Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

لا تزال وظيفة المولد الكبار الخلايا العصبية الثدييات منطقة نشطة للتحقيق. الإشعاع المؤين يمنع ولادة خلايا عصبية جديدة. استخدام الكمبيوتر الموجهة التصوير المقطعي بالإشعاع التنسيق (CFIR)، ثلاثي الأبعاد التشريحية للاستهداف فئات معينة من السكان السلف العصبية ويمكن الآن أن تستخدم لتقييم دور وظيفي من تكوين الخلايا العصبية الكبار.

Abstract

توصيف وظيفي للخلايا العصبية المولد الكبار لا تزال تمثل تحديا كبيرا. نهج لمنع تكوين الخلايا العصبية الكبار عن طريق تسليم الفيروسية الغازية أو حيوانات معدلة وراثيا لديها يفند المحتملة التي تجعل تفسير نتائج هذه الدراسات صعبة. أدوات الإشعاعية جديدة آخذة في الظهور، مع ذلك، أن تسمح لأحد للتحقيق noninvasively وظيفة مجموعات مختارة من الخلايا العصبية المولد الكبار خلال دقيقة ودقيقة استهداف التشريحية في الحيوانات الصغيرة. الإشعاعات المؤينة التنسيق يحول دون ولادة وتمايز الخلايا العصبية الجديدة، ويسمح استهداف مناطق محددة السلف العصبية. من أجل إلقاء الضوء على دور وظيفي المحتملة التي يلعب تكوين الخلايا العصبية طائي الكبار في تنظيم العمليات الفيزيولوجية، قمنا بتطوير تقنية التشعيع تنسيق موسع لمنع انتقائي ولادة الخلايا العصبية المولد الكبار في سماحة وسيطة طائي. نحن تصف طريقة لC omputer الموجهة التصوير المقطعيو ocal الأشعة تحت الحمراء (CFIR) تسليم لتمكين تشريحية دقيقة ودقيقة تستهدف في الحيوانات الصغيرة. يستخدم CFIR ثلاثي الأبعاد الحجمي التوجيه صورة لتوطين واستهداف جرعة الإشعاع، ويقلل من التعرض للإشعاع إلى مناطق الدماغ nontargeted، ويسمح لتوزيع جرعة امتثالي مع حدود شعاع حاد. هذا البروتوكول يسمح لأحد أن يسأل أسئلة بخصوص وظيفة الخلايا العصبية المولد الكبار، ولكن أيضا يفتح المناطق على الأسئلة في مجالات البيولوجيا الإشعاعية، البيولوجيا الورم، وعلم المناعة. وهذه الأدوات الإشعاعية تسهيل ترجمة الاكتشافات في مقاعد البدلاء إلى السرير.

Introduction

وقد أثبتت الاكتشافات الحديثة أن المخ لدى الثدييات الكبار يمكن الخضوع لدرجة كبيرة من المرونة. تتولد الخلايا العصبية المولد الكبار طوال فترة البلوغ في محاريب المتخصصة في أدمغة الثدييات 1. ما هي وظيفة هذه الخلايا العصبية المولد الكبار؟ وأكثر من ذلك، وأنها لا تلعب دورا في علم وظائف الأعضاء والسلوك؟ وقد ركزت الدراسات على هذا الموضوع تقليديا على المنطقة subventricular من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب من الحصين، ولكن الدراسات الحديثة قد تميزت تكوين الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى مثل منطقة ما تحت المهاد الثدييات 2. وقد تم الإبلاغ عن تكوين الخلايا العصبية في الهايبوتلاموس بعد الولادة والبالغين 2-10، وتبقى وظيفة هذه الخلايا العصبية طائي حديثي الولادة منطقة نشطة للتحقيق.

توصيف وظيفي للخلايا العصبية المولد الكبار لا تزال تمثل تحديا كبيرا للحقل علم الأعصاب بشكل عام. تثبيط انتقائي من المواصفاتIFIC لا يزال السكان السلف العصبية محدودة بسبب عدم وجود الواسمات الجزيئية المتاحة التي هي فريدة من نوعها لاحد السكان السلف العصبية 11. وبالتالي، لا يزال الحذف الانتقائي للخلايا العصبية المولد الكبار من هذه الأسلاف العصبية عبر استهداف الوراثية صعبة. وبالمثل، والتسليم الفيروسية لاستهداف الخلايا العصبية الكبار المولد يعاني من المتغيرات التباس محتمل مثل إدخال إصابة والتهاب في البيئة 12.

أدوات الإشعاعية جديدة آخذة في الظهور، مع ذلك، أن تسمح لأحد أن الالتفاف على هذه يفند والتحقيق في هذه الأسئلة من خلال دقيقة ودقيقة استهداف التشريحية في الحيوانات الصغيرة. الإشعاع المؤين يمنع ولادة وتمايز الخلايا العصبية الجديدة، ويسمح أسلوب موسع لاستهداف السكان السلف العصبية 13-15. في الآونة الأخيرة، وصفنا منطقة جرثومي من سماحة متوسط ​​طائي الثدييات (ME) أننا يسمى منطقة التكاثري طائي (HPZ) 2 2. لاختبار ما إذا كان تكوين الخلايا العصبية الكبار داخل ME طائي ينظم عملية التمثيل الغذائي والوزن، وسعينا لتعطيل هذه العملية. وسماحة وسيطة هو بنية صغيرة من جانب واحد في قاعدة البطين الثالث من الهرمونات التي تم إصدارها التنظيمية. من أجل تمنع انتشار وتكوين الخلايا العصبية اللاحقة دون تغيير وظائف فسيولوجية أخرى من هذه المنطقة في الدماغ، قمنا بتطوير تقنية التشعيع تنسيق موسع لمنع انتقائي ولادة الخلايا العصبية الكبار المولود حديثا في فضيلة متوسط ​​طائي 2.

وهناك عدد من الجماعات استخدمت الأشعة لقمع الخلايا العصبية في مناطق الكنسي 14-28. ومع ذلك، النهج الإشعاعية السابقة استهدفت بشكل عام مناطق واسعة، أو ofteن غير قصد استهدفت أيضا مناطق الدماغ متعددة حيث تم الإبلاغ عن تكوين الخلايا العصبية، مما يجعل من الصعب ربط بشكل لا لبس فيه أي عيوب السلوكية لاحظ مع عيوب في فئات معينة من السكان السلف العصبية. يتم توفير القدرة على التشعيع أكثر استهدافا من قبل منصات الإشعاعية التي تجمع بين ج omputer التصوير المقطعي الموجهة مع ocal و شعاع الأشعة تحت الحمراء (CFIR) تسليم لتمكين تشريحية دقيقة تستهدف 29-36. تتوفر لاستهداف السكان السلف العصبية محددة 35 الحزم الإشعاع صغيرة مثل 0.5 ملم في القطر. هذه المنهجية يسمح لنا لاستهداف ME طائي واعتقال ومنع انتشار الخلايا العصبية في الحيوانات الصغيرة. بعد العلاج الإشعاعي على هؤلاء السكان السلف والاختبارات الفسيولوجية والسلوكية لا يمكن أن يؤديها لإلقاء الضوء على وظيفة محتملة للخلايا المولد الكبار. استهداف التنسيق مهم بشكل خاص لطلبنا منذيقع الغدة النخامية على مقربة من سماحة متوسط ​​طائي؛ تشعيع الغدة النخامية قد تؤثر على وظيفة الهرمونية وبالتالي إرباك النتائج.

الأساس البيولوجي لقمع الخلايا العصبية تشعيع التالية لا تزال غير واضحة. وقد اعتمدت الدراسات السابقة على الإشعاع الحزم مساحة واسعة، وخلصت إلى أن قمع الخلايا العصبية وتوسطت من خلال استجابة التهابية 14، 37. على هذا النحو فإنه من غير الواضح ما إذا كانت أشعة محورية للغاية يمكن قمع الخلايا العصبية، لأنها لا تستثير الاستجابة الالتهابية كبيرة. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا من قبل مجموعتنا في المنطقة العصبية في قرن آمون الكلاسيكية التي تشعيع التنسيق للغاية مع جرعة من 10 غراي يمكن قمع تكوين الخلايا العصبية لمدة 4 أسابيع على الأقل بعد التشعيع 35.

لاستجواب وظيفة الخلايا العصبية المولد الكبار طائي في سماحة وسيطة، ونحن نستخدم الإشعاع الدقة دevice القادرة على إيصال جهاز التصوير الطبقي في تركيبة مع أشعة الإشعاع صغيرة القطر لمنع تكوين الخلايا العصبية ME. باستخدام أنبوب الأشعة السينية تعلق على العملاقة التي تدور على مجموعة من 360 درجة، ونحن تقديم قوس شعاع شعاع الإشعاع الجزئي مع استخدام مرحلة عينة تسيطر آليا يسمح تناوب لموضوع الحيوان خلال فترة العلاج الإشعاعي (الشكل 1) . ويستخدم عالية الدقة للكشف عن الأشعة السينية للحصول على الصور عند الهزال هو في وضع أفقي 33. لهذه الدراسة، تم بناؤها الصور المقطعية مع حجم فوكسل الخواص من 0.20 ملم. على متن التصوير المقطعي يسمح بتحديد هدف في حين أن الحيوان هو في موقف العلاج. وكان مترجم الهدف باستخدام CT الملاحة تخطط جرعة البرمجيات، والتي تم تضمينها مع منصة الإشعاعية المتاحة تجاريا لدينا. بعد إضفاء الطابع المحلي على العائد على الاستثمار لدينا عن طريق التصوير CT، تم نقل الحيوان إلى موقف العلاج المناسب من قبل عينة المرحلة الروبوتية التي لديها أربعة ديجريس الحرية (X، Y، Z، θ). من خلال الجمع بين العملاقة والمرحلة الروبوت الزوايا، يمكن أن يتم تسليم الحزم من أي اتجاه نحو النسبية للحيوان، والعلاجات مثل قوس المجسم ممكنة 29. لهذه وجميع الدراسات التصوير الأخرى، تم وضع الفئران في جهاز الشلل الذي يسمح توصيل الغاز isoflurane ومخدر أثناء تقييد الحركة. السرير هو الشلل CT متوافقة، ويربط إلى مرحلة عينة الروبوتية 34.

ونحن نتوقع أن CFIR سيوفر التقدم المفاهيمي في عدد من المجالات البحثية. على الرغم من أننا استخدام الاستهداف الإشعاعية من سماحة متوسط ​​طائي كدليل على مبدأ هذه التقنية، ويمكن استخدامها لاستهداف CFIR أي منطقة من جسم أي كائن نموذج صغير من حيث المبدأ. في العلوم العصبية، على سبيل المثال، ونحن نتصور يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم وظيفة السكان السلف التكاثري بنشاط التي اقترحت لEXIS ر في أجهزة محيطة بالبطينات أخرى، مثل منطقة postrema 38، 39، 40 الجهاز تحت القبو، والغدة النخامية 41. الخلافات منذ فترة طويلة بشأن دور وظيفي من تكوين الخلايا العصبية الكبار وتحديد دور سببية في السلوك يمكن الآن أيضا أن تعالج على نحو أفضل. في الطائر المغرد، وهذا الأسلوب قد تناول دور الخلايا العصبية الكبار في الحفاظ على السلوك قوية والموسمية من أصوات العصافير 42، والتي تم تعوقها القدرة على تثبيط انتقائي الخلايا العصبية في مناطق محددة في الدماغ. فهم هذا النموذج السلوكي قوية قد تلقي نظرة جديدة في دور تكوين الخلايا العصبية الكبار في تنظيم السلوكيات ديمبرافيك جنسيا الأخرى. بدلا من ذلك، في مجال التمثيل الغذائي، CFIR يمكن استخدامها لاستكشاف جوانب دور انتشار الكبدية ودورها في عملية التمثيل الغذائي وتوازن الطاقة. ومما يعزز إمكانية التقدم المفاهيمي في المجالات البحثية متعددة من خلال إدخال هذه التقنية.

= "jove_content"> في هذه الورقة، ونحن لشرح قدرات CFIR لالتشريحية دقة الاستهداف لتشعيع شعاع التنسيق. على الرغم من أننا وضعت في البداية منصة الأبحاث هذه الأشعة الحيوانات الصغيرة (SARRP) لدراساتنا، وأجهزة أخرى مماثلة هي الآن متاحة تجاريا التي يمكن أن تنجز مماثلة موجهة CT التشعيع التنسيق 43، 44. وبالتالي، فإننا تعميم هذا البروتوكول CFIR مع الخطوات المطلوبة لجميع منصات البحوث بدلا من تلك المحددة لSARRP. مزايا CFIR على النهج الإشعاعية السابقة لمنع تكوين الخلايا العصبية هي التي تسمح هذه التقنية ثلاثية الأبعاد الحجمي التوجيه صورة لتوطين واستهداف جرعة، جرعة امتثالي يقلل التعرض للمناطق الدماغ nontargeted، والهندسة عالية الدقة شعاع يسمح لتوزيع جرعة امتثالي مع حدود شعاع حاد. نحن الخطوط العريضة لكيفية استخدام التصوير المقطعي الموجهة لاستهداف الجرعة إلى منطقة تشريحية محددة، وعند القيام بذلك، وكيفية تصور الإشعاعجرعة التوزيع مباشرة في الأنسجة باستخدام تلطيخ المناعى للγ-H2AX، علامة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل 35، 45-48. استخدام هذا النهج لتشعيع انتقائي من محاريب العصبية قد تكون لها آثار كبيرة في الكشف عن الدور الوظيفي للخلايا عصبية جديدة المولد الكبار في علم وظائف الأعضاء والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

استخدام الحيوان

الحصول على موافقة من لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية للرعاية القياسية واستخدام البروتوكولات. تم تطوير البروتوكول الحالي للدراسات التشعيع التنسيق على 5،5 حتي 10 أسبوع من العمر الفئران الكبار C57BL6 / J، و(الشكل 2) 2 الموصوفة سابقا. ومع ذلك، شريطة الأعمار الأخرى، ويمكن أيضا أنواع الحيوانات الصغيرة (الفئران، والفئران البيضاء والسناجب الأرضية، الخ) يمكن استخدامها، أن بروتوكولات التخدير فعالة والأطلس مرجعا الشعاعي السماح تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) متاحة.

1. معايرة منصة الإشعاعية CT الموجهة

أداء المعايرة على أساس فيلم عن جرعة الإشعاع على منصة الإشعاعية مقدما لكل حجم تلسكوب الموازاة ونوع الأشعة السينية أنبوب التصفية المستخدمة. من أجل استهداف شعاع قوس التشعيع في موقع الهدف المطلوب، استخدام الإشعاع البرمجيات الجرعة والتخطيط 49 المتوفرهه على معظم المنصات التجارية لحساب الإشعاع المطلوبة التسليم في الوقت المحدد يعتمد على جرعة الاشعاع، وعمق المنطقة ذات الاهتمام (ROI) على أساس الأشعة المقطعية من الفأرة، وسرعة دوران منصة روبوتية، ويتم ترك التفاصيل حول هذا الخروج من هذا البروتوكول لأنها تختلف بين منصات الإشعاع. لأغراض تصور ما تحت المهاد ventrobasal 2 (الشكل 3) مع التصوير CT، تشغيل أنبوب الأشعة السينية مع بقعة التنسيق 0.4 ملم والطاقة شعاع من 100 KVP مع 1 مم آل الترشيح. لتشعيع المحورية في HPZ، تشغيل أنبوب الأشعة السينية في 225 KVP، 13 أمبير، وبقعة الوصل 1 ملم مع الترشيح من 0.15 ملم النحاس، لتقديم 10 جراى من الإشعاع على عمق الأنسجة من 0.6 سم على العلاج الوقت 4.6 دقيقة. وسوف تستهدف بين مختلف رويس تتطلب حساب معلمات مختلفة.

  1. إذا دراسة آثار اتباع نظام غذائي عالي الدهون على الخلايا العصبية في سماحة وسيطة كما هو موضح سابقا 2، يجب الحصول C57B الإناث من العمر أربعة أسابيعالفئران L6 / J من مختبرات جاكسون ماوس، ومنزل أربعة الفئران في قفص. التبديل الطعام من تشاو الطبيعي أن اتباع نظام غذائي عالي الدهون في خمسة أسابيع من العمر. تسمح الفئران ليتأقلم مع سكنية جديدة والغذاء. أداء العلاج CFIR عند 5.5 أسابيع من العمر. يخضع النقل لغرفة العمليات الذي يحتوي على منصة الإشعاعية. تقليل مستويات الإجهاد أثناء النقل. إعداد غرفة التخدير isoflurane والغاز. ثم، إضافة ماوس واحدة في الغرفة. في موازاة ذلك، إعداد سادة التدفئة (إعداد منخفض) لمرحلة ما بعد المعاملة.
  2. مرة واحدة الماوس تحت والتي لم تعد تستجيب لضغط القدم وسادة، وجلب هذا الموضوع إلى منصة الإشعاعية ووضع على السرير الشلل في المرحلة الروبوتية. وضع الموضوع ضمن الفم التخدير كأس مخروط الأنف، والأسنان في الحرس دغة (1D الشكل). وضع الماوس مسطحة على السرير الشلل وتحقق لمعرفة ما اذا كان لا يزال للحفاظ على تجاوب. إذا كان الأمر كذلك، الشريط أسفل الماوس إلى السرير مع الشريط الشاش. في حين ربط الشرائط أسفل الماوس إلى السرير، تأكد من أن يتم تسوية الرأس إلى مستوى أفقي. هذا يمكن تحديده من خلال سحب ما يصل الآذان ورؤية إذا ما وجهت لها. مرة واحدة على الماوس هو في الموضع الصحيح، أغلق درعا واقيا من الرصاص.
  3. الحصول على فحص الكمبيوتر التصوير المقطعي باستخدام البرمجيات على متن منصة المجرب والإشعاعية (وهذا سوف تختلف بين الأنظمة الأساسية)، والذي سيوفر المسح الهيكلي التشريحية ثلاثية الأبعاد من الفأرة الموضوع. تحقق لمعرفة ما إذا كان تعادل الرأس الماوس إلى المستوى الأفقي. إذا لم يكن كذلك، كرر الخطوات من 1،2-1،3 حتى يتم تسوية الرأس في هذا الموضوع.
  4. تحديد العائد على الاستثمار من قبل CT الصورة. حساب المسافة من العائد على الاستثمار على سطح الجمجمة باستخدام زاوية 45 درجة إلى المستوى الأفقي كما هو مبين في الشكل 3E.
  5. باستخدام البرمجيات على متن، واتخاذ الأشعة السينية من الفأرة الموضوع من فوق كما هو موضح في الشكل 4A. ثم، وإزالة الماوس من منصة الإشعاعية، وطرح على وسادة التدفئة، ومراقبة حتى نشطة.
  6. من الصور المقطعية الاكليلية، وحساب متوسط ​​عمق ROI التشريحية لا تقل عن ثلاثة فئران من أجل تحديد الجرعات التسليم. كمثال من دراسة سابقة 2 حيث كانت تدار 10 جراى من أشعة لمنطقة ما تحت المهاد ventrobasal، وعمق من العائد على الاستثمار من الجمجمة (من زاوية 45 درجة) هو 0.66 سم (انظر الشكل 3E). مع العلم أن استخدم الباحثون برنامج التخطيط جرعة (DPS) المثبتة على برامجهم الإشعاعية لحساب سرعة دوران المناسبة ومدة العلاج لتحقيق الجرعة المطلوبة إلى العائد على الاستثمار.
  7. بعد تحديد مدة العلاج وسرعة دوران للمرحلة الروبوتية مع برنامج جرعة التخطيط وقياس توزيعات جرعة من المعلمات المحسوبة مع الأفلام الحساسة للإشعاع GAFchromic جزءا لا يتجزأ من البلاستيك نموذج الفأر وهمية يعادل في الماء. للقيام بذلك، تضمين ثلاثة أفلام للإشعاع الحساسة GAFchromic بين أربع كتل بلاستيكية مكدسة رأسيا في الماء ما يعادل 29 كماهو مبين في الشكل 4B.
  8. وضع نموذج الفأر وهمية تحتوي على أفلام GAFchromic على خشبة المسرح الروبوتية، وتشغيل تشعيع شعاع التنسيق مع المعلمات المحسوبة حديثا. على سبيل المثال، لاستهداف ventrobasal تحت المهاد، وإدخال المعلمات من 0.15 ملم مرشح النحاس، KVP 225، 13 أمبير، 1 ملم الإعداد الإشعاع شعاع قطره، 45 درجة زاوية العملاقة، 1.3 ° / ثانية التناوب، و 4.6 دقيقة لتحقيق العائد على الاستثمار الجرعة الإشعاعية من 10 غراي.
  9. بعد التشعيع، والتحقق من الأفلام لنمط وكثافة جرعة الإشعاع. ل360 درجة زاوية دوران مع المعلمات المدرجة لاستهداف منطقة ما تحت المهاد ventrobasal، حلقة مظلمة في الفيلم فوق مركز التساوي، بقعة هش صغير في فيلم مركز التساوي، وحلقة أخف وزنا في الفيلم دون مركز التساوي المقابلة لمخروط وسيراعى في إدارة شعاع من أشعة (الشكل 4B).
  10. ركب الفيلم GAFchromic مركز التساوي على الأشعة السينية من الموضوعات الماوس من المعلمات التي كانت كالculated. النقطة المحورية المشع في مركز التساوي ينبغي أن تتداخل مع المنطقة ROI المطلوب كما هو مبين في الشكل 4C.

طريقة بديلة: إذا استمرت صعوبة في استهداف ROI الدماغ، واستخدام اليود على النقيض حقن intrathecally لتعزيز التصور من البطينين تحت الصور المقطعية. من أجل الإيجاز، يتم ترك هذا الإجراء للخروج من هذا البروتوكول، ولكن سبق وصفها 35، 50. وسوف توفر اليود على النقيض معالم البطين إضافية (الشكل 5A).

2. تحديد دقة تشعيع شعاع

مزيد من تأكيد CFIR دقة شعاع بواسطة رؤية مباشرة من شعاع الإشعاع في الأنسجة 2، 35، 51. للقيام بذلك، قم المناعية للكشف عن γH2AX 51، وهو بروتين هيستون وعلامة مبكرة من فواصل حبلا الحمض النووي المزدوج. المواضيع الماوس يجب perfused transcardially وثابتة في غضون ساعة واحدة من الإشعاع. irradi التاليةأوجه، وإصلاح الحمض النووي بسرعة تستتبعه، ومستويات ΥH2Ax يقلل كثيرا 35.

  1. كرر الخطوات من 1،1-1،3.
  2. بعد تحديد الهدف على CT، يتم نقل الماوس يخضع تحت السيطرة الروبوتية لمواءمة هذا الهدف مع التسليم شعاع الإشعاع. إدخال المعلمات المحسوبة (سرعة دوران وطول فترة العلاج لتحقيق الجرعة المطلوب) من الخطوة 1.6 في صناعة البرمجيات الجرعة والتخطيط والبدء في العلاج. يتم تسليم المعاملة مع أشار العملاقة إلى 45 درجة من رأسي بينما تدور الماوس حول محور موجه عموديا.
  3. بعد التشعيع، نفذ نضح transcardial على المواضيع الماوس. أداء نضح في غضون ساعة واحدة 52. التالية العقول التروية، الإصلاح الغمر في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني وصخرة بلطف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. في صباح اليوم التالي، وغسل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 3X لإزالة تثبيتي بارافورمالدهيد. ثم، تزج في السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني 1X على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
  5. صخرة بلطف عند 4 ° C (لنامثير جنسيا 12-16 ساعة)، حتى يغرق الدماغ إلى أسفل الأنبوب. هذا بمثابة خطوة cryoprotection. مرة واحدة تغرق العقول، وإزالة الدماغ مع ملعقة مثقوبة لمنع 30٪ sucrose/1x نقل PBS الزائدة. تضمين بسرعة في تجميد المتوسطة على الثلج الجاف. دوامة تجميد المتوسطة مع ماصة طرف ومواءمة الدماغ في قالب من البلاستيك.
  6. مرة واحدة مجمدة تماما، ونقل كتل الدماغ إلى -20 ° C الثلاجة لمدة التخزين.
  7. في اليوم عندما سيتم تنفيذ المناعية، قسم coronally في 40 ميكرون سمك، وتطفو الى 24 لوحة جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني مع الفرشاة رقيقة. يجب أن تبقى المقاطع في النظام التسلسلي الصحيح لالمناعية لتحديد التغطية تشعيع المنطقة المستهدفة.
  8. Prewarm 0.01 M حل سيترات الصوديوم إلى 80 درجة مئوية في حمام مائي استعدادا لخطوة استرجاع مستضد. في وقت واحد، في حين أن سيترات الصوديوم وارتفاع درجات الحرارة، نفذ 5 دقائق يغسل 3x أخرى في 0.01 M برنامج تلفزيوني.
  9. مرة واحدة حل سيترات الصوديوم هو في 80 درجة مئوية، ويغرق أقسام الدماغ طن حل العازلة سيترات الصوديوم. ترك في حمام الماء عند 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  10. إزالة القسم والسماح حل سيترات الصوديوم للوصول إلى درجة حرارة الغرفة، ثم نفذ ثلاثة يغسل 5 دقائق في 0.01 M برنامج تلفزيوني.
  11. منع أقسام الدماغ لمدة 1 ساعة في برنامج تلفزيوني-تريتون تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادية.
  12. احتضان أقسام الدماغ بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني-تريتون تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي مع تركيز 1:700 الماوس المضادة للالفوسفات-H2AX الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية.
  13. في اليوم التالي، نفذ 15 دقيقة يغسل 3x أخرى في 0.01 M PBS-تريتون.
  14. احتضان أقسام الدماغ PBS-تريتون تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي مع الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق مع 488 نانومتر fluorphore في تركيز 1:500 لمدة 2 ساعة.
  15. أداء 15 دقيقة يغسل 3x أخرى في 0.01 M PBS-تريتون.
  16. أداء 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) وصمة عار (1:5،000 في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقيقة لتصور النواة. ثم، وغسل أقسام الدماغ لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
  17. جبل على الفصل كهربيةالمجهر arged الشرائح من قبل القسم العائمة في برنامج تلفزيوني. تمحو PBS الزائدة وتسمح الشرائح لتجف. ساترة الشرائح باستخدام تصاعد المتوسطة وتسمح الشرائح لتجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  18. التقاط صور لأقسام الاكليلية المسلسل مع المجهر الفلورسنت. ΥH2Ax المناعية (الأخضر) يشير موقع التشعيع. دابي (الأزرق) هو وصمة عار النووي (الشكل 5B).

3. إعداد الموضوعات ماوس لتشعيع البؤري

دراسة النتائج المناعية ΥH2Ax. راض مرة واحدة مع معايرة واستهداف شعاع الإشعاع، المضي قدما في التجربة. عند هذه النقطة، فان مجموع الوقت المطلوب لعلاج ماوس (من الإعداد الحيوان إلى الانتهاء من تسليم شعاع) هو حوالي 10-15 دقيقة لعلاج 10 جراى مع 1 ملم شعاع.

  1. تأمر إناث الفئران من العمر أربعة أسابيع C57BL6 / J من مختبرات جاكسون ماوس. منزل أربعة الفئران في قفص، والتحول الغذائي من تشاو العاديةإلى اتباع نظام غذائي عالي الدهون في خمسة أسابيع من العمر. الفئران الأذن لكمة لمنحهم علامات تحديد فريدة من نوعها. مراقبة صحة الفئران يوميا. ملاحظة: علامات معدنية لا يمكن أن تستخدم لأنها سوف تؤدي إلى streaking التحف على CT.
  2. وزن الفئران في اليوم قبل العلاج الإشعاعي أو صورية. الفئران انقسم الى مجموعتين للإشعاع أو العلاج صورية وضمان أنه لا يوجد فرق كبير في الوزن بين الأفواج. في يوم من العلاج، وعند الفئران ستة أسابيع من العمر، reweigh جميع الفئران وتسجيل كتلتها. نقل بلطف كل من الأفواج إلى منصة الإشعاعية. الحرص على تقليل مستويات التوتر.
  3. إعداد غرفة التخدير isoflurane والغاز. تخدير الفئران اثنين، واحد في المجموعة تشعيع محددة سلفا، وآخر في السيطرة على المجموعة صورية. إعداد سادة التدفئة المنصوص عليها في إعداد منخفض لتلقي العلاج بعد العملية الجراحية.
  4. اتبع الخطوات من 1،2-1،4 عن الماوس لتلقي التشعيع. للفأر صورية، والحفاظ على الماوس في غرفة التخدير أثناء العلاج يجري. جعل سوره أن غرفة التخدير بالقرب من منصة CFIR بحيث يتم يؤخذ أي آثار الإشعاع على البيئة المحيطة. بعد أن يتم تحديد الهدف على CT، تحريك الماوس يخضع تحت السيطرة الروبوتية لمواءمة هذا الهدف مع التسليم شعاع الإشعاع. يحسب إدخال المعلمات (سرعة دوران وطول مدة العلاج) في صناعة البرمجيات جرعة التخطيط.
  5. مرة واحدة المعالجة بالإشعاع كاملة، والعودة على حد سواء صورية والفئران المشع لسادة التدفئة، ومراقبة حتى يستيقظ.
  6. عودة كل من الشام والفئران المشع إلى مرفق الحيوان. رصد كل يوم. وزن الفئران كل نصف الأسبوع. لتأكيد تشعيع استهدفت منطقة التكاثري طائي، إدارة الحقن داخل الصفاق من BrdU (50 ملغ / كلغ) ثلاثة أيام بعد العلاج ودراسة الخلايا العصبية بين الجماعات التي كتبها colabeling من المناعية للBrdU وعلامة العصبية شهر واحد بعد التعرض BrdU الأولية (الشكل 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم الاستهداف CT الموجهة ودقة

معايرة الميكانيكية للنظام هو أمر حاسم لضمان أن الحزم من زوايا مختلفة في جميع تتقاطع في نقطة واحدة. وقد أنجز المعايرة مع الأسلوب القائم على التصوير شبه التلقائي، حيث تم قياس دقة المحاذاة نهاية إلى نهاية ليكون 0.2 مم 29. هذه الدقة أمر بالغ الأهمية للغاية، حيث بلغ حجم هيكل سماحة متوسط ​​طائي صغيرة 2. لاختبار هذه المعايرة، قمنا بقياس توزيعات الجرعة مع الأفلام الحساسة للإشعاع GAFchromic جزءا لا يتجزأ من البلاستيك نموذج الفأر وهمية ما يعادل 35 في الماء (الشكل 4B). لفترة وجيزة، أجري مسح CT-من الفأرة الموضوع، وحددت لدينا ventrobasal طائي الموقع المستهدف. حسبت التسليم وسرعة دوران، وكانت تعلق على الموازاة والترشيح المناسبة لضمان تم تسليم 10 جراى من الإشعاع. نموذج الفأر وهمية مصممة من-يعادلها المياه ثم تم استبدال الهيكل ر البلاستيك جزءا لا يتجزأ مع الأفلام الحساسة للإشعاع GAFchromic للفأر الموضوع الحقيقي لقياس توزيع الجرعات في طائرات التنسيق المختلفة. ويبين الشكل 4B نتائج نهاية إلى نهاية الاختبار من العلاج القوس مع شعاع 1 ملم القطر باستخدام الأفلام GAFchromic في منصة وهمية الفأر. تم تعيين العملاقة في زاوية 45 درجة مع الاحترام لنموذج الفأر وهمية في حين تناوب المرحلة عينة الروبوتية حول محور موجه عموديا، وتوليد "قوس" أو مخروط من الإشعاع. العرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM) هو 2.31 ملم، والتي هي أكبر من 1.0 ملم منذ أقواس تؤثر على الفيلم في زاوية. نظريا حجم شعاع في هذه الزاوية يجب أن يكون 2.0 مم. بقعة شعاع التنسيق هو مبين في الشكل 4 يوضح محاذاة الدقة من الحزم من اتجاهات مختلفة. هذا الفيلم يمكن مضافين على رأس الفأر الموضوع الحقيقي، مما يدل على موقف الحزم والدقة (الشكل 4C).

e_content "> باستخدام 1 مم شعاع تلسكوب الموازاة، تم استخدام تقنية قوس لتسليم 10 جراى إلى النقطة المستهدفة في منطقتنا الماوس الموضوع. القياسات السابقة 29 تشير إلى أن هذا الأسلوب يوفر جرعات منخفضة جدا من الإشعاع (<0.1 جراى) خارج 1 مم الهدف. وبالتالي محمية وتبلغ مساحة الغدة النخامية والهياكل المحيطة بفعالية من أشعة محورية في منطقة ما تحت المهاد ventrobasal. تم قياس دقة استهداف شعاع في دراسات سابقة أن يكون في حدود 0.2 مم في كل من اختبارات الوهمية 29 و 35 أقسام الأنسجة .

في حين ليس مطلوبا، CT الموجهة استهداف العائد على الاستثمار يمكن أن تتعزز حقن النقيض اليود داخل القراب لتعزيز CT موجهة تستهدف لتطبيق دماغنا (الشكل 5A). لأن هذا هو إجراء الغازية ومرهقة، لا يتم استخدام هذا التناقض في كثير من الأحيان، وليس وصفها في هذا البروتوكول. التفاصيل لهذا البروتوكول يمكن العثور عليها في فورد وآخرون. 2011 Chaichana وآخرون 2007. مزايا هذا التناقض معالجتها باليود هي أن البطينين الوحشي والثالث وتصور بوضوح في الأشعة المقطعية حصلت على منصة الإشعاعية CFIR (الشكل 5A). وكان الهدف من سماحة وسيطة، في قاعدة البطين الثالث، وحددت باستخدام برنامج الملاحة بالتوجيهات CT والمستوردة تلقائيا في واجهة الروبوت لتحديد المواقع. وقد تم تحديد الهياكل العظمية في الجمجمة واستخدامها كأداة المعالم التشريحية للدراسات اللاحقة حيث لم يعمل اليود على النقيض.

شعاع استهداف التحقق مع γ-H2AX

لمزيد من تأكيد لدينا استهداف ME طائي موجهة CT، ونحن تصور 1 ملم تشعيع شعاع في الأنسجة عن طريق الفحص غير المباشرة للفواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل التي تنشأ تشعيع التالية. وفسفرته H2AX البروتين هيستون بعد الحمض النووي المزدوج فواصل حبلا. وقد γ-H2AX تستخدم على نطاق واسع في الدماغ والأنسجة الأخرى 46 -48، وعدد γ-H2AX بؤر + يبدو أنها تتطابق جيدا مع جرعة الإشعاع على مجموعة واسعة من الجرعات 51، 53. لاحظنا التصور واضحة من الحزم التالية γ-H2AX المناعية (الشكل 5B). أظهرت الناتجة γ-H2AX تلطيخ الاستهداف الدقيق للمكان المتوقع. كان على حافة شعاع أيضا حادة للغاية، وذلك بالاتفاق مع الفيزياء القياسات التكليف القائم على الفيلم التي تشير إلى غبش 20-80٪ من 0.3 ملم 54. قمنا بقياس سابقا المسافة بين الهدف المقصود ومركز شعاع كما تصور في أقسام الأنسجة 35. ويقابل مركز شعاع من الهدف المقصود لمسافة متوسط ​​0.19 ± 0.36 ملم (الانحراف المعياري) في 10 الفئران المعرضة للإشعاع بعد العوملة للآثار انكماش الأنسجة أثناء التثبيت وتجهيز 35.

باستخدام علاج مثل قوس المجسم يتألف من قوس عند 45 درجة من رأسي، ونحنتظهر كنا قادرين على استهداف فعال تحت المهاد ventrobasal، دون تشعيع محاريب العصبية الأخرى (أرقام 5C-D). كان التشعيع من المناطق المحيطة بها الحد الأدنى، وكان هناك في حدود التعرض للإشعاع كما يتبين من الفيلم GAF-الكروم (الشكل 4B) وγ-H2AX المناعية (أرقام 5B-D). الظهرية الأنسجة إلى طائي ME يظهر ضوء γ-H2AX تلطيخ (الشكل 5B) لأن أشعة الإشعاع تدخل عن طريق هذه المنطقة وأيضا ربما بسبب تعزيز من العظام تتراكب على الرغم من أن من الصعب نسبيا شعاع الأشعة السينية استخدمت (225 KVP، 0.15 ملم النحاس الترشيح).

الآثار على تكوين الخلايا العصبية

على تأكيد خصوصية لدينا موجهة CT تسليم التشعيع، درسنا تأثير 10 جراى من أشعة على مستويات ME تكوين الخلايا العصبية. تم تغذية فئران بالغة اتباع نظام غذائي عالي الدهون وتلقت العلاج الإشعاعي أو صورية، ومن ثم في وقت لاحقحقن BrdU كما هو موضح سابقا ابتداء من الساعة 6 أسابيع من العمر 2. تم التضحية الفئران للفحص في 10 أسابيع من العمر، بعد شهر من الحقن BrdU الأولى. المشع فئران بالغة HFD التي تغذيها عرضت ~ 85٪ تثبيط تكوين الخلايا العصبية ME مقارنة مع الضوابط المعالجة الصورية (الشكل 6A) 2. تم فحص النواة المقوسة، وهيكل المجاورة المطلة على موقع التشعيع، لإجراء تغييرات في تكوين الخلايا العصبية، ووجدت لديهم اي فروق ذات دلالة إحصائية بين الحيوانات المعرضة للإشعاع والضوابط صورية (الشكل 6A) 2.

وظيفة من ولد الكبار متوسط ​​سماحة طائية الخلايا العصبية

تم فحص التغيرات في الفئران المعرضة للإشعاع والشام بعد العلاج. معطف الفرو والاستجابة للمس ظهر العادية. تم فحص لجنة الكيمياء وكاملة لوحة العد الدم أسبوع واحد بعد العلاج بالإشعاع، وأنه لم يلاحظ أي فرق معنوي (ن = 9/group). في ارتفاع الدهون التي تغذيهاالفئران حيث لاحظنا انخفاضا ~ 85٪ في الخلايا العصبية ME المولد الكبار شهر واحد بعد التشعيع (الشكل 6A)، قد انخفض الفئران المشع زيادة الوزن مع مرور الوقت بالمقارنة مع مجموعة صورية المعالجة (الشكل 6C). في المقابل، طبيعية تشاو تغذية السيطرة على الفئران، حيث كانت مستويات الخلايا العصبية وحظ من ME أقل بكثير من نسبة عالية من الدهون نظرائهم تغذية 2، لم يكن لديهم فروق ذات دلالة إحصائية في الوزن بين صورية مقابل الجماعات المشع (الشكل 6B). ومن المثير للاهتمام، ويرافق هذه الزيادة في الوزن في خفض المشع عالية من الدهون الفئران التي تغذيها التغيرات في التمثيل الغذائي والنشاط كما هو موضح سابقا في التفاصيل التي لدينا مجموعة 2 (أرقام 6D-I).

الشكل 1
الشكل 1. الكمبيوتر الموجهة التصوير المقطعي بالإشعاع التنسيق (CFIR) منصة. (A) CFIR يستخدم جهاز الأشعة الدقة القادرة على إيصال أشعة CT الموجهة مع الحزم الصغيرة. مثال على منصة CFIR واحد هو منصة أبحاث الإشعاع الحيوانات الصغيرة (SARRP). مع التدريع الرصاص (كما هو موضح)، وSARRP يبلغ 81 بوصة (الارتفاع) بنسبة 58 بوصة (العرض) بنسبة 41 بوصة (عمق) في 5170 £. (B) عن طريق مصدر المزدوج أنبوب الأشعة السينية تعلق على العملاقة التي تدور 360 درجة، يستخدم SARRP على التحكم آليا المرحلة العينة التي تسمح التناوب لموضوع الحيوان في جميع أنحاء العلاج الإشعاعي. وتتكون (C) CFIR الأجهزة من أشعة X المصدر، تلسكوب الموازاة، بالتناوب العملاقة، ودعم الحيوانية، وتناوب الروبوتية المرحلة العينة، وتصوير الإلكترونية. (D) يتم وضع الموضوع الماوس في سرير مع الشلل التخدير الغاز المدخلات على المسرح عينة الروبوتية. من درع وآخرون. عام 2010. (E) وينبغي أن تتضمن الأجهزة CFIR المخاريط الموازاة للتخصيص لاتصال الأشعة تحت الحمراء تسليم الإشعاع من مختلف الأحجام. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. النموذج التجريبي. أمرت أنثى C57BL / 6 الفئران من مختبرات الماوس جاكسون، وتأقلم لأقفاص المقيمين في أربعة أسابيع من العمر. تم تحويل الماوس تخضع لبالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية نظام غذائي عالي الدهون في خمسة أسابيع من العمر، وتنقسم إلى مجموعتين العلاج: الأفواج المشع أو صورية. اتخذت المقررة الفسيولوجية طوليا قبل وبعد العلاج. كانت تدار العلاجات التشعيع أو صورية عند 5.5 أسابيع. أعطيت حقن داخل الصفاق BrdU في ستة أسابيع من العمر كما هو موضح سابقا 2.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
الرقم 3. المنطقة ذات الاهتمام التعريب. المنطقة التكاثري طائي (HPZ)، وهي منطقة تقع العصبية في سماحة وسيطة طائي، ويقع في mediobasal المهاد بطني. (أ) يتم تمييز منطقة HPZ ذات الاهتمام (ROI) من خلال الشعر الأحمر العرضي في حجم الأطلس مرجعا 3-D نيسل من ألن الدماغ الأطلس بوابة بيانات (موقف: 7.041، 7.211، 5.564) (متوفر من الإلكتروني http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (ب) القسم الدماغ الاكليل من العائد على الاستثمار في الفئران القديمة تسعة عشر يوما. BrdU المناعية (الأخضر) يكشف عن أن العائد على الاستثمار (رأس السهم الأبيض) يحتوي على خلايا التكاثري. يقتصر كثافة الخلايا التكاثري في HPZ في محور الأمامي إلى الخلفي، مع كثافة أعلى مستوى عند -1.75 ملم Bregma. أقسام الأنسجة هي ملطخة مكافحة دابي مع علامة النووي (الازرق). الرقم من لي وآخرون. 2012A.(CE) CT التصوير على منصة CFIR يسمح استهداف HPZ العائد على الاستثمار (صليب أحمر الشعر) بواسطة قوس تسليم الإشعاع شعاع. CT-صورة الماوس الموضوع في المستوي الأفقي (C)، المستوى السهمي (D)، والطائرة الاكليلية (E). (E) المسافة من سطح الجمجمة إلى العائد على الاستثمار هو 0.62 سم (خط أحمر). أشرطة النطاق = 1 ملم (A)، و 50 ميكرومتر (B)، و 0.62 سم (CE). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 4
الشكل 4. معايرة التسليم التشعيع. (A) الأشعة السينية للموضوع تأمين الماوس في الجهاز الشلل على المسرح الروبوتية SARRP. (ب) تنسيق ROI محسوب علىإعادة إدخالها والتي تستهدف نموذج الفأر وهمية. ويتكون نموذج الوهمية من الأفلام الحساسة للإشعاع GAFchromic جزءا لا يتجزأ من البلاستيك يعادل في الماء. الأفلام تقع فوق، في، وتحت مركز التساوي ROI كشف توزيع الجرعة. A 45 ° قوس شعاع الإشعاع من SARRP يسلم توزيع الجرعات على شكل مخروط إلى العائد على الاستثمار، ويتقاطع في مركز التساوي (بقعة شبه الظل). (C) التراكب من قياس الجرعات فيلم المكتسبة مع 1 ملم شعاع الإشعاع في الوهمية مع الأشعة السينية وجود حقيقي الموضوع الماوس (الخط الأصفر). دائرة بيضاء (السهم) ويشير الإشعاع 10 جراى الجرعة المستهدفة الوزراء البريطانى إلى HPZ. يحدد خط منقط الدماغ. لوحة من لي وآخرون. 2012A.

الرقم 5
الرقم 5. تأكيد الإشعاع التسليم. التصوير المقطعي مع تباين اليود يمكن أن تعزز التصور من العائد على الاستثمار إذا CT التصوير العادي لا suffic ه. (A) المواضيع الماوس تلقى اليود يتناقض كما هو موضح سابقا (لوحة من لي وآخرون 2012). وتظهر الصور المقطعية في الطائرة الاكليلية، الأفقي، والسهمي من اليسار إلى اليمين. ويمكن الكشف عن (B) تأكيد التسليم الإشعاع في الأنسجة بواسطة المناعية للγH2AX، علامة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل. γH2AX المناعية يظهر الإشعاع تسليم شعاع تستهدف HPZ العائد على الاستثمار في mediobasal المهاد بطني. ولم يلاحظ γH2AX المناعية في منطقة subventricular من البطينين الوحشي (C)، أو منطقة جزئي التحبب من قرن آمون (D) من الفأرة نفس الموضوع. (BD) وcounterstained المقاطع مع دابي (من لي وآخرون. 2012A). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

س: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> الرقم 6
الرقم 6. تثبيط محورية في تكوين الخلايا العصبية ME النتائج في إحداث تغييرات في الوزن والأيض. (A) واستهدف سماحة الوسيط (الشرق الأوسط) وتقع في mediobasal المهاد بطني لالتشعيع. النواة المقوسة (مطور) هو التركيب التشريحي المجاورة. شهر بعد العلاج، وتم قياس كمية نسبة من الخلايا العصبية BrdU + هو من صورية مقابل الأفواج المشع من قبل المناعية في الشرق الأوسط ومطور. تم تخفيض مستويات ME تكوين الخلايا العصبية بشكل كبير في المشع مقابل الأفواج صورية (ن = 5/cohort، *** = ع <0.0001). لم تتأثر مستويات مطور تكوين الخلايا العصبية (ن = 3/cohort، نانوثانية = ليس كبيرا). (B) تشاو عادي تغذية (NC) وتم فحص (C) عالية الدهون التي تغذيها (HFD) الفئران طوليا لإجراء تعديلات في الوزن بعد التشعيع أو صورية treatmوالأنف والحنجرة (B، ن = 12/cohort؛ C، ن = 9/cohort). (DE) تم فحص شهر واحد بعد العلاج، المشع والشام معاملة الفئران HFD تغذية عن طريق الكمي الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحليل٪ كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهون٪. كان الفئران المعرضة للإشعاع أقل بكثير٪ كتلة الدهون وأكثر بكثير٪ كتلة العجاف من الضوابط صورية (ن = 5، ص = * <0.05). مجموع كتلة: (الشام) 21.0 ± 0.3 غرام، (المشع) 18.86 ± 0.4 غرام؛ الشامل العجاف: (الشام) 14.6 ± 0.2 غرام، (المشع) 13.9 ± 0.3 غرام؛ فات قداس: (الشام) 3.9 ± 0.2 غرام، ( المشع) 2.6 ± 0.3 ز (ن = 5، ص = * <0.05). (FI) المشع ووضعت صورية معاملة الفئران الكبار في نظام الرصد الشامل مختبر الحيوان (CLAMS) لقياس وقت واحد من الاستهلاك الغذائي، والنشاط البدني، والتمثيل الغذائي في الجسم بأكمله التنميط أسبوعين بعد العلاج. التالية التأقلم في غرفة الاختبار، لوحظت الفئران المشع لديك الاشتراكيةأكبر gnificantly نفقات الطاقة، النشاط الكلي، وVO 2 (مل / كغ / ساعة) مقارنة مع الضوابط صورية أثناء الجزء المظلم من يوم (ن = 11، 12؛ * = P <0.05). (G) لم يلاحظ أي اختلاف كبير في سعر صرف الجهاز التنفسي (RER) (ن = 11، 12). يتم إنشاء Subfigure A من البيانات المنشورة سابقا في لي وآخرون. 2012A ولي وآخرون 2012b. Subfigures CI من لي وآخرون. 2012A. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أشعة المقطعية المحورية الموجهة (CFIR) هي رواية ونهج نظام متكامل قادر على تقديم مجالات الإشعاع لأهداف في الحيوانات الصغيرة تحت السيطرة الروبوتية باستخدام CT-32 الإرشاد. قدرة CFIR لتقديم الحزم شديدة التركيز على نماذج حيوانية صغيرة توفر فرص جديدة للبحث لسد البحوث المختبرية والترجمة السريرية. وتصف هذه الورقة مقاربة CFIR للتسليم الإشعاع دقيقة خصيصا لاستهداف طائي عدد سكانها السلف العصبية. علينا أن نظهر هنا كيفية معايرة الإشعاع وتأكيد التسليم خصوصية عبر فيلم الأشعة السينية والأنسجة في الدماغ عن طريق المناعية.

بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه التقنية لمنع تكوين الخلايا العصبية في منطقة محددة في الدماغ. علينا أن نظهر أننا قادرون على استهداف منطقة ما تحت المهاد ventrobasal، وتمنع تكوين الخلايا العصبية في سماحة وسيطة، دون تغيير مستويات تكوين الخلايا العصبية في الهياكل المجاورة. تثبيط Mويرافق E تكوين الخلايا العصبية بسبب التغيرات في التمثيل الغذائي والنشاط، وكذلك تخفيض زيادة الوزن على نظام غذائي عالي الدهون في المشع مقابل مجموعات العلاج صورية (الشكل 6) 2. وتشير هذه البيانات دورا لهذه الخلايا العصبية طائي المولد الكبار في تنظيم عملية التمثيل الغذائي والطاقة التوازن. وعلاوة على ذلك، فإنه يشير إلى أن وجود فائض غذائي عالي الدهون يمكن أن يغير الأيض الدوائر الحرجة حتى في مرحلة البلوغ 3. نتائجنا تمثل توسعا هاما على وظيفة معروفة من الخلايا العصبية المولد الكبار، ويسلط الضوء على الجديد طائي العصبية السكان السلف 3. المحاذير المحتملة لهذا النهج هي أن الإشعاع يحول دون انتشار السلف بدلا من تكوين الخلايا العصبية في حد ذاته، وبالتالي من الممكن أيضا أن التغيرات الفسيولوجية بعد العلاج قد شكلت جزئيا لعن اضطراب الأخرى نشأة خلية بالغة. وسوف تشمل الخطوات المستقبلية لتطوير الأدوات الوراثية لمنع انتشار هذه محددة العصبية السلف صopulation، والتي سوف توفر الوضوح كبيرة لدور وظيفي هذه الأسلاف واللعب ذريتها في تنظيم وظائف الأعضاء 3.

أخذت معا، ومع ذلك، ويقدم منصة الإشعاعية كنقطة انطلاق هامة في أداء شاشات المتوسطة الإنتاجية على الأسلاف العصبية وذريتها. هذه التقنية الإشعاعية لا يقتصر على بحث المسائل في علوم الأعصاب، ومع ذلك، ونحن نتوقع CFIR لتوسيع مسبقا المفاهيمي في عدد من المجالات البحثية. توافر مؤخرا تباع تجاريا منصات الإشعاعية CT الموجهة يتيح الفرصة للباحثين لاستخدام هذه القدرات من هذا المنبر لطرح الأسئلة أبحاثهم (الشكل 1). تتوفر تجاريا التي تسمح لأحد لأداء موجهة الصورة تشعيع الحيوانات الصغيرة عدة بدائل. علاوة على ذلك، يمكن أيضا أنظمة أشعة المقطعية المحورية الموجهة سيتم بناؤها في المنزل، كما كان الحال مع النظام المستخدم لهذه قtudies في جامعة جونز هوبكنز 29-33، 35.

أداء هذه الدرجة من استهداف التنسيق يتطلب معايرة واستهداف العائد على الاستثمار. في حين أن هذا الأسلوب سوف تتخذ في البداية التدريب لكى تصبح مألوفة مع منصة CFIR والبرمجيات الجرعة وتخطيطها، وتشغيل الجهاز من السهل فهم وليس بعد البروتوكول وقدرات منصة. فمن المستحسن أن ممارسات المشغل معايرة شعاع الإشعاع عدة مرات قبل تشغيل التجربة طولية واسعة النطاق. أن قال، مرة واحدة بطلاقة في تشغيل CFIR، يجب الدراسات البحثية التحرك بسرعة.

هذا البروتوكول CFIR الموصوفة هنا يستخدم ثلاثي الأبعاد الحجمي التوجيه صورة لتوطين واستهداف الجرعة. جرعة امتثالي يقلل التعرض للمناطق الدماغ nontargeted، والهندسة عالية الدقة شعاع يسمح لتوزيع جرعة امتثالي مع حدود شعاع حاد. هذا يسمح احد لطرح الأسئلة regardiنانوغرام وظيفة الخلايا العصبية المولد الكبار، ولكن أيضا يفتح مجالات للأسئلة لدور تكاثر الخلايا في مجالات مثل علم وظائف الأعضاء، وعلم الأحياء الورم، وعلم المناعة. هذا الأسلوب يمكن توسيعها في عدة طرق مع الأصباغ التباين وتلألؤ بيولوجي لتعزيز التصور 35، 56. ثمة جهود تبذل الآن لتعزيز قدرات الأجهزة CFIR أخرى، ويجري الآن تعديل النظام الأساسي لتشمل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الماسح الضوئي على متن 56. وهذه تسهل توسيع الأدوات المتاحة للباحثين والمساعدة في ترجمة الاكتشافات في مقاعد البدلاء إلى السرير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW ديها اتفاقيات تمويل البحوث والتشاور مع Xstrahl، وشركة

Acknowledgments

نشكر C. Montojo، J. رييس، وM. درع للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الامريكية الوطنية للصحة منح F31 NS063550 (لDAL)، جائزة باسل أوكونور كاتب الباحث والمنح المقدمة من صندوق Klingenstein وNARSAD (لSB). SB هو WM كيك الكرام الباحث الشاب في البحوث الطبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Tags

علم الأعصاب، العدد 81، خلايا الجذعية العصبية (NSCs)، وزن الجسم، العلاج الإشعاعي، إذ تسترشد صورة، الأيض، طاقة الأيض، تكوين الخلايا العصبية، تكاثر الخلايا، العصبية، تشعيع، علاج إشعاعي، الحاسوب التصوير المقطعي (CT) والتصوير، وتحت المهاد، المهاد التكاثري المنطقة (HPZ)، متوسط ​​سماحة (ME)، الحيوان منصة بحوث الإشعاع الصغيرة (SARRP)
الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J.,… More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter