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Medicine

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

doi: 10.3791/50713 Published: November 2, 2013

Summary

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Abstract

Das Prostata-spezifische Antigen (PSA) ist das wichtigste diagnostische Biomarker für Prostatakrebs im klinischen Einsatz, aber es fehlt die Spezifität und Empfindlichkeit, insbesondere bei niedrigen Dosierungswerten 1. 'Wie PSA verwenden "bleibt ein aktuelles Thema, weder für die Diagnose als Grauzone, die einer Konzentration im Serum von 2,5 bis 10 ng / ml, die nicht zulässt, dass eine klare Unterscheidung zwischen Krebs und noncancer 2 oder für Patienten Follow gemacht werden -up als Analyse der postoperativen PSA kinetischen Parameter können erhebliche Herausforderungen für ihre praktische Anwendung 3,4 darstellen. Alternativ sind nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) als Schlüsselmoleküle in menschlichen Krebsschwellen, mit dem Potenzial, als neuartige Marker der Krankheit dienen, z. B. in PCA3 Prostatakrebs 5,6 und uncharacterized Aspekte der Tumorbiologie zu offenbaren. Darüber hinaus Daten aus dem ENCODE-Projekt im Jahr 2012 veröffentlicht wurden, zeigten, dass verschiedene RNA-Typen decken etwa 62% der Gen-ome. Es scheint auch, daß die Menge des Transkriptionsregulationsmotive mindestens 4,5 x höher als die entsprechende Protein-codierenden Exons. So lange terminale Wiederholungen (LTRs) von menschlichen endogenen Retroviren (HERVs) bilden eine Vielzahl von putativen / Kandidaten-Transkriptionsregulationssequenzen, wie es ihre primäre Funktion in infektiöse Retroviren ist. HERVs, die in der gesamten menschlichen Genom verteilt sind, stammen aus uralten und unabhängige Infektionen in der Keimbahn, gefolgt von Copy-Paste Ausbreitungsvorgänge und führt zu Mehrfachkopien-Familien besetzen 8% des menschlichen Genoms (beachten Sie, dass Exons erstrecken 2% unseres Genoms ). Einige HERV loci noch Proteine ​​exprimieren, die mit verschiedenen Krankheiten, darunter Krebs 10.7 in Verbindung gebracht wurden. Wir haben eine High-Density-Microarray entwickelt, in Affymetrix-Format, mit dem Ziel, optimal charakterisieren einzelnen HERV-Loci Ausdruck, um besser zu verstehen, ob sie aktiv sein können, wenn sie ncRNA Transkription oder m fahrenodulate Codierung Genexpression. Dieses Tool wurde in der Prostatakrebs-Feld (Abbildung 1) angewendet.

Introduction

Menschen endogenen Retroviren (auch HERVs) sind in unserer gesamten Genom verteilt. Sie stammen aus uralten und unabhängige Infektionen in der Keimbahn, gefolgt von Copy-Paste Ausbreitungsvorgänge und führt zu Mehrfach Familien. Heute sind sie nicht mehr infektiös, aber sie besetzen 8% des menschlichen Genoms, als Vergleichspunkt, Exons erstrecken 2% des menschlichen Genoms. Daten aus dem ENCODE-Projekt im Jahr 2012 veröffentlicht wurden, zeigten, dass verschiedene RNA-Typen decken etwa 62% des Genoms, darunter ein Drittel in intergenischen Regionen. Außerdem scheint es, daß die Menge des Transkriptionsregulationsmotive mindestens 4,5 x höher als die entsprechende Protein-codierenden Exons. HERVs long terminal repeats (LTR) repräsentieren ein breites Spektrum von potentiellen Transkriptionsregulationselemente, wie sie ihre übliche Funktion bei infektiösen Retroviren ist. Historisch gesehen, abgesehen von ein paar Loci in der Plazenta oder Hoden exprimiert, wurde allgemein angenommen, dass HERV schweigen aufgrund epigenetic Regulierung. Daher haben wir eine High-Density-Microarray entwickelt, in Affymetrix-Format, mit dem Ziel, optimal charakterisieren einzelnen HERV-Loci Ausdruck, um besser zu verstehen, ob sie aktiv sind, wenn sie Auto fahren oder lncRNA Transkription modulieren Codierung Genexpression. Dieses Tool synchronisiert HERV-V2 Genechip integriert HERV 23.583 Probesets und kann 5.573 verschiedene Elemente der HERV-LTRs solo komponiert sowie Komplett-und Teil Proviren (Abbildung 2) zu unterscheiden.

Diagnose, Beurteilung und Plan:

Diagnose von Prostatakrebs wird über die Dosierung des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) Biomarker in klinischen Labors, einer digitalen rektalen Untersuchung der morphologischen Veränderung der Prostata und schließlich durch den Pathologen beobachtet Prostatabiopsien auszuwerten basiert. Der Mangel an ausreichender Spezifität und Empfindlichkeit unter den herkömmlichen Biomarkern, z. B. PSA für Prostatakrebs, wurde allgemein anerkannt, afTer mehreren Jahrzehnten der klinischen Implikationen ein. Zunächst wurde PSA für die Diagnose und Behandlung von Prostata-Adenokarzinom 11 vorgeschlagen. Es war letzteres für die Krebsvorsorge vorgeschlagen und die Überwachung der Entwicklung der Krankheit 12. Es bleibt jedoch eine Frage, die regelmäßig gefragt wird: "Wie PSA verwenden. (I) Eine Grauzone, die einer Konzentration im Serum von 2,5 bis 10 ng / ml nicht zu einem klaren Unterschied zwischen Krebs und noncancer 2 hergestellt werden, (ii) zwei große Kohortenstudien Einschreibung Hunderttausende von Menschen in Europa und USA versäumt, eine klare Aussage über den Nutzen von Screening im Hinblick auf krankheitsspezifische Mortalität 13,14 kommen, (iii) Analyse der postoperativen PSA kinetischen Parameter wie PSA Abfertigung, PSA-Geschwindigkeit und-Verdopplungszeit, obwohl in der Theorie einfach, können erhebliche Herausforderungen in der praktischen Anwendung 3,4 darstellen. Wir können, dass in den kommenden Jahren zu erwarten, Biomarker-Appchungen wird eine klinische Wahl zwischen beobachtendes Abwarten und mehr oder weniger aggressive Behandlungen je nach Tumor-Phänotyp zu unterstützen. Bezüglich der Diagnose durch den Pathologen gemacht, stammt eine erste limitierende Faktor von 20% falsch-negative Diagnose innerhalb Prostata-Biopsien (viele Krebsarten sind durch Stichproben verpasst). Ein zweites Anliegen befasst sich mit der Notwendigkeit für eine zusätzliche Biopsie nach einem negativen ein, die schädliche Auswirkungen darstellen können.

Radikale Prostatektomie ist derzeit eines der Standard-Behandlungen für Prostatakrebs. Es wird bei gesunden Patienten vorgeschlagen, Alterung 45-65 Jahren, vor allem im Falle von aggressiven Muster (Gleason 7 bis 10), multifokaler Tumor oder Tumor tastbar. Es ist nun in unserer Abteilung mit Roboter-assistierte Chirurgie getan. Aufgrund der zunehmend Beweise, dass molekulare Marker wird größter Bedeutung in den kommenden Jahren haben wir beschlossen, für alle unsere Patienten schlagen die Möglichkeit der Teilnahme an einem Programm für ProstataGewebebanken. Genauer gesagt, haben die expandierenden molekularen Forschungsprogramme auf Prostata-Krebs in einem zunehmenden Bedarf an Zugang zu qualitativ hochwertigen frischen Tumorgewebe von Prostatektomie Proben geführt. Diese Forschung, insbesondere die genomische Ansätze erforderlichen großen Proben hoher DNA / RNA-Qualität. Tumor und benachbarten "nicht tumorale" Gewebe des gleichen Patienten benötigt. Empfehlungen für die Handhabung und Verarbeitung von radikalen Prostatektomie sind entworfen, um pathologischen Merkmale, die Bühne und Marge Status und damit mögliche weitere Behandlung und Prognose festzustellen, zu bewahren. Jede frische Gewebeprobenahmeverfahren sollte daher keine Kompromisse anschließenden pathologischen Einschätzungen, um akzeptabel zu der Diagnose sein. Makroskopische Präparation der Prostata ist schwierig und große Aufmerksamkeit muss den Rand Gewebe und Kapsel Invasion bezahlt werden: jede Präparation für Prostata-Banking sollten immer von einem geschulten uropathologist nach einer Vereinbarung durchgeführt werdend-Protokoll. Die Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät und der Ärztekammer vereinbart, diese Untersuchungen und informierte Zustimmung erhalten für alle Patienten in der Prostata-Gewebe-Banking enthalten.

Protocol

1. Chirurgie

Einmal durch den Chirurgen entfernt, halten Sie die Prostata auf Eis, bis in Höhe von von einem Pathologen übernommen.

2. Behandlung von Prostata-Gewebe

  1. Um die Verzögerung der perioperativen Ischämie zu respektieren, zu übertragen radikale Prostatektomie Proben auf Eis ins Labor von engagierten Mitarbeitern innerhalb von 30 Minuten nach der chirurgischen Ablation. Die Verzögerung des Einfrierens sollte weniger als 20-30 Minuten (3A) sein.
  2. Wiegen und färben die Prostata nach dem üblichen Protokoll (zB grün auf der rechten Seite, schwarz auf der linken Seite finden Sie den 3B und 3C).
  3. Führen eine große Querschnitt der Kabelverschraubung an der hinteren Seite (Fig. 3D). Richten Sie die Prostata und legte es auf der vorderen Seite. Führen eine große Querschnitt der Kabelverschraubung an der hinteren Seite mit einem sterilen Skalpell.
  4. Sezieren Gewebestücke an der Übergangszone,an den linken und rechten Randbereiche, so dass die Ränder intakt (Figur 3E).
  5. Setzen Sie die Kerne von Gewebe in ein Eppendorf-Röhrchen, Schnapp einfrieren und lagern in flüssigem Stickstoff (3F). Wenn Sie nicht so sind Biobank fahren Sie direkt mit Schritt 2.7.
  6. Prostata-Banking durchzuführen, wenn die Gesamtlänge der Krebs auf Biopsien überlegen ist 10 mm. Verwenden Sie einen Faden, um die Prostata zu schließen und die Drüse Verzerrung und minimaler Unterbrechung der operative Marge (Abbildung 3G) zu verhindern. Dann fix die radikale Prostatektomie Probe mit Formalin und einbetten in Paraffin nach dem üblichen Verfahren für die histologische Analyse.
  7. Montieren gefrorenen Gewebekerne vertikal auf einem kleinen Hügel von Oktober und stellen Abschnitte in einem Kryostaten. Werfen Sie einen ersten Single 5 um Gefrierschnitt und färben sie mit blauen Toluidin.
  8. Führen Sie eine schnelle histologische Untersuchung, um die Art des Gewebes analysieren (dh. Gutartig oder bösartig). Für TumorGewebe, schätzen die Menge der Tumorzellen und wählen Sie nur Kerne mit mehr als 80% der Tumorzellen.
  9. Anschließend führen Sie eine neue Single 5 um Gefrierschnitt und färben sie mit Hämatoxylin, Eosin und Safran. Dann schneiden Abschnitte 15 x 30 um und legen Sie sie in einem RNAse freien Eppendorf-Röhrchen.
  10. Werfen Sie einen letzten 5 um Gefrierschnitt für die Hämatoxylin, Eosin und Safran und färben es, die Menge der Tumorzellen am Ende des Verfahrens zu kontrollieren.
  11. Setzen Sie die Eppendorf-Röhrchen in Trockeneis und senden Sie die Probe auf die molekularbiologischen Labor.

3. RNA-Extraktion, Reinigung und Qualitätskontrolle

  1. Homogenisierung. Führen Homogenisierung in Gegenwart von 1 ml Trizol/100 mg Gewebe bis das Gewebe vollständig in Lösung gelöst. In Trizol-Lösung nach und nach, und fahren Sie vorsichtig auf Eis mit einer Handmühle. Sobald homogenisiert, aliquotiert die Lösung in Eppendorf-Röhrchen und lassen in Trizol bei Raumtemperatur fürfünf Minuten.
  2. Phasentrennung. In 300 ul Chloroform (oder 150 ul BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 Sekunden verlassen dann bei Raumtemperatur für 2-3 min. Zentrifugieren bei 12000 × g für 15 min bei 2-8 ° C.
  3. RNA-Niederschlag. Übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. In 750 ul Isopropanol. Inkubation bei RT für 10 min (rühren von Umkehr). Inkubation 2 Stunden bei -19 ° C/-31 ° C Zentrifuge Proben bei 12.000 × g für 30 min bei 2-8 ° C.
  4. RNA-Waschanlage und Federung. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen. Wash RNA-Pellet mit 1 ml 80% EtOH (sanft umgekehrt die Röhren). Zentrifuge Proben bei 7500 g für 10 min bei 2-8 ° C. Überstand entfernen mit Hilfe von P1000 und P10. Lassen restlichen EtOH an der Luft trocknen für 2-3 min. 100 l RNase-freies Wasser, Übertragungsrohre bis 70 ° C Wärmeblock und lassen Sie sich für 2-3 Minuten, um das Pellet zu lösen. Dann legen Sie auf dem Eis. Lagerung bei -19 ° C/-31 ° C für Kurzzeitlagerung und -80 ° C zur Langzeitlagerung.
  5. RNA-Reinigung. Reinige RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Kurz gesagt, starten durch Zugabe von 350 ul Puffer RLT an die 100 ul RNA-Probe und gut mischen, dann folgen die Qiagen Verfahren. Schließlich nehmen eine 3 ul (von 50 ul) Aliquot des gereinigten Produkt für Qualitätskontrollen (Schritt 3.6). Shop-RNA bei -19 ° C/-31 ° C für einen kurzfristigen Zeitraum oder bei -80 ° C für eine langfristige Lagerung.
  6. QC-RNA (Abb. 4A). Prüfen Sie die Qualität der RNA und der RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer (Agilent) und einem Nanodrop (Thermo-), nach den Anweisungen des Herstellers. Die RNA Integrity Number (RIN) wird verwendet, um die RNA-Qualität zu beurteilen. Insbesondere gelingt, den Nachweis von 18S und 28S-Peaks wird dringend empfohlen, die Proben in weiteren Schritten zu verwenden.

4. WT-Ovation RNA Amplification

Empfehlungen, um die Verstärkung Schritte mit dem WT-Ov durchführenation Amplification Kit unter optimalen Bedingungen:

  • Führen Sie nicht weniger als acht Verstärkung Proben gleichzeitig zu Pipetten Präzision zu gewährleisten. Dann entfällt ein Abfallvolumen bei der Vorbereitung Master-Mixe, die eine Aufspaltung des Kits in 3 Chargen von 8 Reaktionen erfordern.
  • Halten Sie immer aufgetauten Reagenzien und Reaktionsgefäße auf Eis, es sei denn anders angewiesen.
  • Verwenden Sie nur frische 80% Ethanol-Lösung für die Reinigung.
  • Sie in jeder Phase des Protokolls nicht zu stoppen.

  1. Gesamt-RNA verdünnt, um eine Konzentration von 25 ng / &mgr; l zu erhalten. Verfahren 2 ul der verdünnten Probe.
  2. Vorbereiten des Poly-A-RNA in Spike-Control-Lösung durch eine serielle Verdünnung des Poly-A-RNA Lizenz mit Poly-A Steuerverdünnungspuffer (Affymetrix), um eine 1:25.000 Verdünnung zu erreichen.

    Schritt 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. Die genannten Reagenzien werden durch den Lieferanten wie folgt bezeichnet: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (First Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzym-Mix).

  3. Auftauen A1 und A2 bei Raumtemperatur. Mischen Sie mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 2 sec und Spin 2 Sekunden. Dann schnell auf Eis legen. Legen Sie A3 auf Eis.
  4. Setzen Sie 2 ul von Gesamt-RNA (50 ng) in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen und fügen 2 ul A1 (Endvolumen: 4 ul). Cap und drehen Sie das Rohr für 2 sek.
  5. Inkubation bei 65 ° C für 5 min dann das Rohr auf Eis.
  6. Bereiten Sie das First Strand cDNA Master Mix wie folgt (für eine einzelne Reaktion angegeben). Mischen durch Pipettieren und Zentrifugieren Sie das Master Mix kurz. Sofort, auf Eis legen.
    Reagens Volumen
    First Strand Buffer Mix (A2) 5 ul
    Poly-A-RNA Control (1:25.000) 0,5 ul
    First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 ul
  7. 6 & # hinzufügen181, l der Master Mix auf die RNA / Primer-haltigen Röhre. Mix Dazu den Schlauch, Spin 2 Sek. und schnell auf Eis (Endvolumen: 10 ul) zu platzieren.
  8. Inkubieren bei 4 ° C für 1 min, dann 25 ° C für 10 min, dann 42 ° C für 10 Minuten und dann 70 ° C für 15 min. Keep cool bei 4 ° C Entfernen Sie die Reaktionsröhrchen aus Thermocycler, kurz drehen und auf Eis zu halten. Weiter sofort mit dem Zweiten Strand cDNA Synthesis Schritt.

    Schritt 2: Zweiter Strand cDNA Synthese von 4,8 bis 4,12. B1 (Zweite Strand Buffer Mix) und B2 (Zweite Strand Enzym-Mix): Die genannten Reagenzien werden durch den Lieferanten wie folgt bezeichnet.

  9. Spin down B2 und B3 für 2 Sek. und schnell auf Eis legen. Auftauen B1 bei Raumtemperatur. Mischen Sie mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 2 Sek., 2 Sek. Spin und schnell auf Eis legen.
  10. Bereiten Sie einen zweiten Strang Master Mix wie folgt (für eine einzige Reaktion gegeben). Mischen durch Pipettieren und Zentrifugieren Sie das Master Mix Briefliegen. Sofort, auf Eis legen.
    Reagens Volumen
    Zweitens Strand Buffer Mix (B1) 9,75 ul
    Zweitens Strand Enzyme Mix (B2) 0,25 ul
  11. Hinzufügen von 10 &mgr; l Master Mix jedem First Strand Reaktionsröhrchen. Mischen durch Pipettieren 3x, Spin 2 Sekunden und auf Eis (Abschlussvolumen: 20 ul).
  12. Inkubieren bei 4 ° C für 1 min, dann 25 ° C für 10 min, dann 50 ° C für 30 Minuten und dann 70 ° C für 5 min. Keep cool bei 4 ° C Entfernen Sie die Reaktionsröhrchen aus Thermocycler, kurz drehen und auf Eis zu halten. Weiter sofort mit der Post-Second Strand Enhancement Schritt.

    Schritt 3: Post-Second Strand Enhancement 4,13-4,15. Die genannten Reagenzien werden durch den Lieferanten wie folgt bezeichnet: B1 (Zweite Strand Buffer Mix), B3 (Reaktion Enhancement Enzyme Mix).

  13. Bereiten Sie ein Master Mix durch die Kombination von B1 und B3 Mix wie folgt (für eine einzige Reaktion gegeben). Mischen durch Pipettieren und Zentrifugieren Sie das Master Mix kurz. Sofort, auf Eis legen.
    Reagens Volumen
    Zweitens Strand Buffer Mix (B1) 1,9 ul
    Reaktion Enhancement Enzyme Mix (B3) 0,1 ul
  14. Add 2 ul des Master Mix zu jeder Zweite Strand Reaktionsrohr. Mischen durch Pipettieren 3x, Spin 2 Sekunden und auf Eis (Endvolumen: 22 ul).
  15. Inkubieren bei 4 ° C für 1 min, dann 37 ° C für 15 Minuten und dann 80 ° C für 20 min. Keep cool bei 4 ° C Entfernen Sie die Reaktionsröhrchen aus Thermocycler, kurz drehen und legen auf Eis. Weiter sofort mit dem SPIA Amplification Schritt.

    Schritt 4: Einzelstrang-cDNA (sscDNA) Synthese durch SPIA Prozedur von 4.16 -4.19. C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzym-Mix): Die genannten Reagenzien werden durch den Lieferanten wie folgt bezeichnet.

  16. Auftauen C1 und C2 bei Raumtemperatur. Mischen Sie mit Hilfe eines Vortex-Mischer, Spin 2 Sek. und schnell auf Eis legen. C3 auf Eis auftauen. Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Umdrehen 5x. Achten Sie darauf, nicht die Luftblasen vor. Dann drehen für 2 Sekunden und auf Eis.
  17. Bereiten Sie eine SPIA-Master-Mix, auf die ein 0,5 Abfallvolumen, wie folgt. Mischen durch Pipettieren und Zentrifugieren Sie das Master Mix kurz. Sofort, auf Eis legen.
    Reagens Volumen
    SPIA Buffer-Mix (C2) 5 ul
    SPIA-Primer Mix (C1) 5 ul
    SPIA-Enzym-Mix (C3) 10 ul
  18. In 20 ul der SPIA Master Mix auf der Enhanced zweiten Strang Reaktion tube. Mischen durch Pipettieren 6-8x, Spin und schnell auf Eis legen (Endvolumen: 42 ul).
  19. Inkubieren bei 4 ° C für 1 min, dann 47 ° C für 60 Minuten und dann 95 ° C für 5 min. Keep cool bei 4 ° C Entfernen Sie den Schlauch vom Thermocycler, kurz drehen und legen auf Eis.

5. sscDNA Reinigung und Qualitätskontrolle

  1. sscDNA Reinigung. Reinige sscDNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Kurz gesagt, starten durch Zugabe von 200 ul Puffer PB zu den 42 ul der amplifizierten cDNA-Produkt, mischen und Beladung der Säule. Dann folgen Sie der Qiagen Verfahren. Schließlich nehmen eine 3 ul (von 30 ul) aliquoten Teil der sscDNA gereinigte Produkt für die Qualitätskontrolle (Schritt 5.2).
  2. sscDNA ergeben und Größenverteilung Prüfung (4B). Überprüfen sscDNA Ausbeute und Größenverteilung mit einem Bioanalyzer und Nanodrop, nach den Anweisungen des Herstellers. Die Größe der Verteilung der amplifizierte cDNA sollte be in der Regel zwischen 100 und 1500 Basen lang, mit einem Höhepunkt um 600 Basen besteht.

6. sscDNA Fragmentierung

  1. Bereiten 2 ug cDNA in 30 ul, Anpassen der Lautstärke mit Nuklease-freies Wasser.
  2. Bereiten 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), ausgehend von einem 10-fach OPA Puffer PLUS Lösung.
  3. Planen 0,2 U / ul DNase I (5-fache Verdünnung von 1 U / &mgr; l DNase I).
  4. Bereiten Sie eine Fragmentierung Master Mix wie folgt (für eine einzige Reaktion gegeben):
    Reagens Volumen
    10X One-Phor-All Buffer PLUS 3,6 ul
    DNase I (0,2 U / &mgr; l) 3 ul
  5. In 6,6 ul Fragmentierung Mix zu den 30 ul sscDNA.
  6. Spin und bei 37 ° C für 10 min, dann inaktivieren DNase I bei 95 ° C für 10 Minuten und auf Eis halten. Aliquot 1 &# 181; l des fragmentierten cDNA für Agilent basierend Größenverteilung Überprüfung.
  7. sscDNA Größenverteilung Prüfung (4C). Überprüfen sscDNA Größenverteilung mit einem Bioanalyzer (Agilent). Die Größenverteilung der fragmentierten cDNA sollte in der Regel zwischen 35 und 200 Basen, bestehen.

7. Kennzeichnung von Fragmentierte sscDNA

  1. Verdünnen Sie die DLR-1a 7,5 mm bis 5 mm in DEPC-Wasser.
  2. Bereiten Sie eine Beschriftung Master Mix wie folgt (für eine einzige Reaktion gegeben):
    Reagens Volumen
    5x Reaction Buffer TdT 14 ul
    CoCl 2 (25 mM) 14 ul
    DLR-1a (5 mM) 1 ul
    Terminale Transferase (400 U / &mgr; l) 4.4 ul
  3. In 33,4 ul der Markierungsmischungzu jedem fragmentierten cDNA-Probe.
  4. Mix Dazu den Schlauch, kurz drehen und bei 37 ° C für 60 min, dann auf Eis zu halten.

8. Hybridisierung mit der Microarray-Chip HERV

  1. Vorbefeuchtet HERV Genechip mit 200 &mgr; l Vorhybridisierung Mix (Affymetrix) und Inkubation bei 50 ° C, 60 Upm, 10 min.
  2. Bereiten Sie die Hybridisierung Mischung wie folgt (für eine einzige Reaktion gegeben):
    Reagens Volumen
    Steuer Oligo B2 (3 nM) 3.3 ul
    20x Eukaryotische Hybridisierung Steuer 10 ul
    2x Hybridisierung Mix 100 ul
    99,9% DMSO 17,7 ul
  3. Fügen Sie die 131 ul Hybridisierung Mix zu den 69 ul der fragmentierten und markierten cDNA bei Raumtemperatur, um eine endgültige vo machenlume von 200 ul.
  4. Mischen und Denaturierung für 2 min bei 95 ° C, dann bei 50 ° C inkubiert und für 5 min Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 5 min.
  5. Leeren Sie die Feuchtsalzstreuung HERV Genechip und laden Sie die 200 ul Ziel Vorbereitung. Bewerben zäh-Flecken auf der zwei Septen.
  6. Hybridisierung bei 50 ° C, 60 Upm, 18 Stunden.
  7. Nach 18 Stunden, leeren Sie den HERV Genechip und speichern die gesammelten Hybridisierungslösung bei 4 ° C Füllen Sie den Sondenarray mit 250 ul Waschpuffer A. Wenn die Chips nicht sofort auf die Fluidik, bei 4 ° C gelagert laufen

9. Waschen und Färben

  1. Führen Sie die Fluidtechnik aus dem GCOS Menüleiste. Im Dialogfenster Fluidtechnik, wählen Sie den Sender von Interesse (1 - 4), und wählen Sie dann Shutdown_450 für alle Module, dann führen. Tauchen Sie die 3 Fluidik Aspiration Leitungen in Milli-Q-Wasser. Folgen Sie den LCD-Bildschirm.
  2. Tragen Sie die Prime_450 Programm auf alle Module. Legen Sie den Schlauch für Waschpuffer A ineine Flasche mit 400 ml Waschpuffer A, und der für Waschpuffer B in eine Flasche mit 200 ml Waschpuffer B. Dann wieder, folgen Sie den LCD-Bildschirm.
  3. Heben Sie die Nadeln und legen 600 ul Fleck Cocktail 1 (SAPE Lösung Mix) und 600 ul Fleck Cocktail 2 (Antikörperlösung Mix)-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen an den Positionen # 1 und # 2 und 800 ul-Array, Pufferlösung an Position Nr. 3 .
  4. Weisen Sie den richtigen Chip für jedes Modul, wählen Sie die FS450-004-Protokoll und führen jedes Modul, folgende Anweisungen am Bildschirm.

10. Scannen

  1. Wärmen Sie den GS3000-Scanner. Sie ist bereit, zu scannen, wenn die Ampel auf grün.
  2. Bewerben zäh-Spots auf die Scheidewände zu vermeiden, leckt dann den Chip laden in den Autoloader oder alternativ direkt in den Scanner. Starten des Scanvorgangs.
  3. Nach dem Scannen der Chips. Cel-Dateien generiert. Überprüfen Sie das Bild und richten Sie das Raster auf der Stelle, um die Sonde Zellen (identifizieren <strong> Zahlen 4D-F).

11. Datenanalyse

  1. Qualitätskontrolle. Finden Sie in der Standard-Affymetrix steuert, um zu überprüfen, dass die HERV-V2-Chips erfüllen die QC-Kriterien. Zu diesem Zweck die folgenden Darstellungen können verwendet werden: die Protokollintensitätswert-Verteilung (Dichte Plots und Box-Plots), die mittlere absolute Abweichung (MAD) gegenüber der Intensität Median (MAD-Med) Grundstücke, die Hintergrund-Plots, die normierte unscaled Standardfehler (NUSE) Grundstücke und die relative Protokollausdruck (RLE) Parzellen.
  2. Normalisierung. Darüber hinaus sollte die Datenmenge untersucht werden, um unerwartete Effekte Batch markieren und sie vor der statistischen Analyse zu korrigieren. Die Datenvorverarbeitung umfasst somit eine Hintergrundkorrektur (z. B.. Bezogen auf das Tryptophan Sondenausgangssignal), gefolgt von RMA Normalisierung und Verdichtungs 15.
  3. Data-Mining-und Such für Differenz exprimierten Genen. Normalisieren Sie die Chips und gelten eine hierarchische clustering Ansatz, um die Datenmenge (6A) zu erkunden. Dann die Suche nach differenziell exprimierte Gene (DEG) ausführen, indem Sie eine klassische signifikanten Analyse von Microarray (SAM), gefolgt von einem False Discovery Rate (FDR) Korrekturverfahren 17 16. Beachten Sie, dass diese Schritte werden vollständig in einigen Software-Analyse-Suiten wie Partek GS integriert, kann aber alternativ mit der Statistiksoftware R 18 mit Paketen aus dem Bioconductor Projekt 19 durchgeführt werden. Nach der statistischen Analyse, filtern Sie die Datenmenge, die Probesets für die Expressionswerte von weniger als 2 6 auszuschließen.
  4. Visualisierung und Interpretation. Interpretieren Sie die Ergebnisse aus der HERV-V2 Microarray in einem eigenen Schnittstelle mit Beschriftungs Datenbanken.

Representative Results

Der Wert der Transkriptom-Studien liegt vor allem in der Qualität des Ausgangs biologischen Material. Wenn die RNA-Extraktion unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird, ist die RNA Integrity Number (RIN), die typischerweise 7 oder höher (Fig. 4A). Die Notwendigkeit, auf der Affymetrix HERV-V2-Chip hybridisieren 2 ug cDNA impliziert die Verwendung eines Amplifikationsverfahrens. Eine erfolgreiche Amplifikation Schritt führt zu einer glockenförmigen Verteilung (Figur 4B). Dann wird DNAse1 Fragmentierung, um die cDNA Größenverteilung um 100 Nukleotide vor der Hybridisierung (4C) Homogenisierung durchgeführt. Nach der Hybridisierung und Scannen (4D), eine visuelle Kontrolle des Bild ermöglicht es, zu überprüfen, ob das Gitter gut zu den Spots (4E) ausgerichtet ist, und wenn die Hybridisierung Kontrollen konsistent sind (4F). Dieser Schritt ist auch um Mikroarrays auszuschließen, die in dem Luftblasen oder Fehler trat während des Experiments.

Sobald die Chips QC (Abbildung 5) geführt und nach der Normalisierung, die statistische Analyse von 5 Match-Paar Tumor-und Normal Prostata-RNA-Proben aus der Lyon-Sud Krankenhaus führte zur Identifizierung von 207 HERV Probesets mit Differenzexpressionswerte (p.val <0,05) (Fig. 6A). Um diese Datensätze unterstützen und Prostata-spezifischen Informationen zu erhalten, wurden 35 zusätzliche Spiel-Pair-Proben (Dickdarm-, Eierstock-, Hoden-, Brust-, Lungen-und Prostatakrebs), um die Analyse und der SAM-FDR-Verfahren (FDR = 20%) schließlich identifiziert hinzugefügt 44 Prostata-spezifischen HERV Probesets. Unter ihnen werden die wichtigsten 10 HERV Strukturen beschrieben (6B). Weitere klinische Studien erforderlich, um die Werte der Empfindlichkeit und Spezifität dieser Biomarker-Kandidaten zu beurteilen.

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. Figur 1 Schema des Gesamtverfahrens von der Klinik (1: Prostatektomie durch den Kliniker und den Gewebepräparation durch den Pathologen) an die Bank (2-6: Probenvorbereitung, Zielpräparation, Microarray-Verarbeitung), die zur Identifizierung von Kandidaten-Biomarker (7: Bioinformatik-Analyse der HERV-Microarrays). Nukleinsäuren von normalem Gewebe abgeleitet werden orange dargestellt; Nukleinsäuren von Tumorbereich abgeleitet bestehen aus einer Mischung aus normalen (orange) und tumorspezifischen (schwarz) Nukleinsäuren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
. Abbildung 2 Konzeption und Inhalt des HERV-V2-Chip: HERV-Sequenzenaus dem menschlichen Genom abgerufen werden, werden in einer Datenbank namens HERV-gDB3 gespeichert, dann die 25-mer Kandidat Sonden durchlaufen einen speziellen Hybridisierung Modellierungsverfahren (EDA +), bevor er schließlich auf dem Array synthetisiert (die resultierende gezielte Teilbereiche werden für jede dargestellte Familie). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
Abbildung 3. Prostata-Behandlung durch den Pathologen. (A) Frische radikale Prostatektomie Probe wird an das Labor übertragen. (BC) Die Prostata ist gefärbt (grün auf der rechten Seite, schwarz auf der linken Seite). (D) Große Querschnitt der Kabelverschraubung an der hinteren Seite. (E) Verlassen Sie die Ränder intakt, piecn von Geweben aus verschiedenen Bereichen der Prostata seziert. (F) Kerne von Gewebe werden in einem Eppendorf-Röhrchen gegeben. (G) Die Nahtfaden verwendet, um die Prostatadrüse zu schließen und Verzerrung und minimaler Störung der chirurgischen Spanne zu verhindern. Dann ist die radikale Prostatektomie Probe bereit zur Fixierung in Formalin nach dem üblichen Verfahren für die histologische Analyse. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
Abbildung 4. Qualitätskontrollen der Nukleinsäurepräparation und Hybridisierung Effizienz. (A) RNA-Integrität, (B) cDNA amplifizierten Targets und (C) fragmentiert Ziele in der Hybridisierungsstufe verwendet. These drei Qualitätskontrollen wurden mit dem Bioanalyzer mittels RNA Nano-Chips und die Eukaryote Nano Serie II Test erhalten. (D) Gesamtbild des HERV-V2-Microarray-Hybridisierungsbereich nach dem Scannen, (E) Vergrößerung der linken oberen Ecke zeigt Gitterausrichtung Kontrollen und (F) Erweiterung der mittlere Bereich zeigt Spek Hybridisierung Kontrollen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 5
5. Verarbeitung von Signalen. (A) Affymetrix polyA Spike-Verstärkung in Kontrollen. Die polyA steuert Dap, Thr, Phe und Lys-Transkripte aus B. subtilis Gene sind in der RNA-Probe versetzt und dienen dazu, den Gesamterfolg zu beurteilen der Zielvorbereitungsschritte. Intensität sollte bei abnehmenden Werten unter diesen Dorn in Kontrollen festgestellt werden, um sicherzustellen, dass es keine Vorspannung während des WT-Ovation Verstärkung zwischen hoch-und niedrig exprimierten Genen. (B) Affymetrix Spike-in-Hybridisierung Kontrollen. Diese Ziele von E. isoliert coli und P1 Bakteriophagen werden vor dem Markierungsverfahren versetzt. Steigende Werte von BioB, BioC, BioD und Cre zeigen den Gesamterfolg der Hybridisierung. (C) Intensitätsverteilung der Chip-Signale nach RMA Normalisierung. Die meisten der Probesets weisen Signale mit Werten unter 2 6 (Hintergrund), was auf eine Gesamtausdruck vor allem auf einige spezifische HERV Loci beschränkt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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6. Datenanalyse. (A) Hierarchical Clustering-Analyse von normalen und Tumorproben. Und unten (blau)-Regulierung unter Normal-und Tumorproben - Partitionierung Clustering wurde mit einem euklidischen Abstand Funktionsalgorithmus, Gruppierung Probesets, die in bis (rot) an den normalisierten Expressionswerte angewendet. (B) Die Auswahl der Bewerber als Biomarker für Prostatakrebs identifiziert Top-10-HERV-Strukturen. Für jede HERV Element, der damit verbundenen HERV-Familie, die genomischen Koordinaten (NCBI 36/hg18) und eine kurze Beschreibung des HERV-Struktur gegeben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 7
Abbildung 7. Der HERV Repertoire. (A) Sequenzierung des menschlichen Genoms ergab, 25.000 Protein kodierende Gene (Exons, 2%) und eine riesige Menge von Transposons einschließlich 200.000 Lang Terminal Repeat (LTR) Retrotransposons (HERV, 8%). (B) Die Extrapolation von HERV-V2-Chip und die damit verbundenen Inhalte Expressionsdaten (79 Proben von 8 normalen gegenüber Tumorgewebetypen Ursprung) legen nahe, dass ein Drittel der HERV Repertoire ist transkriptionell aktiv. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 8
Figur 8. Funktionellen Auslegung der Signale von dem Chip. (A) Promoter Identifikation und epigenetische Kontrolle: U3 negatives Signal (rote Sonde, 5'LTR) Gegenüber der R-U5 positives Signal (blau-Sonde, 5 'LTR) schlagen U3-driven Transkription, durch die unterschiedliche CpG-Methylierung (fest schwarze Kreise) Inhalt der U3 in peritumoral normalen gegenüber Tumorgewebe unterstützt. (B) Splicing-Strategie: die vermeintliche 3,1 kb mRNA codiert, Umschlag ausschließlich im Tumor exprimiert wird mit SD1/SA2 Spleißstelle überlappenden Sonde identifiziert. * Durch den Vergleich mit anderen nicht-Plazenta-Gewebe abgeleitet wird. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

In den letzten 10 Jahren wurden die meisten Versuche zur Expression HERV Messung wurden RT-PCR-Techniken verwendet werden, entweder über einen spezifischen Locus 20-24 oder basierend auf der relativen Erhaltung der pol-Gene auf allgemeine Trends in HERV Gattungen 25,26 bewerten konzentrieren . Zusätzlich PCR-Amplifikationen mit hoch degenerierten Primern gepaart mit niedrigen Dichte Microarrays bestimmt zu erkennen und zu quantifizieren, die Expression von HERV Familien 27,28. Um die Expression einzelner Locus innerhalb einer Familie zu verfolgen, Ansätze, die auf der PCR-Amplifikation von konservierten Regionen kombiniert mit anschließender Klonierung und Sequenzierung der Basis aktiviert transkriptionell aktiv verschiedene Elemente der HML-2 29,30 oder 31 E4.1 HERV-Familien identifiziert werden. Auch endet durch Klonierung und Sequenzierung Schritte, das Genom Repeat Expressionsüberwachungstechnik mit dem Ziel, unter den Promotoren identifiziert wiederholt aktiv HML-2-spezifischen menschlichen einsamen LTRs identifizieren 34,35 minimieren. Die HERV-V2-Chip, der 2690 und 2883 deutliche Proviren Solo-LTRs von HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 und HERV-K HML-5 Familien richtet, stellte die Expression von HERV 1718 Loci (7A und B) in einer Vielzahl von Geweben 35, in dieser Arbeit durch die Identifizierung von mutmaßlichen Prostatakrebs Biomarker veranschaulicht. Darüber hinaus ist die Verwendung von mehreren Probesets auf einem bestimmten Locus informative um seine Transkriptionsregulation. Zunächst wird ein negatives Signal U3 in Verbindung mit einer U5 positiv klassifiziert die LTR als Promotor, und umgekehrt U3 positive und negative Signale U5 kann eine Polyadenylierung Rolle zu reflektieren. Damit haben wir identified 326 Promoter LTRs in einer breiten Palette von Geweben 35 und auf der Grundlage dieser U3-U5 dichotome Informationen von der Anordnung vorgesehen ist, haben wir vorgeschlagen und experimentell für einige ausgewählte Fälle bestätigt, dass solche autonomen Transkription wurde durch eine Methylierung abhängig epigenetischer Prozess 34 (gesteuert 8). Zweitens, die Erfassung von Signalen von zB LTR, gag und env unabhängige Probesets oder von Sonden auf bestimmte Spleißstelle ausgestellt ist informativ über die proviraler Spleißen Strategie, wie von der ERVWE1/Syncytin1 Expressionsprofil in der Plazenta oder in Tumor Hoden 34 veranschaulicht. Dies zeigt an, dass der Prozess des HERV-spezifischen Sonde Auswahl robust genug ist, um die Identifizierung von Gewebe-assoziierten Spleiß Strategie so effizient wie für herkömmliche Gene 36 (Fig. 8) unterstützt.

Diese Methode ist der erste Versuch, individuell HERV Expression Ort identifizierenmit einem benutzerdefinierten hoher Dichte basierend auf Microarray-Technologie von Affymetrix. Die eindeutig identifiziert Vorteile der Microarray-Format zu HERV Transkriptom, bestehend aus (i) entschlüsseln die koordinierte Erforschung verschiedener HERV Familien und (ii) das gleichzeitige und unabhängige Analyse der verschiedenen Regionen für jeden Locus, z. B.. U3 und U5 Domains für Solo-und proviralen LTR, gag oder env-Regionen und mögliche gespleißt Kreuzungen mit proviralen Strukturen verbunden, ohne von vornherein auf die Funktionalität des HERV-Element. Perspektiven verlassen sich auf eine Verbesserung der Anmerkungen in den Microarray-assoziierten Bioinformatik-Tools. Damit sollte ein Chipsignale in biologischen Hypothesen belegt beispielsweise, ob aktiv HERVs fahren lncRNA Transkription oder modulieren, mehr oder weniger proximalen Codierung Genexpression zu konvertieren. In der Tat wird diese Vermutung durch die jüngsten Studien, die Prostata-Krebs-assoziierte ncRNA Transkripten, die Komponenten von v identifiziert unterstütztIRAL ORFs aus der HERV-K endogenen Retrovirus-Familie oder Teile eines viralen LTR-Promotor-Region 37, sowie zwei Genfusionsereignisse nämlich HERV-K22q11-ETV1 und HERV-K17-ETV 38,39. Zusammengenommen können diese ganze Transkriptom-Ansatz verbunden mit LTR-Funktion und Spleiß-Strategie Identifikationen helfen, um den Marker im Vergleich zu den Trigger-Komponenten von HERV-Expression in der chronischen Infektionskrankheiten und 40,41 42,43 entziffern.

Disclosures

Diese Arbeit wurde von bioMérieux SA, dem Hospices Civils de Lyon und dem Französisch Behörde OSEO (Advanced Diagnostics für neue therapeutische Ansätze, ein Französisch-Regierung finanziertes Programm zur personalisierten Medizin gewidmet) unterstützt. PP, VC, GO, NM, und FM sind Mitarbeiter von bioMérieux SA. PP, NM und FM haben Patentanmeldungen, die die Ergebnisse dieser Arbeit vorgelegt.

Acknowledgments

Wir danken Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard und Bertrand Bonnaud für ihren Beitrag zu der anfänglichen Entwicklung und Optimierung der HERV-V2-Protokoll. Wir möchten auch Hader Haidous für seine Leitlinien für ethische Überlegungen danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Invitrogen 15596-026
RNA poly-A control stock Affymetrix 900433
DNAse 1 Promega M6101 1,000 U (1 U/µl)
Terminal transferase Roche 3333574001 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).
DLR-1a Affymetrix 900542
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control Affymetrix 900454
GeneChip Hybridization, Wash and staining Affymetrix 900720 Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions
10x One-Phor-All Buffer PLUS Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.
RNeasy Mini kit Qiagen 74104 RNA cleanup protocol
WT-Ovation RNA amplification system Nugen 2210-24
QIAquik PCR purification kit Qiagen 28104
EQUIPMENT
Material Name Company Catalogue Number Comments
Nanodrop 1000 Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7G Affymetrix GS30007G Optional: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450 Affymetrix FS450
GeneChip Hybridization 640 Oven Affymetrix 640 Includes 4 GeneChip Probe array carriers
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chip Affymetrix Custom array.
For microarray availability (for research use only), please contact:
François Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux
Medical Diagnostic Discovery Department
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F
69495, Pierre Bénite cedex France
Phone: 33 (0)4 72 67 87 85
Email: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35.

Locus-specific probes design
Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.

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Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs
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Pérot, P., Cheynet, V., Decaussin-Petrucci, M., Oriol, G., Mugnier, N., Rodriguez-Lafrasse, C., Ruffion, A., Mallet, F. Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (81), e50713, doi:10.3791/50713 (2013).More

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