Summary
Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l'8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l'espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici.
Abstract
L'antigene prostatico specifico (PSA) è il principale biomarker diagnostico per il cancro della prostata in uso clinico, ma manca di specificità e sensibilità, in particolare bassi valori di dosaggio 1. 'Come usare PSA' rimane un problema di corrente, sia per la diagnosi come una zona grigia corrispondente ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml che non permette una chiara differenziazione da effettuare tra cancro e noncancer 2 o per follow paziente -come l'analisi del PSA post-operatorio parametri cinetici possono porre notevoli sfide per la loro applicazione pratica 3,4. In alternativa, RNA non codificanti (ncRNAs) stanno emergendo come molecole chiave nel cancro umano, con la possibilità di servire come nuovi marcatori di malattia, ad esempio PCA3 nel carcinoma della prostata 5,6 e rivelare aspetti non caratterizzate della biologia tumorale. Inoltre, i dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha mostrato che i diversi tipi di RNA coprono circa il 62% della generazioneome. Risulta inoltre che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Così, ripetizioni terminali lunghe (LTR) di retrovirus endogeni umani (HERVs) costituiscono una vasta gamma di putative / candidati sequenze regolatrici trascrizionali, in quanto è la loro funzione primaria nei retrovirus infettivi. HERVs, che sono diffuse in tutto il genoma umano, provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all'interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e portano a Multicopy famiglie che occupano l'8% del genoma umano (notare che esoni coprono il 2% del nostro genoma ). Alcuni loci HERV esprimere ancora le proteine che sono stati associati con diverse patologie tra cui il cancro 7-10. Abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se possono essere attivi, se guidano ncRNA trascrizione o modulate codifica genica. Questo strumento è stato applicato nel campo del cancro della prostata (Figura 1).
Introduction
Retrovirus endogeni umani (chiamati anche HERVs) sono sparsi in tutto il nostro genoma. Essi provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all'interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e conducono alle famiglie multicopia. Oggi, essi non sono più infettive ma occupano 8% del genoma umano, come punto di confronto, esoni abbracciano 2% del genoma umano. Dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha dimostrato che diversi tipi di RNA coprono circa il 62% del genoma, compreso un terzo in regioni intergeniche. Inoltre, sembra che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Ripetizioni HERVs lungo terminali (LTR) rappresentano una vasta gamma di potenziali elementi regolatori trascrizionali, come lo è la loro funzione abituale nei retrovirus infettivi. Storicamente, a parte alcuni loci espresso nella placenta o testicolo, si credeva che HERV tacciono a causa di epregolamento igenetic. Pertanto, abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se sono attivi, se guidano lncRNA trascrizione o modulano l'espressione genica codificante. Questo strumento soprannominato HERV-V2 GeneChip integra 23.583 probesets HERV e può discriminare 5.573 elementi HERV distinti composti da LTR solisti così come provirus complete e parziali (Figura 2).
Diagnosi, Valutazione, e il Piano:
La diagnosi di cancro alla prostata è basato sul dosaggio dell'antigene prostatico specifico (PSA) biomarker in laboratorio clinico, un esame rettale digitale per valutare alterazione morfologica della prostata e infine biopsie prostatiche osservati dal patologo. La mancanza di specificità e sensibilità sufficiente tra biomarker tumorali convenzionali, come PSA per il cancro alla prostata, è stato ampiamente riconosciuto after decenni di implicazioni cliniche 1. Inizialmente, PSA è stato proposto per la diagnosi e il trattamento di adenocarcinoma della prostata 11. Era quest'ultimo proposto per lo screening del cancro e monitorare lo sviluppo della malattia 12. Tuttavia, rimane una domanda che viene regolarmente chiesto: 'come usare PSA'. (I) Una zona grigia che corrisponde ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml non consente una chiara differenza deve essere fatta tra il cancro e non oncologico 2; (ii) due studi di coorte grandi iscrivendosi centinaia di migliaia di persone in Europa e USA non è riuscito a giungere ad una chiara conclusione circa l'utilità dello screening in termini di malattia mortalità specifica 13,14, (iii) analisi dei parametri cinetici di PSA post-operatorio come liquidazione PSA, PSA velocity e tempo di raddoppio, anche se semplice in teoria, può porre notevoli sfide in pratica 3,4 applicazione. Possiamo aspettarci che nei prossimi anni, biomarker appcazioni sosterranno una scelta clinica tra vigile attesa e più o trattamenti meno aggressivi a seconda del tumore fenotipo. Per quanto riguarda la diagnosi reso dal patologo, un primo fattore limitante proviene da una falsa diagnosi negativa del 20% entro biopsie prostatiche (molti tumori sono mancati per campionamento). Una seconda preoccupazione occupa della necessità di una procedura biopsia ulteriore seguente uno negativo, che possono presentare effetti avversi.
La prostatectomia radicale è attualmente uno dei trattamenti standard per il cancro alla prostata. Si propone in pazienti sani, invecchiamento 45-65 anni, soprattutto nel caso di modelli aggressivi (Gleason 7 a 10), tumore multifocale o tumore palpabile. Ora è fatto nel nostro reparto con chirurgia robotica assistita. A causa della crescente evidenza che i marcatori molecolari avranno fondamentale importanza nei prossimi anni, abbiamo deciso di proporre a tutti i nostri pazienti la possibilità di partecipare a un programma per la prostatabanche di tessuti. Più precisamente, i programmi di ricerca in espansione molecolari sul cancro alla prostata hanno portato ad una richiesta crescente di accesso ai tessuti tumorali freschi di alta qualità da campioni prostatectomia. Questa ricerca, in particolare gli approcci genomici, richiesto grandi campioni di qualità elevata DNA / RNA. Tumorali e tessuti adiacenti "non tumorali" dello stesso paziente sono necessari. Raccomandazioni per la gestione e l'elaborazione prostatectomies radicali sono progettati per preservare le caratteristiche patologiche che determinano palco e lo stato dei margini e così il potenziale ulteriore trattamento e la prognosi. Qualsiasi metodo di campionamento tessuto fresco, quindi, non dovrebbe compromettere successive valutazioni patologiche per essere accettabile per la diagnosi. Dissezione macroscopica della prostata è difficile e grande attenzione deve essere prestata ai tessuti di margine e capsulare invasione: qualsiasi dissezione per la prostata bancario dovrebbe essere sempre condotta da un esperto uropathologist in base a un accordod protocollo. Il comitato etico della facoltà di medicina e la scheda medica stato convenuto di queste indagini e il consenso informato è stato ottenuto per tutti i pazienti inclusi nel tessuto della prostata bancario.
Protocol
1. Chirurgia
Una volta rimosso dal chirurgo, mantenere la prostata in ghiaccio fino presa in carico da un patologo.
2. Manipolazione dei tessuti della prostata
- Per rispettare il ritardo di ischemia perioperatoria, trasferire i campioni prostatectomia radicale sul ghiaccio al laboratorio da personale dedicato entro 30 minuti dopo l'ablazione chirurgica. Il ritardo di congelamento deve essere inferiore a 20-30 min (Figura 3A).
- Pesare e macchiare la prostata secondo l'usuale protocollo (ad esempio verde sul lato destro, nero sul lato sinistro, si vedano le figure 3B e 3C).
- Eseguire una grande sezione trasversale della ghiandola sul lato posteriore (Figura 3D). Orientare la prostata e metterlo sul lato anteriore. Eseguire una grande sezione trasversale della ghiandola sul lato posteriore con un bisturi sterile.
- Sezionare pezzi di tessuto sulla zona di transizione,sulle zone periferiche sinistro e destro, lasciando intatti i margini (Figura 3E).
- Mettete i nuclei di tessuto in un tubo Eppendorf, scatto congelare e conservare in azoto liquido (Figura 3F). Se non si stanno facendo biobanca procedere direttamente con passo 2.7.
- Eseguire prostata banking solo se la lunghezza totale del cancro su biopsie è superiore a 10 mm. Utilizzare un filo di sutura per chiudere la prostata e per evitare distorsioni della ghiandola e un'interruzione minima del margine chirurgico (Figura 3G). Quindi fissare il campione prostatectomia radicale con formalina e incorporare in paraffina secondo la procedura usuale per l'analisi istologica.
- Montare nuclei di tessuto congelato in verticale su un piccolo tumulo di ottobre e fare sezioni di un criostato. Prendete un primo singolo 5 micron sezione congelata e macchiare con blu di toluidina.
- Eseguire un esame istologico pratica di analizzare la natura del tessuto (cioè. Benigno o maligno). Per tumoraletessuto, stimare la quantità di cellule tumorali e selezionare solo nuclei con più del 80% delle cellule tumorali.
- A seguito di questo, eseguire un nuovo singolo 5 micron sezione congelata e macchiare con ematossilina, eosina e Safran. Poi, tagliate 15 sezioni x 30 micron e metterlo in una provetta Eppendorf libero RNAsi.
- Un ultimo 5 micron sezione congelata per ematossilina, eosina e Safran Coloratela per controllare la quantità di cellule tumorali al termine della procedura.
- Inserire il tubo Eppendorf in ghiaccio secco e inviare il campione al laboratorio di biologia molecolare.
3. RNA estrazione, purificazione e Controllo Qualità
- Omogeneizzazione. Eseguire omogeneizzazione in presenza di 1 ml di Trizol/100 mg tessuto finché il tessuto è completamente sciolto in soluzione. Aggiungere la soluzione Trizol gradualmente e procedere con cautela su ghiaccio utilizzando una smerigliatrice a mano. Una volta omogeneizzato, un'aliquota la soluzione per provette Eppendorf e lasciare in Trizol a temperatura ambiente percinque minuti.
- Separazione di fase. Aggiungere 300 microlitri cloroformio (o 150 microlitri BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sec poi lasciato a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare a 12.000 xg per 15 minuti a 2-8 ° C.
- RNA precipitazioni. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Aggiungere 750 microlitri isopropanolo. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti (agitare per inversione). Incubare 2 ore a -19 ° C/-31 ° C. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 30 min a 2-8 ° C.
- Lavaggio RNA e sospensione. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante. Lavare RNA pellet con 1 ml di 80% EtOH (indietro delicatamente i tubi). Centrifugare i campioni a 7.500 xg per 10 min a 2-8 ° C. Rimuovere il surnatante utilizzando P1000 e P10. Lasciare restante EtOH asciugare all'aria per 2-3 minuti. Aggiungere 100 acqua RNase-free microlitri, tubi di trasferimento a 70 blocco termico ° C e lasciate riposare per 2-3 minuti per sciogliere il pellet. Poi mettere sul ghiaccio. Conservare a -19 ° C/-31 stoccaggio ° C per breve termine e -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
- Purificazione dell'RNA. Purificare RNA utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen). In breve, inizia con l'aggiunta di 350 microlitri di buffer RLT al campione di RNA 100 microlitri e mescolare bene, quindi seguire la procedura Qiagen. Infine, prendere a 3 ml (su 50 ml) un'aliquota del prodotto purificato per i controlli di qualità (passo 3.6). Conservare RNA a -19 ° C/-31 ° C per un periodo breve termine oa -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
- RNA QC (Figura 4A). Controllare la qualità dell'RNA e l'integrità dell'RNA utilizzando un Bioanalyzer (Agilent) e un Nanodrop (Thermo), secondo le istruzioni del produttore. L'RNA Integrity Number (RIN) viene utilizzato per valutare la qualità dell'RNA. In particolare, riuscire nella rilevazione di 18S e 28S picchi si consiglia vivamente di utilizzare i campioni in ulteriori passi.
4. WT-ovation RNA Amplification
Raccomandazioni per eseguire le fasi di amplificazione utilizzando il WT-Ovzione kit di amplificazione in condizioni ottimali:
- Eseguire non meno di otto campioni di amplificazione alla volta per garantire la precisione di pipettaggio. Poi, tenere conto di 1 volume di rifiuti durante la preparazione master mix che richiedono una scissione del kit in 3 lotti di 8 reazioni.
- Tenere sempre i reagenti scongelati e provette su ghiaccio, se non diversamente indicato.
- Utilizzare solo una soluzione di etanolo al fresco 80% per la depurazione.
- Non smettere in qualsiasi fase del protocollo.
- Diluire RNA totale per ottenere una concentrazione di 25 ng / ml. Processo 2 microlitri del campione diluito.
- Preparare il Poly-A RNA picco-in di controllo della soluzione da una diluizione seriale del Poly-A RNA Archivio con Poly-A controllo tampone di diluizione (Affymetrix), per ottenere una diluizione 1:25.000.
Fase 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (FiRST Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).
- Scongelare A1 e A2 a temperatura ambiente. Mescolare utilizzando un vortice-mixer per 2 secondi e centrifugare per 2 sec. Poi, mettere rapidamente sul ghiaccio. Mettere A3 sul ghiaccio.
- Mettere 2 pl di RNA totale (50 ng) in una provetta da 0,2 ml PCR e aggiungere 2 ml di A1 (volume finale: 4 ml). Cap e girare la provetta per 2 sec.
- Incubare a 65 ° C per 5 min quindi la provetta in ghiaccio.
- Preparare la First Strand cDNA Master Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio.
Reagente Volume First Strand Buffer Mix (A2) 5 microlitri Poly-A RNA Control (1:25.000) 0,5 microlitri First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 microlitri - Aggiungere 6 & #181, l del Master Mix al / tubo Primer contenente RNA. Mescolare muovendo il tubo, centrifugare per 2 sec e mettere rapidamente sul ghiaccio (volume finale: 10 microlitri).
- Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 25 ° C per 10 min, quindi 42 ° C per 10 min e poi 70 ° C per 15 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e tenere in ghiaccio. Proseguire immediatamente con la seconda fase di Strand cDNA Synthesis.
Fase 2: Second Strand cDNA Synthesis 4,8-4,12. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: B1 (Seconda Strand Buffer Mix) e B2 (Seconda Strand Enzyme Mix).
- Spin giù B2 e B3 per 2 secondi e rapidamente disporli sul ghiaccio. Scongelare B1 a temperatura ambiente. Mescolare utilizzando un vortex mixer per 2 sec, centrifugare per 2 sec e rapidamente posto sul ghiaccio.
- Preparare un secondo filone Master Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin giù il brie Master Mixvolare. Immediatamente, disporli sul ghiaccio.
Reagente Volume Secondo Strand Buffer Mix (B1) 9.75 microlitri Secondo Strand Enzyme Mix (B2) 0,25 ml - Aggiungere 10 ml di Master Mix per ciascun tubo di reazione First Strand. Mescolare pipettando 3x, centrifugare per 2 sec e posto sul ghiaccio (volume finale: 20 microlitri).
- Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 25 ° C per 10 min, quindi 50 ° C per 30 min, quindi 70 ° C per 5 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e tenere in ghiaccio. Proseguire immediatamente con la fase post-Seconda Enhancement Strand.
Fase 3: post-Seconda Strand Enhancement 4,13-4,15. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: B1 (Seconda Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzyme Mix).
- Preparare una Master Mix combinando B1 e B3 Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio.
Reagente Volume Secondo Strand Buffer Mix (B1) 1,9 microlitri Reazione Enhancement Enzyme Mix (B3) 0.1 microlitri - Aggiungere 2 ml di Master Mix per ciascun tubo di reazione Second Strand. Mescolare pipettando 3x, centrifugare per 2 sec e posto sul ghiaccio (volume finale: 22 microlitri).
- Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 37 ° C per 15 min, quindi 80 ° C per 20 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e disporli sul ghiaccio. Continuare subito con il passo SPIA amplificazione.
Fase 4: Single strand cDNA (sscDNA) sintesi mediante procedura SPIA da 4.16 -4.19. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
- Scongelare la C1 e C2 a temperatura ambiente. Mescolare con un vortice-mixer, centrifugare per 2 sec e mettere rapidamente sul ghiaccio. Scongelare C3 su ghiaccio. Mescolare il contenuto capovolgendo delicatamente 5x. Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria. Poi, girare per 2 sec e posto sul ghiaccio.
- Preparare un SPIA-Master Mix, che rappresentano un volume di 0,5 spreco, come segue. Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio.
Reagente Volume SPIA-Buffer Mix (C2) 5 microlitri SPIA-Primer Mix (C1) 5 microlitri SPIA-Enzyme Mix (C3) 10 microlitri - Aggiungere 20 ml di SPIA Master Mix per Enhanced secondo filone di reazione tube. Mescolare pipettando 6-8x, effetti e mettere rapidamente sul ghiaccio (volume finale: 42 microlitri).
- Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 47 ° C per 60 min e poi 95 ° C per 5 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Togliere la provetta dal termociclatore, centrifugare brevemente e disporli sul ghiaccio.
5. sscDNA Depurazione e Controllo Qualità
- sscDNA purificazione. Purificare sscDNA utilizzando il kit di purificazione QIAquik PCR (Qiagen). Brevemente, iniziare aggiungendo 200 microlitri tampone PB a 42 ml di prodotto cDNA amplificato, mescolare e carico sulla colonna. Quindi seguire la procedura Qiagen. Infine, prendere a 3 ml (su 30 ml) un'aliquota del prodotto purificato sscDNA per i controlli di qualità (passo 5.2).
- sscDNA cedere e verifica distribuzione dimensionale (Figura 4B). Controllare sscDNA resa e distribuzione dimensionale usando un Bioanalyzer e un Nanodrop, secondo le istruzioni del produttore. La dimensione di distribuzione di cDNA amplificati dovrebbe be in genere compreso tra i 100 ei 1.500 basi lunghe con un picco di circa 600 basi.
6. sscDNA frammentazione
- Preparare 2 mg di cDNA in 30 microlitri, la regolazione del volume con acqua priva di nucleasi.
- Preparare 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), partendo da un buffer 10x OPA PLUS soluzione.
- Preparare 0,2 U / ml DNasi I (diluizione 5 volte di 1 U / ml DNasi I).
- Preparare una frammentazione Master Mix come segue (proposta per una singola reazione):
Reagente Volume 10X One-Phor-All Buffer PLUS 3,6 microlitri DNasi I (0,2 U / ml) 3 microlitri - Aggiungere 6.6 ml di frammentazione Mix ai 30 ml di sscDNA.
- Spin e incubare a 37 ° C per 10 min, poi inattivare la DNasi I a 95 ° C per 10 min e tenere in ghiaccio. Aliquota 1 &# 181; l di cDNA frammentato per la verifica della distribuzione di dimensioni basati Agilent.
- sscDNA verifica distribuzione dimensionale (Figura 4C). Controllare distribuzione delle dimensioni sscDNA utilizzando un Bioanalyzer (Agilent). La granulometria delle cDNA frammentato deve essere tipicamente compresa tra 35 e 200 basi.
7. Etichettatura dei frammentati sscDNA
- Diluire il DLR-1a 7,5 mm a 5 mm di DEPC-acqua.
- Preparare una etichettatura Master Mix come segue (data per una singola reazione):
Reagente Volume 5x TdT Reaction Buffer 14 microlitri CoCl 2 (25 mm) 14 microlitri DLR-1a (5 mm) 1 ml Transferasi terminale (400 U / ml) 4.4 microlitri - Aggiungere 33.4 ml di mix di etichettaturaper ciascun campione di cDNA frammentato.
- Mescolare muovendo il tubo, girare brevemente e incubare a 37 ° C per 60 minuti, poi tenere su ghiaccio.
8. L'ibridazione di microarray HERV Chip
- Prewet il GeneChip HERV con 200 ml di preibridazione Mix (Affymetrix) e incubare a 50 ° C, 60 rpm, per 10 min.
- Preparare la miscela di ibridazione come segue (proposta per una singola reazione):
Reagente Volume Controllo Oligo B2 (3nm) 3.3 microlitri 20x eucariotico ibridazione di controllo 10 microlitri 2x Ibridazione Mix 100 microlitri 99,9% DMSO 17.7 ml - Aggiungere 131 ml di miscela di ibridazione a 69 ml di frammentazione e cDNA marcato a temperatura ambiente per effettuare una vo finalelume di 200 microlitri.
- Mescolare e denaturare per 2 min a 95 ° C, poi incubare a 50 ° C per 5 minuti e centrifugare a massima velocità per 5 min.
- Svuotare il HERV GeneChip prewetted e caricare la preparazione di destinazione 200 ml. Applicare difficili macchie sui due setti.
- Ibridare a 50 ° C, 60 rpm, per 18 hr.
- Dopo 18 ore, svuotare il GeneChip HERV e conservare la soluzione di ibridazione raccolte a 4 ° C. Riempire la matrice sonda con 250 microlitri tampone di lavaggio A. Se il chip non vengono eseguiti immediatamente sul fluidica, conservati a 4 ° C.
9. Lavaggio e colorazione
- Eseguire i Fluidics dalla barra dei menu GCOS. Nella finestra di dialogo Fluidics, selezionare la stazione di interesse (1-4), quindi selezionare Shutdown_450 per tutti i moduli, quindi eseguire. Immergere le 3 linee di aspirazione Tecnica pneumatica in acqua Milli-Q. Seguire le istruzioni sullo schermo LCD.
- Applicare il programma Prime_450 a tutti i moduli. Posizionare il tubo di tampone di lavaggio A inun flacone contenente 400 ml di tampone di lavaggio A, e quello per tampone di lavaggio B in un flacone contenente 200 ml di tampone di lavaggio B. Poi di nuovo, seguire le istruzioni visualizzate sul display.
- Sollevare e posizionare gli aghi macchia 600 microlitri cocktail 1 (SAPE Solution Mix) e 600 microlitri macchia cocktail 2 (Soluzione Anticorpi Mix) contenente microprovette alle posizioni # 1 e # 2, e 800 microlitri di matrice possesso di soluzione tampone alla posizione # 3 .
- Assegnare il chip diritto di ogni modulo, selezionare il protocollo FS450-004 ed eseguire ogni modulo, seguendo le istruzioni sullo schermo.
10. Scansione
- Scaldare il scanner GS3000. E 'pronto per la scansione quando la luce diventa verde.
- Applicare dure-spot sul setti per evitare perdite quindi caricare il chip nel caricatore automatico o in alternativa direttamente nello scanner. Avviare la scansione.
- Dopo la scansione del chip. File cel vengono generati. Controllare l'immagine e allineare la griglia al posto per identificare le cellule sonda (<strong> Figure 4D-F).
11. Analisi dei dati
- Il controllo di qualità. Fare riferimento alla norma Affymetrix controlli per verificare che i chip HERV-V2 soddisfano i criteri di QC. A questo scopo possono essere utilizzate le seguenti rappresentazioni: la distribuzione valore di intensità log (trame densità e box plot), la deviazione assoluta mediana (MAD) rispetto alla media intensità (MAD-Med) trame, le trame di fondo, l'errore standard normalizzato unscaled (Nuse) Trame e l'espressione di registro relativa (RLE) Trame.
- Normalizzazione. Inoltre, il set di dati dovrebbe essere esplorata per evidenziare gli effetti lotti inattesi e di correggerli prima analisi statistica. La pre-elaborazione dei dati comprende quindi una correzione del fondo (ad es. Sulla base del segnale di base sonda triptofano), seguita da RMA normalizzazione e riepilogo 15.
- Data mining e ricerca di geni differenziali espressi. Normalizzare le patatine e applicare un clusteri gerarchicoapproccio ng per esplorare il dataset (Figura 6A). Quindi, eseguire una ricerca di geni espressi in modo differenziale (DEG) utilizzando il classico un'analisi significativa dei microarray (SAM) Procedura di 16 seguito da un tasso di scoperta falso (FDR) Correzione 17. Si noti che questi passaggi siano pienamente integrati in alcune suite software di analisi come Partek GS, ma possono in alternativa essere eseguiti utilizzando il software statistico R 18 con i pacchetti del progetto Bioconductor 19. Dopo l'analisi statistica, filtrare il set di dati per escludere le probesets per i quali i valori di espressione sono meno di 2 6.
- Visualizzazione e interpretazione. Interpretare i risultati del microarray HERV-V2 in un'interfaccia dedicata utilizzando database di annotazione.
Representative Results
Il valore di studi trascrittomiche risiede principalmente nella qualità del materiale biologico di partenza. Se l'estrazione dell'RNA avviene in condizioni ottimali, l'RNA Integrity Number (RIN) è tipicamente 7 o superiore (Figura 4A). La necessità di ibridare 2 pg di cDNA sul chip Affymetrix HERV-V2 implica l'uso di un processo di amplificazione. Un procedimento di amplificazione di successo porta ad una distribuzione a campana (Figura 4B). Poi, DNAse1 frammentazione viene eseguita al fine di omogeneizzare la distribuzione dimensionale cDNA circa 100 nucleotidi prima ibridazione (Figura 4C). Dopo l'ibridazione e la scansione (Figura 4D), un controllo visivo dell'immagine permette di controllare se la griglia è ben allineata ai punti (Figura 4E) e se i controlli di ibridazione sono coerenti (Figura 4F). Questa fase è utile per escludere microarray in cui bolle d'aria o errori verificato durante l'esperimento.
Una volta che i chip sono passati QC (Figura 5) e dopo la normalizzazione, l'analisi statistica dei 5 match-pair tumorali e normali campioni di RNA prostata dall'Ospedale Lyon-Sud portato all'identificazione di 207 probesets HERV con i valori di espressione differenziale (p.val <0,05) (Figura 6A). Per sostenere questi record e di acquisire informazioni prostata-specifico, 35 campioni match-pair aggiuntivi (colon, ovaio, testicolo, mammella, del polmone e della prostata) sono stati aggiunti l'analisi e la procedura SAM-FDR (FDR = 20%) eventualmente individuato 44 della prostata specifiche probesets HERV. Tra questi, i più rilevanti 10 strutture HERV sono descritti (Figura 6B). Ulteriori studi clinici saranno necessari per valutare i valori di sensibilità e specificità di questi biomarcatori candidati.
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. Figura 1 Schema del procedimento complessivo dalla clinica (1: prostatectomia dal clinico e la preparazione del tessuto dal patologo) al banco (2-6: preparazione del campione, preparazione bersaglio, elaborazione microarray) conduce alla identificazione di biomarcatori candidati (7: analisi bioinformatica dei microarrays HERV). Gli acidi nucleici derivate da tessuto normale sono rappresentati in arancione e acidi nucleici derivati dalla zona tumorale sono costituiti da una miscela di normale (arancione) e specifica del tumore (nero) acidi nucleici. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
. Figura 2 Concezione e il contenuto del chip HERV-V2: sequenze HERVrecuperato dal genoma umano sono memorizzati in un database chiamato HERV-gDB3, poi le sonde candidati 25-mer passano attraverso una procedura di modellazione ibridazione dedicato (EDA +) prima di essere poi sintetizzato sulla matrice (risultanti sottoregioni mirate sono rappresentati per ciascun famiglia). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Manipolazione prostata dal patologo. (A) freschi prostatectomia radicale campione viene trasferito al laboratorio. (BC) La prostata è macchiato (verde sul lato destro, nero sul lato sinistro). (D) sezione trasversale grande della ghiandola sul lato posteriore. (E) Lasciando i margini intatti, pieces di tessuti vengono sezionati da diverse aree della ghiandola prostatica. (F) Nucleo del tessuto sono collocati in una provetta Eppendorf. (G) filo di sutura viene utilizzato per chiudere la prostata e per evitare distorsioni della ghiandola e un'interruzione minima del margine chirurgico. Poi, la prostatectomia radicale campione è pronto per la fissazione in formalina secondo la procedura usuale per l'analisi istologica. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Controlli Figura 4. Qualità della preparazione di acido nucleico e l'efficienza di ibridazione. (A) L'integrità dell'RNA, (B) cDNA target e (C) obiettivi frammentate utilizzati nella fase di ibridazione amplificato. ThESE tre controlli di qualità sono stati ottenuti con il Bioanalyzer utilizzando RNA chip nano e il saggio Eucariota Nano Serie II. (D) l'immagine complessiva del HERV-V2 zona ibridazione microarray dopo la scansione, (E) allargamento della fascia sinistra angolo mostrando griglia controlli di allineamento superiore e (F), allargamento della zona centrale che mostra avvistare i controlli di ibridazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 5. Elaborazione di segnali. (A) Affymetrix polyA picco-in controlli di amplificazione. Il polyA controlla Dap, Thr, Phe e Lys trascrizioni da B. geni subtilis sono spillo nel campione di RNA e servono per valutare il successo complessivo delle fasi di preparazione bersaglio. Intensità dovrebbe essere rilevata a valori decrescenti tra questi controlli spike-in per garantire che non vi era alcuna distorsione durante l'amplificazione WT-Ovation tra altamente e geni basso espresso. (B) Affymetrix spike-in controlli di ibridazione. Tali obiettivi isolato da E. coli e P1 batteriofago sono a spillo prima della procedura di etichettatura. L'aumento dei valori da BioB, Bioc, BioD e Cre indicano il successo globale del ibridazione. (C) distribuzione di intensità dei segnali di chip dopo RMA normalizzazione. La maggior parte dei probesets segnali presentano con valori inferiori a 2, 6 (sfondo), che indica l'espressione complessiva riservata principalmente ad alcuni loci HERV specifico. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 6. Analisi dei dati. (A) Analisi di clustering gerarchico dei campioni normali e tumorali. Partizionamento raggruppamento è stato applicato ai valori di espressione normalizzati utilizzando un algoritmo di funzione di distanza euclidea, raggruppando probesets in alto (rosso) - e giù (blu)-regolazione tra campioni normali e tumorali. (B) La selezione dei migliori 10 strutture HERV identificati come candidato biomarker del cancro alla prostata. Per ogni elemento HERV, la relativa famiglia HERV, le coordinate genomiche (NCBI 36/hg18) e una breve descrizione della struttura HERV sono date. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 7. Il repertorio HERV. (A) Il sequenziamento del genoma umano ha rivelato 25.000 geni codificanti proteine (esoni, 2%) e una quantità enorme di elementi trasponibili, tra cui 200.000 long-terminal repeat (LTR) retrotrasposoni (HERV, 8%). (B) estrapolazione da HERV-V2 contenuto del chip e dati di espressione associati (79 campioni provenienti da 8 normale rispetto a tipi di tessuti tumorali) indicano che un terzo del repertorio HERV è trascrizionalmente attivo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 8. Interpretazione funzionale dei segnali dal chip. (A) l'identificazione Promotore e controllo epigenetico: segnale negativo U3 (sonda rossa, 5'LTR) Rispetto al segnale positivo R-U5 (sonda blu, 5'LTR) suggeriscono U3-driven trascrizione, sostenuto dalla differente metilazione CpG (cerchi neri pieni) contenuto di U3 in peritumorale normale rispetto a tessuti tumorali. (B) strategia di splicing: la presunta busta 3.1 kb mRNA codificante espresso esclusivamente nel tumore viene identificato utilizzando SD1/SA2 giunzione giunzione sovrapposti sonda. * Evince dal confronto con altri tessuti non-placentare. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Discussion
Negli ultimi 10 anni, la maggior parte dei tentativi di misurazione espressione HERV hanno utilizzato tecniche di RT-PCR a concentrarsi su un locus specifico 20-24 oppure sulla base della relativa conservazione dei geni pol Per valutare le tendenze generali all'interno HERV generi 25,26 . Inoltre, amplificazioni PCR con primer altamente degenerati accoppiato con microarray a bassa densità destinati a rilevare e quantificare l'espressione di famiglie HERV 27,28. Al fine di rintracciare l'espressione del locus individuo all'interno di una famiglia, metodi basati sulla PCR di regioni conservate in combinazione con successiva clonazione e il sequenziamento abilitato elementi distinti trascrizionalmente attivi delle HML-2 29,30 o HERV-E4.1 31 famiglie a essere identificati. Finendo anche dalla clonazione e sequenziamento passi, la tecnica di monitoraggio espressione del genoma di ripetizione al fine di individuare i promotori tra ripetizioni identificati attivi HML-2 specifici LTR solitarie umani
Questo metodo è il primo tentativo di identificare l'espressione locus individualmente HERVutilizzando un microarray ad alta densità personalizzato basato sulla tecnologia Affymetrix. I vantaggi chiaramente identificati formato microarray di decifrare transcriptome HERV costituito da (i) l'esplorazione coordinata di diversi famiglie HERV e (ii) l'analisi simultanea e indipendente dalle regioni differenti per ciascun locus, ad es. Domini U3 e U5 per solista e LTR provirali, le regioni del bavaglio o env ed eventuali giunzioni di splicing associati alle strutture provirali, senza alcun a priori sulla funzionalità dell'elemento HERV. Le prospettive si basano su un miglioramento delle annotazioni negli strumenti di bioinformatica microarray associati. Ciò dovrebbe permettere di convertire i segnali di chip in ipotesi biologiche, ad esempio se HERVs attivi rappresentati in auto lncRNA trascrizione o modulano più o meno prossimale codifica l'espressione genica. Infatti, tale ipotesi è supportata da recenti studi che hanno identificato prostata cancro associato trascritti ncRNA contenenti componenti di vORF IRAL della famiglia HERV-K endogeno retrovirus o più parti di una regione del promotore LTR virale 37, così come due eventi gene di fusione ovvero HERV-K22q11-ETV1 e HERV-K17-ETV 38,39. Nel loro insieme, questo approccio intero trascrittoma combinata con la funzione LTR e splicing identificazioni strategia può aiutare a decifrare il marcatore contro gli elementi di innesco di espressione HERV a 40,41 croniche e le malattie infettive 42,43.
Disclosures
Questo lavoro è stato sostenuto da bioMérieux SA, la Hospices Civils de Lyon e l'agenzia pubblica francese OSEO (Diagnostica avanzata per nuovi approcci terapeutici, un programma finanziato dal governo francese dedicato alla medicina personalizzata). PP, VC, GO, NM, e FM sono dipendenti di bioMérieux SA. PP, NM e FM hanno presentato le domande di brevetto che coprono le conclusioni di questo lavoro.
Acknowledgments
Ringraziamo Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard e Bertrand Bonnaud per il loro contributo allo sviluppo iniziale e ottimizzazione del protocollo HERV-V2. Desideriamo inoltre ringraziare Hader Haidous per la sua guida su considerazioni etiche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
| DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
| Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
| DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
| Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
| GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
| 10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
| WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
| QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
| GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
| GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
| Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
| HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
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| HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |
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