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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Die Funktion der Erwachsenen-geboren Säugetierneuronen bleibt ein aktives Forschungsgebiet. Ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung neuer Nervenzellen. Mit Hilfe von Computer-Tomographie-geführte Brenn Bestrahlung (CFIR) können dreidimensionale anatomische Ausrichtung auf bestimmte neuronale Vorläuferpopulationen nun verwendet, um die funktionelle Rolle der adulten Neurogenese zu beurteilen.

Abstract

Die funktionelle Charakterisierung der Erwachsenen geborene Neuronen vor eine große Herausforderung. Ansätze über invasive virale Lieferung oder transgenen Tieren zu adulten Neurogenese hemmen, haben das Potenzial, die verwechselt Interpretation der Ergebnisse aus diesen Studien erschweren. Neue radiologischen Werkzeuge entstehen jedoch, dass ein nicht-invasiv zu untersuchen, die Funktion von ausgewählten Gruppen von Erwachsenen geboren Neuronen durch genaue und präzise anatomische Ausrichtung in kleine Tiere zu ermöglichen. Brenn ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung und Differenzierung von neuen Nervenzellen und ermöglicht Targeting von spezifischen neuronalen Vorläufer Regionen. Um das Potenzial funktionelle Rolle, dass erwachsene Neurogenese Hypothalamus spielt bei der Regulierung der physiologischen Prozesse zu beleuchten, haben wir eine nicht-invasive Brennbestrahlungstechnik, um die Geburt von Erwachsenen geboren Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz selektiv hemmen. Wir beschreiben ein Verfahren zur C omputer-Tomographie-geführtenf ocal ir-Strahlung (CFIR) Lieferung an präzise und genaue anatomische Targeting in kleine Tiere zu ermöglichen. CFIR verwendet dreidimensionale Volumenbildführung für die Lokalisierung und die Ausrichtung der Strahlendosis, minimiert die Strahlenbelastung für nontargeted Hirnregionen und ermöglicht konforme Dosisverteilung mit scharfen Strahl Grenzen. Dieses Protokoll ermöglicht es, Fragen in Bezug auf die Funktion der Erwachsenen-Neuronen geboren fragen, sondern eröffnet auch Bereiche, Fragen in den Bereichen Strahlenbiologie, Tumorbiologie und Immunologie. Diese Werkzeuge werden radiologische Übersetzung von Entdeckungen an der Bank auf dem Bett zu erleichtern.

Introduction

Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass das Gehirn erwachsener Säuger kann einen bemerkenswerten Grad an Plastizität zu unterziehen. Adult-geboren Neuronen im Erwachsenenalter in spezialisierten Nischen des Säugetiergehirns 1 erzeugt. Was ist die Funktion dieser Erwachsenen-Neuronen geboren? Und mehr noch, sie eine Rolle in der Physiologie und Verhalten zu spielen? Studien zu diesem Thema haben traditionell am Subventrikularzone der lateralen Ventrikel und der Subgranularzone des Hippocampus konzentriert, jedoch haben neuere Studien der Neurogenese in anderen Hirnregionen wie den Hypothalamus Säugetier 2 gekennzeichnet. Neurogenese in der postnatalen und adulten Hypothalamus 2-10 berichtet worden, und die Funktion dieser Neugeborenen hypothalamischer Neurone bleibt ein aktives Forschungsgebiet.

Die funktionelle Charakterisierung der Erwachsenen geborene Neuronen bleibt eine große Herausforderung für die Neurowissenschaften im Allgemeinen. Die selektive Hemmung der Spezifikationific neuralen Vorläuferpopulationen bleibt durch den Mangel an verfügbaren molekularen Marker, die spezifisch für einzelne neuronale Vorläuferpopulationen 11 begrenzt sind. So bleibt selektive Löschung von Erwachsenen geboren Neuronen aus diesen neuralen Vorläuferzellen über genetische Targeting schwierig. Ebenso virale Lieferung an Erwachsene geboren Neuronen gezielt leidet Potenzial Störvariablen wie die Einführung von Verletzungen und Entzündungen in die Umwelt 12.

Neue radiologischen Werkzeuge entstehen jedoch, dass man diese verwechselt zu umgehen und untersuchen diese Fragen durch genaue und präzise anatomische Ausrichtung in kleine Tiere zu ermöglichen. Ionisierende Strahlung hemmt die Entstehung und Differenzierung von neuen Nervenzellen und ermöglicht eine nicht-invasive Methode, um neurale Vorläuferpopulationen gezielt 13-15. Vor kurzem hat eine Keim Region des Hypothalamus Säugetier Eminentia mediana (ME), dass wir die Hypothalamus proliferative Zone (HPZ) 2 genannt haben wir beschrieben, 2 ME. Um zu testen, ob adulte Neurogenese im Hypothalamus ME reguliert den Stoffwechsel und Gewicht, haben wir versucht, diesen Prozess zu stören. Die Eminentia mediana ist eine kleine einseitige Struktur an der Basis des dritten Ventrikels, von dem regulatorischen Hormone freigesetzt. Zur Vermehrung und anschließende Neurogenese, ohne die anderen physiologischen Funktionen dieses Hirnregion zu verhindern, entwickelten wir eine nicht-invasive Brennbestrahlungstechnik, um die Geburt des neugeborenen erwachsenen Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz 2 selektiv hemmen.

Eine Reihe von Gruppen Strahlung auf die Neurogenese im kanonischen Regionen 14-28 unterdrücken beschäftigt. Allerdings haben frühere radiologische Ansätze in der Regel gezielt große Flächen, oder often unbeabsichtigt auch gezielt mehreren Hirnregionen, wo die Neurogenese wurde berichtet, so dass es schwierig ist, eindeutig alle mit Defekten in spezifischen neuralen Vorläuferpopulationen beobachteten Verhaltensdefekte zu assoziieren. Die Möglichkeit für weitere gezielte Bestrahlung durch radiologische Plattformen, c omputer-Tomographie-geführte Bildgebung kombiniert mit f ocal Strahl IR-Strahlung (CFIR) Lieferung, genaue anatomische 29-36 Targeting ermöglichen. Strahlungsstrahlen so klein wie 0,5 mm im Durchmesser sind, um spezifische neurale Vorläuferpopulationen 35 zielen. Diese Methode erlaubt uns, den Hypothalamus ME Ziel und verhaften Proliferation und blockieren die Neurogenese in kleinen Tiere. Nach radiologischen Behandlung auf diesen Vorläuferpopulationen, können physiologische und Verhaltenstests durchgeführt werden, um das Potenzial in Abhängigkeit von Erwachsenen geboren Zellen zu beleuchten. Focal-Targeting ist besonders wichtig für unsere Anwendung, da dieHirnanhangdrüse liegt in der Nähe der Hypothalamus Eminentia mediana; Bestrahlung der Hypophyse können Hormonfunktion beeinflussen und anschließend verwechseln Ergebnisse.

Die biologische Grundlage für die Unterdrückung der Neurogenese nach der Bestrahlung noch unklar. Vorherige Studien Strahlung auf großflächigen Strahlen verlassen, und haben festgestellt, daß die Unterdrückung der Neurogenese durch eine entzündliche Reaktion 14, 37 vermittelt. Als solches ist es unklar, ob hochBrenn Bestrahlung konnte die Neurogenese unterdrücken, da es nicht zu einem wesentlichen Entzündungsreaktion hervorzurufen. Die jüngsten Studien von unserer Gruppe der klassischen neurogenen Region im Hippocampus haben gezeigt, dass hochBrenn Bestrahlung mit einer Dosis von 10 Gy kann die Neurogenese für mindestens 4 Wochen nach der Bestrahlung 35 zu unterdrücken.

Um die Funktion der Erwachsenen-geboren Neuronen im Hypothalamus Median Eminenz abzufragen, verwenden wir ein Präzisionsbestrahlung device der Lage ist, CT-Bildgebung in Verbindung mit kleinem Durchmesser Strahlen ME Genese hemmen. Verwendung einer Röntgenröhre an einem Portal, das über einen Bereich von 360 ° dreht, befestigt ist, liefern wir bogenMikroStrahlBestrahlungsStrahl unter Verwendung eines robotergesteuerten Probentisch, der die Drehung eines tierischen Patienten während der Bestrahlung (Fig. 1) ermöglicht . Ein hochauflösender Röntgendetektor wird verwendet, um Bilder zu erfassen, wenn die Gantry in der horizontalen Position 33. Für diese Studie wurden die CT-Bilder mit einer isotropen Voxel-Größe von 0,20 mm rekonstruiert. Bord CT erlaubte die Identifizierung eines Ziel während sich das Tier in der Behandlungsposition. Das Ziel wurde mit der CT-Navigation Dosis-Planungs-Software, die mit unserem Handel erhältlich radiologische Plattform aufgenommen wurde lokalisiert. Nach der Lokalisierung unserer ROI durch CT-Bildgebung wurde das Tier in die entsprechende Behandlungsposition durch die Roboter-Probenbühne, die vier Grad bewegt hatRees Freiheits (X, Y, Z, θ). Durch eine Kombination von Portalroboter und Stufe Winkel können Strahlen aus nahezu jeder Richtung relativ zu dem Tier geliefert werden, und stereobogenartige Behandlungen möglich sind 29. Für diese und alle anderen bildgebenden Untersuchungen wurden die Mäuse in einer Feststellvorrichtung, die die Lieferung von Narkosegas Isofluran ermöglicht, während die Bewegungsfreiheit einzuschränken positioniert. Die Immobilisierung Bett CT-kompatibel, und eine Verbindung mit dem Roboter-Probentisch 34.

Wir erwarten, dass CFIR werden konzeptionelle Fortschritte in einer Reihe von Forschungsbereichen zu schaffen. Obwohl wir radiologische Ausrichtung der Hypothalamus Medianstellung als Beweis für das Prinzip dieser Technik kann CFIR verwendet, um jede Region des Körpers eines jeden kleinen Modellorganismus im Prinzip gezielt werden. In den Neurowissenschaften, zum Beispiel stellen wir uns diese Technik verwendet, um die Funktion aktiv proliferativen Vorläuferpopulationen, die Existenz vorgeschlagen worden sind, zu bewertent in zirkumventrikulären anderen Organen wie der Area postrema 38, 39, Subfornikalorgans 40 und 41 der Hypophyse. Langjährige Streitigkeiten über die funktionelle Rolle der adulten Neurogenese und die Identifizierung eine kausale Rolle im Verhalten können nun besser angesprochen werden. In Singvogel, kann diese Technik mit der Rolle von adulten Neurogenese bei der Aufrechterhaltung der robusten und saisonale Verhalten der Vogelgesang 42, die durch die Fähigkeit zur selektiven Hemmung der Neurogenese in spezifischen Hirnregionen beeinträchtigt wurde. Das Verständnis dieser robusten Verhaltensmodell könnte neue Einblicke in die Rolle der Neurogenese bei der Regulierung anderer sexuell dimorphen Verhaltensweisen zu vergießen. Alternativ kann in der Stoffwechselfeld CFIR könnte verwendet werden, um Aspekte der Rolle von Hepatozyten-Proliferation und ihre Rolle im Stoffwechsel und Energiebilanz zu erkunden. Die Möglichkeit für die konzeptionelle Voraus in mehreren Forschungsrichtungen wird durch die Einführung dieser Technik verbessert.

43, 44 erreichen kann. Daher verallgemeinern wir dieses Protokoll mit CFIR Schritte für alle Forschungsplattformen eher als diejenigen, die spezifisch für SARRP erforderlich. Die Vorteile gegenüber bisherigen CFIR radiologischen Ansätze Genese hemmen, dass diese Technik ermöglicht dreidimensionale volumetrische Bildführung für die Lokalisierung und Ausrichtung der Dosis, konforme Dosis minimiert Einwirkung nontargeted Hirnregionen und hoher Präzision Strahlgeometrie ermöglicht konforme Dosisverteilung mit scharfen Strahl Grenzen. Wir beschreiben, wie CT-gesteuerte Bildgebung zu verwenden, um die Dosis zu einer bestimmten anatomischen Region ansprechen und auf diese Weise, wie man die Strahlung visualisierenDosisverteilung direkt im Gewebe unter Verwendung von immunhistochemischen Färbung für γ-H2AX, einem Marker der DNA-Doppelstrangbrüche 35, 45-48. Die Verwendung dieses Ansatzes für die selektive Bestrahlung der neurogenen Nischen kann erhebliche Auswirkungen in enthüllt die funktionelle Rolle der neuen Erwachsenen-geboren Neuronen auf Physiologie und Krankheit.

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Protocol

Tiernutzungs

Holen Sie die Genehmigung von institutionellen Animal Care und Verwenden Ausschuss für Standard-Pflege und Nutzung Protokolle. Das derzeitige Protokoll wurde für Brenn Bestrahlung Studien über 5,5-10 Wochen alten erwachsenen C57BL6 / J-Mäusen entwickelt, wie früher beschrieben (Fig. 2) 2. Aber auch andere Zeiten und kleine Tierarten (Ratte, Hamster, Eichhörnchen Boden, etc.) können ebenfalls verwendet werden, sofern eine wirksame Anästhesie-Protokolle und ein Röntgenreferenz Atlas zur Identifizierung des interessierenden Bereich (ROI) zur Verfügung.

1. Kalibrierung von CT-gesteuerte Radiological Platform

Führen filmbasierten Kalibrierungen für Strahlungsdosis auf die radiologische Plattform im Voraus für jeden Kollimator Größe und Art der Röntgenröhre Filter verwendet. Um einen Bogen Strahl der Bestrahlung in der gewünschten Zielort Ziel, verwenden Sie die Strahlendosis-Planungs-Software 49 available für die meisten kommerziellen Strahlung Plattformen erforderlichen Lieferzeit zu berechnen, basierend auf der Strahlungsdosis, die Tiefe der Region von Interesse (ROI) auf Basis von CT-Scans der Maus, und die Rotationsgeschwindigkeit des Roboterplattform, werden Einzelheiten hierzu ausgelassen dieses Protokolls, wie sie zwischen der Strahlung Plattformen unterscheiden. Für die Zwecke der Sichtbarmachung der ventrobasalen Hypothalamus 2 (Fig. 3) mit der CT-Bildgebung, betreiben die Röntgenröhre mit einer 0,4-mm-Brennpunkt-und Strahlenergie von 100 kVp mit 1 mm Al Filtration. Für Schwer Bestrahlung des HPZ, betreiben die Röntgenröhre bei 225 kVp, 13 mA und einem 1-mm-Brennfleck mit Filtration von 0,15 mm Cu, bis 10 Gy Strahlung bei einer Gewebetiefe von 0,6 cm über einen Behandlungs liefern Zeit von 4,6 min. Targeting zwischen verschiedenen ROIs wird die Berechnung verschiedener Parameter erforderlich.

  1. Wenn die Untersuchung der Auswirkungen des hohen Fett-Diät auf die Neurogenese in der Median-Eminenz, wie zuvor beschrieben 2, erhalten vier Wochen alten weiblichen C57BL6 / J-Mäuse von Jackson Maus-Labors, und Haus vier Mäuse pro Käfig. Schalten Sie Lebensmittel aus normalen Futter zu einem hohen Fett-Diät an fünf Wochen alt. Lassen Mäuse auf neue Wohnung und Nahrung zu gewöhnen. Führen CFIR Behandlung bei 5,5 Wochen alt. Transport unterzieht, um den OP, die die radiologische Plattform enthält. Minimieren Sie Stress während der Übertragung. Bereiten Isofluran-Gasnarkose Kammer. Dann fügen Sie eine einzelne Maus in die Kammer. Parallel dazu bereiten Heizkissen (niedrige Einstellung) zur Nachbehandlung.
  2. Sobald Maus ist unter und reagiert nicht mehr auf Fuß-Pad Kompression, bringen das Thema auf die radiologische Plattform und legen Sie auf der Immobilisierung Bett des Roboter-Bühne. Zeigen Mund Subjekts in die Nase Kegel Anästhesie Tasse, und die Zähne in der Aufbiss (Abbildung 1D). Legen Maus flach auf dem Bett und Immobilisierung zu überprüfen, um zu sehen, ob es weiterhin pflegen Teilnahmslosigkeit. Wenn dem so ist, kleben Maus nach unten auf das Bett mit Gaze-Band. Während Abklebewerkzeugs die Maus auf dem BettSicher, dass der Kopf auf eine horizontale Ebene eingeebnet. Dies kann durch Hochziehen der Ohren und sehen, ob sie eingeebnet werden bestimmt werden. Sobald sich die Maus in der richtigen Position, schließen Sie die Führung Schutzschild.
  3. Erwerben Sie die Computer-Tomographie-Scan mit On-Board-Software des radiologischen Plattform des Experimentators (dies wird zwischen den Plattformen unterscheiden), die eine dreidimensionale anatomische Struktur Scan der Maus Thema zur Verfügung stellt. Überprüfen Sie, ob die Mauskopf in der horizontalen Ebene eingeebnet. Wenn nicht, wiederholen Sie die Schritte von 1,2 bis 1,3, bis der Kopf des Patienten wird eingeebnet.
  4. Identifizieren ROI von CT-Bild. Berechnen Abstand ROI an der Oberfläche des Schädels unter Verwendung eines 45 °-Winkel zu der horizontalen Ebene, wie in Fig. 3E gezeigt.
  5. Mit On-Board-Software, nehmen Sie ein X-ray des Maus-Thema von oben wie in 4A gezeigt. Entfernen Sie dann mit der Maus aus der radiologische Plattform, setzen auf Heizkissen und aktiv bis zu überwachen.
  6. Von den koronalen CT-Bilder, die Berechnung der durchschnittliche ROI anatomischen Tiefe von mindestens drei Mäusen, um die Liefer Dosierung zu bestimmen. Als ein Beispiel einer früheren Studie 2 wurden 10 Gy Bestrahlung wurde der ventrobasalen Hypothalamus verabreicht wird, die Tiefe des ROI aus dem Schädel (von 45 °) beträgt 0,66 cm (siehe Fig. 3E). Wissend, dass die Forscher die Dosis Planungssoftware (DPS) auf ihre radiologische Plattform installiert, um die entsprechende Drehgeschwindigkeit und Dauer der Behandlung zu berechnen, um die gewünschte Dosis auf den ROI zu erzielen.
  7. Nach der Bestimmung der Behandlungsdauer und der Drehgeschwindigkeit des Roboterstufe mit der Dosisplanungssoftware messen Dosisverteilungen der berechneten Parameter mit GAFCHROMIC strahlungsempfindliche Filme in einer wasseräquivalenten Kunststoff Mock-Mausmodell eingebettet. Um dies zu tun, betten drei GAFCHROMIC strahlungsempfindlichen Filmen, die zwischen vier vertikal gestapelten Wasser-Äquivalent Kunststoffblöcke 29 alsin Fig. 4B gezeigt.
  8. Zeigen Mock-Maus-Modell enthält GAFCHROMIC Roboter-Filme auf der Bühne, und führen Sie den Brennstrahl Bestrahlung mit den neu berechneten Parameter. Zum Beispiel, um die ventrobasalen Hypothalamus, Eingangs Ziel die Parameter von 0,15 mm Cu-Filter, 225 kVp, 13 mA, 1 mm Durchmesser Strahl Einstellung, 45 ° Gestellwinkel, 1,3 ° / sec Rotation, und 4,6 min, eine ROI erzielen Strahlendosis von 10 Gy.
  9. Nach der Bestrahlung, überprüfen Filme für Muster und Intensität der Strahlendosis. Für eine 360 ​​°-Winkel Drehung mit den aufgeführten, die ventrobasalen Hypothalamus, einen dunklen Ring in dem Film über das Isozentrum, einem kleinen Ort knackig im Isozentrum Film und einem helleren Ring in dem Film unter dem Isozentrum entsprechend der Kegel-Zielparameter Strahl Verabreichung der Bestrahlung beobachtet werden (Fig. 4B).
  10. Lagern Isozentrum GAFCHROMIC Film über der X-Strahlen der Maus Fächern, aus denen die Parameter waren calnete. Die bestrahlte Brennpunkt an Isozentrum der gewünschten ROI Region überlappen, wie in Fig. 4C gezeigt.

Alternative Methode: Wenn Schwierigkeiten bei der Ausrichtung der ROI Gehirn bestehen, verwenden Jodkontrastmittel intrathekal injiziert, um Visualisierung der Herzkammern unter CT-Bilder zu verbessern. Aus Gründen der Kürze wird dieses Verfahren aus diesem Protokoll verlassen, aber vorher beschriebenen 35, 50. Jod-Kontrast zusätzliche ventrikuläre Sehenswürdigkeiten (5A) zu liefern.

2. Die Genauigkeit der Bestimmung der Bestrahlung Strahl

Ferner bestätigen CFIR Strahlgenauigkeit durch direkte Visualisierung des Strahlenbündels in Gewebe 2, 35, 51. Um dies zu tun, führen die Immunhistochemie an γH2AX 51, eine Histon-Protein und ein früher Marker von DNA-Doppelstrangbrüche zu erkennen. Maus Personen müssen transkardial perfundiert und innerhalb einer Stunde nach der Bestrahlung fixiert werden. Nach der Bestrahlungation, DNA-Reparatur schnell Ensues, und die Höhe der ΥH2Ax 35 deutlich sinken.

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,3.
  2. Nachdem das Ziel auf CT identifiziert, wird die Maus Thema unter Robotersteuerung bewegt, um dieses Ziel mit der Strahlung Lieferung Strahl auszurichten. Eingangs berechneten Parameter (Drehzahl und Dauer der Behandlung, um die gewünschte Dosierung zu erreichen) aus Schritt 1.6 in Dosisplanungssoftware und die Behandlung beginnen. Behandlung geliefert mit der Gantry wies auf 45 ° von der Vertikalen, während die Maus rotiert um eine vertikal ausgerichtete Achse.
  3. Nach der Bestrahlung durchzuführen transkardialer Perfusion auf Maus Themen. Führen Perfusion innerhalb einer Stunde 52. Nach Perfusion, Tauch fix Gehirne in 4% PFA / PBS und schaukeln über Nacht bei 4 ° C
  4. Am folgenden Morgen, waschen 5 min in PBS 3x zu Para Fixiermittel zu entfernen. Dann Eintauchen in 30% Saccharose in 1 × PBS auf einem Schüttler bei 4 ° C.
  5. Vorsichtig bei 4 ° C (us rockenmanuell 12-16 h), bis Gehirn sinkt zum Boden des Röhrchens. Dies dient als Gefrierschutz Schritt. Sobald Gehirn sinken, entfernen Gehirn mit einem Schaumlöffel, um überschüssige 30% sucrose/1x PBS Übertragung zu verhindern. Schnell in Gefriermedium auf Trockeneis einbetten. Swirl Gefriermedium mit Pipettenspitze und richten Gehirn in Plastikform.
  6. Einmal vollständig gefroren, über Gehirn Blöcke zu -20 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
  7. Am Tag, als die Immunhistochemie durchgeführt werden, koronalen Abschnitt bei 40 um Dicke, und schweben in einer 24-Well-Platte mit PBS mit einem dünnen Pinsel. Die Schnitte werden in der richtigen Serienauftrag für die Immunfärbung der Bestrahlung Abdeckung der Zielregion zu bestimmen, gehalten werden.
  8. Vorwärmen 0,01 M Natriumcitrat-Lösung auf 80 ° C im Wasserbad in Vorbereitung für Antigengewinnungsschritt. Gleichzeitig, während die Natrium-Citrat wärmt, führen Sie 5 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS.
  9. Sobald Natriumcitrat Lösung ist bei 80 ° C, tauchen Gehirnschnitte in die Natriumcitrat-Pufferlösung. Verlassen in einem Wasserbad bei 80 ° C für 1 Stunde.
  10. Abschnitt entfernen und lassen Natrium-Citrat-Lösung auf Raumtemperatur zu erreichen, führen drei 5-minütigen Waschschritten in 0,01 M PBS.
  11. Blockieren Gehirnschnitte für 1 Stunde in PBS-Triton mit 5% normalem Ziegenserum.
  12. Inkubieren über Nacht Hirnschnitte in PBS-Triton enthaltend 5% normales Ziegenserum 1:700 Konzentration von Maus-Anti-phospho-H2AX primären Antikörper bei 4 ° C.
  13. Am nächsten Tag durchführen 15 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkubieren Gehirnschnitte PBS-Triton enthaltend 5% normales Ziegenserum Ziegen-Anti-Maus-sekundären Antikörper bei 488 nm Fluorophor konjugiert 2 h bei 1:500 Konzentration.
  15. Führen Sie 15 Minuten wäscht 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  16. Führen 4 ',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Färbung (1:5000 in PBS) für 10 min auf Kern visualisieren. Dann waschen Hirnschnitte für 5 min mit PBS.
  17. Montieren Sie an elektrostatisch charged Objektträger durch schwimmende Abschnitt in PBS. Wischen Sie überschüssiges PBS und Folien erlauben, um zu trocknen. Deckglas der Objektträger mit Montagemedium und lassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht trocknen.
  18. Machen Sie Fotos von Serien koronalen Abschnitte mit Fluoreszenzmikroskop. ΥH2Ax Immunfärbung (grün) zeigt Ort der Bestrahlung. DAPI (blau) ist eine Kernfärbung (Abbildung 5B).

3. Herstellung von Maus-Themen für Focal Bestrahlung

Untersuchen ΥH2Ax Immunfärbung Ergebnisse. Einmal mit der Kalibrierung zufrieden und Targeting des Bestrahlungsstrahl, fahren Sie mit dem Experiment. An diesem Punkt wird die Gesamtzeit, erforderlich, um eine Maus (aus tierischen Einrichtung zur Vervollständigung des Strahlabgabe) zu behandeln, ist etwa 10-15 Minuten für eine 10-Gy-Behandlung mit einer 1-mm-Strahl.

  1. Bestellen vier Wochen alten C57BL6 / J weibliche Mäuse von Jackson Maus Labors. Haus vier Mäuse pro Käfig, und schalten Sie Lebensmittel aus normalen Futterauf eine fettreiche Diät an fünf Wochen alt. Ohrstanzmäuse, sie zu eindeutigen Identifizierungszeichen zu geben. Überwachung der Gesundheit der Mäuse täglich. Hinweis: metallische Marker können nicht verwendet werden, wie sie in Streifenartefakte auf dem CT-führt.
  2. Wiegen Mäuse am Tag vor der Strahlung oder Scheinbehandlung. Split Mäuse in zwei Kohorten für Strahlung oder Scheinbehandlung und sicherzustellen, dass es keinen signifikanten Unterschied im Gewicht zwischen Kohorten. Am Tag der Behandlung, wenn die Mäuse sechs Wochen alt, nochmals wiegen alle Mäuse und erfassen ihre Masse. Beide Kohorten vorsichtig transportieren, um die radiologische Plattform. Achten Sie darauf, Stress zu minimieren.
  3. Bereiten Isofluran-Gasnarkose Kammer. Anesthetize zwei Mäuse, eine in der vorgegebenen Bestrahlungsgruppe, und ein anderer in der Schein-Kontrollgruppe. Bereiten Heizkissen in der niedrigen Einstellung für die postoperative Behandlung eingestellt.
  4. Folgen Sie den Schritten von 1,2 bis 1,4 für die Maus auf die Bestrahlung zu erhalten. Für die Schein-Maus, halten Sie die Maus in der Anästhesie während der Behandlung Kammer vor sich geht. Machen sure, dass Anästhesie Kammer ist in der Nähe der Plattform, so CFIR alle Auswirkungen auf die Umgebungsstrahlung sind eingepreist Nachdem das Ziel auf CT identifiziert, bewegen Sie die Maus Thema unter Robotersteuerung, um dieses Ziel mit der Bestrahlungsstrahl auszurichten. Eingangs berechneten Parameter (Drehzahl und Dauer der Behandlung) in Dosisplanungssoftware.
  5. Nach Bestrahlung Behandlung abgeschlossen ist, kehren beide Schein und bestrahlten Mäusen zu Heizkissen und überwachen, bis sie aufwachen.
  6. Zurück sowohl Schein und bestrahlten Mäusen zu Tieranlage. Überwachung jeden Tag. Wiegen Sie die Mäuse jede halbe Woche. Um gezielte Bestrahlung von Hypothalamus proliferative Zone bestätigen, verwalten intraperitoneale Injektion von BrdU (50 mg / kg) 3 Tage nach der Behandlung und untersuchen die Neurogenese zwischen Gruppen von colabeling Immunhistochemie für BrdU und einem neuronalen Marker einen Monat nach Anfangs BrdU-Exposition (Abbildung 6) 2.

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Representative Results

Beurteilung der CT-gesteuerten Targeting und Genauigkeit

Die mechanische Kalibrierung des Systems ist für die Gewährleistung, dass Strahlen, die von verschiedenen Winkeln schneiden sich alle in einem einzigen Punkt. Die Kalibrierung erfolgte mit einem halbautomatischen bildgestützte Verfahren, bei dem die Ausrichtungsgenauigkeit Ende-zu-Ende wurde gemessen zu 0,2 mm 29 bewerkstelligt sein. Diese Genauigkeit ist sehr kritisch, da das Volumen des Hypothalamus Median Eminenz Struktur ist klein 2. Um diese Kalibrierung zu testen, messen wir Dosisverteilungen mit GAFCHROMIC strahlungsempfindliche Filme in einer Wasser-Äquivalent Kunststoff Mock-Maus-Modell 35 (4B) eingebettet. Kurz gesagt, ein CT-Scan der Maus Thema wurde genommen, und unsere ventrobasalen Hypothalamus Zielstelle identifiziert. Lieferung und Drehzahl berechnet und die entsprechende Kollimator und Filtration wurden angebracht, um sicherzustellen, 10 Gy von Strahlung geliefert wurde. Ein Mock-Maus-Modell aus einer Wasser-equivalen konzipiert t Kunststoffstruktur mit GAFCHROMIC strahlungsempfindlichen Filmen eingebettet wurde dann für die echte Maus unterworfen Dosisverteilung bei verschiedenen Brennebenen messen substituiert. 4B zeigt End-to-End-Testergebnisse von einem Lichtbogen Behandlung mit 1-mm-Durchmesser Strahl mit GAFCHROMIC Filme in einem Mock-Maus-Plattform. Die Gantry wurde in einem 45 °-Winkel in Bezug auf die Scheinmausmodell einstellen, während die Roboter-Probentisch wurde um eine vertikal ausgerichtete Achse gedreht wird, Erzeugen eines "Lichtbogen" oder Strahlungskegel. Die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) ist 2,31 mm, was größer als 1,0 mm ist, da die Bögen treffen auf die Folie in einem Winkel. Theoretisch ist die Strahlgröße bei diesem Winkel sollte 2,0 mm betragen. Die in Fig. 4 gezeigte Brennstrahlflecks zeigt die präzise Ausrichtung von Strahlen aus unterschiedlichen Richtungen. Dieser Film kann auf der Oberseite der Maus realen Gegenstand überlagert werden, was zeigt, Strahlposition und Präzision (4C).

e_content "> Mit einem Durchmesser von 1 mm Strahlkollimator wurde ein Lichtbogentechnik verwendet werden, um 10 Gy auf den Zielpunkt in unserem Maus Thema zu liefern. Vorherige Messungen 29 zeigen, dass diese Technik sehr geringe Strahlendosen (<0,1 Gy) außerhalb der 1 Ziel mm. Der Bereich der Hypophyse und der umgebenden Strukturen ist deshalb wirksam von Brenn Bestrahlung des Hypothalamus ventrobasalen abgeschirmt. Die Genauigkeit der Strahlzielen in früheren Studien gemessen wurden, innerhalb von 0,2 mm sowohl in Phantom Tests 29 und Gewebeschnitte 35 .

Obwohl nicht erforderlich, können CT-geführte Targeting des ROI durch einen injizierten intrathekale Jod Gegensatz zu erweitern verbessert werden CT-geführte Targeting für das Gehirn Anwendung (Fig. 5A). Da dies eine invasive und umständliche Prozedur ist dieser Kontrast nicht häufig verwendet, und in diesem Protokoll beschrieben. Details zu diesem Protokoll kann in Ford et al. 201 gefunden werden1 und Chaichana et al. 2007. Die Vorteile dieser jodhaltigen Kontrast sind, daß die seitlichen und dritten Ventrikel eindeutig auf einer CFIR radiologische Plattform (5A) erfassten CT-Scans sichtbar gemacht. Das Ziel war die mediane Eminenz, an der Basis des dritten Ventrikels und wurde mit CT-gesteuerte Navigations-Software und automatisch in die Roboterpositionierung Schnittstelle importiert identifiziert. Bony Schädelstrukturen wurden identifiziert und als anatomische Orientierungspunkte für nachfolgende Studien, in denen Jod Kontrast nicht eingesetzt wurde.

Beam-Targeting-Validierung mit γ-H2AX

Um weiter zu bestätigen unsere CT-gesteuerte Targeting der Hypothalamus ME, visualisiert wir die 1-mm-Bestrahlung Strahl in Gewebe durch indirekte Untersuchung der Doppelstrang-DNA-Brüche, die nach der Bestrahlung auftreten. Histon H2AX-Protein wird nach der DNA-Doppelstrangbrüchen phosphoryliert. γ-H2AX wurde weithin im Gehirn und anderen Geweben verwendet 46 -48, und die Zahl der γ-H2AX + Foci scheint gut mit Strahlung zu korrelieren Dosis über einen breiten Bereich von Dosen 51, 53. Wir haben beobachtet, klare Visualisierung des Strahls folgenden γ-H2AX-Immunfärbung (Abbildung 5B). Resultierende γ-H2AX-Färbung zeigte eine präzise Ausrichtung der erwarteten Lage. Die Strahlrand war auch extrem scharf, im Einvernehmen mit Film-basierten Physik Inbetriebnahme Messungen, die eine 20-80% Penumbra von 0,3 mm 54 anzuzeigen. Wir zuvor gemessenen des Abstandes zwischen dem beabsichtigten Ziel und dem Zentrum des Strahls in den Gewebeschnitten 35 visualisiert. Die Mitte des Strahls aus dem beabsichtigten Ziel durch einen mittleren Abstand von 0,19 ± 0,36 mm (Standardabweichung) in 10 bestrahlten Mäusen nach Berücksichtigung Effekte von Gewebeschrumpfung während der Fixierung und Verarbeitung 35 versetzt.

Verwendung eines stereoähnlichen Bogenbehandlung, bestehend aus einem Bogen von 45 ° von der Vertikalen, wirzeigen, wir waren in der Lage, effektiv Ziel der ventrobasalen Hypothalamus, ohne Bestrahlung anderen neurogenen Nischen (5C-D). Bestrahlung der Umgebung war minimal, und es gab eine Grenze bei Strahlenbelastung von GAF chromen Film (4B) und γ-H2AX Immunfärbung (Fig. 5B-D) gezeigt. Das Gewebe dorsal des Hypothalamus ME zeigt Licht γ-H2AX-Färbung (5B), weil die Strahlung Strahlen treten durch diese Region und möglicherweise auch wegen der Erweiterung durch die Überlagerung Knochen, obwohl eine relativ harte Röntgenstrahlung verwendet wurde (225 kVp, 0,15 mm Cu-Filtration).

Auswirkungen auf die Neurogenese

Nach der Bestätigung der Spezifität der CT-gesteuerte Bestrahlung Lieferung, untersuchten wir die Wirkung von 10 Gy Bestrahlung auf Ebenen ME Neurogenese. Erwachsene Mäuse wurden einer fettreichen Diät gefüttert später, erhielt die Strahlen-oder Scheinbehandlung, und dannBrdU-Injektionen, wie zuvor beschrieben, beginnend bei 6 Wochen alt 2. Die Mäuse wurden für die Untersuchung nach 10 Wochen alt nach dem ersten BrdU-Injektion getötet, ein Monat. Bestrahlte HFD-fed erwachsenen Mäusen zeigten ~ 85% ige Hemmung der Neurogenese ME verglichen mit scheinbehandelten Kontrollen (6A) 2. Die bogenförmige Kern eine benachbarte Struktur an der Grenze des Bestrahlungsplatzes wurde für Änderungen in der Neurogenese untersucht und gefunden, daß keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den bestrahlten Tieren und schein Kontrollen (Fig. 6A) 2 aufweisen.

Funktion des Alters-Median Eminence geboren Neuronen des Hypothalamus

Änderungen in bestrahlten und schein-Mäuse wurden nach der Behandlung untersucht. Pelzmantel und Antwort zu berühren schien normal. Ein Chemie-Panel und Blutbild-Panel wurde eine Woche nach der Bestrahlung untersucht Behandlung und kein signifikanter Unterschied beobachtet (n = 9/group). In hohen Fett-fedMäuse, wo wir beobachteten eine Reduktion ~ 85% in der Erwachsenen geborene ME Neuronen einen Monat nach der Bestrahlung (6A), hatte bestrahlten Mäusen die Gewichtszunahme im Laufe der Zeit zurückgegangen im Vergleich zum Schein behandelten Gruppe (6C). Im Gegensatz Normalfutter gefüttert Kontrollmäusen, wo beobachtet Ebenen der Neurogenese ME waren deutlich niedriger als ihre hohen Fett zugeführt Gegen 2, keinen statistisch signifikanten Unterschied im Gewicht zwischen Schein gegenüber bestrahlten Gruppen (6B) haben. Interessant ist, dass diese reduzierte Gewichtszunahme in bestrahlten hohen Fett gefütterten Mäusen durch Veränderungen im Stoffwechsel und Aktivität wie zuvor im Detail von unserer Gruppe 2 (6D-I) beschrieben begleitet.

Figur 1
Fig. 1 ist. Computertomographie-gesteuerte Brenn Bestrahlung (CFIR)-Plattform. (A) CFIR verwendet eine Präzisionsbestrahlungsgerät der Lage ist, CT-gesteuerte Bestrahlung mit kleinen Balken. Ein Beispiel für eine CFIR Plattform ist die Kleintier Strahlung Forschungsplattform (SARRP). Mit Bleiabschirmung (wie gezeigt), steht die SARRP bei 81 cm (Höhe) von 58 cm (Breite) mal 41 cm (Tiefe) bei 5170 £. (B) Unter Verwendung einer Doppelquellen-Röntgenröhre an einem Portal, das um 360 ° dreht, befestigt ist, verwendet der SARRP ein Roboter steuern Probenbühne, die eine Drehung von einem Tier-Subjekt während Bestrahlung. (C) CFIR-Hardware besteht aus einer Röntgenquelle, Kollimator zusammengesetzt rotierenden Gantry, Tier-Drehroboterprobentisch, und elektronische Bildwandler. (D) Die Maus ist in einem Gegenstand Immobilisierung Bett mit Gasnarkose-Eingang auf der Roboter-Probentisch platziert. Von Armour et al. Jahr 2010. (E) CFIR Hardware sollte anpassbare Kollimator-Brennkegel für ir sind Strahlung Lieferung von verschiedenen Größen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Figur 2
2. Experimental-Paradigma. Weibliche C57BL / 6 Mäuse wurden von Jackson Maus Labors bestellt, und im Alter von vier Wochen gewöhnt, wohnhaft Käfige. Die bestrahlten oder Schein-Kohorten: Maus zu einem Thema wurden ad libitum fettreiche Ernährung an fünf Wochen alt, und in zwei Behandlungsgruppen geschaltet. Physiologische Bewertungen wurden in Längsrichtung vor und nach der Behandlung entnommen. Bestrahlung oder Schein-Behandlungen wurden bei 5,5 Wochen. BrdU intraperitoneale Injektionen wurden in sechs Wochen alten gegeben, wie zuvor beschrieben 2.

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3. Region von Interesse Lokalisierung. Die Hypothalamus-proliferative Zone (HPZ), eine neurogene Region im Hypothalamus Median Eminenz, befindet sich in der ventralen Hypothalamus mediobasal. (Erhältlich von: (A) Das HPZ Region of Interest (ROI) wird durch rote Fadenkreuz in einem 3-D-Atlas Nissl Referenzvolumen von der Allen-Gehirn-Atlas Data Portal (7,041, 7,211, 5,564 Position) hervorgehoben http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) Im koronaren Hirnschnitt des ROI in neunzehn Tage alten Mäusen. BrdU Immunhistochemie (grün) zeigt, dass der ROI (weiße Pfeilspitze) enthält proliferativen Zellen. Die Dichte der proliferativen Zellen im HPZ ist in der vorderen Achse beschränkt sich auf -1,75 mm Bregma posterior, mit der Dichte am höchsten. Gewebeschnitte sind mit DAPI Kernmarker (blau) gegengefärbt. Abbildung von Lee et al. 2012a.(CE) CT-Bildgebung auf einer Plattform ermöglicht CFIR gezielt den HPZ ROI (rote Fadenkreuz) durch Lichtbogenstrahlung Lieferung. CT-Bild der Maus Gegenstand in der horizontalen Ebene (C), sagittalen Ebene (D) und der Frontalebene (E). (E) Entfernung von der Oberfläche des Schädels auf die ROI ist 0,62 cm (rote Linie). Maßstabsbalken = 1 mm (A), 50 um (B) und 0,62 cm (CE). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
4. Kalibrierung von Strahlungs Lieferung. (A) X-ray eines Maus-Thema in der Feststellvorrichtung auf der SARRP Roboter Bühne gesichert. (B) berechnete ROI-Koordinaten einWieder eingegeben und gegen ein Schein Maus-Modell ausgerichtet. Das Phantommodell besteht aus GAFCHROMIC strahlungsempfindliche Filme in einer wasseräquivalenten Kunststoff eingebettet ist. Filme über, auf und unter der ROI Isozentrum erfassen die Dosisverteilung. Ein 45 º-Bogen Strahl vom SARRP liefert eine kegelförmige Dosisverteilung zu der ROI und konvergiert im Isozentrum (Penumbra Ort). (C) Überlagerung der Dosimetrie-Film mit 1-mm-Strahl in Phantom mit einer X-ray einer echten Maus Gegenstand (gelbe Linie) erworben. Weiß Kreis (Pfeil) zeigt 10-Gy Strahlendosis fokal zu HPZ richtet. Die gestrichelte Linie umreißt Gehirn. Steuerung von Lee et al. 2012a.

Figur 5
5. Bestätigung der Strahlenliefer. CT-Bildgebung mit Jod-Kontrast kann die Visualisierung der ROI zu verbessern, wenn die normale CT-Bildgebung nicht sufficE. (A) Maus Probanden erhielten Jod Kontraste wie zuvor beschrieben (Steuerung von Lee et al. 2012). CT-Bilder im koronalen, horizontalen und sagittalen Ebene von links nach rechts dargestellt. (B) Bestätigung der Bestrahlungs in Gewebe durch Immunhistochemie für γH2AX, einem Marker der DNA-Doppelstrangbrüche festgestellt werden. γH2AX-Immunfärbung zeigt Strahl Lieferung an den ROI HPZ im ventralen Hypothalamus mediobasal richtet. γH2AX Immunfärbung ist im Subventrikularzone der lateralen Ventrikel (C) oder der Subgranularzone des Hippocampus (D) von der gleichen Maus Subjekt beobachtet. (BD) Die Schnitte werden mit DAPI (von Lee et al. 2012a) gegengefärbt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .


6. Brenn Hemmung der Neurogenese ME Ergebnisse zu Veränderungen in Gewicht und Stoffwechsel. (A) Die mediane Eminenz (ME) in der ventralen Hypothalamus mediobasal wurde für die Bestrahlung gezielt. Der Nucleus arcuatus (ARCn) ist das Nachbar anatomische Struktur. Einen Monat nach der Behandlung ist der Anteil der BrdU + Hu Neuronen aus Schein gegenüber bestrahlten Kohorten wurden immunhistochemisch in der ME und ARCn quantifiziert. Stufen der Neurogenese ME wurden in bestrahlten deutlich reduziert im Vergleich zu Schein-Kohorten (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Stufen der Neurogenese ARCn nicht betroffen waren (n = 3/cohort, ns = nicht signifikant). (B) Normalfutter gefüttert (NC) und (C) hohe Fett zugeführt (HFD) Mäuse wurden in Längsrichtung auf Veränderungen im Gewicht untersucht nach Bestrahlung oder Schein treatment (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) Ein Monat nach der Behandlung bestrahlt und Schein behandelt HFD-gefütterten Mäusen wurden durch quantitative Resonanzspektroskopie zur Analyse von%% Fettmasse und Muskelmasse untersucht. Bestrahlte Mäuse hatten deutlich weniger% Fettmasse und deutlich mehr Muskelmasse% als Schein-Kontrollen (n = 5, * = p <0,05). Gesamtmasse: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (bestrahlte) 18,86 ± 0,4 g; Lean Masse: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (bestrahlte) 13,9 ± 0,3 g; Fettmasse: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( bestrahlten) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Bestrahlte und Schein behandelten erwachsenen Mäusen wurden in einem Tierlabor Umfassende Monitoring System (Venusmuscheln) zur gleichzeitigen Messung der Nahrungsaufnahme, körperliche Aktivität, und die Ganzkörper-Stoffwechselprofiling zwei Wochen nach der Behandlung gelegt. Nach der Akklimatisierung in der Testkammer wurden bestrahlten Mäusen beobachtet haben significantly größeren Energieaufwand, Gesamtaktivität und VO 2 (ml / kg / h) im Vergleich zu Scheinkontrollen während des dunklen Abschnitts von dem Tag (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) Kein signifikanter Unterschied wurde in der Atmungsaustauschrate (RER) (n = 11, 12). Teilfigur A von zuvor in Lee et al. 2012a und Lee et al. 2012b veröffentlichten Daten erzeugt. Teilfiguren CI von Lee et al. 2012a. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

CT-gesteuerte Brenn Bestrahlung (CFIR) ist eine neue und vollständige Systemansatz der Lage ist, Strahlungsfelder, Ziele in kleinen Tiere unter Robotersteuerung mit CT-Führung 32. Die Fähigkeit CFIR hoch fokussierten Strahlen auf kleine Tiermodellen liefern stellt neue Forschungsmöglichkeiten für Laborforschung und klinische Übersetzung brücken. Dieses Papier beschreibt die CFIR Ansatz für die präzise Bestrahlung Lieferung, gezielt eine Hypothalamus neuralen Vorläufer Bevölkerung. Wir zeigen hier, wie Sie durch Immunhistochemie kalibrieren und bestätigen Strahlung Lieferung Spezifität über X-ray-Film und im Hirngewebe.

Außerdem zeigen wir, wie diese Technik verwendet, um die Neurogenese in einer bestimmten Hirnregion zu hemmen. Wir zeigen, dass wir in der Lage, um die ventrobasalen Hypothalamus im Median Eminenz gerichtet sind, und die Neurogenese hemmen, ohne dabei Ebenen der Neurogenese im benachbarten Strukturen. Hemmung der ME Neurogenese wird durch Veränderungen im Stoffwechsel und Aktivität, sowie reduzierte Gewichtszunahme auf einem hohen Fett-Diät in bestrahlten gegen Scheinbehandlungsgruppen (Abbildung 6) 2 begleitet. Diese Daten legen nahe, eine Rolle für diese Erwachsenen-geboren Neuronen im Hypothalamus regulieren den Stoffwechsel und die Energie-Homöostase. Darüber hinaus schlägt er vor, dass ein Überschuss fettreiche Ernährung kann entscheidend Stoffwechselschaltung auch im Erwachsenenalter 3 ändern. Unsere Ergebnisse stellen eine wichtige Erweiterung der bekannten Funktion der Erwachsenen-Neuronen geboren, und wirft Licht auf eine neue Hypothalamus neuralen Vorläuferpopulation 3. Mögliche Einschränkungen bei diesem Ansatz ist, dass die Bestrahlung hemmt die Proliferation Vorläufer anstatt Neurogenese an sich und ist somit auch möglich, dass physiologische Veränderungen nach der Behandlung kann teilweise durch Störung der anderen erwachsenen Zellbildung berücksichtigt werden. Künftige Schritte wird die Entwicklung der genetischen Werkzeugen, um die Verbreitung dieses spezifischen neuralen Vorläufer p hemmenEVÖLKERUNG, die wesentliche Klarheit in die funktionelle Rolle dieser Vorläuferzellen und deren Nachkommen spielen bei der Regulierung der Physiologie 3 liefert.

Zusammengenommen jedoch dient diese radiologische Plattform als wichtiger Ausgangspunkt bei der Durchführung von mittlerem Durchsatz Bildschirme auf neuralen Vorläuferzellen und deren Nachkommen. Diese radiologische Technik ist nicht beschränkt auf die Fragen in den Neurowissenschaften zu erforschen, aber, und wir erwarten, dass CFIR der konzeptionellen Fortschritt in einer Reihe von Forschungsdisziplinen zu erweitern. Die jüngste Verfügbarkeit kommerziell verkauft radiologischen CT-gesteuerte Plattformen bietet eine Gelegenheit für Forscher, um diese Fähigkeiten dieser Plattform für ihre Forschungsfragen verwenden (Abbildung 1). Mehrere Alternativen sind im Handel erhältlich, mit denen man Bild-geführte Kleintier Bestrahlung durchzuführen. Darüber hinaus können CT-gesteuerte Brennbestrahlungssysteme auch im Haus gebaut werden, wie der Fall mit der für diese s verwendete System warTUDIEN an der Johns Hopkins 29-33, 35.

Die Durchführung dieser Grad der Schwer Targeting erfordert eine entsprechende Kalibrierung und Ausrichtung der ROI. Während diese Technik wird zunächst nehmen Training, um sich mit dem CFIR Plattform und ihre Dosis-Planungs-Software vertraut sind, ist der Betrieb des Gerätes nach dem Verständnis des Protokolls und der Funktionalität der Plattform und ziemlich einfach. Es wird empfohlen, dass die Betreiber Praktiken Kalibrierung der Strahl mehrmals vor der Ausführung umfassende Längs Experiment. Das heißt, einmal in den Betrieb CFIR fließend, sollten Studien schnell zu bewegen.

Diese hier beschriebenen CFIR Protokoll verwendet dreidimensionale Volumenbildführung für die Lokalisierung und Targeting der Dosis. Konforme Dosis minimiert die Exposition gegenüber nontargeted Hirnregionen, hohe Präzision und Strahlgeometrie ermöglicht konforme Dosisverteilung mit scharfen Strahl Grenzen. Dies erlaubt es, Fragen zu stellen regarding der Funktion des Erwachsenen stamm Neuronen, sondern eröffnet auch Bereiche stellen die Rolle der Zellproliferation in den Bereichen Physiologie, Tumorbiologie und Immunologie. Dieses Verfahren kann auf verschiedene Weise mit Kontrastfarbstoffe und Biolumineszenz erweitert Visualisierung 35, 56 zu verbessern. Es sind Bemühungen im Gange, um CFIR Hardware-Fähigkeiten weiter zu verbessern, und die Plattform wird nun modifiziert, um eine On-Board-Positronen-Emissions-Tomographen 56 umfassen. Diese werden den Ausbau von Werkzeugen zur Verfügung, die Forscher und Hilfe bei der Übersetzung Entdeckungen an der Bank auf dem Bett zu erleichtern.

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Disclosures

JW hat eine Forschungsförderung und Beratung Abkommen mit Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Wir danken C. Montojo, J. Reyes, und M. Armour für die technische Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschuss F31 NS063550 (DAL), ein Basil O'Connor Starter Scholar-Preis und Zuschüsse aus dem Fonds und NARSAD Klingenstein (SB) unterstützt. SB ist ein WM Keck Distinguished Scholar Junge in der medizinischen Forschung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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