Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Yetişkin doğumlu memeli nöronların işlevi, soruşturma aktif bir alan kalır. İyonize radyasyon yeni nöron doğum engeller. Bilgisayar tomografi rehberliğinde fokal ışınlaması (CFIR) kullanılarak özel nöral progenitör popülasyonlarının üç boyutlu anatomik hedefleme şimdi yetişkin nöron işlevsel rolünü değerlendirmek için kullanılabilir.

Abstract

Yetişkin doğumlu nöronların fonksiyonel karakterizasyonu önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Invaziv viral teslimi veya transgenik hayvanların yoluyla yetişkin nöron inhibe yaklaşımları bu çalışmalardan zor sonuçların yorumlanmasını yapmak potansiyel boşa var. Yeni radyolojik araçlar tek noninvaziv küçük hayvanlarda doğru ve hassas anatomik hedefleme yoluyla yetişkin doğumlu nöronların seçin gruplarının işlevini araştırmak için izin olduğunu, ancak, ortaya çıkmaktadır. Odak iyonlaştırıcı radyasyon yeni nöronların doğuşunu ve farklılaşmasını inhibe, ve spesifik nöral progenitör bölgelerin hedef sağlar. Yetişkin hipotalamik nöron fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinde oynadığı potansiyel fonksiyonel rolünü aydınlatmak için, biz seçici hipotalamik median eminence yetişkin doğumlu nöronların doğuşunu engellemek için invaziv olmayan bir odak ışınlama tekniği geliştirdi. Biz C omputer için bir yöntem tarif tomografi kılavuzluğundaKüçük hayvanlarda hedef kesin ve doğru anatomik etkinleştirmek için f Öçal ir radyasyon (CFIR) teslim. CFIR lokalizasyonu için üç boyutlu hacimsel görüntü kılavuzluğunda kullanır ve radyasyon dozunun hedef, nontargeted beyin bölgelerine radyasyon maruziyeti en aza indirir ve keskin ışın sınırları ile konformal doz dağılımı sağlar. Bu protokol bir yetişkin doğumlu nöronların fonksiyonu ile ilgili soru sormak için izin verir, ama aynı zamanda radyobiyolojide, tümör biyolojisi ve immünoloji alanlarında soruların alanları açılır. Bu radyolojik araçlar başucunda için tezgah keşifler çeviri kolaylaştıracaktır.

Introduction

Yeni keşifler yetişkin memeli beyin plastisitesindeki olağanüstü derecede tabi olduğunu göstermiştir. Yetişkin doğmuş nöronlar memeli beyninde 1 uzman nişler yetişkinlik boyunca oluşturulur. Bu yetişkin doğumlu nöronların işlevi nedir? Ve daha çok, onlar fizyoloji ve davranış bir rol oynarlar? Bu konuyla ilgili çalışmalar geleneksel lateral ventriküller ve hipokampus subgranular bölgenin subventricular odaklanmıştır, ancak son çalışmalar bu tür memeli hipotalamus 2 gibi diğer beyin bölgelerinde nörogenezi karakterize var. Nöron postnatal ve erişkin hipotalamus 2-10 rapor edilmiştir, ve bu yeni doğmuş hipotalamik nöronların işlevi soruşturmanın etkin bir alan kalır.

Yetişkin doğumlu nöronların fonksiyonel karakterizasyonu genel nöroloji alan için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Spec selektif inhibisyonuIFIC nöral progenitör topluluklar tek nöral progenitör popülasyonları 11 özgü mevcut moleküler belirteçlerin eksikliği sınırlı kalmaktadır. Böylece, genetik hedefleme yoluyla bu nöral progenitörlerinden yetişkin doğumlu nöronların seçici silinmesi zor kalır. Aynı şekilde, yetişkin doğumlu nöronlar hedef viral dağıtım gibi çevreye 12 içine yaralanma ve inflamasyon tanıtan gibi potansiyel karıştırıcı değişkenler muzdarip.

Yeni radyolojik araçlar biri bu boşa aşmak ve küçük hayvanlarda doğru ve hassas anatomik hedefleme yoluyla bu soruları araştırmak için izin olduğunu, ancak, ortaya çıkmaktadır. İyonize radyasyon yeni nöron doğum ve farklılaşmasını inhibe, ve noninvaziv bir yöntemdir nöral progenitör popülasyonları 13-15 hedef sağlar. Son zamanlarda, biz (HPZ) 2 hipotalamik proliferatif bölgeyi adlandırılan memeli hipotalamik median eminens (ME) bir germinal bölgesini tarif 2 beslenen denetimleri normal yiyecekle (NC) önemli ölçüde daha yüksek olduğu bulundu. Hipotalamik ME içinde yetişkin nöron metabolizmasını düzenler ve kilo olup olmadığını test etmek için, biz bu süreci bozmaya çalıştı. Ortanca eminence düzenleyici hormonlar salındığı üçüncü ventrikül tabanında küçük tek taraflı bir yapıdır. Bu beyin bölgesinde diğer fizyolojik fonksiyonlarını değiştirmeden çoğalma ve daha sonra nöron inhibe etmek amacıyla, seçici hipotalamik median eminens 2'de yeni doğan yetişkin nöronların doğum inhibe etmek için bir odak ışınlama invaziv olmayan bir teknik geliştirdi.

Grupları bir dizi bölgeleri kanonik 14-28 nörogenezi bastırmak için radyasyon kullanmışlardır. Ancak, önceki radyolojik yaklaşımlar genellikle ofte geniş alanları hedef, ya da varn istemeden de zor açıkça belirli nöral progenitör nüfus hatalarına gözlemlenen herhangi bir davranış kusurları ilişkilendirmek için yapım, nörogenezis bildirilmiştir çoklu beyin alanlarını hedef. Daha hedefli ışınlama için yeteneği 29-36 hedefleyen kesin anatomik etkinleştirmek için f Öçal ışın ir radyasyon (CFIR) teslim c omputer tomografi eşliğinde görüntüleme birleştirmek radyolojik platformları tarafından sağlanmaktadır. Çapı 0.5 mm kadar küçük radyasyon ışınları özel nöral projenitör popülasyonları 35 hedeflemek için kullanılabilir. Bu metodoloji bize hipotalamik ME hedef ve çoğalmasını tutuklama ve küçük hayvanlar nörogenezi engellemek için izin verir. Bu hücrelerin popülasyonları üzerinde radyolojik işleminin ardından, fizyolojik ve davranış testleri yetişkin doğumlu hücrelerin potansiyel fonksiyonu aydınlatmak için gerçekleştirilebilir. Odak hedefleme beri bizim uygulama için özellikle önemlidirHipofiz bezi hipotalamik medyan eminense yakın yer, hipofiz ışınlama hormonal fonksiyonlarını etkiler ve sonradan sonuçları yanıltabilecek.

Nöron aşağıdaki ışınlama bastırılması için biyolojik temeli hala belirsizliğini koruyor. Önceki radyasyon çalışmalar büyük bir alan kirişler dayanmıştır, ve nöron bastırılması bir inflamatuvar yanıt 14, 37 aracılı olduğu sonucuna varmışlardır. Gibi bunun önemli bir inflamatuar tepki uyandırmak olmadığından yüksek odak ışınlama, nörogenezi bastırmak olabilir belirsizdir. Bununla birlikte, hipokampusta klasik nörojenik bölgenin grubumuzca son çalışmalar 10 Gy ile son derece odak radyasyon ışınlama 35 sonra en az 4 hafta için nöron bastırmak olduğunu göstermiştir.

Median eminence yetişkin doğumlu hipotalamik nöronların işlevini sorgulamak için, biz hassas bir radyasyon d kullanınME nöron inhibe küçük çaplı radyasyon ışınları ile birlikte BT görüntüleme sunma yeteneğine evice. 360 ° 'lik bir aralığı üzerinde dönen, bir yapıya eklenmiş bir X-ışını tüpü kullanarak, ışın tedavisi sırasında bir hayvan öznenin dönüş (Şekil 1) sağlayan bir robot kontrollü bir numune aşamasının kullanımı ile yay ışınlı ışınlama mikro ışın teslim . Yüksek çözünürlüklü X-ışını detektörü gantry yatay konumda 33 olduğunda görüntüler elde etmek için kullanılır. Bu çalışma için, BT görüntüleri 0.20 mm'lik bir izotropik voksel boyutu ile yeniden inşa edildi. Hayvan tedavi konumunda iken on-board BT görüntüleme bir hedefin tespitine olanak tanıdı. Hedef bizim piyasada mevcut radyolojik platformu ile dahil oldu CT navigasyon doz planlama yazılımı kullanılarak lokalize edildi. BT görüntüleme ile ROI'mız yerelleştirilmesi sonra, hayvan dört ° sahip robotik numune aşamasına göre uygun tedavi konuma taşındıserbestlik Rees (X, Y, Z, θ). Portal ve robot sahne açıları bir kombinasyonu sayesinde, kirişler hayvana neredeyse her yönde teslim edilebilir ve stereotaktik yay gibi tedaviler 29 mümkündür. Bu ve diğer tüm görüntüleme çalışmaları için, fareler hareketi sınırlandırırken izofluran anestezi gazı verilmesini sağlayan bir hareketsiz hale getirme cihazında yerleştirilmiştir. Hareketsizleştirme yatak CT uyumludur ve robotik numune aşamasına 34 bağlanır.

Biz CFIR araştırma alanlarında bir dizi kavramsal gelişmeler sağlayacağını bekliyoruz. Bu tekniğin ilke kanıtı olarak hipotalamik medyan eminens radyolojik hedefleme kullanımı olsa da, prensipte herhangi bir CFIR küçük model organizmanın vücudun herhangi bir bölgesini hedef için kullanılabilir. Sinirbilimlerin, örneğin, biz bu tekniği exis ileri sürülmüştür aktif çoğalma progenitör popülasyonlarının fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan olabilir öngörülüyorBu tür postrema 38, 39, subfornical organı 40 ve 41 gibi diğer hipofiz circumventricular organlarda, t. Yetişkin nöron işlevsel rolüne ilişkin ve davranış nedensel bir rol tanımlayan uzun süredir devam eden tartışmalar da artık daha iyi ele alınabilir. Ötücü kuş, bu teknik seçici belirli beyin bölgelerinde nöron inhibe yeteneği ile engel olmuştur birdsong 42 arasında sağlam ve mevsimsel davranışını sürdürmek yetişkin nöron rolünü ele olabilir. Bu sağlam bir davranış modelini anlama diğer dimorfik davranışlarını düzenleyen yetişkin nöron rolüne yeni anlayış döken olabilir. Alternatif olarak, metabolik alanına CFIR hepatosit çoğalmasının rol ve metabolizma ve enerji dengesinde rolü yönleriyle keşfetmek için kullanılabilir. Çoklu araştırma disiplinlerdeki kavramsal peşin için olasılığı bu tekniğin tanıtımı tarafından geliştirilmiştir.

43, 44 başarabilirsiniz piyasada mevcuttur. Bu nedenle, biz oldukça SARRP özgü dışındaki tüm araştırma platformları için gerekli adımlar bu CFIR protokolü genelleme. Nöron inhibe etmek için önceki radyolojik yaklaşımlara CFIR avantajları, bu teknik, lokalizasyonu için üç boyutlu hacimsel görüntü yol sağlar ve dozun hedef konformal doz nontargeted beyin bölgelerine teması en aza indirgeyen, ve yüksek hassasiyetli ışın geometrisi ile konformal doz dağılımı için izin vardır keskin ışın sınırları. Biz belirli bir anatomik bölgeye hedef doz CT eşliğinde görüntüleme nasıl kullanılacağını anahat, ve bunu yaparken üzerine, nasıl radyasyon görselleştirmekγ-H2AX, DNA çift sarmallı tatili 35, 45-48 bir marker için immunohistokimyasal kullanarak doğrudan doku dağılımını doz. Nörojenik nişler seçici ışınlanması için bu yaklaşımın kullanılması fizyolojisi ve hastalığın yeni yetişkin doğumlu nöronların fonksiyonel rolünü açığa çıkaran önemli etkileri olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan Kullanımı

Standart bakım ve kullanım protokolleri için kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi onay alın. Önce (Şekil 2) tarif edildiği gibi 2 mevcut protokol, 5,5-10 haftalık yetişkin C57BL6 / J farelerinde fokal ışınlama çalışmaları için geliştirilmiştir. Ancak, diğer yaş ve küçük hayvan türlerinin (sıçan, hamster ve zemin sincap, vb) de kullanılabilir, etkili anestezi protokolleri ve (ROI) bölgenin tespitine imkan veren bir radyografik referans atlas kullanılabilir olması koşuluyla.

1.. BT eşliğinde Radyolojik Platformu Kalibrasyon

Her kolimatör boyutu ve kullanılan X-ışını tüpü filtre türü için önceden radyolojik platformda radyasyon dozu için film tabanlı kalibrasyonları gerçekleştirin. Radyasyon dozu planlama yazılım 49 availabl kullanarak, arzu edilen hedef bölgeye ışınlama bir yay ışın hedeflemek amacıylaradyasyon dozu dayalı gerekli teslimat süresini hesaplamak için en ticari radyasyon platformlarda e, fare CT taramalarına dayanan faiz (ROI) bölgenin derinliği, ve robotik platformun dönme hızı; Bu konuda ayrıntılar dışında kalan Bu protokolün onlar radyasyon platformlar arasında farklılık gibi. CT görüntüleme ile ventrobazal hipotalamus 2 (Şekil 3) görüntülenmesi amaçları için, 1 mm Al filtrasyon ile bir 0.4 mm ve odak noktasının 100 kVp ışın enerjisi ile X-ışını tüpü yapmaktadır. HPZ fokal ışınlama için, tedavi üzerinde 0.6 cm'lik bir doku derinlikte radyasyon 10 Gy sunmak için, 225 kVp, 13 mA de X-ışını tüpü ve 0.15 mm Cu filtrasyonu ile bir 1-mm odak spotu çalıştırabilir 4.6 dakika süresi. Farklı ROI arasındaki Hedefleme farklı parametrelerin hesaplanmasında gerektirir.

  1. Daha önce açıklandığı gibi 2 median eminence nöron yüksek yağlı diyetin etkilerini inceleyerek varsa, dört haftalık dişi C57B eldeJackson Fare laboratuvarların L6 / J fareler ve kafes başına evin dört fareler. Beş haftalık bir yüksek yağlı diyet normal yiyecekle gıda geçin. Fareler yeni konut ve gıda gelmesini bekleyin. 5.5 haftalıkken CFIR tedaviyi uygulayın. Ulaştırma radyolojik platformu içeren ameliyathaneye tabi. Aktarım sırasında stres düzeylerini en aza indirin. Izofluran gaz anestezi odasını hazırlayın. Daha sonra, odanın içine bir fare ekleyin. Buna paralel olarak, tedavi sonrası için ısıtma pedi (düşük ayar) hazırlamak.
  2. Fare ayak pad sıkıştırmaya karşı yanıt altında ve artık sonra, radyolojik platforma konuyu getirmek ve robot aşamanın hareketsiz yatak yerleştirin. Isırık koruma (Şekil 1D) içine deneğin burun konisi anestezi fincan içine ağız ve diş yerleştirin. Immobilizasyon yatağa fare düz yatırın ve Yanıtsızlık korumak için devam edip etmediğini görmek için kontrol edin. Eğer öyleyse, gazlı bez bant ile yatağa fareyi aşağı bantlayın. Yatağa fareyi aşağı taping, Kafa yatay bir düzleme tesviye olduğundan emin olun. Bu kulakları yukarı çekerek ve tesviye eğer görerek tespit edilebilir. Fare doğru pozisyonda sonra, kurşun koruyucu kalkanı kapatın.
  3. Fare konunun üç boyutlu anatomik yapı tarama sağlayacak olan, (bu platformlar arasında farklılık olacaktır) deneycinin radyolojik platformu on-board yazılımını kullanarak bilgisayar tomografi taraması edinin. Fare kafası yatay düzleme tesviye olup olmadığını görmek için kontrol edin. Kişinin kafası tesviye olana kadar 1.3 - Değilse, tekrar 1.2 adımları.
  4. CT görüntüsünde yatırım getirisini belirlemek. Şekil 3E'de gösterildiği gibi, bir 45 ° 'lik bir açı ile yatay düzleme ROI, kafatasının yüzeyine mesafeyi hesaplayabilir.
  5. On-board yazılımı kullanarak, Şekil 4A'da gösterildiği gibi, yukarıda fare konunun bir X-ışını alır. Ardından, radyolojik platformdan fareyi kaldırmak ısıtma yastığı koymak, ve aktif kadar izlemeye.
  6. Koronal BT görüntüleri, teslimat dozunu belirlemek amacıyla en az üç farelerin ortalama ROI anatomik derinliğini hesaplamak. Işınlama 10 Gy ventrobazal hipotalamus uygulanmıştır bir çalışmada 2 ikinci bir örnek olarak, (45 ° açı) kafatası ROI derinliği 0.66 cm (Şekil 3E bakınız) 'dir. Bilerek, araştırmacılar ROI için istenen dozaja ulaşmak için tedavinin uygun dönme hızını ve uzunluğunu hesaplamak için kendi radyolojik platformunda kurulu doz planlama yazılımı (DPS) kullanılır.
  7. Doz-planlama yazılım ile tedavi süresi ve robot aşamasının dönme hızı saptanmasından sonra, bir su eşdeğer plastik mock-fare modelinde gömülü GAFchromic radyasyona duyarlı filmler ile hesaplanan parametreler doz dağılımı ölçer. Bunu yapmak için, dört dikey yığılmış su eşdeğer plastik bloklar 29 sıra arasında üç GAFchromic radyasyona duyarlı filmler embedŞekil 4B'de gösterilmektedir.
  8. Robotik sahnede GAFchromic filmleri içeren sahte fare modeli yerleştirin ve yeni hesaplanan parametreleri ile fokal ışınlama ışınını çalıştırın. Örneğin, ventrobazal hipotalamus, giriş hedef 0,15 mm Cu filtre, 225 kvp parametreleri, bir yatırım getirisi elde etmek için 13 mA, 1 mm çaplı radyasyon ışın ayarı, 45 ° gantry açısı, 1.3 ° / sn dönme ve 4.6 dakika 10 Gy radyolojik dozu.
  9. Işınlama ardından, desen ve radyasyon doz yoğunluğu için filmler edin. Ventrobazal hipotalamus, karşılık İzomerkez yukarıdaki film, İzomerkez filmde küçük bir net nokta, ve İzomerkez aşağıda filmde hafif bir halkada bir koyu halka koni hedef listelenen parametreleri ile 360 ​​° açılı dönüş için Işınlama ışın uygulanması (Şekil 4B) gözlemlenecektir.
  10. Parametreler cal vardı hangi fare konuların X-ışınları üzerinde İzomerkez GAFchromic filmi üst üsteparametrelerde kayıtlı. Şekil 4C'de gösterildiği gibi İzomerkez de ışınlanmış odak noktası istenen ROI bölge ile üst üste gerekir.

Alternatif yöntem: Beyin ROI hedefleme güçlüğü devam ederse, iyotlu kontrast CT görüntülerinin altında ventrikül görselleştirme geliştirmek için intratekal enjekte kullanın. Kısalık aşkına, bu prosedür bu protokolün dışında kalan, ancak daha önce 35, 50 tarif edilir. İyot kontrast ek ventriküler işaretlerini (Şekil 5A) sağlayacaktır.

2. Işınlama Işın doğrulanmadı Belirlenmesi

Bundan başka doku 2, 35, 51 içindeki radyasyon ışınının doğrudan görselleme yoluyla CFIR kiriş doğruluğu teyit etmektedir. Bunu yapmak için, γH2AX 51, bir histon proteini ve DNA çift iplik sonlarının erken bir işaretleyici tespit etmek için immünohistokimya gerçekleştirin. Fare konular transcardially perfüze ve ışınlama bir saat içinde sabit olmalıdır. Aşağıdaki ışınlanmışΥH2Ax fez, DNA onarımı hızla gelişir ve düzeyleri 35 önemli ölçüde azalır.

  1. 1.3 - 1.1 adımları tekrarlayın.
  2. Hedef BT ile belirlendikten sonra, fare konusu radyasyon iletim demeti ile aynı hizaya bu hedefe robotlu kontrol altına taşınır. Giriş hesaplanan parametreler (dönme hızı ve tedavi süresi arzu edilen dozaja ulaşmak için) doz-planlama yazılım içine aşama 1.6 'dan ve tedavi başlar. Fare dikey yönelimli ekseni etrafında dönerken, gezer dikeyden 45 ° 'ye işaret ile tedavi teslim edilir.
  3. Işınlama ardından, fare konularda transcardial perfüzyon gerçekleştirin. Bir saat içinde 52 perfüzyon yapın. % 4 PFA / PBS olarak perfüzyon, daldırma düzeltme beyinleri izlenerek ve hafifçe 4 ° C de bir gece kaya
  4. Sonraki sabah, paraformaldehit fiksatif çıkarmak için PBS içinde 3 x 5 dk yıkayın. Daha sonra, 4 ° C'de bir sallama düzeneği üzerinde 1 x PBS içinde% 30 sukroz içinde bırakın
  5. Yavaşça 4 ° C (bize de kayamanuel bir 12-16 saat), beyin tüpün dibine battı kadar. Bu, donmaya karşı koruma sağlamak adım olarak hizmet vermektedir. Beyinleri lavabo sonra fazla% 30 sucrose/1x PBS transferini engellemek için delikli bir kaşık ile beyin kaldırmak. Çabuk kuru buz üzerinde orta dondurma embed. Pipet ile donma orta girdap ve plastik kalıp beyin hizalayın.
  6. Kez tamamen dondurulmuş, depolama için -20 ° C derin dondurucuda beyin blokları transfer.
  7. Immünohistokimya yapılacağı gün, koronal kesit 40 um kalınlıkta ve ince bir fırça ile PBS ihtiva eden bir 24-yuvalı plaka içine yüzer. Bölümler hedef bölgenin ışınlama kapsama belirlemek için immünboyama için doğru seri sırayla tutulmalıdır.
  8. Antijen geri alma aşaması için hazırlık olarak bir su banyosunda 80 ° C'ye kadar ön ısıtılması, 0.01 M sodyum sitrat çözeltisi. Aynı zamanda, sodyum sitrat ısınırken, 5 dakika yıkama 0.01 M PBS içinde 3 kat gerçekleştirin.
  9. Sodyum sitrat çözeltisi, 80 ° C'de sonra, beyin bölümleri daldırın in sodyum sitrat tampon çözeltisi. 1 saat boyunca 80 ° C'de su banyosu içinde bırakın.
  10. Bölümünü çıkarmak ve sodyum sitrat solüsyonu oda sıcaklığına ulaşmasına izin verir, daha sonra 0.01 M PBS içinde 5 dakikalık üç yıkama yapar.
  11. % 5 normal keçi serumu içeren PBS-Triton 1 saat boyunca bloke beyin bölümleri.
  12. 4 ° C'de fare anti-fosfo-H2AX birincil antikor konsantrasyonu ile 1:700,% 5 normal keçi serumu içeren PBS-Triton beyin bölümleri gece boyunca inkübe
  13. Ertesi gün, 15 dakika yıkama 0.01 M PBS içinde 3 kat Triton-gerçekleştirin.
  14. PBS-Triton 2 saat boyunca 1:500 yoğunlukta 488 nm fluorphore ile konjuge edilmiş keçi anti-fare ikincil antikoru ile,% 5 normal keçi serumu ihtiva eden beyin bölümleri inkübe edin.
  15. 15 dk yıkar 0.01 M PBS-Triton 3x gerçekleştirin.
  16. Çekirdeği görselleştirmek için 10 dakika boyunca 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) lekesi (PBS içinde 1:5,000) yapın. Daha sonra PBS ile 5 dakika boyunca beyin bölümleri yıkayın.
  17. Elektrostatik ch montearged mikroskop PBS içinde yüzen bölüm kayar. Aşırı PBS silin ve slaytlar kurumasını bekleyin. Montaj orta kullanarak slaytlar lamel ve slaytlar bir gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kurumaya bırakın.
  18. Floresan mikroskop ile seri koronal kesitlerin fotoğraf çekmek. ΥH2Ax İmmünbüyanmanın (yeşil) ışınlama siteyi gösterir. DAPI (mavi) bir nükleer boya (Şekil 5B) 'dir.

3. Fare hazırlanması Odak Işınlaması için Konular

ΥH2Ax İmmünbüyanmanın sonuçları inceleyin. Bir kez kalibrasyon memnun ve ışınlama kiriş hedefleyen, denemeye devam. Bu noktada (kiriş teslimat tamamlanması için hayvan kurulum itibaren) bir fare tedavi etmek için gereken toplam süre, bir 1-mm koluna sahip olan bir 10-Gy tedavisi için yaklaşık olarak 10-15 dk.

  1. Jackson Fare laboratuvarların dört haftalık C57BL6 / J dişi fareler sipariş. Evin dört kafes başına fareler ve normal yiyecekle gıda geçişBeş haftalık bir yüksek yağlı diyet. Kulak delme fareler onlara benzersiz bir tanımlayıcı işaretleri vermek. Günlük farelerin sağlığını izlemek. Not: BT eserler çizgiler neden olur gibi metalik belirteçleri kullanılamaz.
  2. Farelere radyasyon veya plasebo tedavisi öncesi gün tartılır. Bölünmüş radyasyon veya plasebo tedavisi için iki kohort içine fareler ve kohort arasındaki ağırlık açısından anlamlı bir fark yoktur emin olun. Farenin altı haftalık zaman tedavi gününde, tüm fareler tartılır ve kütle kayıt. Yavaşça radyolojik platformuna iki tabur taşıyacak. Stres düzeylerini en aza indirmeye özen gösterin.
  3. Izofluran gaz anestezi odasını hazırlayın. Iki fare, sham kontrol grubu önceden belirlenmiş bir ışınlama grubunda ve başka anestezisi. Ameliyat sonrası tedavi için düşük ayarında ayarlanan ısıtma yastığı hazırlayın.
  4. Radyasyon almak için fare için 1.4 - 1.2 adımları izleyin. Tedavisi devam ederken sahte fare için, anestezi odasına fare tutmak. Sur olunHedef BT'de tespit edildikten sonra ortam radyasyon üzerinde herhangi bir etkisi radyasyon teslim ışını ile bu hedefe uyum için robotik kontrol altında fare konusu hareket, in çarpanlarına böylece e O anestezi odası CFIR platformu yakındır. Girdi doz planlama yazılımı içine parametrelerini (dönme hızı ve tedavinin süresi) hesaplandı.
  5. Işınlama tedavisi tamamlandıktan sonra, ısıtma yastığı sham ve ışınlanmış fareler hem dönmek, onlar uyanmak kadar izlemek.
  6. Hayvan tesis sham ve ışınlanmış fareler hem dönün. Her gün izliyoruz. Her yarım hafta fareler tartılır. Ilk BrdU maruz kaldıktan sonra BrdU ve nöronal bir işaretleyici bir ay için immünohistokimya colabeling gruplar arasında hedef hipotalamik çoğalma bölgesi ışınlama doğrulamak için, BrdU intraperitonal enjeksiyonları yönetmek (50 mg / kg) üç gün sonrası işleme ve incelemek nöron (Şekil 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Değerlendirilmesi BT eşliğinde Hedefleme ve Doğruluk

Bu sistemin, mekanik kalibrasyon çeşitli açılardan tek bir profil noktada kesişir sağlamak için çok önemlidir. Kalibrasyon uçtan uca hizalama doğruluğu 0.2 mm 29 olarak ölçülmüştür bir yarı-otomatik bir görüntü-bazlı yöntem ile gerçekleştirilmiştir. Hipotalamik orta tepe yapının hacmi 2 küçük olduğu için bu doğruluk oldukça önemlidir. Bu kalibrasyon test etmek için, bir su eşdeğer plastik mock-35 fare modelinde (Şekil 4B) gömülü GAFchromic radyasyona duyarlı filmler ile doz dağılımları ölçülmüştür. Kısaca, fare konu bir CT-tarama alınmıştır, ve ventrobazal hipotalamik hedef alan tespit edilmiştir. Teslimat ve dönme hızı hesaplandı ve uygun kolimatör ve filtrasyon radyasyon 10 Gy teslim edildi sağlamak bağlanmıştır. Su-equivalen tasarlanmış bir mock-fare modeli GAFchromic radyasyona duyarlı film ile gömülü t plastik yapı, daha sonra, farklı odak düzlemlerde doz dağılımı ölçmek için, gerçek fare konu için ikame edilmiştir. Şekil 4B, 1-mm çaplı demeti olan bir ark tedaviden uçtan uca test sonuçları kullanılarak gösterir mock-fare platformda GAFchromic filmler. Robot numune aşama, bir "yay" ya da radyasyon koni üreten, dikey olarak yönlendirilmiş bir eksen etrafında döndürülerek ise Portal sahte fare modeli ile ilgili olarak 45 ° açı ile belirlenmiştir. Yarı maksimum (FWHM) de tam genişlik yaylar bir açıyla filmin çarpacak Başlangıcı 1.0 mm'den daha büyük olan 2.31 mm. ' Teorik olarak bu açıda ışın boyutu 2.0 mm olmalıdır. Şekil 4'te gösterilen ışın odak nokta farklı yönlerden kirişlerin hassas hizalamasını gösterir. Bu film ışın konumunu ve hassasiyet (Şekil 4C) gösteren, gerçek fare konunun üstüne bindirilmiş olabilir.

e_content "> 1 mm çapında ışın kolimatörü kullanarak, bir yay tekniği hem fare bireyde hedef noktaya 10 Gy teslim etmek için kullanılmıştır. Önceki ölçümler 29, bu tekniğin, 1 dışında (<0.1 Gy) radyasyonunun çok düşük dozlarda sağladığını gösterir Hedef mm. hipofiz bezi ve çevresindeki yapıların alan bu nedenle etkili bir ventrobazal hipotalamus odak ışınlama karşı korumalıdır. demeti hedefleme doğruluğu hayali olarak her iki 0.2 mm mesafede olduğu önceki çalışmalarda ölçülmüştür 29 ve doku bölümleri 35 test .

Gerekli olmasa da, ROI hedefleyen BT eşliğinde geliştirmek için bir enjekte intratekal iyotlu kontrast tarafından geliştirilmiş olabilir beynimiz uygulama (Şekil 5A) için hedef CT rehberliğinde. Bu invaziv ve hantal bir işlemdir gibi, bu karşıtlık genellikle kullanılmaz ve bu protokolü açıklanan değildir. Bu protokol ile ilgili ayrıntıları Ford et al. 201 bulunabilir1 ve Chaichana et al. 2007. Bu iyotlu kontrast avantajları lateral ve üçüncü ventriküller açıkça CFIR radyolojik platformu (Şekil 5A) edinilmiş CT taramaları görselleştirildiği vardır. Hedef üçüncü ventrikül tabanında, medyan itibar oldu, ve BT destekli navigasyon yazılımını kullanarak ve otomatik robot konumlandırma arayüzü içine ithal tespit edilmiştir. Bony kafatası yapıları tespit ve iyotlu kontrast istihdam değildi sonraki çalışmalar için anatomik noktalara olarak kullanılmıştır.

Işın γ-H2AX ile Doğrulama Hedefleme

Ayrıca onaylamak için bizim CT rehberliğinde hipotalamik ME hedefleyen, biz aşağıdaki ışınlama ortaya çift iplikli DNA kırıkları dolaylı muayene ile dokuda 1-mm ışınlama ışın görüntülendi. H2AX histon proteini DNA çift iplikli kırılmalara sonra fosforilatlanır. γ-H2AX yaygın olarak beyinde ve diğer dokulardaki 46 kullanılmıştır -48 ve γ-H2AX + odaklarının sayısı doz 51, 53, geniş bir aralık üzerinde doza radyasyon ile iyi bir korelasyon görülmektedir. Biz, γ-H2AX imüno (Şekil 5B) aşağıdaki ışının açık görselleştirme görülmektedir. Sonuç γ-H2AX boyama beklenen konumu hassas hedefleme gösterdi. Kiriş kenar 0,3 mm 54% 20-80 yarı gölge belirtmek film tabanlı fizik devreye ölçümleri ile anlaşarak, aynı zamanda son derece keskin oldu. Daha önce, amaçlanan hedefe ve doku bölümleri 35 görselleştirildiği gibi, kirişin merkezi arasındaki mesafe ölçüldü. Kirişin merkezi tespit ve işlem 35 esnasında doku büzülme etkileri için hesaba katıldıktan sonra 10 ışınlanmış farelerde 0.19 ± 0.36 mm (standart sapma) bir ortalama mesafe ile amaçlanan hedeften dengelenmiştir.

Dikeyden 45 ° 'lik bir yay oluşan bir stereotaktik benzeri bir yay tedavi kullanarak,Biz etkili bir diğer nörojenik nişler (Şekil 5C-D) aydınlatarak olmadan, ventrobazal hipotalamus hedef başardık göstermektedir. Çevresinde ışınlanması az, ve GAF-kromik filmi (Şekil 4B) ve γ-H2AX imüno (Şekiller 5B-D) ile gösterildiği gibi, radyasyona maruz kalma, bir sınır oldu. Nispeten sert X-ışını (225 dozmetre kullanılmış olsa da ışınlar nedeniyle kaplayan kemik tarafından donanımın belki de bu bölge ile girin çünkü hipotalamus ME için doku dorsal, ışık γ-H2AX boyanma (Şekil 5B) gösterir 0.15 mm Cu filtrasyon).

Nöron üzerindeki etkileri

Bizim BT eşliğinde ışınlama teslim özgünlüğünü teyit üzerine, biz ME nöron düzeylerine ışınlama 10 Gy etkisini incelemiştir. Yetişkin fareler daha sonra, daha sonra, bir yüksek yağlı diyetle beslenen radyasyon veya plasebo tedavi ve edilmiştirBrdU enjeksiyonu, daha önce eski 6 hafta 2 başlayarak tarif edildiği. Fareler ilk BrdU enjeksiyondan bir ay sonra, 10 haftalıkken muayene için kurban edildi. Işınlanmış HFD beslenen yetişkin fareler plasebo uygulanan kontroller ile karşılaştırıldığında ME ~ 85% inhibisyon nöron sergiledi (Şekil 6A) 2. Arkuat nükleus, ışınlama sitesi çevreleyen bir bitişik yapı, nöron değişiklikler açısından incelenir ve ışınlanmış hayvanlar ve sham kontrol grubu arasında istatistiksel olarak önemli bir fark (Şekil 6A) 2 olduğu bulunmuştur.

Yetişkin doğmuş Medyan Hazretleri Hipotalamus Nöronlar Fonksiyonu

Işınlanmış ve sahte farelerde değişiklikler tedavisi sonrasında incelenmiştir. Kürk ceket ve dokunmaya tepki normal görünüyordu. Bir kimya paneli ve tam kan sayımı paneli ışınlama tedavisini takiben bir hafta incelenmiş ve anlamlı bir fark (n = 9/group) gözlenmiştir. Yüksek yağlı beslenenlerdeBiz ışınlama (Şekil 6A) takip eden bir aylık yetişkin doğumlu ME nöronlarda bir ~% 85 bir azalma gözlenmiştir farenin, ışınlanmış fareler, plasebo ile tedavi edilen grupta (Şekil 6C) kıyasla zaman içinde kilo azalmıştı. Aksine, normal-chow, kontrol fareleri beslenen ME gözlenen seviyelerinin nöron yüksek yağlı beslenen muadillerine 2 önemli ölçüde daha düşük olduğu durumlarda, ışınlanmış gruplar (Şekil 6B) karşı plasebo arasındaki ağırlık istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. İlginç bir şekilde, ışınlanmış yüksek yağlı beslenen farelerde bu düşük kilo alımı, daha önce eden Grup 2 (Şekiller 6D-I) ile detaylı bir şekilde tarif metabolizma ve aktivitedeki değişiklikler eşlik etmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Bilgisayar tomografi rehberliğinde fokal ışınlama (CFIR) platformu. (A) CFIR küçük kirişler ile BT kılavuzluğunda radyoterapi sunma yeteneğine sahip hassas bir radyasyon cihazı kullanır. Bir CFIR platformun bir örnek küçük hayvan radyasyon araştırma platformu (SARRP) 'dir. Kurşun koruyucu (gösterildiği gibi) ile, SARRP £ 5170 de 41 inç (derinlik) ile 58 inç (genişlik) tarafından 81 inç (yükseklik) duruyor. (B) 360 ° döner, bir yapıya bağlı bir çift kaynak X-ışını tüpü kullanarak, SARRP bir robot izin veren numune aşamasını kontrol kullanır radyasyon tedavisi boyunca bir hayvan öznenin dönmesi. (C) CFIR donanımı kızak, hayvan desteğe, robot numune sahne döner ve dönen elektronik görüntüleyici, bir X-ışını kaynağı, kolimatör oluşmaktadır. (D) fare konu robotik numune aşama gaz girişi ile anestezi bir hareketsiz yatak yerleştirilir. Zırh kaynaktan et al. 2010. (E) CFIR donanım odak ir için özelleştirilebilir collimating koniler içermelidir Farklı boyutlarda radyasyon teslim. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Deneysel paradigma. Kadın C57BI / 6 fareler Jackson fare laboratuarlardan emretti ve dört haftalıkken ikamet kafesleri alıştırıldı. Işınlanmış veya sahte tabur: Fare tabi bir reklam libitum yüksek yağlı beş haftalıkken diyet ve iki tedavi gruba bölünmüş geçirildi. Fizyolojik değerlendirmeler uzunlamasına öncesi ve tedaviden sonra alındı. Işınlama veya sahte tedaviler 5,5 hafta uygulandı. Daha önce tarif edildiği gibi 2 intraperitoneal enjeksiyonları BrdU altı haftalık verildi.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Faiz lokalizasyon bölgesi. Hipotalamik proliferatif zon (HPZ), hipotalamik medyan eminens bulunan nörojenik bölge, ventral mediobasal hipotalamusta yer almaktadır. Edinilebilir (: (A) faiz (ROI) HPZ bölgesi Allen Beyin Atlas Veri Portalının (7.041, 7.211, 5.564 pozisyon) bir 3-D Nissl referans atlas hacmindeki kırmızı çapraz kıllar tarafından vurgulanır http:// mouse.brain-map.org / ) 55. Ondokuz gün yaşlı farelerde ROI (B) Koronal beyin bölümü. BrdU immünhistokimya (yeşil) ROI (beyaz ok) proliferatif hücreler içerdiğini ortaya koymaktadır. HPZ proliferatif hücrelerin yoğunluğu -1.75 mm Bregma'ya en yüksek yoğunluğa sahip, ekseni posterior anterior sınırlıdır. Doku kesitleri DAPI nükleer işaretleyici (mavi) ile karşıt-boyanmış bulunmaktadır. Lee et al. 2012A ikinci Şekil.Bir CFIR platformda (CE) CT-görüntüleme ark ışını radyasyon teslimat HPZ ROI (kırmızı çapraz kıllar) hedefleme sağlar. Yatay düzlemin (C), sagital düzlemi (D), ve koronal düzlemde (E) fare konu CT-görüntüsü. ROI için kafatasının yüzeyine (E) Uzaklık 0.62 cm (kırmızı çizgi) 'dir. Ölçek bar = 1 mm (A), 50 mikron (B), ve 0.62 cm (CE). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4. Işınlama teslim kalibrasyonu. SARRP robotik sahnede immobilizasyon cihazda güvenli bir fare konu (A) X-ışını. (B) Hesaplanan ROI koordinatlarıyeniden girilir ve bir sahte fare modeli karşı hedeflenmiş. Fantom modeli suda eşdeğer plastik gömülü GAFchromic radyasyona duyarlı film oluşmaktadır. Filmler de, yukarıda yer alan ve ROI İzomerkez altında doz dağılımını algılar. SARRP bir 45 ° yay radyasyon ışın ROI bir koni şeklinde bir doz dağılımı sunar ve İzomerkez (yarı gölge nokta) yakınsarsa. Gerçek bir fare konu (sarı hat) bir X-ray ile hayali olarak 1 mm radyasyon ışını ile edinilen dozimetre-film (C) üst üste binmesi. Beyaz daire (ok) 10 Gy radyasyon fokal HPZ hedeflenen doz gösterir. Noktalı çizgi beyin özetliyor. Lee et al. 2012A Panel.

Şekil 5,
Şekil 5,. Normal BT görüntüleme suffic yapmazsa iyotlu kontrast ile Radyasyon Teslim. BT görüntüleme Onay ROI görselleştirme artırabilirsinize. (A) Fare denekler önce (Lee et al. 2012: Panel) tarif edildiği gibi iyot tezat aldı. , Koronal yatay ve sagital düzlemde BT görüntüleri soldan sağa gösterilmiştir. Dokuda radyasyon teslimat (B) onay γH2AX DNA, çift sarmallı tatili bir marker için imünohistokimya ile tespit edilebilir. γH2AX İmmünbüyanmanın ventral mediobasal hipotalamusta ROI HPZ hedeflenen radyasyon ışın iletimini göstermektedir. γH2AX immüno-boyama lateral ventriküllere (C), ya da aynı fare konu hipokampus (D) 'nin subgranular bölgesinin subventricular bölgesinde gözlenmemiştir. (BD) Bölümler (Lee ve ark. 2012A itibaren) DAPI ile zıt olan. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .


Şekil 6,. Ağırlığı ve metabolizma değişmesi olarak ME nöron sonuç odak inhibisyonu. (A) ventral mediobasal hipotalamusta yer alan orta tepe (ME) ışınlanması için hedeflenmiştir. Arkuat nükleus (ArcN) komşu anatomik yapıdır. Bir ay tedaviden sonra, ışınlanmış kohort versus plasebo ikinci BrdU + Hu nöronların yüzdesi, ME ve ArcN immünohistokimya ile nicelleştirilmiştir. ME nöron düzeyleri sham kohortlarda (n = 5/cohort, *** = p <0.0001) ışınlanmış azaltılmıştır. ArcN nöron düzeyleri etkilenmez (n = 3/cohort, ns = anlamlı değil) vardı. (B) Normal yemi ışınlama veya sahte treatm aşağıdaki (NC) beslenen ve (HFD) fareler beslenen (C), yüksek yağ ağırlığı değişiklikler için boyuna incelendiENT (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) tedavisi, ışınlanmış ve sham HFD beslenen fareler tedavi aşağıdaki Bir ​​ay% yağ kütlesi ve% yağsız kitle analizi için kantitatif manyetik rezonans spektroskopisi ile incelenmiştir. Işınlanmış fareler daha az% yağ kütlesi vardı ve sahte kontrol grubundan daha fazla% yağsız kitle (n = 5, * = p <0.05). Toplam kütle: (Sham) 21.0 ± 0.3 g (Irradiated) 18.86 ± 0.4 g; Yalın kütle: (Sham) 14.6 ± 0.2 g (Irradiated) 13.9 ± 0.3 g; Yağ Kitle: (Sham) 3.9 ± 0.2 g, ( Işınlanmış) 2.6 ± 0.3 g (n = 5, * = p <0.05). (FI) Işınlanmış ve plasebo uygulanan erişkin farenin gıda alımı, fiziksel aktivite ve tedavi sonrası iki haftalık profil bütün vücudun metabolik ölçümleri için kapsamlı bir Lab Hayvan İzleme Sistemi (CLAMS) yerleştirildi. Test odasına alışma devresinden sonra, ışınlanmış farenin si olduğu gözlenmiştirgnificantly yüksek enerji tüketimi, toplam aktivitesi, ve VO 2 (ml / kg / saat) bir gün karanlık bölümü sırasında sham kontrol grubu ile karşılaştırıldığında (n = 11, 12, * = p <0.05). (G) Anlamlı fark (n = 11, 12) solunum değişim oranı (YEK) gözlendi. Alt çizim Önceden Lee et al. 2012A ve Lee et al. 2012b yayınlanan verileri oluşturulur. Lee ve ark. 2012A adlı Subfigures CI. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BT eşliğinde odak ışınlama (CFIR) CT-rehberlik 32 kullanılarak robot kontrolünde küçük hayvanlar hedeflere radyasyon alanları sunma yeteneğine sahip bir roman ve tam bir sistem yaklaşımıdır. Küçük hayvan modelleri yüksek odaklı kirişler teslim CFIR bir yeteneği laboratuar araştırmaları ve klinik çeviri köprü yeni araştırma fırsatları sunar. Bu kağıt özellikle hipotalamik nöral progenitör nüfusunu hedeflemek için hassas radyasyon teslimat için CFIR yaklaşım anlatılmaktadır. Biz immünohistokimya ile X-ışını filmi üzerinden ve beyin dokusunda radyasyon teslim özgüllük kalibre ve onaylamak için nasıl burada göstermek.

Buna ek olarak, bu teknik, belli bir beyin bölgesinde nöron inhibe etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Biz komşu yapıların nöron düzeylerini değiştirmeden, medyan eminensin nörogenezi ventrobazal hipotalamus hedef ve inhibe mümkün olduğunu göstermek. M inhibisyonuE nöron metabolizmasının ve aktivitesinin değişiklikler, hem de sahte tedavi gruba karşı ışınlanmış yüksek yağlı diyet ile redüklenmiştir kilo (Şekil 6) 2 eşlik eder. Bu veriler, metabolizma ve enerji homeostazının düzenlenmesinde, bu yetişkin doğumlu hipotalamus nöronları için bir rol önermektedir. Ayrıca, aşırı yüksek yağlı diyet hatta yetişkinlikte 3 kritik metabolik devre değiştirebilir göstermektedir. Bizim sonuçlar yetişkin doğumlu nöronların bilinen fonksiyonu üzerinde önemli bir genişleme temsil ve yeni bir hipotalamik nöral progenitör nüfus 3 ışık tutuyor. Bu yaklaşımın potansiyel uyarılar ışınlama yerine nöron başına daha progenitör çoğalmasını engeller ve böylece fizyolojik değişiklikler tedavi sonrası kısmen diğer yetişkin hücre oluşumu bozulması ile açıklanabileceğini olması da mümkün olduğunu vardır. Gelecek adımda, bu özel nöral projenitör p çoğalmasını inhibe etmek için genetik araçlar geliştirilmesi içerecektiropulation, işlevsel rolü, bu öncüleri ve fizyoloji 3 düzenlenmesinde onların soyu oynamak için önemli bir açıklık sağlayacak olan.

Birlikte ele alındığında, ancak, bu radyolojik platformu sinir atalarıdır ve onların soyu üzerinde orta düzeyde ekranlar performans önemli bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet vermektedir. Bu radyolojik teknik, ancak sinirbilimlerin soruları araştırma sınırlı ve biz CFIR araştırma disiplinleri bir dizi kavramsal avans genişletmek için beklemek değildir. Ticari satılan BT eşliğinde radyolojik platformlarının son durumu Araştırmacılar araştırma soruları için bu platformun bu yeteneklerini kullanmak için bir fırsat (Şekil 1) sağlar. Birçok alternatif olduğu bir görüntü kılavuzlu küçük bir hayvan radyasyon yapmasına izin ticari olarak mevcuttur. Bu s için kullanılan sistemi ile olduğu gibi Ayrıca, CT eşliğinde odak ışınlama sistemi aynı zamanda, ev inşa edilebilirJohns Hopkins 29-33, 35 at tudies.

Fokal hedefleme bu derece Sahne uygun kalibrasyon ve ROI hedefleme gerektirir. Bu teknik başlangıçta CFIR platformu ve doz planlama yazılımı ile aşina olmak için eğitim alacak olsa da, cihazın çalışma platformunun protokolü ve yeteneklerini anlayarak sonra oldukça kolaydır. Tavsiye edilir radyasyon ışınının önceden tam ölçekli deney uzunlamasına çalışan birkaç kez kalibre operatör uygulamaları. Bu CFIR operasyonda kez akıcı, araştırmalar hızlı hareket etmeleri gerektiğini söyledi.

Bu tarifnamede tarif edilen bu CFIR protokol lokalizasyonu için üç boyutlu hacimsel görüntü yol kullanır ve doz hedeflenmesi. Konformal doz nontargeted beyin bölgelerinin maruz aza indirir ve yüksek hassasiyetli ışın geometrisi keskin ışın sınırları ile konformal doz dağılımı sağlar. Bu bir soru sormak için izin verir regardiyetişkin doğumlu nöronların fonksiyonu ng değil, aynı zamanda bu tür fizyoloji, tümör biyoloji ve immünoloji gibi alanlarda hücre çoğalmasının rol sorulara bölgeleri açılır. Bu yöntem, görselleştirme 35, 56 geliştirmek için kontrast boyalar ve biyolüminesans ile çeşitli şekillerde genişletilebilir. Çabalar şimdi daha CFIR donanım yeteneklerini geliştirmek için devam etmektedir, ve platformu artık bir on-board pozitron emisyon tomografi tarayıcı 56 içerecek şekilde modifiye ediliyor. Bu araştırmacılar ve hasta yatağına tezgah keşifler çevirisinde yardım için mevcut araçları genişlemesini kolaylaştıracak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW Xstrahl, Inc ile bir araştırma finansman ve danışmanlık anlaşmaları vardır

Acknowledgments

Biz teknik danışmanlık ve yardım C. Montojo, J. Reyes, ve M. Armour teşekkür ederim. Bu çalışma (DAL) Sağlık hibe F31 NS063550 ABD National Institutes, Basil O'Connor Starter Scholar Ödülü ve (SB) Klingenstein Fonu ve NARSAD hibe tarafından desteklenmiştir. SB Tıp Araştırma WM Keck Seçkin Genç Bilim İnsanı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Tags

Nörobilim Sayı 81 Nöral Kök Hücreler (NSC'lerde) Vücut Ağırlığı Radyoterapi Görüntü Rehberliğinde Metabolizma Enerji Metabolizması nöron hücre çoğalma Nörobilim Işınlama Radyolojik tedavi Bilgisayar tomografi (BT) görüntüleme Hipotalamus Hipotalamus Proliferatif Bölge (HPZ) Medyan Eminence (ME) Küçük Hayvan Radyasyon Araştırma Platformu (SARRP)
Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J.,… More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter