Summary
La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un'area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.
Abstract
La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa. Approcci per inibire neurogenesi adulta tramite consegna virale invasivo o animali transgenici hanno potenziali confonde che rendono l'interpretazione dei risultati di questi studi difficile. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di indagare in modo non invasivo la funzione di selezionare gruppi di neuroni adulti nati attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti Focal inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni e consente il targeting di specifiche regioni progenitrici neurali. Per illuminare il potenziale ruolo funzionale che la neurogenesi adulta ipotalamico svolge nella regolazione dei processi fisiologici, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti nati nel eminenza mediana dell'ipotalamo. Descriviamo un metodo per C omputer tomografia-guidaf Ocal ir radiazione (CFIR) la consegna per consentire preciso e accurato anatomica di targeting in piccoli animali. CFIR utilizza l'orientamento dell'immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose di radiazione, riduce al minimo l'esposizione alle radiazioni regioni cerebrali nontargeted, e consente la distribuzione della dose conforme con i confini del fascio taglienti. Questo protocollo permette di porre domande riguardanti la funzione dei neuroni adulti di nascita, ma apre anche le aree a domande nei settori di radiobiologia, biologia dei tumori, e dell'immunologia. Questi strumenti radiologici faciliteranno la traduzione di scoperte al banco al capezzale.
Introduction
Recenti scoperte hanno dimostrato che il cervello dei mammiferi adulti può subire un notevole grado di plasticità. Neuroni nati adulti, vengono generati durante l'età adulta in nicchie specializzate del cervello dei mammiferi 1. Qual è la funzione di questi neuroni adulti nati? E tanto più, non giocano un ruolo nella fisiologia e del comportamento? Studi su questo argomento sono tradizionalmente focalizzati sulla zona subventricular dei ventricoli laterali e la zona subgranulare dell'ippocampo, tuttavia, studi recenti hanno caratterizzato neurogenesi in altre regioni del cervello come l'ipotalamo mammifero 2. Neurogenesi è stata riportata nel postnatale e adulta ipotalamo 2-10, e la funzione di questi neuroni ipotalamici neonati rimane un'area attiva di ricerca.
La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa per il campo delle neuroscienze in generale. L'inibizione selettiva di specific popolazioni progenitrici neurali resta limitata dalla mancanza di marcatori molecolari disponibili che sono unici per singole popolazioni progenitrici neurali 11. Così, l'eliminazione selettiva dei neuroni adulti nati da questi progenitori neurali tramite il targeting genetico rimane difficile. Allo stesso modo, la consegna virale di indirizzare neuroni adulti nati soffre di potenziali variabili confondenti quali l'introduzione di lesioni e infiammazioni nell'ambiente 12.
Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di aggirare queste confonde e indagare queste domande attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni, e permette un metodo non invasivo per indirizzare le popolazioni progenitrici neurali 13-15. Recentemente, abbiamo descritto una regione germinale dell'eminenza mediana dell'ipotalamo mammiferi (ME) che abbiamo chiamato la zona proliferativa ipotalamico (HPZ) 2 2. Per verificare se neurogenesi adulta all'interno della ME ipotalamo regola il metabolismo e il peso, abbiamo cercato di interrompere questo processo. L'eminenza mediana è una piccola struttura unilaterale alla base del terzo ventricolo da cui vengono rilasciati ormoni regolamentazione. Al fine di inibire la proliferazione e la successiva neurogenesi senza alterare le altre funzioni fisiologiche di questa regione del cervello, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti appena nati nel eminenza mediana ipotalamico 2.
Un certo numero di gruppi hanno impiegato radiazione per sopprimere la neurogenesi nelle regioni canonici 14-28. Tuttavia, gli approcci radiologici precedenti hanno generalmente mirata grandi aree, o often involontariamente preso di mira anche diverse aree cerebrali in cui e 'stato segnalato neurogenesi, il che rende difficile associare in modo univoco tutti i difetti comportamentali osservati con difetti in specifiche popolazioni progenitrici neurali. La capacità di irradiazione più mirato è fornito dalle piattaforme radiologiche che combinano c omputer tomografia guidata con radiazioni Ocal f fascio ir (CFIR) la consegna per consentire precisa anatomica di targeting 29-36. Fasci di radiazioni fino a 0,5 mm di diametro sono a disposizione per indirizzare specifiche popolazioni progenitrici neurali 35. Questa metodologia ci permette di indirizzare il ME ipotalamo e l'arresto della proliferazione e blocchiamo la neurogenesi nei piccoli animali. Dopo il trattamento radiologico nelle popolazioni progenitrici, prove funzionali e comportamentali possono essere eseguite per illuminare la funzione potenziale di cellule adulte-nato. Il targeting focale è particolarmente importante per la nostra applicazione in quanto laghiandola pituitaria si trova vicino alla eminenza mediana dell'ipotalamo, irradiazione dell'ipofisi può influenzare la funzione ormonale e successivamente confondere risultati.
La base biologica per la soppressione della neurogenesi dopo irradiazione rimane ancora poco chiaro. Gli studi di radiazione precedenti hanno fatto affidamento su grandi travi della zona, e hanno concluso che la soppressione della neurogenesi è mediata da una risposta infiammatoria 14, 37. Come tale non è chiaro se l'irradiazione altamente focale potrebbe sopprimere la neurogenesi, dal momento che non evoca una risposta infiammatoria notevole. Tuttavia, studi recenti nostro gruppo del classico regione neurogenica nell'ippocampo hanno dimostrato che l'irradiazione altamente focale con una dose di 10 Gy può sopprimere neurogenesi per almeno 4 settimane dopo l'irradiazione 35.
Per interrogare la funzione di adulti nati neuroni ipotalamici nella eminenza mediana, usiamo una radiazione di precisione device in grado di erogare TC in combinazione con piccolo diametro fasci di radiazioni per inibire ME neurogenesi. L'utilizzo di un tubo a raggi X attaccato ad un cavalletto che ruota in un intervallo di 360 °, trasportiamo arco-Trave micro irradiazione con l'uso di un portaoggetti controllato robot che permette la rotazione di un soggetto animale durante il trattamento con radiazioni (Figura 1) . Un rivelatore di raggi X ad alta risoluzione viene utilizzato per acquisire immagini quando il cavalletto è in posizione orizzontale 33. Per questo studio, immagini CT sono state ricostruite con una dimensione voxel isotropico di 0.20 mm. Bordo TC permesso l'identificazione di un obiettivo, mentre l'animale è in posizione di trattamento. L'obiettivo è stato localizzato utilizzando il software di navigazione CT dose di pianificazione, che era inclusa con il nostro disponibile in commercio piattaforma radiologica. Dopo localizzazione nostro ROI TC, l'animale è stato spostato nella posizione di trattamento appropriato dal portaoggetti robotico che ha quattro gradiRees di libertà (X, Y, Z, θ). Attraverso una combinazione di angoli gantry e stage robot, le travi possono essere forniti da quasi qualsiasi direzione rispetto per l'animale, e trattamenti ad arco-like stereotassica sono possibili 29. Per questi e altri studi di imaging, i topi sono stati posizionati in un dispositivo di immobilizzazione che consente l'erogazione di gas anestetico isoflurano mentre limita il movimento. Il letto immobilizzazione è compatibile CT, e si connette al portaoggetti robotico 34.
Ci aspettiamo che CFIR fornirà anticipazioni concettuali in un certo numero di aree di ricerca. Anche se usiamo il targeting radiologica dell'eminenza mediana ipotalamico come prova di principio di questa tecnica, CFIR può essere utilizzato per mirare qualsiasi regione del corpo di qualsiasi piccola organismo modello in linea di principio. Nelle neuroscienze, per esempio, prevediamo questa tecnica può essere utilizzata per valutare la funzione di popolazioni progenitrici attivamente proliferanti che sono state proposte per esit in altri organi circumventricolari, come l'area postrema 38, 39, organo subfornicale 40, e l'ipofisi 41. Controversie di lunga data per quanto riguarda il ruolo funzionale della neurogenesi adulta e che identificano un ruolo causale nel comportamento possono ora essere meglio affrontati. In songbird, questa tecnica potrebbe riguardare il ruolo di neurogenesi nel mantenere il comportamento robusta e stagionale degli uccelli 42, che è stato ostacolato dalla capacità di inibire selettivamente neurogenesi in specifiche regioni cerebrali. La comprensione di questo modello comportamentale robusta potrebbe gettare nuova visione del ruolo della neurogenesi adulta nel regolare altri comportamenti dimorfismo sessuale. In alternativa, nel campo metabolico, CFIR potrebbe essere utilizzato per esplorare aspetti del ruolo di epatociti proliferazione e il suo ruolo nel metabolismo e bilancio energetico. La possibilità di avanzamento concettuale in molteplici discipline di ricerca viene migliorato con l'introduzione di questa tecnica.
43, 44. Quindi, generalizziamo questo protocollo CFIR con passaggi necessari per tutte le piattaforme di ricerca piuttosto che quelli specifici per SARRP. I vantaggi di CFIR oltre approcci radiologici precedenti per inibire neurogenesi sono che questa tecnica permette orientamento immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose, la dose conformazionale minimizza l'esposizione di regioni cerebrali nontargeted e geometria della trave alta precisione permette di distribuzione della dose conforme con confini fascio taglienti. Delineiamo come usare l'imaging TC guidata di indirizzare la dose di una regione anatomica specifica e su questo modo, come visualizzare la radiazionedosare la distribuzione direttamente nel tessuto utilizzando colorazione immunoistochimica per γ-H2AX, un marker di DNA a doppio filamento breaks 35, 45-48. L'uso di questo approccio per l'irradiazione selettiva di nicchie neurogena può avere implicazioni significative nel rivelare il ruolo funzionale di nuovi neuroni adulti nati sulla fisiologia e patologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Uso Animal
Ottenere l'approvazione dal Comitato istituzionale, cura degli animali ed uso di protocolli di cura standard di utilizzo. Il protocollo attuale è stato sviluppato per studi di irradiazione focali 5,5-10 settimane di età adulte C57BL6 / J topi, come precedentemente descritto (Figura 2) 2. Tuttavia, altre epoche e le piccole specie animali (ratti, criceti, scoiattoli di terra, ecc) possono essere utilizzati anche, a condizione che i protocolli di anestesia efficaci e di un atlante di riferimento radiografici che consentono di identificare la regione di interesse (ROI) sono disponibili.
1. Taratura di TC guidata piattaforma radiologica
Effettuare calibrature a pellicola per dose di radiazioni sulla piattaforma radiologica in anticipo per ciascun formato collimatore e tipo di filtro tubo radiogeno utilizzato. Al fine di indirizzare un fascio di irradiazione arco al sito bersaglio desiderato, utilizzare la radiazione software dose-pianificazione 49 dispone sulla maggior parte delle piattaforme di radiazione commerciali per calcolare i tempi di consegna necessaria in base alla dose di radiazione, la profondità della regione di interesse (ROI) basato su TC del mouse e la velocità di rotazione della piattaforma robotica; dettagli su questo sono lasciati fuori di questo protocollo in quanto essi differiscono tra le piattaforme di radiazione. Ai fini della visualizzazione del ventrobasal ipotalamo 2 (Figura 3) con TC, azionare il tubo radiogeno con macchia focale 0,4 mm ed energia del fascio 100 kVp con 1 mm Al filtrazione. Per irradiazione focale del HZP azionare il tubo radiogeno a 225 kVp, 13 mA, e un punto focale 1 mm con filtrazione 0,15 mm e Cu, per fornire 10 Gy di radiazioni tessuti a una profondità di 0,6 cm su un trattamento tempo di 4.6 min. Targeting tra diversi ROI sarà necessario calcolare diversi parametri.
- Se studiare gli effetti della dieta ricca di grassi sulla neurogenesi nel eminenza mediana come descritto in precedenza 2, avere quattro settimane di età C57B femminileL6 / J topi da laboratorio Jackson Mouse, e case di quattro topi per gabbia. Passare cibo da chow normale ad una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Consentire topi per acclimatarsi alle nuove abitazioni e cibo. Eseguire il trattamento CFIR a 5,5 settimane di vita. Trasporti sottopone alla sala operatoria che contiene la piattaforma radiologica. Ridurre al minimo i livelli di stress durante il trasferimento. Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Quindi, aggiungere un singolo mouse nella camera. In parallelo, preparare rilievo di riscaldamento (livello basso) per il post-trattamento.
- Una volta mouse è sotto e non risponde alla compressione piede-pad, portare il soggetto alla piattaforma radiologica e posizionare sul letto immobilizzazione della fase robotico. Posizionare la bocca del soggetto in anestesia tazza naso-cone, e denti nella guardia morso (Figura 1D). Posare il mouse sul letto immobilizzazione e verificare se continua a mantenere insensibilità. Se è così, il nastro fino mouse sul letto con nastro garza. Mentre taping giù il mouse per il letto, Assicurarsi che la testa è livellato ad un piano orizzontale. Questo può essere determinato tirando le orecchie e vedere se sono livellate. Una volta che il mouse è nella posizione corretta, chiudere lo scudo protettivo di piombo.
- Acquisire la scansione del computer-tomografia utilizzando il software a bordo della piattaforma radiologica dello sperimentatore (questo sarà diverso tra le piattaforme), che fornirà un tridimensionale anatomico scansione strutturale del soggetto mouse. Controllare per vedere se la testa del mouse è livellata al piano orizzontale. In caso contrario, ripetere i passaggi 1,2-1,3 fino a quando la testa del soggetto è livellato.
- Identificare ROI per immagine TC. Calcolo della distanza da ROI alla superficie del cranio con un angolo di 45 ° rispetto al piano orizzontale, come mostrato nella Figura 3E.
- Utilizzo del software di bordo, prendere una radiografia del soggetto mouse da sopra, come mostrato in Figura 4A. Quindi, rimuovere il mouse dalla piattaforma radiologica, messo in rilievo di riscaldamento, e monitorare fino attiva.
- Dalle immagini CT coronali, calcolare la profondità media ROI anatomica di almeno tre topi per determinare consegna dosaggio. Come esempio di un precedente studio 2 dove 10 Gy di irradiazione è stato somministrato all'ipotalamo ventrobasal, la profondità della ROI dal cranio (da un angolo di 45 °) è 0,66 centimetri (vedere Figura 3E). Sapendo che, i ricercatori hanno utilizzato il software di pianificazione dose (DPS) installato sulla loro piattaforma radiologica per calcolare la velocità di rotazione e della lunghezza del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato al ROI.
- Dopo aver determinato la durata del trattamento e velocità di rotazione della fase robotico con il software dose-pianificazione, misurare distribuzioni di dose dei parametri calcolati con pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic incorporati in una plastica modello mock-topo equivalente-acqua. Per fare questo, inserire tre film sensibili alle radiazioni GAFchromic tra quattro impilati verticalmente equivalente in acqua blocchi di plastica da 29mostrato nella Figura 4B.
- Posizionare il modello finto topo contenenti film GAFchromic sul palco robotica, ed eseguire il fascio di irradiazione focale con i nuovi parametri calcolati. Ad esempio, per indirizzare la ventrobasal ipotalamo, inserire i parametri da 0,15 mm Filtro Cu, 225 kVp, 13 mA, 1-mm impostazione radiazioni diametro del fascio, 45 ° a portale, 1,3 ° / sec rotazione e 4,6 min per ottenere un ROI la dose radiologica di 10 Gy.
- A seguito di irradiazione, controllare film per modello e l'intensità della dose di radiazioni. Per un angolo di rotazione di 360 ° con i parametri elencati di indirizzare l'ipotalamo ventrobasal, un anello scuro nella pellicola sopra all'isocentro un piccolo punto croccante alla pellicola isocentro, e un anello leggero nel film sotto la isocentro corrispondente al cono- somministrazione fascio di irradiazione sarà osservato (Figura 4B).
- Sovrapporre isocentro pellicola GAFchromic sulle radiografie di soggetti topo da cui i parametri sono stati calcalcolato. Il punto focale irradiato di isocentro dovrebbe sovrapporsi con la regione ROI desiderato come mostrato in figura 4C.
Metodo alternativo: se difficoltà di mirare ROI cervello persiste, utilizzare contrasto iodato iniettato intratecale per migliorare la visualizzazione dei ventricoli in immagini CT. Per brevità, questa procedura è lasciato fuori di questo protocollo, ma viene descritto in precedenza 35, 50. Contrasto iodato fornirà punti di riferimento ventricolari supplementari (Figura 5A).
2. Determinare l'accuratezza di irradiazione del fascio
Ulteriore conferma CFIR precisione fascio per la visualizzazione diretta del fascio di radiazioni nel tessuto 2, 35, 51. Per fare questo, eseguire immunoistochimica per rilevare γH2AX 51, una proteina istone e un marker precoce di DNA a doppio filamento si rompe. Soggetti mouse deve essere transcardiaca perfusi e fissati entro un'ora di irradiazione. A seguito di irraggiamentoation, riparazione del DNA rapidamente ne deriva, e livelli di ΥH2Ax diminuiscono in modo significativo 35.
- Ripetere i passaggi 1,1-1,3.
- Dopo che il bersaglio è identificato CT, il soggetto mouse viene spostato sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Parametri calcolati ingresso (velocità di rotazione e durata del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato) dal punto 1.6 nel software dose di pianificazione e iniziare il trattamento. Il trattamento è fornito con il cavalletto puntato a 45 ° rispetto alla verticale mentre il mouse ruota attorno ad un asse verticale orientato.
- A seguito di irradiazione, eseguire perfusione transcardial su argomenti mouse. Eseguire perfusione entro un'ora 52. A seguito di cervelli perfusione, l'immersione fissi nel 4% PFA / PBS e rock delicatamente notte a 4 ° C.
- La mattina seguente, lavare 5 min in PBS 3x per rimuovere paraformaldeide fissativo. Poi, immergere in 30% saccarosio in PBS 1x su un agitatore a 4 ° C.
- Agitare delicatamente a 4 ° C (usmanualmente 12-16 ore), fino al cervello affonda al fondo della provetta. Questo serve come un passo crioprotezione. Una volta che il cervello lavello, rimuovere il cervello con un cucchiaio forato per evitare che l'eccesso del 30% sucrose/1x trasferimento PBS. Rapidamente incorporare nel congelamento di media in ghiaccio secco. Agitare medie congelamento con puntale e allineare cervello in stampi in plastica.
- Una volta completamente congelato, trasferire i blocchi del cervello a -20 ° C per una conservazione.
- Il giorno in cui verrà effettuata l'immunoistochimica, sezione coronale a 40 micron di spessore, e galleggiare in una piastra a 24 pozzetti contenenti PBS con un pennello sottile. Le sezioni devono essere conservati in modo seriale corretto per immunoistochimica per determinare la copertura irradiazione della regione di destinazione.
- Preriscaldare 0,01 M soluzione di citrato di sodio a 80 ° C a bagnomaria in preparazione per il passaggio recupero dell'antigene. Contemporaneamente, mentre il citrato di sodio si sta riscaldando, eseguire 5 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS.
- Una soluzione di citrato di sodio è a 80 ° C, immergere sezioni di cervello in la soluzione tampone di citrato di sodio. Lasciare in bagno d'acqua a 80 ° C per 1 ora.
- Smontare la parte e lasciare soluzione di citrato di sodio a temperatura ambiente, quindi eseguire tre lavaggi di 5 minuti in 0,01 M PBS.
- Bloccare sezioni di cervello per 1 ora in PBS-Triton contenenti siero di capra normale al 5%.
- Incubare le sezioni cerebrali overnight nella PBS-Triton contenenti siero di capra normale 5% con 1:700 concentrazione di topo anticorpo primario anti-fosfo-H2AX a 4 ° C.
- Il giorno dopo, eseguono 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton.
- Incubare le sezioni cerebrali PBS-Triton contenente 5% di siero di capra normale di capra anti-topo anticorpo secondario coniugato con 488 nm fluorphore a 1:500 concentrazione per 2 h.
- Eseguire 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton.
- Esegui 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia (1:5.000 in PBS) per 10 min per visualizzare nucleo. Poi, lavare sezioni di cervello per 5 minuti con PBS.
- Montare su elettrostaticamente chmicroscopio arged scivola dalla sezione galleggianti in PBS. Pulire l'eccesso di PBS e lasciare i vetrini si asciughino. Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio e permettono i vetrini si asciughino al buio a temperatura ambiente per una notte.
- Scatta foto di sezioni coronali seriali con microscopio a fluorescenza. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica sito di irradiazione. DAPI (blu) è un colorante nucleare (Figura 5B).
3. Preparazione del mouse Soggetti di irradiazione focale
Esaminare i risultati di immunoistochimica ΥH2Ax. Una volta soddisfatti con la calibrazione e la destinazione del fascio di irradiazione, procedere con l'esperimento. A questo punto, il tempo totale necessario per trattare un mouse (da impostazione animale a completamento di consegna fascio) è di circa 10-15 minuti per un trattamento di 10 Gy con un raggio di 1 mm.
- Ordina quattro settimane di età topi C57BL6 / J femminile dai laboratori Jackson Mouse. Casa di quattro topi per gabbia, e passare il cibo da chow normalea una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Topi orecchio pugno per dare loro segni di riconoscimento unici. Monitorare la salute dei topi al giorno. Nota: marcatori metallici non possono essere utilizzati come essi rappresentino striature artefatti sul CT.
- Pesare i topi il giorno prima del trattamento con radiazioni o sham. Topi suddivisi in due coorti per le radiazioni o il trattamento sham e garantire che non vi è alcuna differenza significativa nel peso tra coorti. Il giorno di trattamento, quando i topi sono sei settimane di vita, si ripesa tutti i topi e registrare la loro massa. Trasportare delicatamente entrambe le coorti alla piattaforma radiologica. Fate attenzione a ridurre al minimo i livelli di stress.
- Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Anestetizzare due topi, uno nel gruppo irradiazione predeterminato, e un altro nel gruppo di controllo sham. Preparare rilievo di riscaldamento impostata sul basso per il trattamento post-operatorio.
- Seguire i passaggi 1,2-1,4 per il mouse a ricevere irradiazione. Per il topo finto, tenere il mouse in camera di anestesia mentre il trattamento è in corso. Fai sure che la camera di anestesia si trova vicino alla piattaforma CFIR così eventuali effetti sulle radiazioni ambientali sono presi in Dopo il bersaglio viene identificato in CT, spostare il mouse soggetto sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Ingresso parametri (velocità di rotazione e durata del trattamento) calcolato nel software dose-pianificazione.
- Una volta che il trattamento di irradiazione è completo, di ritorno sia sham e topi irradiati al pad di riscaldamento, e monitorare fino a quando si svegliano.
- Rientro sia sham e topi irradiati per stabulario. Controllare ogni giorno. Pesare il mouse ogni metà settimana. Per confermare irradiazione di mirati zona proliferativa ipotalamica, somministrare iniezioni intraperitoneali di BrdU (50 mg / kg), tre giorni dopo il trattamento ed esaminare neurogenesi tra i gruppi per colabeling di immunoistochimica per BrdU e un marcatore neuronale un mese dopo l'esposizione iniziale BrdU (Figura 6) 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Valutare Targeting CT-guidata e precisione
La taratura meccanica del sistema è fondamentale per garantire che travi da varie angolazioni tutti intersecano in un unico punto. Calibrazione è stata eseguita con un metodo di imaging basata semi-automatico, dove end-to-end precisione di allineamento è stato misurato per essere 0,2 millimetri 29. Questa precisione è molto critica come il volume della struttura eminenza mediana ipotalamico è piccolo 2. Per verificare questa taratura, abbiamo misurato distribuzioni di dose con pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic incorporati in una plastica modello mock-topo equivalente-acqua 35 (Figura 4B). In breve, una TC del soggetto topo è stata presa, e il nostro ventrobasal sito di destinazione ipotalamico è stato identificato. Consegna e velocità di rotazione sono stati calcolati, e il collimatore e filtrazione adeguato erano attaccati a garantire 10 Gy di radiazioni è stato consegnato. Un modello di mock-topo progettato da un acqua-equivalen struttura t plastica embedded con pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic è stato poi sostituito con il mouse soggetto reale per misurare la distribuzione della dose a diversi piani focali. Figura 4B mostra end-to-end risultati rispetto a un trattamento arco con trave 1 mm di diametro usando film GAFchromic in una piattaforma mock-topo. Il cavalletto è stato fissato a un angolo di 45 ° rispetto al modello di simulazione mouse mentre il portaoggetti robotico è stato ruotato su un asse orientato verticalmente, generando un "arco" o cono di radiazione. La larghezza a metà altezza (FWHM) è 2.31 mm, è superiore a 1,0 mm da archi urto sulla pellicola in un angolo. Teoricamente la dimensione del fascio in questo angolo dovrebbe essere 2,0 mm. Il punto focale del fascio mostrata in figura 4 illustra l'allineamento di precisione di travi da diverse direzioni. Questa pellicola può essere sovrapposta al soggetto reale topo, dimostrando posizione del fascio e precisione (Figura 4C).
e_content "> Usando un collimatore trave 1 mm di diametro, una tecnica arco è stato usato per fornire 10 Gy al punto nel nostro mouse soggetto. Misurazioni precedenti 29 indicano che questa tecnica fornisce dosi molto basse di radiazioni (<0,1 Gy) fuori dal 1 mm porta. L'area della ghiandola pituitaria e strutture circostanti è quindi protetto in maniera efficace da irradiazione focale dell'ipotalamo ventrobasal. L'accuratezza del targeting fascio è stato misurato in studi precedenti per essere di 0,2 mm, di prove in phantom 29 e sezioni di tessuto 35 .Anche se non richiesto, TC guidata di targeting del ROI può essere migliorata da un contrasto iodato per via intratecale iniettato per migliorare TC guidata di targeting per la nostra applicazione cervello (Figura 5A). Poiché questa è una procedura invasiva e ingombrante, questo contrasto non viene utilizzato spesso, e non descritto in questo protocollo. Dettagli per questo protocollo possono essere trovati in Ford et al. 2011 e Chaichana et al. 2007. I vantaggi di questo contrasto iodati sono che i ventricoli laterali e terzo sono chiaramente visualizzati in TC acquisite su una piattaforma radiologica CFIR (Figura 5A). L'obiettivo era l'eminenza mediana, alla base del terzo ventricolo, ed è stato identificato utilizzando software di navigazione TC guidata e automaticamente importata nell'interfaccia posizionamento robot. Strutture ossee del cranio sono stati identificati e utilizzati come punti di riferimento anatomici per i successivi studi in cui contrasto iodato non è stato impiegato.
Fascio Targeting Validazione con γ-H2AX
Per confermare ulteriormente la nostra TC guidata mira dell'asse ipotalamo ME, abbiamo visualizzato il fascio di irradiazione di 1 mm nel tessuto per l'esame indiretta delle rotture del doppio filamento di DNA che si verificano a seguito di irradiazione. H2AX proteina istone viene fosforilata dopo DNA rotture del doppio filamento. γ-H2AX è stato ampiamente utilizzato nel cervello e altri tessuti 46 -48, e il numero di γ-H2AX + foci appare ben correlata con dose di radiazioni su un ampio intervallo di dosi 51, 53. Abbiamo osservato chiara visualizzazione del fascio seguente γ-H2AX immunoistochimica (Figura 5B). Risultante γ-H2AX colorazione mostrato targeting preciso della posizione prevista. Il bordo del fascio era anche estremamente tagliente, in accordo con le misure di fisica messa a pellicola che indicano una penombra 20-80% di 0,3 mm 54. Precedentemente abbiamo misurato la distanza tra il bersaglio e il centro del fascio come visualizzate nelle sezioni di tessuto 35. Il centro del fascio è stata compensata dal bersaglio da una distanza media di 0,19 ± 0,36 millimetri (deviazione standard) in 10 topi irradiati dopo avere scomposto per fenomeni di ritiro del tessuto durante la fissazione e la trasformazione 35.
Usando un trattamento arco stereotassica simile costituito da un arco di 45 ° rispetto alla verticale, siMostriamo siamo stati in grado di indirizzare efficacemente l'ipotalamo ventrobasal, senza irradiando altre nicchie neurogena (figure 5C-D). L'irradiazione delle zone circostanti è stato minimo, e c'era un limite di esposizione a radiazioni, come dimostrato dal film GAF-cromatici (Figura 4B) e γ-H2AX immunoistochimica (Figure 5B-D). La dorsale tessuto ipotalamico ME mostra la luce γ-H2AX colorazione (Figura 5B) perché i fasci di radiazioni entrano attraverso questa regione e anche forse a causa della valorizzazione da parte del midollo sovrapponendo, anche se un fascio di raggi X relativamente duro è stato usato (225 kVp, 0,15 millimetri filtrazione Cu).
Effetti sulla neurogenesi
Alla conferma della specificità della nostra consegna irradiazione TC guidata, abbiamo esaminato l'effetto di 10 Gy di irradiazione sui livelli di ME neurogenesi. Topi adulti sono stati alimentati con una dieta ricca di grassi, hanno ricevuto il trattamento con radiazioni o sham, e poi successivamenteIniezioni BrdU come precedentemente descritto inizio alle 6 settimane 2. I topi sono stati sacrificati per l'esame a 10 settimane, un mese dopo la prima iniezione BrdU. Irradiati topi adulti HFD-fed esposti ~ 85% di inibizione della ME neurogenesi rispetto ai controlli sham-trattati (Figura 6A) 2. Il nucleo arcuato, una struttura adiacente al confine con il sito di irradiazione, è stato esaminato per i cambiamenti nella neurogenesi, e risultano avere alcuna differenza statisticamente significativa tra gli animali irradiati e controlli sham (Figura 6A) 2.
Funzione di adulti nati Mediana Eminence ipotalamica Neuroni
Cambiamenti nei topi irradiati e sham sono stati esaminati dopo il trattamento. Cappotto di pelliccia e la risposta al tatto apparivano normali. Un pannello di chimica e completo quadro emocromocitometrico è stata esaminata una settimana dopo il trattamento di irradiazione, e nessuna differenza significativa è stata osservata (n = 9/group). In fed alto contenuto di grassitopi in cui abbiamo osservato una riduzione del ~ 85% in neuroni adulti nati ME un mese dopo irradiazione (Figura 6A), topo irradiati era diminuito l'aumento di peso nel tempo rispetto alla farsa gruppo trattato (Figura 6C). Al contrario, normale-chow alimentato topi di controllo, dove i livelli osservati di ME neurogenesi erano significativamente più bassi rispetto ai loro omologhi alimentati alto contenuto di grassi 2, non hanno una differenza statisticamente significativa di peso tra farsa contro i gruppi irradiati (Fig. 6b). È interessante notare che questo aumento di peso ridotto in irradiato alto contenuto di grassi topi alimentati è accompagnata da cambiamenti nel metabolismo e attività precedentemente descritte in dettaglio dal nostro gruppo 2 (Figure 6D-I).
Figura 1. Tomografia computerizzata a guida irradiazione focale (CFIR) piattaforma. (A) CFIR utilizza un dispositivo di radiazione di precisione in grado di fornire irradiazione TC guidata con piccole travi. Un esempio di una piattaforma CFIR è la piattaforma di ricerca sulle radiazioni di piccoli animali (SARRP). Con schermatura di piombo (come indicato), la SARRP è pari a 81 cm (altezza) da 58 pollici (larghezza) da 41 pollici (profondità) a £ 5170. (B) L'utilizzo di un tubo a raggi X a doppia sorgente collegato a un cavalletto che ruota di 360 °, il SARRP utilizza un controllo robot portaoggetti che permette la rotazione di un soggetto animale durante il trattamento di radiazioni. (C) CFIR hardware è composto da una fonte di raggi X, collimatore, cavalletto, sostegno animale, rotante portaoggetti robotico, e imager elettronico rotante. (D) Il soggetto mouse viene posizionato nel letto immobilizzazione con ingresso anestesia gas sul portaoggetti robotico. Da Armour et al. 2010. (E) hardware CFIR dovrebbe includere coni collimanti personalizzabili per ir focale consegna di radiazione di diverse dimensioni. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Paradigma sperimentale. Femminile C57BL / 6 topi sono stati ordinati dai laboratori del mouse Jackson, e acclimatati gabbie residenti in quattro settimane di vita. Oggetto del mouse è stato passato a un alto contenuto di grassi ad libitum dieta in cinque settimane di vita, e suddivisa in due gruppi di trattamento: le coorti irradiati o sham. Valutazioni fisiologiche sono state prese longitudinalmente prima e dopo il trattamento. Trattamenti di irradiazione o sham sono stati somministrati a 5,5 settimane. Iniezioni di BrdU intraperitoneali sono stati dati a sei settimane come descritto in precedenza 2.
pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Figura 3. Regione di localizzazione interesse. La zona proliferativa ipotalamico (HPZ), una regione neurogenica situato nel eminenza mediana ipotalamico, si trova nella mediobasal ipotalamo ventrale. (A) La regione HPZ di interesse (ROI) è evidenziato da rosso a croce in 3-D Nissl volume di riferimento atlante del cervello portale Allen Atlas dati (posizione: 7,041, 7,211, 5,564) (disponibile da http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) Sezione cervello coronale del ROI in diciannove giorni di topi. BrdU immunoistochimica (verde) rivela che il ROI (freccia bianca) contiene cellule proliferative. La densità di cellule proliferative nel HPZ è limitata nella anteriore a posteriore asse, con densità massima a -1.75 mm Bregma. Le sezioni di tessuto sono contro-colorate con DAPI marcatore nucleare (blu). Figura da Lee et al. 2012A.(CE) CT-imaging su una piattaforma CFIR permette di mira il HPZ ROI (rosso a croce) mediante consegna a radioterapia arco. CT-immagine di topo soggetto nel piano orizzontale (C), piano sagittale (D), e piano coronale (E). (E) Distanza dalla superficie del cranio al ROI è 0,62 cm (linea rossa). Barre di scala = 1 mm (A), 50 pm (B), e 0,62 centimetri (CE). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Taratura di consegna irradiazione. (A) X-ray di un argomento del mouse fissato nel dispositivo di immobilizzazione sul palco robotica SARRP. (B) ROI calcolato coordina unre immesso e mirata nei confronti di un modello di simulazione del mouse. Il modello phantom è composto di pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic incorporati in un materiale plastico equivalente-acqua. Films trovano sopra, a, e sotto all'isocentro ROI rilevare la distribuzione della dose. A 45 ° arco fascio di radiazione dal SARRP offre una distribuzione di dose conico al ROI, e converge all'isocentro (spot penombra). (C) Sovrapposizione di dosimetria film acquisita con 1 mm fascio di radiazioni in fantoccio con una radiografia di un vero e proprio oggetto del mouse (linea gialla). Cerchio bianco (freccia) indica la radiazione di 10 Gy dose di focale mirato a HPZ. La linea tratteggiata delinea cervello. Pannello da Lee et al. 2012A.
Figura 5. Conferma di Radioterapia consegna. TC con mezzo di contrasto iodio può migliorare la visualizzazione del ROI se normale TC non suffice. (A) Soggetti mouse ricevuti iodio contrasta come precedentemente descritto (pannello da Lee et al. 2012). Immagini TC nel piano coronale, orizzontale e sagittale sono indicati da sinistra a destra. (B) La conferma della consegna radiazione nei tessuti può essere rilevata mediante immunoistochimica per γH2AX, un marker di DNA rotture del doppio filamento. γH2AX immunoistochimica mostra radiazione consegna del fascio mirato al HPZ ROI nel mediobasal ipotalamo ventrale. γH2AX immunostaining non si osserva nella zona subventricular dei ventricoli laterali (C), o la zona subgranulare dell'ippocampo (D) dello stesso soggetto mouse. (BD) Le sezioni sono di contrasto con DAPI (da Lee et al. 2012a). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Inibizione focale ME risultati neurogenesi in alterazioni del peso e del metabolismo. (A) L'eminenza mediana (ME) si trova nella mediobasal dell'ipotalamo ventrale stato preso di mira per l'irradiazione. Il nucleo arcuato (ArcN) è la struttura anatomica vicina. Un mese dopo il trattamento, la percentuale di BrdU + Hu neuroni da farsa contro coorti irradiati sono stati quantificati mediante immunoistochimica in ME e ArcN. Livelli di ME neurogenesi sono stati significativamente ridotti in irraggiato contro coorti sham (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Livelli di ArcN neurogenesi non sono stati colpiti (n = 3/cohort, ns = non significativo). (B) chow normale alimentato (NC) e (C), alto contenuto di grassi (HFD) alimentato topi sono stati esaminati longitudinalmente per le alterazioni di peso dopo irradiazione o sham trattament (B, n = 12/cohort; C, n = 9/cohort). (DE) Un mese dopo il trattamento, irradiati e sham topi trattati con HFD-alimentati sono stati esaminati mediante spettroscopia di risonanza magnetica per l'analisi quantitativa della massa grassa e la massa magra%%. Topi irradiati avevano massa grassa significativamente meno% e la massa molto più magra% rispetto ai controlli sham (n = 5, * = p <0.05). Massa totale: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (irradiato) 18,86 ± 0,4 g; massa magra: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (irradiato) 13,9 ± 0,3 g; Fat Mass: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( irradiata) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0.05). (FI) Irradiati e sham trattati topi adulti sono stati collocati in un sistema di monitoraggio completo Lab Animal (VONGOLE) per la misurazione simultanea di assunzione di cibo, l'attività fisica e metabolismo di tutto il corpo profiling due settimane dopo il trattamento. Dopo acclimatazione nella camera di test, i topi irradiati sono stati osservati per avere SIgnificantly maggiore dispendio energetico, attività totale, e VO 2 (ml / kg / ora) rispetto ai controlli sham durante la parte scura del giorno (n = 11, 12; * = p <0,05). (G) Nessuna differenza significativa è stata osservata nel tasso di scambio respiratorio (RER) (n = 11, 12). Subfigure A è generato dai dati precedentemente pubblicati in Lee et al. 2012a e Lee et al. 2012b. Sottofigure CI da Lee et al. 2012a. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Irradiazione focale TC-guidata (CFIR) è un approccio nuovo e completo sistema in grado di fornire campi di radiazione a obiettivi nei piccoli animali sotto controllo robotico con CT-guida 32. La capacità di CFIR di fornire fasci altamente mirati per piccoli modelli animali offre nuove opportunità di ricerca per colmare laboratorio di ricerca e traduzione clinica. Questo documento descrive l'approccio CFIR per la consegna di radiazione preciso per indirizzare specificamente una popolazione progenitore neuronale ipotalamico. Dimostriamo qui come calibrare e confermare la radiazione consegna specificità con pellicola a raggi X e nel tessuto cerebrale mediante immunoistochimica.
Inoltre, si mostra come questa tecnica può essere usata per inibire neurogenesi in una regione specifica del cervello. Abbiamo dimostrato che siamo in grado di indirizzare l'ipotalamo ventrobasal, e inibire la neurogenesi nel eminenza mediana, senza alterare i livelli di neurogenesi in strutture adiacenti. Inibizione di ME neurogenesi è accompagnata da cambiamenti nel metabolismo e l'attività, così come ridotto aumento di peso su una dieta ricca di grassi in irradiato contro i gruppi di trattamento sham (Figura 6) 2. Questi dati suggeriscono un ruolo per questi neuroni ipotalamici-adulti nati nella regolazione del metabolismo energetico e l'omeostasi. Inoltre, suggerisce che una dieta ricca di grassi in eccesso può alterare i circuiti metabolici critica anche in età adulta 3. I nostri risultati rappresentano un ampliamento importante sulla funzione nota di neuroni adulti nati, e mette in luce un nuovo ipotalamico popolazione neurale progenitore 3. Potenziali avvertimenti di questo approccio è che l'irradiazione inibisce la proliferazione progenitore piuttosto che la neurogenesi di per sé e quindi è anche possibile che cambiamenti fisiologici post-trattamento può essere parzialmente rappresentato da rottura di altri genesi cellula adulta. Passi futuri comprenderanno lo sviluppo di strumenti genetici per inibire la proliferazione di questo specifico progenitrici neurali popolazione, che fornirà sostanziale chiarezza il ruolo funzionale di questi progenitori e il loro gioco discendenza nella regolazione della fisiologia 3.
Presi insieme, tuttavia, questa piattaforma radiologica serve come un punto di partenza importante nello svolgimento schermi di throughput medio sui progenitori neurali e la loro progenie. Questa tecnica radiologica non è limitato in ricerche nelle neuroscienze, tuttavia, e ci aspettiamo CFIR per espandere l'avanzamento concettuale in un certo numero di discipline di ricerca. La recente disponibilità di commercio vendute piattaforme radiologici TC guidata offre l'opportunità per i ricercatori di utilizzare queste funzionalità di questa piattaforma per le loro domande di ricerca (Figura 1). Diverse alternative sono disponibili in commercio che permettono di eseguire guidata dalle immagini piccole irradiazione animale. Inoltre, i sistemi di irradiazione focale TC-guidate possono essere costruite anche in casa, come è avvenuto con il sistema utilizzato per questi sTUDI della Johns Hopkins 29-33, 35.
L'esecuzione di questo grado di targeting per focale richiede una corretta taratura e il targeting del ROI. Mentre questa tecnica sarà inizialmente prendere formazione al fine di acquisire familiarità con la piattaforma CFIR e il suo software dose-progettazione, il funzionamento del dispositivo è piuttosto facile dopo aver compreso il protocollo e le capacità della piattaforma. Si raccomanda che le pratiche operatore taratura del fascio di radiazioni diverse volte prima di correre in piena regola esperimento longitudinale. Detto questo, una volta fluente nel funzionamento di CFIR, studi di ricerca dovrebbero muoversi rapidamente.
Questo protocollo CFIR qui descritto utilizza l'orientamento dell'immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose. Dose Conformal riduce al minimo l'esposizione a regioni cerebrali nontargeted, e la geometria del fascio di alta precisione permette la distribuzione della dose conforme con i confini del fascio taglienti. Questo permette di porre domande regarding la funzione dei neuroni adulti di nascita, ma apre anche le aree di domande al ruolo della proliferazione cellulare in settori quali la fisiologia, biologia dei tumori, e dell'immunologia. Questo metodo può essere ampliato in vari modi con coloranti di contrasto e di bioluminescenza per migliorare la visualizzazione 35, 56. Gli sforzi sono ora in corso per migliorare ulteriormente le capacità hardware CFIR, e la piattaforma viene ora modificato per includere una tomografia a emissione di positroni scanner a bordo 56. Questi facilitare l'espansione di strumenti disponibili per i ricercatori e gli aiuti a tradurre le scoperte al banco al capezzale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JW ha un finanziamento della ricerca e consultazione accordi con Xstrahl, Inc.
Acknowledgments
Ringraziamo C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour per la consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health di sovvenzione F31 NS063550 (a DAL), un Premio Basilio O'Connor Starter Scholar e sovvenzioni del Fondo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB è un WM Keck Distinguished giovane studioso nella ricerca medica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SARRP research platform | Xstrahl | RS225A | http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm |
| SARRP irradiation bunker | Xstrahl | Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding | |
| GAF chromic film | IPS | GAFchromic ETB2 | |
| Mouse phantom | Gammex | 457 | Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size. |
| Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody | Millipore, Inc. | 05-636 | clone JBW301 |
| High-fat rodent diet | Research Diets | D12492i | 60% of the calories as fat, food should be irradiated |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | 10019-360-40 | |
| 0.01 M Sodium citrate | Fisher Scientific | 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| DAPI | Fisher Scientific | nuclear counterstain | |
| Mounting medium | Fisher Scientific | Vectashield or Gelvatol is preferred |
References
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
- Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
- Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
- Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
- Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
- Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
- Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
- Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
- Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
- Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
- Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
- Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
- Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
- Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
- Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
- Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
- Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
- Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
- Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
- McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
- Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
- Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
- Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
- Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
- Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
- Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
- Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
- Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
- Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
- Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
- Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
- Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
- Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
- Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
- Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
- Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
- Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
- Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
- Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
- Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
- Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
- Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
- Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
- Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
- Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
- Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
- Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).
