Summary
La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l'enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte.
Abstract
La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né demeure un défi important. Approches pour inhiber la neurogenèse adulte via livraison virale invasive ou des animaux transgéniques ont confond potentiels qui rendent l'interprétation des résultats de ces études difficile. De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent d'enquêter de manière non invasive une fonction de certains groupes de neurones adultes-né grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants focale inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et permet le ciblage des régions spécifiques progénitrices neurales. Afin d'éclairer le rôle fonctionnel potentiel que la neurogenèse adulte hypothalamique joue dans la régulation des processus physiologiques, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus. Nous décrivons une méthode pour C omputer tomographie guidéef ocal IR (CFIR) pour permettre la livraison anatomique précise et exacte ciblant les petits animaux. CFIR utilise tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose de rayonnement, réduit au minimum l'exposition au rayonnement de régions du cerveau non ciblés, et permet une distribution de dose conforme aux limites de faisceaux tranchants. Ce protocole permet de poser des questions concernant la fonction des neurones adultes-né, mais ouvre aussi des zones à des questions dans les domaines de la radiobiologie, la biologie de la tumeur, et de l'immunologie. Ces outils radiologiques faciliteront la traduction des découvertes sur le banc au chevet.
Introduction
Des découvertes récentes ont démontré que le cerveau des mammifères adultes peuvent subir un degré remarquable de plasticité. neurones adultes nés sont générés à l'âge adulte dans des niches spécialisées du cerveau des mammifères 1. Quelle est la fonction de ces neurones adultes-né? Et d'autant plus, ils jouent un rôle dans ne physiologie et le comportement? Les études sur ce sujet sont traditionnellement concentrées sur la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire de l'hippocampe, mais des études récentes ont caractérisé la neurogenèse dans d'autres régions du cerveau comme l'hypothalamus chez les mammifères 2. Neurogenèse a été rapporté dans le post-natale et l'hypothalamus adulte 2-10, et la fonction de ces neurones hypothalamiques nouveau-nés demeure une zone active de l'enquête.
La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né reste un défi important pour le domaine des neurosciences en général. L'inhibition sélective de specIFIC populations de cellules progénitrices neurales reste limitée par le manque de marqueurs moléculaires disponibles qui sont uniques aux populations progénitrices neurales simples 11. Ainsi, la suppression sélective des neurones adultes nés de ces progéniteurs neuronaux via le ciblage génétique reste difficile. De même, la livraison virale de cibler les neurones adultes-né souffre de variables confondantes potentielles telles que l'introduction des blessures et de l'inflammation dans l'environnement 12.
De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent de contourner ces facteurs de confusion et d'enquêter à ces questions grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et une méthode non invasive permet de cibler les populations progénitrices neurales 13-15. Récemment, nous avons décrit une région germinale de l'éminence médiane de l'hypothalamus chez les mammifères (ME) que nous avons appelé la zone proliférative hypothalamique (HPZ) 2 2. Pour tester si la neurogenèse adulte dans le ME hypothalamique régule le métabolisme et le poids, nous avons cherché à perturber ce processus. L'éminence médiane est une petite structure unilatérale à la base du troisième ventricule à partir de laquelle hormones de régulation sont libérés. Afin d'inhiber la prolifération et la neurogenèse ultérieure sans altérer les autres fonctions physiologiques de cette région du cerveau, nous avons développé une technique d'irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nouvellement nés dans l'éminence médiane de l'hypothalamus 2.
Un certain nombre de groupes ont utilisé le rayonnement de supprimer la neurogenèse dans les régions canoniques 14-28. Cependant, les approches radiologiques précédentes ont généralement ciblé les grandes surfaces, ou Often involontairement également ciblé plusieurs zones du cerveau où la neurogenèse a été signalée, ce qui rend difficile d'associer sans ambiguïté les défauts comportementaux observés avec des défauts dans des populations particulières progénitrices neurales. La capacité de l'irradiation plus ciblée est assurée par des plateformes radiologiques qui combinent c omputer imagerie de tomographie guidée avec f ocal ir faisceau rayonnement (CFIR) livraison pour permettre un ciblage précis anatomique 29-36. Faisceaux de rayonnement aussi faibles que 0,5 mm de diamètre sont disponibles pour cibler des populations de cellules progénitrices neurales spécifiques 35. Cette méthode nous permet de cibler le ME hypothalamique et arrêtons prolifération et bloquons la neurogenèse chez les petits animaux. Après le traitement radiologique sur ces populations de cellules progénitrices, des tests physiologiques et comportementales peuvent être effectuées pour éclairer la fonction potentiel des cellules adultes-né. Ciblage focale est particulièrement important pour notre application depuis lehypophyse est situé à proximité de l'éminence médiane de l'hypothalamus, de l'hypophyse irradiation peut affecter la fonction hormonale et ensuite brouiller les résultats.
La base biologique pour la répression de la neurogenèse après irradiation ne sait toujours pas. Études sur les radiations précédents se sont appuyés sur de grosses poutres de la région, et ont conclu que la suppression de la neurogenèse est médiée par une réponse inflammatoire 14, 37. Comme tel, il est difficile de savoir si l'irradiation très focal pourrait supprimer la neurogenèse, car il n'évoque pas une réaction inflammatoire importante. Cependant, des études récentes par notre groupe de la région neurogène classique dans l'hippocampe ont démontré que l'irradiation très focal avec une dose de 10 Gy peut supprimer la neurogenèse pendant au moins 4 semaines après l'irradiation 35.
Pour interroger la fonction des neurones hypothalamiques adultes nés dans l'éminence médiane, nous utilisons un rayonnement de précision dériphérique capable de fournir l'imagerie CT en combinaison avec des faisceaux de rayonnement de faible diamètre ME inhiber la neurogenèse. L'utilisation d'un tube à rayons X fixé à un support mobile qui tourne sur une plage de 360 °, nous fournissons arc-faisceau faisceau de micro-irradiation à l'aide d'une platine porte-objet commandé par robot qui permet la rotation d'un sujet animal au cours du traitement de rayonnement (Figure 1) . Un détecteur de rayons X à haute résolution est utilisé pour acquérir des images lorsque le support mobile est dans la position horizontale 33. Pour cette étude, les images TDM ont été reconstituées avec une taille de voxel isotrope de 0,20 mm. Imagerie de bord CT a permis l'identification d'une cible alors que l'animal se trouve dans la position de traitement. La cible a été localisé à l'aide du logiciel de planification de la navigation dose-CT, qui a été inclus dans notre plate-forme radiologique disponible dans le commerce. Après localisation de notre ROI par imagerie CT, l'animal a été déplacé vers la position de traitement approprié par l'étage robotique de spécimen qui a quatre degrees de liberté (X, Y, Z, θ). Grâce à une combinaison de portiques et la scène de robot angles, poutres peuvent être livrés à partir de presque n'importe quelle direction par rapport à l'animal, et les traitements en forme d'arc stéréotaxiques sont possibles 29. Pour ces tous et d'autres études d'imagerie, les souris ont été placées dans un dispositif d'immobilisation qui permet la livraison de gaz isoflurane anesthésie tout en limitant le mouvement. Le lit d'immobilisation est compatible CT, et se connecte à l'étage de spécimen robotisé 34.
Nous nous attendons à ce que CFIR fournira avancées conceptuelles dans un certain nombre de domaines de recherche. Bien que nous utilisions le ciblage radiologique de l'éminence médiane de l'hypothalamus comme preuve de principe de cette technique, CFIR peut être utilisé pour cibler n'importe quelle région du corps d'un petit organisme modèle en principe. Dans le domaine des neurosciences, par exemple, nous envisageons cette technique pourrait être utilisée pour évaluer la fonction de populations de cellules progénitrices activement prolifératifs qui ont été proposés à exist dans d'autres organes, tels que circumventriculaires la région postrema 38, 39, subfornical organe 40, et 41 l'hypophyse. Controverses de longue date concernant le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte et identifiant un rôle causal dans le comportement peuvent désormais être mieux pris en compte. Dans chanteur, cette technique pourrait aborder le rôle de la neurogenèse adulte dans le maintien du comportement robuste et saisonnière de chants d'oiseaux 42, qui a été entravée par la capacité d'inhiber sélectivement la neurogenèse dans des régions spécifiques du cerveau. La compréhension de ce modèle de comportement robuste pourrait jeter un nouvel éclairage sur le rôle de la neurogenèse adulte dans la régulation d'autres comportements dimorphisme sexuel. En variante, dans le domaine du métabolisme, CFIR pourrait être utilisé pour explorer les aspects du rôle de la prolifération des hépatocytes et son rôle dans le métabolisme et la balance énergétique. La possibilité pour l'avance conceptuelle dans plusieurs disciplines de recherche est renforcée par l'introduction de cette technique.
43, 44. Par conséquent, nous généralisons ce protocole de CFIR avec des étapes nécessaires pour toutes les plateformes de recherche plutôt que celles qui sont spécifiques pour SARRP. Les avantages de CFIR par rapport aux approches radiologiques précédentes pour inhiber la neurogenèse sont que cette technique permet tridimensionnel orientation d'image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose, la dose conforme minimise l'exposition de régions du cerveau non ciblés, et de la géométrie du faisceau de haute précision permet une distribution de dose conforme à tranchants limites de faisceau. Nous décrivons comment utiliser l'imagerie CT-guidée de cibler la dose à une région anatomique spécifique, et en faisant ainsi, comment visualiser le rayonnementRépartition de la dose directement dans le tissu en utilisant une coloration immunohistochimique pour γ-H2AX, un marqueur de cassures double brin 35, 45-48. L'utilisation de cette approche pour l'irradiation sélective des niches neurogène peut avoir des conséquences importantes en révélant le rôle fonctionnel de nouveaux neurones adultes-né sur la physiologie et la maladie.
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Protocol
utilisation des animaux
Obtenir l'approbation du Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel pour les protocoles de soins standard et l'utilisation. Le protocole actuel est développé pour des études d'irradiation de 5,5 à 10 semaines d'intervention sur des souris adultes âgés C57BL6 / J, comme décrit précédemment (figure 2) 2. Cependant, d'autres âges et petites espèces animales (rats, hamsters, écureuils terrestres, etc) peuvent également être utilisés, à condition que les protocoles d'anesthésie efficace et radiographiques atlas de référence permettant l'identification de la région d'intérêt (ROI) sont disponibles.
Une. Calibration de la plate-forme radiologique CT-guidée
Effectuer des étalonnages à base de film pour la dose de rayonnement sur la plate-forme radiologique à l'avance pour chaque taille de collimateur et le type de filtre de tube à rayons X utilisés. Afin de cibler un faisceau d'arc de l'irradiation sur le site cible souhaitée, utilisez le logiciel de planification de dose rayonnement 49 en stocke sur la plupart des plates-formes de rayonnement commerciales pour calculer le délai de livraison souhaitée en fonction de la dose de rayonnement, la profondeur de la région d'intérêt (ROI) sur la base de tomodensitométrie de la souris, et la vitesse de rotation de la plate-forme robotique; détails sur cette sont laissés de côté de ce protocole car ils diffèrent entre les plates-formes de rayonnement. Aux fins de la visualisation de l'hypothalamus ventrobasal 2 (figure 3) avec l'imagerie CT, utiliser le tube à rayons X avec une tache focale de 0,4 mm et l'énergie du faisceau de 100 kV avec 1 mm Al filtration. Pour irradiation focale de la HPZ, utiliser le tube à rayons X à 225 kV, 13 mA, et une tache focale de 1 mm avec système de filtration de 0,15 mm Cu, de livrer 10 Gy de rayonnement à une profondeur de tissu de 0,6 cm sur un traitement temps de 4,6 min. Ciblage entre les différentes régions d'intérêt, il faudra calculer des paramètres différents.
- Si l'étude des effets de l'alimentation riche en graisses sur la neurogenèse dans l'éminence médiane comme décrit précédemment 2, obtenir quatre semaines-vieux C57B fémininL6 / J souris de laboratoires Jackson souris, et de la maison quatre souris par cage. Mettez la nourriture de bouffe normale à une alimentation riche en gras à l'âge de cinq semaines. Permettre souris s'acclimater à un nouveau logement et de la nourriture. Effectuer le traitement CFIR à l'âge de 5,5 semaines. Transport soumet à la salle d'opération qui contient la plate-forme radiologique. Réduire le niveau de stress pendant le transfert. Préparer la chambre de l'anesthésie au gaz isoflurane. Ensuite, ajoutez un simple clic dans la chambre. En parallèle, préparer coussin chauffant (bas de réglage) pour le post-traitement.
- Une fois la souris est sous et ne répond plus à la compression coussinet plantaire, amener le sujet à la plate-forme radiologique et placer sur le lit de l'immobilisation de la scène robotique. Placez la bouche dans le nez cône anesthésie tasse, et les dents de l'objet dans la gouttière occlusale (figure 1D). Lay à plat de la souris sur le lit d'immobilisation et de vérifier pour voir si elle continue à maintenir l'absence de réponse. Si c'est le cas, la bande adhésive souris sur le lit avec du ruban de gaze. Bien coller la souris pour le lit, Assurez-vous que la tête est nivelé à un plan horizontal. Ceci peut être déterminé en le tirant vers le haut des oreilles et de voir si elles sont nivelées. Une fois que la souris est dans la position correcte, fermer le bouclier protecteur de plomb.
- Acquérir de l'analyse par ordinateur tomographie utilisant le logiciel de bord de la plate-forme radiologique de l'expérimentateur (ce sera différent entre les plates-formes), qui fournira une analyse structurelle anatomique tridimensionnelle de l'objet de la souris. Vérifiez si la tête de la souris est nivelé au plan horizontal. Si pas, répétez les étapes 1.2 à 1.3 jusqu'à ce que la tête du sujet est nivelé.
- Identifier le ROI par l'image CT. Calculer la distance de ROI de la surface du crâne à l'aide d'un angle de 45 ° par rapport au plan horizontal comme le montre la figure 3E.
- En utilisant le logiciel de bord, prendre une radiographie de l'objet de la souris au-dessus comme le montre la figure 4A. Ensuite, retirez la souris à partir de la plate-forme radiologique, mettre sur le tapis de chauffage, et de surveiller jusqu'à active.
- A partir des images TDM coronale, calculer la profondeur ROI anatomique moyenne d'au moins trois souris afin de déterminer livraison dosage. A titre d'exemple d'une étude précédente 2 où 10 Gy d'irradiation a été administré à l'hypothalamus ventro-basal, la profondeur de la ROI du crâne (à partir d'un angle de 45 °) est de 0,66 cm (voir la figure 3E). Sachant cela, les chercheurs ont utilisé le logiciel de planification de la dose (DPS) installé sur leur plate-forme radiologique pour calculer la vitesse de rotation appropriée et la durée du traitement pour obtenir la dose souhaitée de la ROI.
- Après la détermination de la durée du traitement et de la vitesse de rotation de l'étage de robot avec le logiciel de planification de la dose, de mesurer les distributions de dose des paramètres calculés avec GAFchromic films sensibles au rayonnement incorporés dans un modèle souris maquette plastique équivalent dans l'eau. Pour ce faire, intégrer trois films sensibles aux rayonnements GAFchromic entre quatre blocs de plastique empilées verticalement équivalent-eau 29 quereprésenté sur la figure 4B.
- Placez modèle de souris maquette contenant des films GAFchromic sur scène robotique, et exécuter le faisceau d'irradiation focale avec les nouveaux paramètres calculés. Par exemple, pour cibler le ventrobasal hypothalamus, l'entrée des paramètres de 0,15 mm filtre de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de réglage de rayonnement de diamètre de faisceau, à 45 ° d'angle de portique, 1,3 rotation ° / sec, et de 4,6 min pour atteindre une ROI dose de rayonnement de 10 Gy.
- Après l'irradiation, consultez films pour modèle et l'intensité de la dose de rayonnement. Pour un angle de rotation de 360 ° avec les paramètres indiqués à une cible, l'hypothalamus ventro-basal, un anneau foncé dans le film au-dessus de l'isocentre, une petite tache croustillant à la pellicule de l'isocentre, et un anneau plus léger dans le film au-dessous de l'isocentre correspondant au cône administration de faisceau de l'irradiation sera observé (figure 4B).
- Superposer isocentre films GAFchromic sur les rayons X de sujets de souris à partir de laquelle les paramètres sont calcalculée. Le point focal irradié à isocentre doit chevaucher avec la région de ROI désirée comme montré dans la figure 4C.
Autre méthode: Si la difficulté à cibler cerveau ROI persiste, utilisez contraste iodé injecté par voie intrathécale à améliorer la visualisation des ventricules dans les images CT. Par souci de concision, cette procédure est laissée hors de ce protocole, mais est décrit précédemment 35, 50. contraste de l'iode fournira sites ventriculaires supplémentaires (figure 5A).
2. Précision de l'irradiation de faisceau déterminer
Confirmer davantage la précision du faisceau CFIR par visualisation directe du faisceau de rayonnement dans le tissu 2, 35, 51. Pour ce faire, effectuez l'immunohistochimie pour détecter γH2AX 51, une protéine histone et un marqueur précoce de cassures double brin. Sujets de souris doivent être perfusés transcardiaque et fixés dans l'heure de l'irradiation. Après l'irradianceation, réparation de l'ADN rapidement s'ensuit, et les niveaux de ΥH2Ax diminuent de façon significative 35.
- Répétez les étapes 1.1 à 1.3.
- Après la cible est identifiée sur CT, l'objet de la souris est déplacé sous le contrôle robotisé d'aligner cette cible avec le faisceau d'émission de rayonnement. Les paramètres d'entrée calculés (vitesse de rotation et la durée du traitement pour obtenir la dose désirée) à partir de l'étape 1.6 dans un logiciel de planification de la dose et de commencer le traitement. Le traitement est administré avec le portique pointé 45 ° de la verticale alors que la souris tourne autour d'un axe orienté verticalement.
- Après l'irradiation, effectuer perfusion transcardial sur des sujets de souris. Effectuer perfusion en une heure 52. Après cerveaux perfusion, immersion fixes dans 4% PFA / PBS et balancer doucement pendant une nuit à 4 ° C.
- Le lendemain matin, lavez 5 min dans du PBS 3x pour enlever paraformaldéhyde fixateur. Ensuite, immerger dans 30% de saccharose dans du PBS 1x sur une bascule à 4 ° C.
- Secouez doucement à 4 ° C (noussivement 12-16 h), jusqu'à ce que le cerveau tombe au fond du tube. Cela sert comme une étape de cryoprotection. Une fois le cerveau évier, enlever cerveau avec une cuillère perforée pour éviter un excès de 30% sucrose/1x transfert PBS. Intégrer rapidement dans un milieu de congélation sur glace sèche. Agiter milieu de congélation avec la pointe de la pipette et aligner cerveau dans le moule en plastique.
- Une fois complètement congelée, transférer des blocs de cerveau de congélateur à -20 ° C pour le stockage.
- Le jour où l'immunohistochimie sera effectuée, section coronaire à 40 um d'épaisseur, et flottent dans une plaque de 24 puits contenant du PBS avec un pinceau fin. Les articles doivent être conservés afin de série correct pour immunomarquage pour déterminer la couverture d'irradiation de la région cible.
- Préchauffer la solution 0,01 M de citrate de sodium à 80 ° C dans un bain d'eau en vue de l'étape d'extraction de l'antigène. Simultanément, alors que le citrate de sodium est en train de chauffer, effectuer lavages de 5 minutes 3x dans du PBS 0,01 M.
- Une fois que la solution de citrate de sodium est à 80 ° C, immerger coupes de cerveau in de la solution de tampon de citrate de sodium. Laisser au bain-marie à 80 ° C pendant 1 heure.
- Déposer la partie et laisser la solution de citrate de sodium à atteindre la température ambiante, puis effectuez trois lavages de 5 minutes dans du PBS 0,01 M.
- Bloquer des coupes de cerveau pendant 1 h dans du PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal.
- Incuber les coupes d'une nuit dans du PBS-Triton cerveau contenant 5% de sérum de chèvre normal à 1:700 concentration de l'anticorps primaire de souris anti-phospho-H2AX à 4 ° C.
- Le lendemain, effectuer 15 lavages min 3x à 0,01 M PBS-Triton.
- Incuber les coupes de cerveau de PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à 488 nm à une concentration de fluorophore 1:500 pendant 2 h.
- Accomplir 15 lavages min 3x dans du PBS 0,01 M-Triton.
- Effectuer 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache (1:5000 dans du PBS) pendant 10 min pour visualiser noyau. Ensuite, lavez les coupes de cerveau pendant 5 min avec du PBS.
- Montez sur électrostatique chmicroscope arged glisse par l'article flottant dans du PBS. Essuyez l'excès de PBS et permettent lames sécher. Lamelle les diapositives à l'aide milieu de montage et laisser les lames sécher à l'obscurité à température ambiante jusqu'au lendemain.
- Prenez des photos de coupes coronales série avec microscope à fluorescence. ΥH2Ax immunologique (vert) indique le site de l'irradiation. DAPI (bleu) est un colorant nucléaire (figure 5B).
3. Préparation de souris Sujets pour l'irradiation focale
Examiner les résultats d'immunomarquage ΥH2Ax. Une fois satisfait de l'étalonnage et le ciblage du faisceau d'irradiation, procéder à l'expérience. À ce stade, le temps total nécessaire pour traiter une souris (de configuration de l'animal à l'achèvement de la prestation de faisceau) est d'environ 10-15 minutes pour un traitement de 10 Gy avec un faisceau de 1 mm.
- Commandez-quatre semaines, âgé de souris femelles C57BL6 / J de laboratoires Jackson souris. Maison quatre souris par cage, et passer la nourriture de bouffe normaleà un régime alimentaire riche en matières grasses à l'âge de cinq semaines. Souris oreille de punch pour leur donner des marques d'identification uniques. Surveiller la santé de souris tous les jours. Remarque: marqueurs métalliques ne peuvent pas être utilisés tels qu'ils résulteront en stries artefacts sur le CT.
- Peser souris le jour avant la radiothérapie ou fictive. souris divisé en deux cohortes de radiothérapie ou de simulacre et de s'assurer qu'il n'y a pas de différence significative de poids entre les cohortes. Le jour du traitement, lorsque les souris sont de six semaines, la réévaluer toutes les souris et enregistrer leur masse. Transporter doucement les deux cohortes de la plate-forme radiologique. Prendre soin de minimiser le niveau de stress.
- Préparer la chambre de l'anesthésie au gaz isoflurane. Anesthésier deux souris, l'une dans le groupe d'irradiation prédéterminée, et une autre dans le groupe témoin factice. Préparer coussin chauffant réglé dans la bas pour le traitement post-opératoire.
- Suivez les étapes 1.2 à 1.4 pour la souris à une irradiation. Pour la souris imposture, garder la souris dans la chambre anesthésie tandis que le traitement est en cours. Faire sure que la chambre de l'anesthésie est proche de la plate-forme de CFIR si les effets sur le rayonnement ambiant sont pris po Après la cible est identifiée sur CT, déplacer l'objet de la souris sous le contrôle robotisé d'aligner cette cible avec le faisceau d'émission de rayonnement. Entrée calculé paramètres (vitesse de rotation et la durée du traitement) dans le logiciel dose de planification.
- Une fois le traitement d'irradiation est terminée, retournez imposture et souris irradiées à coussin chauffant, et suivre jusqu'à ce qu'ils se réveillent.
- Retour à la fois factice et souris irradiées à l'animalerie. Surveillance de tous les jours. Peser la souris toutes les demi semaines. Pour confirmer l'irradiation de la zone proliférative hypothalamique ciblée, administrer des injections intra-péritonéales de BrdU (50 mg / kg), trois jours après le traitement et examiner la neurogenèse entre les groupes par co-marquage de l'immunohistochimie pour BrdU et un marqueur neuronal un mois après l'exposition au BrdU initiale (Figure 6) 2.
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Representative Results
Évaluation de ciblage tomodensitométrique et précision
L'étalonnage du système mécanique est essentielle pour assurer que les faisceaux de différents angles tous se coupent en un seul point. L'étalonnage a été réalisé avec un procédé à base de formation d'image à semi-automatique, où la précision de l'alignement bout-à-bout a été mesuré à 0,2 mm 29. Cette précision est très critique à mesure que le volume de la structure de l'éminence médiane de l'hypothalamus est faible 2. Pour tester cette calibration, on a mesuré les distributions de dose avec GAFchromic films sensibles au rayonnement incorporés dans un modèle souris maquette plastique équivalente à l'eau 35 (figure 4B). En bref, un CT-scan de l'objet de la souris a été prise, et notre site cible hypothalamique ventro-basal a été identifié. Livraison et vitesse de rotation ont été calculés, et le collimateur et la filtration appropriée ont été fixés pour assurer 10 Gy de rayonnement a été livré. Un modèle maquette souris conçu à partir d'une eau-équivalen Structure t de matière plastique incorporé avec des films sensibles au rayonnement GAFchromic a ensuite été remplacé par le véritable objet de la souris pour mesurer la distribution de la dose à différents plans focaux. figure 4B montre les résultats de bout-en-bout tests dans un traitement d'arc avec le rayon 1 mm de diamètre à l'aide films GAFchromic dans une plate-forme maquette souris. Le portique a été fixée à un angle de 45 ° par rapport au modèle de souris simulé alors que la platine robotique a été mis en rotation autour d'un axe orienté verticalement, la génération d'un "arc" ou cône de rayonnement. La largeur à mi-hauteur (FWHM) est de 2,31 mm, ce qui est plus grand que 1,0 mm car les arcs empiètent sur le film à un angle. Théoriquement, la taille du faisceau au niveau de cet angle doit être de 2,0 mm. La tache focale du faisceau représenté à la figure 4 illustre l'alignement de précision des faisceaux provenant des directions différentes. Ce film peut être superposé à l'objet réel de la souris, ce qui démontre la position du faisceau et la précision (figure 4C).
e_content "> L'utilisation d'un 1 mm collimateur de faisceau de diamètre, une technique d'arc a été utilisé pour délivrer 10 Gy au point dans notre objet de la souris cible. mesures précédentes 29 indiquent que cette technique donne de très faibles doses de rayonnement (<0,1 Gy) en dehors de la 1 cible mm. L'aire de la glande pituitaire et les structures environnantes est donc efficacement protégés contre l'irradiation focale de l'hypothalamus ventro-basal. L'exactitude du ciblage de faisceau a été mesurée dans des études précédentes pour être à moins de 0,2 mm à la fois en trait mixte essais 29 et les coupes de tissus 35 .Bien que pas nécessaire, CT-guidée de ciblage de la ROI peut être améliorée par un iode contraste injecté par voie intrathécale pour améliorer CT-guidée de ciblage pour notre application de cerveau (figure 5A). Comme il s'agit d'une procédure invasive et lourde, ce contraste n'est pas souvent utilisé, et pas décrite dans ce protocole. Détails de ce protocole peuvent être trouvés dans Ford et al. 2011 et Chaichana et al. 2007. Les avantages de ce contraste iodés sont que les ventricules latéraux et le troisième sont clairement visibles dans la tomodensitométrie acquis sur une plate-forme radiologique CFIR (figure 5A). La cible était de l'éminence médiane, à la base du troisième ventricule, et a été identifié en utilisant un logiciel de navigation tomodensitométrique et automatiquement importé dans l'interface de positionnement du robot. Structures osseuses du crâne ont été identifiés et utilisés comme points de repère anatomiques pour des études ultérieures où le contraste de l'iode n'a pas été employé.
Faisceau ciblage Validation avec γ-H2AX
Pour confirmer davantage notre tomodensitométrique de ciblage de la ME hypothalamique, nous avons visualisé le faisceau d'irradiation de 1 mm dans le tissu lors d'un examen indirect de cassures double-brin d'ADN qui surviennent suite à l'irradiation. Protéine histone H2AX est phosphorylée après cassures double brin. γ-H2AX a été largement utilisé dans le cerveau et d'autres tissus 46 -48, et le nombre de γ-H2AX + foyers semble en bonne corrélation avec dose de rayonnement sur une large plage de doses de 51, 53. Nous avons observé une visualisation claire de la poutre suivante γ-H2AX immunologique (figure 5B). Coloration résultante γ-H2AX a montré un ciblage précis de l'emplacement prévu. Le bord de faisceau était également très forte, en accord avec la physique des mesures de mise en base de film qui indiquent une pénombre 20-80% de 0,3 mm 54. Nous avons précédemment mesuré la distance entre la cible visée et l'axe de la poutre, comme visualisé dans les sections de tissu 35. Le centre du faisceau est décalée par rapport à la cible visée par une distance moyenne de 0,19 ± 0,36 mm (écart-type) dans 10 des souris irradiées après prise pour les effets de rétrécissement du tissu au cours de la fixation et de la transformation 35.
L'utilisation d'un traitement de l'arc stéréotaxique consistant d'un arc à 45 ° de la verticale, nousmontrer que nous étions en mesure de cibler efficacement l'hypothalamus ventro-basal, sans irradier d'autres niches neurogène (figures 5C-D). L'irradiation des zones environnantes était minime, et il y avait une limite à l'exposition aux rayonnements comme l'a démontré par le film GAF-chromique (figure 4B) et γ-H2AX immunologique (figures 5B-D). La dorsale de tissu à l'axe hypothalamo ME montre lumière γ-H2AX coloration (figure 5B) en raison des faisceaux de rayonnement entrent par cette région et également probablement en raison de l'amélioration de l'os recouvrant même si un faisceau de rayons X relativement dur a été utilisé (225 kVp, 0,15 mm de filtration Cu).
Effets sur la neurogenèse
Lors de confirmer la spécificité de notre prestation d'irradiation CT-guidée, nous avons examiné l'effet de 10 Gy d'irradiation sur les niveaux de ME neurogenèse. Les souris adultes ont été nourris avec un régime riche en matières grasses, ont reçu la radiothérapie ou fictive, et ensuiteinjections de BrdU tel que décrit précédemment à partir de six semaines vieux 2. Les souris ont été sacrifiées pour examen à 10 semaines, un mois après la première injection de BrdU. Souris adultes HFD nourris irradiées présentaient ~ 85% d'inhibition de la neurogenèse ME par rapport aux témoins de faux-traitée (figure 6A) 2. Le noyau arqué, une structure adjacente en bordure de la place d'irradiation, a été examinée pour les changements dans la neurogenèse, et d'avoir trouvé aucune différence statistiquement significative entre les animaux irradiés et des contrôles factices (Figure 6A) 2.
Fonction des adultes nés médian Eminence hypothalamique neurones
Changements chez les souris irradiées et faux ont été examinés après traitement. manteau de fourrure et de la réponse au toucher semblaient normaux. Un panneau de la chimie et complète panneau de comptage de sang a été examiné la semaine qui suit le traitement d'irradiation, et aucune différence significative n'a été observée (n = 9/group). En haute teneur en gras nourrissouris où nous avons observé une réduction de ~ 85% des neurones adultes nés ME un mois après irradiation (figure 6A), souris irradiées a diminué le gain de poids au fil du temps par rapport au groupe traité factice (Figure 6C). En revanche, normale-chow nourri des souris de contrôle, où les niveaux observés de la neurogenèse ME étaient significativement plus faibles que leurs homologues nourris riches en matières grasses 2, n'a pas eu une différence statistiquement significative de poids entre imposture contre les groupes irradiés (figure 6B). Fait intéressant, ce gain de poids chez les souris irradiées alimenté riche en graisses est accompagnée par des changements dans le métabolisme et l'activité comme décrit précédemment en détail par notre groupe 2 (Figures 6D-I).
Figure 1. Irradiation focale de tomographie guidée ordinateur (CFIR) plate-forme. (A) CFIR utilise un dispositif de rayonnement de précision capables de délivrer l'irradiation tomodensitométrique avec de petites poutres. Un exemple d'une plate-forme de la plate-forme est CFIR de recherche de rayonnement petit animal (SARRP). Avec un blindage de plomb (comme indiqué), la SARRP est de 81 pouces (hauteur) par 58 pouces (largeur) par 41 pouces (profondeur) à £ 5,170. (B) En utilisant un tube de rayons X à double source fixée à un support mobile qui tourne de 360 °, la SARRP utilise un contrôle par robot porte-échantillon qui permet la rotation d'un sujet animal tout au long de la radiothérapie. (C) CFIR matériel est composé d'une source de rayons X, le collimateur, portique, un appui de l'animal, le stade de la robotique échantillon tournant, et d'un imageur électronique tournante. (D) L'objet de la souris est placé dans un lit d'immobilisation avec une entrée de gaz d'anesthésie sur la platine robotique. De Armour et al. 2010. (E) matériel CFIR devrait inclure des cônes de collimation personnalisables pour ir focal livraison de rayonnement de différentes tailles. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Paradigme expérimental. Souris femelles C57BL / 6 ont été commandés auprès de laboratoires de souris Jackson, et acclimatés dans des cages résidents à l'âge de quatre semaines. Sous réserve de souris ont été mis à un ad libitum haute teneur en matières grasses à cinq semaines, et divisée en deux groupes de traitement: les cohortes irradiés ou faux. Évaluations physiologiques ont été prises longitudinalement avant et après le traitement. Irradiation ou faux traitements ont été administrés à 5,5 semaines. Injections de BrdU intrapéritonéale ont été donnés à six semaines, comme décrit précédemment 2.
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Figure 3. Région d'intérêt localisation. La zone proliférative hypothalamique (HPZ), une région neurogène situé dans l'éminence médiane de l'hypothalamus, est situé dans le mediobasal hypothalamus ventral. (A) La région de HPZ d'intérêt (ROI) est mis en évidence par réticules rouges dans un volume d'atlas de référence 3-D Nissl du cerveau Portail Allen données de l'Atlas (position: 7,041, 7,211, 5,564) (disponible à partir de http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) section du cerveau coronale du ROI chez les souris de dix-neuf jours d'âge. BrdU immunohistochimie (vert) révèle que le ROI (tête de flèche blanche) contient des cellules prolifératives. La densité de cellules prolifératives dans la HPZ est limitée dans le antérieure à postérieure axe, avec la densité la plus élevée à -1,75 mm bregma. Les coupes de tissus sont contre-colorées avec du DAPI marqueur nucléaire (bleu). Figure de Lee et al. 2012a.(CE) CT-imagerie sur une plate-forme de ciblage permet CFIR la HPZ ROI (réticules rouges) par la prestation de radiothérapie arc. CT-image de l'objet de la souris dans le plan horizontal (C), plan sagittal (D), et le plan frontal (F). (E) Distance de la surface du crâne pour le retour sur investissement est de 0.62 cm (ligne rouge). Barres d'échelle = 1 mm (A), 50 um (B), et 0,62 cm (CE). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Calibration de la prestation de l'irradiation. (A) X-ray d'un sujet de souris fixé dans le dispositif d'immobilisation sur la scène robotique SARRP. (B) ROI Calculé coordonne unre entré et ciblée contre un modèle de souris maquette. Le modèle fantôme est composé de GAFchromic films sensibles au rayonnement noyées dans une matière plastique équivalente à l'eau. Films situés au-dessus, à, et en vertu de l'isocentre ROI détectent la distribution de dose. A 45 ° arc faisceau de rayonnement à partir de la SARRP fournit une distribution de dose en forme de cône de la région d'intérêt, et converge à l'isocentre (spot de pénombre). (C) Superposition de dosimétrie film acquis avec un faisceau de rayonnement de 1 mm en fantôme avec un rayon X d'un objet réel de la souris (ligne jaune). Cercle blanc (flèche) indique dose rayonnement de 10 Gy focalement destiné aux HPZ. La ligne en pointillé indique cerveau. Panneau de Lee et al. 2012a.
Figure 5. Confirmation de rayonnement livraison. Imagerie CT avec contraste iode peut améliorer la visualisation de la ROI si l'imagerie CT normale ne suffice. (A) Sujets de souris ont reçu de l'iode contraste comme décrit précédemment (Groupe de Lee et al. 2012). Images CT dans le plan frontal, horizontal, et sagittal sont présentés de gauche à droite. (B) La confirmation de l'émission de rayonnement dans le tissu peut être détectée par immunohistochimie pour γH2AX, un marqueur de cassures double brin d'ADN. γH2AX immunologique montre livraison de faisceau de rayonnement ciblé pour la HPZ ROI dans le mediobasal hypothalamus ventral. γH2AX immunomarquage n'est pas observée dans la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux (C), ou la zone sous-granulaire de l'hippocampe (D) de la même matière de la souris. (BD) Les articles sont DAPI (De Lee et al. 2012a). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 6. Inhibition focale de ME résultats de neurogenèse dans les altérations du poids et du métabolisme. (A) L'éminence médiane (ME) situé dans le mediobasal hypothalamus ventral a été ciblée pour irradiation. Le noyau arqué (ARCN) est la structure anatomique voisine. Un mois après le traitement, le pourcentage de neurones BrdU + Hu de simulacre contre cohortes irradiés ont été quantifiés par immunohistochimie dans le ME et ARCN. Niveaux de ME neurogenèse ont été considérablement réduits dans irradié par rapport cohortes fictives (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Niveaux de ARCN neurogenèse n'ont pas été affectés (n = 3/cohort, ns = non significatif). (B) bouffe normale alimenté (NC) et (C) riche en graisses nourri des souris (SIH) ont été examinés longitudinale des altérations du poids après irradiation ou fictive traitement (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) Un mois après le traitement, irradié et imposture souris traitées HFD nourris ont été examinés par spectroscopie de résonance magnétique quantitative pour l'analyse des% la masse grasse et la masse maigre%. Souris irradiées avaient significativement moins de% de masse grasse et beaucoup plus% de la masse maigre de contrôles factices (n = 5, * = p <0,05). Masse totale: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (irradié) 18,86 ± 0,4 g; masse maigre: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (irradiés) de 13,9 ± 0,3 g; masse grasse: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( irradié) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Irradiés et des souris adultes de faux traités ont été placés dans un système global de suivi animaux de laboratoire (palourdes) pour les mesures simultanées de la prise alimentaire, l'activité physique, et l'ensemble du corps métabolique profilage deux semaines suivant le traitement. Suite à l'acclimatation dans la chambre d'essai, les souris ont été irradiées observé que sidépenses gnificantly plus d'énergie, l'activité totale, et VO 2 (ml / kg / h) par rapport à des contrôles de faux au cours de la partie sombre de la journée (n = 11, 12; * = p <0,05). (G) Aucune différence significative n'a été observée dans le taux de change respiratoire (RER) (n = 11, 12). La sous-figure A est générée à partir des données publiées antérieurement dans Lee et al. 2012a et Lee et al. 2012b. Les sous-figures CI de Lee et al. 2012a. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Irradiation focale tomodensitométrique (CFIR) est une approche nouvelle et complète du système capable de fournir des champs de rayonnement à des cibles dans les petits animaux sous contrôle robotique utilisant CT-guidage 32. La capacité de CFIR à fournir des faisceaux très ciblés à de petits modèles animaux offre de nouvelles possibilités de recherche pour combler la recherche en laboratoire et la traduction clinique. Ce document décrit l'approche de CFIR pour la livraison de rayonnement précis pour cibler spécifiquement une population de progéniteurs de neurones de l'hypothalamus. Nous démontrons ici comment calibrer et valider livraison rayonnement spécificité par un film radiographique et dans le tissu cérébral par immunohistochimie.
En outre, nous montrons comment cette technique peut être utilisée pour inhiber la neurogenèse dans une région spécifique du cerveau. Nous démontrons que nous sommes en mesure de cibler l'hypothalamus ventro-basal, et inhiber la neurogenèse dans l'éminence médiane, sans altérer les niveaux de la neurogenèse dans les structures adjacentes. L'inhibition de ME neurogenèse est accompagnée par des changements dans le métabolisme et l'activité, ainsi que le gain de poids réduit à un régime riche en graisses dans irradié par rapport à des groupes de traitement faux (figure 6) 2. Ces données suggèrent un rôle pour ces neurones hypothalamiques adultes nés dans la régulation du métabolisme et homéostasie énergétique. En outre, il suggère que l'excès régime riche en graisses peut modifier un circuit métabolique critique même à l'âge adulte 3. Nos résultats représentent une importante expansion sur la fonction connue de neurones adultes-né, et met en lumière un nouveau hypothalamique neurones population progénitrices 3. Réserves potentielles de cette approche sont que l'irradiation inhibe la prolifération ancêtre plutôt que la neurogenèse en soi et est donc également possible que des changements physiologiques post-traitement peut être partiellement expliquée par la perturbation d'autres genèse de cellule adulte. Les prochaines étapes comprennent le développement d'outils génétiques pour inhiber la prolifération de cette ancêtre de neurones spécifique population, qui apportera plus de clarté importante pour le rôle fonctionnel de ces progéniteurs et leur jeu de descendance dans la régulation de la physiologie 3.
Dans l'ensemble, cependant, cette plate-forme radiologique sert de point de départ important dans l'exécution des écrans à moyen débit sur cellules progénitrices neurales et leur progéniture. Cette technique radiologique ne se limite pas toutefois aux questions de recherche en neurosciences, et nous nous attendons à CFIR pour agrandir l'avancée conceptuelle dans un certain nombre de disciplines de recherche. La disponibilité récente de plates-formes radiologiques CT-guidées commercialement vendus donne l'occasion aux chercheurs d'utiliser ces capacités de cette plate-forme pour leurs questions de recherche (figure 1). Plusieurs alternatives sont disponibles dans le commerce qui permettent un petit pour effectuer l'irradiation des animaux guidée par l'image. En outre, les systèmes d'irradiation focale CT-guidées peuvent également être construits dans la maison, comme ce fut le cas avec le système utilisé pour ces ses études à Johns Hopkins 29-33, 35.
L'exécution de ce degré de ciblage focal nécessite un étalonnage et le ciblage de la ROI bon. Bien que cette technique sera d'abord suivre une formation afin de se familiariser avec la plate-forme CFIR et son logiciel dose de planification, le fonctionnement de l'appareil est assez facile après avoir compris le protocole et les capacités de la plate-forme. Il est recommandé que les pratiques de l'opérateur de calibrage du faisceau de rayonnement à plusieurs reprises avant de lancer expérience longitudinale à grande échelle. Cela dit, une fois l'aise dans l'opération de CFIR, des études doivent se déplacer rapidement.
Ce protocole de CFIR décrit ici utilise les trois dimensions de l'image de l'orientation volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose. dose conforme minimise l'exposition aux régions du cerveau non ciblés, et de la géométrie du faisceau de haute précision permet une distribution de dose conforme aux limites des faisceaux tranchants. Cela permet de poser des questions regarding la fonction des neurones adultes-né, mais ouvre également des zones à des questions au rôle de la prolifération cellulaire dans des domaines comme la physiologie, la biologie de la tumeur, et de l'immunologie. Ce procédé peut être étendu de plusieurs façons avec des colorants de contraste et la bioluminescence pour améliorer la visualisation 35, 56. Des efforts sont en cours pour renforcer les capacités matérielles CFIR plus loin, et la plate-forme est actuellement modifiés pour inclure une tomographie par émission de scanner à bord 56. Ceux-ci faciliter l'expansion des outils disponibles pour les chercheurs et les aide à transformer les découvertes en laboratoire à la clinique.
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Disclosures
JW a une entente de financement et de consultation avec la recherche Xstrahl, Inc.
Acknowledgments
Nous remercions C. Montojo, J. Reyes, et M. Armour pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health subvention F31 NS063550 (DAL), à un prix Basil O'Connor Starter Scholar et des subventions du Fonds Klingenstein et NARSAD (à SB). SB est un WM Keck Distinguished Scholar jeune en recherche médicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SARRP research platform | Xstrahl | RS225A | http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm |
| SARRP irradiation bunker | Xstrahl | Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding | |
| GAF chromic film | IPS | GAFchromic ETB2 | |
| Mouse phantom | Gammex | 457 | Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size. |
| Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody | Millipore, Inc. | 05-636 | clone JBW301 |
| High-fat rodent diet | Research Diets | D12492i | 60% of the calories as fat, food should be irradiated |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | 10019-360-40 | |
| 0.01 M Sodium citrate | Fisher Scientific | 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| DAPI | Fisher Scientific | nuclear counterstain | |
| Mounting medium | Fisher Scientific | Vectashield or Gelvatol is preferred |
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