og sette den på fremre side. Utføre et stort tverrsnitt av kjertelen på den bakre side med en steril kirurgisk kniv.
- Dissekere stykker av vev på overgangssone,på venstre og høyre randsonene, forlater marginene intakt (Figur 3E).
- Sett kjernene av vev i en Eppendorf tube, knipse fryse og lagre i flytende nitrogen (Figur 3F). Hvis du ikke gjør biobank gå direkte med trinn 2.7.
- Utfør prostata banking bare hvis den totale lengde av kreft på biopsier er overlegne i forhold til 10 mm. Bruk en sutur tråden for å lukke prostata og for å hindre kjertel forvrengning og minimal forstyrrelse av den kirurgiske margin (Figur 3G). Deretter fikse radikal prostatektomi prøven med formalin og embed i parafin i henhold til vanlig prosedyre for histologisk analyse.
- Monter frosne vev kjerner vertikalt på en liten haug av oktober og gjør seksjoner i en kryostat. Ta en første singel 5 mikrometer frosne delen og beis det med blå toluidinfraksjon.
- Utføre en rask histologisk undersøkelse for å analysere arten av det vev (f.eks. Godartet eller ondartet). For svulstvev, anslå mengden av tumorceller og velger bare kjerner med mer enn 80% av tumorcellene.
- Etter dette ved å utføre en ny singel 5 mikrometer frosne delen og beis det med hematoxylin, eosin og Safran. Deretter kuttet 15 seksjoner x 30 mikrometer og legg den i en RNAse gratis Eppendorf tube.
- Ta en siste 5 mikrometer frosne delen for hematoxylin, eosin og Safran og flekken det for å styre mengden av svulstceller ved slutten av prosedyren.
- Sett Eppendorf rør på tørris og sende prøven til molekylærbiologi laboratoriet.
Tre. RNA Utvinning, Rensing, og kvalitetskontroll
- Homogenisering. Utfør homogenisering i nærvær av 1 ml Trizol/100 mg vev til vev er fullstendig oppløst i løsningen. Legg Trizol løsningen gradvis og fortsette med forsiktighet på isen ved hjelp av en håndholdt jeksel. Når homogenisert, delmengde løsningen på Eppendorfrør og la i Trizol ved romtemp forfem minutter.
- Faseseparasjon. Tilsett 300 mL kloroform (eller 150 mL BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sek deretter forlate ved romtemperatur i 2-3 min. Sentrifuger ved 12 000 xg i 15 min ved 2-8 ° C.
- RNA nedbør. Overfør nøye toppen vandige fase i et nytt rør. Legg 750 mL isopropanol. Inkuber ved romtemperatur i 10 min (agitere ved reversering). Inkuber to timer ved -19 ° C/-31 ° C. Sentrifuger prøvene ved 12 000 xg i 30 min ved 2-8 ° C.
- RNA vask og suspensjon. Etter sentrifugering, fjern supernatanten. Vask RNA pellet med 1 ml 80% EtOH (forsiktig tilbake rørene). Sentrifuger prøvene ved 7500 xg i 10 min ved 2-8 ° C. Fjern supernatanten ved hjelp av P1000 og P10. Tillat rester EtOH lufttørkes i 2-3 min. Tilsett 100 ul RNase-fritt vann, overfører rør til 70 ° C varmeblokk og la det stå i 2-3 min for å oppløse pelleten. Deretter lagt på is. Oppbevares ved -19 ° C/-31 ° C i kort tid, og -80 ° C for langtidslagring.
- RNA-rensing. Rense RNA bruker RNeasy Mini Kit (Qiagen). Kort forklart starter ved å legge til 350 mL buffer RLT til 100 mL RNA prøven og bland godt, deretter følger Qiagen prosedyren. Til slutt, kan en 3 ul (av 50 ul) prøve av det rensede produkt for kvalitetskontroller (trinn 3.6). Butikk RNA ved -19 ° C/-31 ° C for en kortvarig periode eller ved -80 ° C for en langsiktig lagring.
- RNA QC (figur 4A). Sjekk kvaliteten av RNA og RNA integritet ved hjelp av en Bioanalyzer (Agilent) og en Nanodrop (Thermo), i henhold til produsentens instruksjoner. Den RNA Integrity nummer (RIN) blir brukt til å vurdere RNA kvalitet. Spesielt lykkes i påvisning av 18S og 28S topper anbefales sterkt å bruke prøvene i flere trinn.
4. WT-ovasjoner RNA Amplification
Anbefalinger for å utføre forsterkning trinn med WT-Ovasjon forsterkning kit i optimale forhold:
- Kjør ikke mindre enn åtte forsterkning prøver på et tidspunkt for å sikre pipettering presisjon. Deretter står for en avfallsmengde når du forbereder Master Mix som krever en splitting av settet inn i tre grupper av åtte reaksjoner.
- Hold alltid tinte reagenser og reaksjonsrørene på is med mindre annet er instruert.
- Bruk bare en frisk 80% etanol løsning for rensing.
- Ikke stopp på ethvert stadium av protokollen.
- Fortynn total RNA for å få en konsentrasjon på 25 ng / pl. Prosess 2 ul av den fortynnede prøven.
- Klargjør poly-A RNA spike-kontroll-løsning av en seriell fortynning av poly-A RNA med lager Poly-A Kontroll Dilution Buffer (Affymetrix), for å oppnå en 1:25,000 fortynning.
Steg 1: Først Strand cDNA Synthesis 4,3 til 4,8. Reagensene nevnt er referert av leverandøren som følger: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).
- Tin A1 og A2 ved romtemperatur. Bland ved hjelp av en vortex-mikser for 2 sek og spinn for 2 sek. Deretter raskt sted på is. Plasser A3 på is.
- Sett 2 pl av totalt RNA (50 ng) i et 0,2 ml PCR-rør og tilsett 2 mL av A1 (endelig volum: 4 mL). Cap og spinne rør for 2 sek.
- Inkuber ved 65 ° C i 5 min og deretter plassere røret på is.
- Klargjør First Strand cDNA Master Mix som følger (gitt for en enkelt reaksjon). Bland ved pipettering og spinne ned Master Mix kort. Umiddelbart, legg på is.
Reagens Volume First Strand Buffer Mix (A2) 5 mL Poly A RNA Control (1:25,000) 0,5 mL First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 mL - Legg 6 & #181, l av Master Mix til RNA / Primer holdige rør. Bland ved å flikke røret, spinn for 2 sek og raskt plassere på is (sluttvolum: 10 mL).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, deretter 25 ° C i 10 min, deretter 42 ° C i 10 min og deretter 70 ° C i 15 min. Oppbevares kjølig ved 4 ° C. Fjern reaksjonsrøret fra termosykler, spinne kort og holde på is. Fortsett umiddelbart med Second Strand cDNA Synthesis trinn.
Trinn 2: Second Strand cDNA Synthesis 4,8 til 4,12. Reagensene nevnt er referert av leverandøren som følger: B1 (Second Strand Buffer Mix) og B2 (Second Strand Enzyme Mix).
- Spinn ned B2 og B3 for 2 sek og raskt plassere på is. Tine B1 ved romtemperatur. Bland ved hjelp av en vortex-mikser for 2 sek, spinn for 2 sek og raskt plassere på is.
- Forbered en Second Strand Master Mix som følger (gitt for en enkelt reaksjon). Bland ved pipettering og spinne ned Master Mix briefly. Umiddelbart, legg på is.
Reagens Volume Andre Strand Buffer Mix (B1) 9.75 mL Andre Strand Enzyme blanding (B2) 0,25 mL - Tilsett 10 pl av den Master Mix til hver First Strand reaksjonsrøret. Bland ved pipettering 3x, spinn for 2 sek og legg på is (sluttvolum: 20 mL).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, deretter 25 ° C i 10 min, deretter 50 ° C i 30 min, og deretter 70 ° C i 5 min. Oppbevares kjølig ved 4 ° C. Fjern reaksjonsrøret fra termosykler, spinne kort og holde på is. Fortsett umiddelbart med Post-Andre Strand Enhancement trinn.
Trinn 3: Post-Andre Strand Enhancement 4,13 til 4,15. Reagensene nevnt er referert av leverandøren som følger: B1 (Second Strand Buffer Mix), B3 (Reaksjon Enhancement Enzyme Mix).
- Forbered en Master Mix ved å kombinere B1 og B3 Mix som følger (gitt for en enkelt reaksjon). Bland ved pipettering og spinne ned Master Mix kort. Umiddelbart, legg på is.
Reagens Volume Andre Strand Buffer Mix (B1) 1,9 mL Reaksjon Enhancement Enzyme Mix (B3) 0,1 mL - Tilsett 2 mL av Master Mix til hver Second Strand Reaction tube. Bland ved pipettering 3x, spinn for 2 sek og legg på is (sluttvolum: 22 mL).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, deretter 37 ° C i 15 min, og deretter 80 ° C i 20 min. Oppbevares kjølig ved 4 ° C. Fjern reaksjonsrøret fra termosykler, spinne kort og legg på is. Fortsett umiddelbart med SPIA Amplification trinnet.
Trinn 4: Enkelt strand cDNA (sscDNA) syntese av SPIA prosedyre fra 4.16 -4.19. Reagensene nevnt er referert av leverandøren som følger: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
- Tine C1 og C2 ved romtemperatur. Bland ved hjelp av en vortex-mikser, spinn for 2 sek og raskt plassere på is. Tine C3 på is. Bland innholdet ved å forsiktig snu 5x. Sørg for ikke å innføre luftbobler. Deretter spinner for 2 sek og legg på is.
- Forbered en SPIA-Master Mix, sto for en 0,5 avfallsmengde, som følger. Bland ved pipettering og spinne ned Master Mix kort. Umiddelbart, legg på is.
Reagens Volume SPIA-Buffer Mix (K2) 5 mL SPIA-Primer Mix (C1) 5 mL SPIA-Enzyme Mix (C3) 10 ul - Legg 20 mL av SPIA Master Mix til Enhanced Second Strand Reaction tube. Bland ved pipettering 6-8x, spin og raskt plassere på is (sluttvolum: 42 mL).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, deretter 47 ° C i 60 min og deretter 95 ° C i 5 min. Oppbevares kjølig ved 4 ° C. Fjern røret fra termisk cycler, spinne kort og legg på is.
5. sscDNA Rensing og Quality Control
- sscDNA rensing. Rens sscDNA bruker QIAquik PCR rensing kit (Qiagen). Kort forklart starter ved å legge til 200 mL buffer PB til 42 mL av forsterket cDNA produkt, bland og belastningen på kolonnen. Deretter følger Qiagen prosedyren. Til slutt, kan en 3 ul (av 30 ul) aliquot av sscDNA rensede produkt for kvalitetskontroller (trinn 5.2).
- sscDNA utbytte og størrelsesfordeling verifikasjon (figur 4B). Sjekk sscDNA yield og størrelsesfordeling ved hjelp av en Bioanalyzer og en Nanodrop, i henhold til produsentens instruksjoner. Størrelsen på fordelingen av amplifiserte cDNA bør be typisk svis mellom 100 og 1500 baser lang med en topp rundt 600 baser.
6. sscDNA Fragmentering
- Forbered 2 pg av cDNA i 30 pl, justering av volumet med nuklease-fritt vann.
- Forbered 1x En Phor-All Buffer PLUS (OPA), fra en 10x OPA buffer PLUS løsning.
- Forbered 0.2 U / pl DNase I (5-ganger fortynning av 1 U / pl DNase I).
- Forbered en Fragmentering Master Mix som følger (gitt for en enkelt reaksjon):
Reagens Volume 10X En Phor-All Buffer PLUS 3,6 mL DNase I (0,2 U / pl) 3 mL - Legg 6,6 mL av fragmentering Mix til 30 mL av sscDNA.
- Sentrifugering og inkuberes ved 37 ° C i 10 min, deretter inaktivere DNase I ved 95 ° C i 10 min og holde på is. Delmengde 1 &# 181; l av den fragmenterte cDNA for Agilent basert størrelsesfordeling verifisering.
- sscDNA størrelsesfordeling verifisering (Figur 4C). Sjekk sscDNA størrelsesfordeling ved hjelp av en Bioanalyzer (Agilent). Størrelsen fordeling av fragmenterte cDNA bør typisk omfatter mellom 35 og 200 baser.
7. Merking av Fragmentert sscDNA
- Fortynne DLR-1a 7,5 mM til 5 mm i DEPC-vann.
- Forbered en merking Master Mix som følger (gitt for en enkelt reaksjon):
Reagens Volume 5x TdT Reaction Buffer 14 mL CoCl 2 (25 mM) 14 mL DLR-1a (5 mm) 1 mL Terminal transferase (400 U / mL) 4,4 mL - Legg 33,4 mL av merking mixtil hvert fragmentert cDNA prøven.
- Bland ved å dra røret, spinner raskt og inkuber ved 37 ° C i 60 min, og deretter holde på is.
8. Hybridisering til Herv Chip microarray
- Prewet den Herv Genechip med 200 mL av PreHybridization Mix (Affymetrix) og inkuberes ved 50 ° C, 60 rpm, 10 min.
- Klargjør Hybridisering blanding som følger (gitt i en enkelt reaksjon):
Reagens Volume Kontroll Oligo B2 (3 nM) 3,3 mL 20x Eukaryot Hybridisering kontroll 10 ul 2x Hybridisering Mix 100 mL 99,9% DMSO 17,7 mL - Tilsett 131 ul Hybridisering Mix til 69 ul av fragmenterte og merkede cDNA ved romtemperatur for å få en endelig volume av 200 mL.
- Bland og denaturere i 2 min ved 95 ° C, og deretter inkuberes ved 50 ° C i 5 min og sentrifuge ved maksimal hastighet i 5 min.
- Tømme pre-fuktet Herv Genechip og laste 200 mL målet forberedelse. Påfør tøffe-spots på to septa.
- Hybridiser ved 50 ° C, 60 rpm, i 18 timer.
- Etter 18 timer, tøm Herv Genechip og oppbevarer innsamlet hybridisering løsning ved 4 ° C. Fyll sonden array med 250 mL vaskebuffer A. Hvis brikkene ikke er umiddelbart kjøre bort på lufthåndtering, lagret ved 4 ° C.
9. Vasking og Farging
- Kjør lufthåndtering fra GCOS menylinjen. I lufthåndtering dialogboksen velger du stasjonen av interesse (1 - 4), og velg deretter Shutdown_450 for alle moduler, deretter kjøre. Fordyp de tre lufthåndtering aspirasjon linjer i Milli-Q vann. Følg instruksjonene på LCD-skjermen.
- Påfør Prime_450 programmet til alle moduler. Plasser røret for vaskebuffer A inen flaske som inneholder 400 ml vaskebuffer A, og en for vaskebuffer B i en flaske som inneholder 200 ml vaskebuffer B. Så igjen, følg instruksjonene på LCD-skjermen.
- Løft opp nålene og plassere 600 mL flekken cocktail 1 (SAPE Solution Mix) og 600 mL flekken cocktail 2 (Antistoff Solution Mix) holdig mikrosentrifugerør i posisjonene # 1 og # 2, og 800 mL utvalg holder bufferløsning i posisjon # 3 .
- Tildele rettigheten chip til hver modul, velger du FS450-004-protokollen og kjøre hver modul, å følge instruksjonene på skjermen.
10. Skanning
- Varm opp GS3000 skanneren. Den er klar til å skanne når lyset blir grønt.
- Påfør tøffe-spots på septa å unngå lekker deretter laste chip inn i autoloaderen eller alternativt direkte inn i skanneren. Begynne å skanne.
- Etter skanning av chip,. Cel filene er generert. Sjekk bildet og justere rutenettet til stedet for å identifisere sonde celler (<sterke> Figurene 4D-F).
11. Data Analysis
- Kvalitetskontroll. Se i standard Affymetrix kontroller for å verifisere at de Herv-V2 chips møte QC kriterier. For dette formålet følgende representasjoner kan brukes: loggen intensitet verdifordeling (tetthet plott og boksplott), median absolutte avviket (MAD) versus intensiteten median (MAD-MED) plott, bakgrunns tomter, normalisert uskalert standard feil (nBruk) plott og den relative log uttrykk (RLE) tomter.
- Normalisering. I tillegg bør selve datasettet bli undersøkt for å fremheve uventede batch-virkninger, og for å rette dem før statistisk analyse. Dataene forbehandling omfatter således en bakgrunnskorrigering (f.eks. Basert på tryptofan probe referansesignal), etterfulgt av RMA normalisering og summarization 15..
- Data mining og søk etter differensial uttrykte gener. Normaliserer chips og bruke en hierarkisk clustering tilnærming til å utforske datasettet (Figur 6A). Deretter utfører et søk etter differensielt uttrykte gener (DEG) ved hjelp av en klassisk betydelig analyse av microarray (SAM) prosedyre 16 etterfulgt av en falsk funnrate (FDR) korreksjon 17. Merk at disse trinnene er fullt integrert i enkelte programvareanalyse suiter som Partek GS, men kan alternativt utføres ved hjelp av R statistisk programvare 18 med pakker fra Bioconductor prosjektet 19. Etter den statistiske analysen, filtrere datasettet for å utelukke de probesets som uttrykksverdier er mindre enn 2 6.
- Visualisering og tolkning. Tolke resultatene fra Herv-V2 microarray i et eget grensesnitt ved hjelp av merknads databaser.
Representative Results
Verdien av transcriptomic studier ligger først og fremst i kvaliteten av utgangs biologisk materiale. Dersom RNA ekstraksjon utføres under optimale betingelser, RNA Integrity nummer (RIN) er typisk 7 eller høyere (figur 4A). Behovet for å hybridisere to ug av cDNA på Affymetrix Herv-V2 chip innebærer bruken av en forsterkning prosess. En vellykket amplifikasjon trinn fører til en klokkeformet fordelings (figur 4B). Deretter blir DNAse1 fragmentering utført for å homogenisere cDNA størrelsesfordeling rundt 100 nukleotider før hybridiseringen (figur 4C). Etter hybridisering og skanning (Figur 4D), gjør det mulig for en visuell inspeksjon av bildet en å sjekke om rutenettet er godt justert i forhold til flekker (figur 4E), og hvis hybridisering kontrollene er konsistent (Figur 4F). Dette trinn er også nyttig for å utelukke mikromatriser hvor luftboblene eller feil inntraff i løpet av eksperimentet.
Når brikkene har passert QC (figur 5) og etter normalisering, den statistiske analysen av 5 kamp-pair tumor og normal prostata RNA prøver fra Lyon-Sud Hospital førte til opprullingen av 207 Herv probesets med differensialuttrykksverdier (p.val <0,05) (figur 6A). For å støtte disse postene, og for å få prostata-spesifikk informasjon, ble 35 ekstra kamp-pair prøver (colon, eggstokk, testikkel, bryst, lunge og prostata) lagt til analyse og SAM-FDR prosedyre (FDR = 20%) til slutt identifisert 44 prostata spesifikt Herv probesets. Blant dem, er de mest relevante 10 Herv strukturer beskrevet (figur 6B). Ytterligere kliniske studier vil være nødvendig for å vurdere verdien av sensitivitet og spesifisitet av disse kandidat biomarkører.
pload/50713/50713fig1.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 1 reaksjonsskjema av den generelle fremgangsmåten fra klinikken (1: prostatektomi av klinikeren og vevspreparat av patologen) i benken (2-6: prøvepreparering, Målet preparat, mikromatrisebehandling) som fører til identifisering av kandidat biomarkører (7: biocomputing analyse av Herv mikromatriser). Nukleinsyrer avledet fra normalt vev er avbildet i oransje, nukleinsyrer avledet fra svulstområdet består av en blanding av normal (oransje) og tumor spesifikke (svart) nukleinsyrer. Klikk her for å se større bilde .
. Figur 2 Conception og innholdet i Herv-V2 chip: Herv sekvenserhentes fra det humane genom, er lagret i en database, kalt Herv-gDB3, da de 25-mer kandidat prober passere gjennom en dedikert hybridisering modelleringsprosedyre (EDA +), før den til slutt syntetisert på matrisen (de resulterende målrettede subregioner er vist for hvert familie). Klikk her for å se større bilde .
Fig. 3. Prostata håndtering av patolog. (A) Fersk radikal prostatektomi prøven overføres til laboratoriet. (BC) Prostata er farget (grønn på høyre side, svart på venstre side). (D) stort tverrsnitt av kjertelen på den bakre side. (E) Leaving marginene intakt, pieces av vev er dissekert fra ulike områder av prostatakjertelen. (F) Kjerner av vev er plassert i en Eppendorf-rør. (G) Suture tråd blir brukt til å lukke prostata og for å hindre gland forvrengning og minimal forstyrrelse av det kirurgiske margin. Så, er klar for å feste i formalin i henhold til vanlig prosedyre for histologisk analyse radikal prostatektomi prøven. Klikk her for å se større bilde .
Fig. 4. Kvalitetskontroller av nukleinsyre fremstilling og hybridiserings-effektiviteten. (A) RNA integritet, (B) cDNA amplifisert mål og (C) fragmenterte mål som benyttes i hybridiserings-fasen. These tre kvalitetskontroller ble oppnådd med Bioanalyzer bruke RNA nano chips og Eukaryote Nano Serie II analysen. (D) Samlet bilde av Herv-V2 microarray hybridisering området etter skanning, (E) utvidelse av de øvre venstre hjørne Viser grid justeringskontroller og (F) utvidelse av senterområdet som viser spotting hybridisering kontroller. Klikk her for å se større bilde .
Figur 5. Behandling av signaler. (A) Affymetrix polyA spike-in forsterkning kontroller. Den polyA styrer Dap, THR, Phe og Lys transkripsjoner fra B. subtilis gener er tilsatt i RNA-prøven og tjener til å vurdere den generelle suksess av pulsfrem-stillingstrinn. Intensitet skal påvises ved minkende verdier blant disse pigg-kontroller for å sikre at det ikke var noen skjevhet under WT-Ovation forsterkning mellom høyt og lavt uttrykte gener. (B) Affymetrix spike-in hybridisering kontroller. Disse målene isolert fra E. coli og P1 bakteriofag er tilsatt før merking prosedyren. Økende verdier fra BioB, BIOC, BIOD og Cre indikerer den totale suksessen av hybridisering. (C) Intensitet fordeling av chip signaler etter RMA normalisering. De fleste av probesets utstillingen signaler med verdier lavere enn 2 6 (bakgrunnen), som indikerer en samlet uttrykk i hovedsak begrenset til noen spesifikke Herv loci. Klikk her for å se større bilde .
ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "width =" 500px "/>
Figur 6. Analyse data. (A) Hierarkisk clustering analyse av normale og tumorprøver. Partisjone clustering ble brukt til de normaliserte uttrykksverdier ved hjelp av en Euklidsk avstand funksjon algoritme, gruppere probesets inn opp (rød) - og ned (blå)-regulering blant normale og tumorprøver. (B) Valg av de beste 10 Herv strukturer er identifisert som kandidat biomarkør for prostatakreft. For hver Herv element, den relaterte Herv familien, de genomiske koordinater (NCBI 36/hg18) og en kort beskrivelse av Herv strukturen er gitt. Klikk her for å se større bilde .
Figur 7. Den Herv repertoar. (A) Sekvensering av det menneskelige genom avslørte 25000 protein-kodende gener (eksoner, 2%) og en enorm mengde transposable elementer, inkludert 200.000 lang terminal repeat (LTR) retrotransposons (Herv, 8%). (B) Ekstrapolasjon fra Herv-V2 chip innhold og tilhørende uttrykk data (79 prøvene stammer fra åtte normal versus tumor vevstyper) foreslår at en tredjedel av Herv repertoaret er transcriptionally aktiv. Klikk her for å se større bilde .
Figur 8. Funksjonell tolkning av signalene fra brikken. (A) Arrangøren identifikasjon og epigenetisk kontroll: U3 negativt signal (rød sonde, 5'LTR) Versus R-U5 positivt signal (blå sonde, 5'LTR) foreslår U3-drevet transkripsjon, som støttes av de ulike CpG metylering (solide svarte sirkler) innhold av U3 i peritumoral normal versus tumor vev. (B) Skjøting strategi: den antatte 3,1 kb konvolutt koding mRNA uttrykkes utelukkende i svulsten er identifisert ved hjelp av SD1/SA2 spleise krysset overlapp sonde. * Utledes av sammenligningen med andre ikke-placenta vev. Klikk her for å se større bilde .
Discussion
I løpet av de siste 10 årene, har de fleste av forsøkene for Herv uttrykk måling brukes RT-PCR teknikker enten å fokusere på en bestemt locus 20-24 eller basert på den relative bevaring av pol gener å evaluere generelle trender innenfor Herv slekter 25,26 . I tillegg PCR presiseringer som bruker svært degenererte primere kombinert med lav tetthet mikromatriser ment å oppdage og kvantifisere uttrykk for Herv familier 27,28. For å spore uttrykk for enkelte locus innen en familie, tilnærminger basert på PCR forsterkning av konserverte regioner kombinert med påfølgende kloning og sekvense aktivert transcriptionally aktive distinkte elementer av HML-2 29,30 eller Herv-E4.1 31 familier til bli identifisert. Også slutter ved kloning og sekvense trinn, genomet gjenta uttrykket overvåking teknikk som mål å identifisere arrangører blant gjentar identifisert aktive HML-to spesifikke menneskelige ensomme Ltrs
Denne fremgangsmåten er det første forsøk på å identifisere individuelt Herv locus ekspresjonved hjelp av en tilpasset høy tetthet microarray basert på Affymetrix teknologi. De klart identifisert fordeler av microarray format å dechiffrere Herv transcriptome bestående av (i) den koordinerte utforskning av flere Herv familier og (ii) den samtidige og uavhengige analyser av de ulike regionene for hvert locus, f.eks. U3 og U5 domener for solo og proviral Ltrs, gag eller env regioner og mulige skjøtes veikryss forbundet med proviral strukturer, uten a priori på funksjonaliteten til Herv element. Utsiktene stole på en forbedring av merknader i microarray-forbundet biocomputing verktøy. Dette bør tillate en å konvertere chip signaler til biologiske hypoteser som for eksempel om dokumentert aktive HERVs kjøre lncRNA transkripsjon eller modulere mer eller mindre proksimale koding genuttrykk. Faktisk er en slik antagelse støttes av nyere studier som identifiserte prostata kreft-assosiert ncRNA transkripsjoner inneholder komponenter av viral ORF'er fra Herv-K endogene retrovirus familien eller deler av en viral LTR promoter region 37, samt to genet fusion hendelser nemlig Herv-K22q11-ETV1 og Herv-K17-ETV 38,39. Til sammen kan dette hele transkriptom tilnærming kombinert med LTR funksjon og spleise strategi identifikasjoner bidra til å dechiffrere markør versus trigger komponenter av Herv uttrykk i kronisk 40,41 og infeksjonssykdommer 42,43.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet av bioMérieux SA, Hospices civils de Lyon og det franske offentlige etaten OSEO (Advanced Diagnostics for nye terapeutiske tilnærminger, en fransk statlig finansiert program dedikert til personlig medisin). PP, VC, GO, NM, og FM er ansatte i bioMérieux SA. PP, NM og FM har sendt inn patentsøknader som dekker resultatene av dette papiret.
Acknowledgments
Vi takker Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali JAILLARD og Bertrand Bonnaud for deres bidrag til den første utvikling og optimalisering av Herv-V2-protokollen. Vi ønsker også å takke Hader Haidous for hans veiledning på etiske hensyn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
| DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
| Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
| DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
| Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
| GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
| 10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
| WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
| QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
| GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
| GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
| Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
| HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
| HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |
|||
References
- Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
- Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
- You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
- Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
- Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
- Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
- Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
- Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15 (2008).
- Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
- Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
- Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
- Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
- Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
- Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
- Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
- Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80 (2004).
- de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
- Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
- Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
- Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
- Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
- Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
- Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
- Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
- Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
- Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39 (2007).
- Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354 (2008).
- Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341 (2012).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67 (2006).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
- Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
- Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194 (2012).
- Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47 (2005).
- Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
- Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
- Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
- Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
- Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
- Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
- Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6 (2012).
- Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
- Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).
