Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

הפונקציה של תאי עצב של יונקים בוגרים שנולדו נשארת אזור פעיל של חקירה. קרינה מייננת מעכבת את לידתו של נוירונים חדשים. באמצעות הקרנה המונחה טומוגרפיה מחשב מוקד (CFIR), מיקוד אנטומיים תלת ממדי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים.

Abstract

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהווה אתגר משמעותי. יש גישות לעכב neurogenesis למבוגרים באמצעות משלוח נגיפי פולשניים או בעלי חיים מהונדסים בלבול פוטנציאלי שהופכים את הפרשנות של תוצאות מהמחקרים אלה קשים. הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לחקור noninvasively הפונקציה של קבוצות נבחרות של מבוגר יליד נוירונים באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת המוקדים מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת מיקוד של אזורים עצביים ספציפיים. על מנת להאיר את התפקיד הפונקציונלי הפוטנציאלי שנוירוגנזה ההיפותלמוס מבוגר משחקת בוויסות של תהליכים פיסיולוגיים, פיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של מבוגר יליד נוירונים ברוממות החציוני ההיפותלמוס באופן סלקטיבי. אנו מתארים שיטה לomputer C-מודרך טומוגרפיהמשלוח ו ocal ir קרינה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מדויקת מיקוד בבעלי חיים קטנים. CFIR משתמש בהדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של מינון הקרינה, מצמצם את החשיפה לקרינה לאזורים במוח nontargeted, ומאפשר להפצת מינון קונפורמי עם גבולות חדים קרן. פרוטוקול זה מאפשר לאדם לשאול שאלות לגבי תפקידו של מבוגר יליד נוירונים, אבל גם פותח אזורים לשאלות בתחומי radiobiology, ביולוגיה של גידול, ואימונולוגיה. הכלים רדיולוגי אלה יקלו את התרגום של תגליות בספסל לצד המיטה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תגליות שנעשו לאחרונה הראו כי המוח של היונקים הבוגרים יכול לעבור במידה יוצאת דופן של גמישות. מבוגר יליד נוירונים נוצרים לאורך הבגרות בנישות מיוחדות של המוח של היונקים 1. מהו תפקידיו של מבוגר יליד נוירונים אלה? ויותר מכך, אין הם ממלאים תפקיד בפיזיולוגיה והתנהגות? מחקרים בנושא זה התמקדו באופן מסורתי באזור subventricular של החדרים לרוחב ואזור subgranular של ההיפוקמפוס, עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מתאפיינים נוירוגנזה באזורים אחרים במוח כגון ההיפותלמוס היונקים 2. נוירוגנזה כבר דווחה שבלאחר הלידה וההיפותלמוס המבוגר 2-10, ואת הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס יילוד אלה נותרת אזור פעיל של חקירה.

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהוות אתגר משמעותי עבור תחום מדעי המוח באופן כללי. עיכוב סלקטיבי של מפרטific אוכלוסיות עצביות נותרת מוגבלות על ידי חוסר של סמנים מולקולריים זמינים שהנם ייחודיים לאוכלוסיות עצביות אחת 11. לפיכך, מחיקה סלקטיבית של מבוגר יליד נוירונים מאבות העצביים אלה באמצעות מיקוד גנטי עדיין קשה. כמו כן, משלוח ויראלי למקד מבוגר יליד נוירונים סובל ממשתנים מבלבלים פוטנציאליים כגון החדרת פציעה ודלקת לתוך הסביבה 12.

הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לעקוף את הבלבול אלה ולחקור את השאלות האלה באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת בשיטה לא פולשנית למקד אוכלוסיות עצביות 13-15. לאחרונה, תיארתי את האזור נבטי של רוממות היונקים ההיפותלמוס החציוני (ME) שכינינו את אזור שגשוג ההיפותלמוס (HPZ) 2 2. כדי לבדוק אם neurogenesis למבוגרים בתוך ME ההיפותלמוס מווסת את חילוף החומרים ומשקל, שבקשנו לשבש את התהליך הזה. רוממות החציוני היא מבנה חד צדדי קטן בבסיס של החדר השלישי שממנו ההורמונים רגולטוריים הם שוחררו. על מנת לעכב את התפשטות ונוירוגנזה הבאה מבלי לשנות את הפונקציות פיסיולוגיות האחרות של האזור הזה במוח, שפיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של נוירונים בוגרים שזה עתה נולדו ברוממות החציוני ההיפותלמוס 2 באופן סלקטיבי.

מספר הקבוצות מועסק קרינה לדכא נוירוגנזה באזורים הקנונית 14-28. עם זאת, גישות רדיולוגי קודמות בדרך כלל ממוקדות שטחים גדולים, או often שלא במתכוון גם ממוקד אזורים במוח שבו מספר רב של נוירוגנזה כבר דיווחו, ולכן קשה לשייך באופן חד משמעי כל פגמים התנהגותיים שנצפו עם מומים באוכלוסיות עצביות ספציפיות. היכולת להקרנה ממוקדת יותר מסופקת על ידי פלטפורמות רדיולוגי המשלבות הדמיה מודרכת טומוגרפיה omputer ג עם הקרינה ו ocal ir קרן מסירה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מיקוד 29-36. קורות קרינה קטנות כמו 0.5 מ"מ קוטר זמינות למקד אוכלוסיות עצביות ספציפיות 35. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו למקד את ME ההיפותלמוס ולעצור את ההתפשטות ולחסום נוירוגנזה בבעלי חיים קטנים. בעקבות טיפול רדיולוגי על אוכלוסיות אב אלה, ניתן לבצע בדיקות פיסיולוגיות והתנהגותיים כדי להאיר את פונקצית הפוטנציאל של תאי בוגרים שנולדו. מיקוד הפוקוס הוא חשוב במיוחד עבור היישום שלנו מאזבלוטת יותרת המוח ממוקמת קרובה לרוממות החציוני ההיפותלמוס; הקרנה של יותרת המוח עשויה להשפיע על תפקוד הורמונלי ובהמשך לבלבל את התוצאות.

הבסיס הביולוגי לדיכוי ההקרנה הבאה נוירוגנזה עדיין אינו ברור. מחקרי קרינה קודמים הסתמכו על קורות שטח גדולות, והגיעו למסקנה כי דיכוי נוירוגנזה מתווך דרך תגובה דלקתית 14, 37. ככזה הוא לא ברור אם הקרנת מוקד מאוד יכולה לדכא נוירוגנזה, שכן הוא אינו מעורר תגובה דלקתית משמעותית. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה על ידי הקבוצה של האזור העצבי הקלאסי בהיפוקמפוס שלנו הוכיחו כי הקרנת מוקד מאוד עם מינון של 10 Gy יכולה לדכא נוירוגנזה לפחות 4 שבועות לאחר הקרנת 35.

כדי לחקור את הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס בוגרים שנולדו ברוממות החציוני, אנו משתמשים ד קרינת דיוקevice מסוגל לספק הדמיה CT בשילוב עם קורות קרינה בקוטר קטן כדי לעכב ME נוירוגנזה. שימוש בשפופרת רנטגן מצורף gantry שמסתובבת על פני טווח של 360 °, שאנו מספקים אלומת קרינת מיקרו קשת קורה עם השימוש בשלב דגימת רובוט מבוקר המאפשר סיבוב של נושא בעלי החיים במהלך טיפול בקרינה (איור 1) . גלאי רנטגן ברזולוציה גבוהה המשמשים לרכישת תמונות כאשר gantry הוא במצב האופקי 33. לצורך המחקר, תמונות CT שוחזרו בגודל voxel איזוטרופיים של 0.20 מ"מ. ההדמיה CT על הלוח אפשרה זיהוי של יעד בעוד החיה נמצאת במצב הטיפול. היעד מקומי באמצעות תוכנת CT הניווט מתכנן במינון, שנכללה עם פלטפורמת רדיולוגי זמינה המסחרית שלנו. לאחר האיתור את ההחזר על ההשקעה שלנו על ידי הדמיה של CT, בעלי החיים הועברו לתפקיד על ידי הטיפול המתאים בשלב הדגימה רובוטית שיש לו ארבע מעלותריס של חופש (X, Y, Z, θ). באמצעות שילוב של זוויות פיגום ושלב רובוט, קורות יכולות להיות מועברות כמעט מכל כיוון ביחס לבעלי החיים, וטיפולים כמו קשת stereotactic אפשריים 29. לבדיקות הדמיה אחרות אלה וכל, העכברים הוצבו במכשיר קיבוע המאפשר אספקה ​​של גז isoflurane הרדמה תוך הגבלת תנועה. מיטת חוסר התנועה היא CT תואם, ומתחברת לשלב הדגימה רובוטית 34.

אנו מצפים כי CFIR יספק התקדמות רעיונית במספר תחומי מחקר. למרות שאנו משתמשים במיקוד לפי רדיולוגי של רוממות החציוני ההיפותלמוס כהוכחה לעיקרון של טכניקה זו, CFIR יכול לשמש היעד כל אזור של הגוף של כל אורגניזם מודל קטן באופן עקרוני. בתחום מדעי המוח, למשל, אנו רואים בטכניקה זו יכולה לשמש כדי להעריך את תפקודן של אוכלוסיות אב פעיל שגשוג שהוצע לExis לא באיברי circumventricular אחרים, כגון postrema האזור 38, 39, איבר subfornical 40, ובלוטת יותרת המוח 41. מחלוקות ארוכי שנים בנוגע לתפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים וזיהוי תפקיד סיבתי בהתנהגות יכולות גם עכשיו יהיו טובות יותר לטפל. בציפור שיר, טכניקה זו עשויה להתייחס לתפקיד של neurogenesis המבוגר בשמירה על ההתנהגות החזקה ועונתית של ציוץ ציפור 42, שכבר הקשו על ידי היכולת לעכב באופן סלקטיבי נוירוגנזה באזורים מסוימים במוח. הבנת מודל התנהגותי חזק זה עשויה לשפוך תובנה חדשה את התפקיד של neurogenesis למבוגרים בויסות התנהגויות מיניים דימורפית אחרות. לחלופין, בתחום מטבולים, CFIR עשוי לשמש כדי לחקור היבטים של התפקיד של התפשטות הפטוציט ותפקידה בחילוף חומרים ומאזן אנרגיה. האפשרות להתקדמות רעיונית בתחומי מחקר רבים היא משופרת על ידי ההקדמה של טכניקה זו.

= "Jove_content"> במאמר זה, אנחנו מדגימים את היכולות של CFIR לאנטומיים דיוק מיקוד של אלומת קרינת מוקד. למרות שאנחנו בהתחלה פיתחנו פלטפורמה זו קרינת חיה קטנה מחקר (SARRP) ללימודים שלנו, מכשירים דומים אחרים זמינים באופן מסחרי, שיכול להשיג הקרנה דומה מודרך CT מוקד 43, 44 עכשיו. לפיכך, אנו מכלילים פרוטוקול CFIR זה בצעדים הנדרשים לכל פלטפורמות המחקר ולא את אלה ספציפיים לSARRP. היתרונות של CFIR פני גישות רדיולוגי קודמות לעכב נוירוגנזה הם כי טכניקה זו מאפשרת הדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של המינון, מינון קונפורמי ממזער את החשיפה לאזורים במוח nontargeted, והגיאומטריה קורה דיוק גבוה מאפשרת להפצת מינון קונפורמי עם גבולות קורה חדים. אנחנו מתארים כיצד להשתמש דמיון מודרך-CT למקד את המינון לאזור אנטומי ספציפי, ועל כך, איך לדמיין את הקרינהמינון הפצה ישירות ברקמות באמצעות מכתים immunohistochemical לγ-H2AX, סמן של הפסקות גדילי הדנ"א כפולות 35, 45-48. השימוש בגישה זו להקרנה סלקטיבית של נישות עצביות עשויה להיות השלכות משמעותיות בחושף את התפקיד הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים חדש על פיזיולוגיה ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שימוש בבעלי חיים

לקבל אישור מועדת טיפול בבעלי חיים והשימוש מוסדי לפרוטוקולי טיפול ושימוש סטנדרטיים. הפרוטוקול הנוכחי פותח ללימודי הקרנת מוקד בעכברים בוגרים ישנים 5.5-10 שבוע C57BL6 / J, כפי שתואר לעיל (איור 2) 2. עם זאת, בגילים אחרים וגם מינים של בעלי חיים קטנים (חולדות, אוגרים, סנאי קרקע, וכו ') יכולים לשמש, ובלבד שפרוטוקולי הרדמה יעילים ואטלס התייחסות רדיוגרפי המאפשר זיהוי של האזור של עניין (ROI) הנן זמינים.

1. כיול של פלטפורמה רדיולוגית מודרכת-CT

לבצע כיולים מבוססי סרט למינון קרינה על פלטפורמת רדיולוגי מראש לכל גודל collimator וסוג של מסנן שפופרת רנטגן בשימוש. על מנת למקד את קרן קשת של קרינה באתר היעד הרצוי, השתמש בavailabl 49 תוכנת מינון תכנון קרינהדואר ברוב פלטפורמות קרינה מסחריות לחישוב זמן אספקה ​​הנדרש המבוסס על מינון הקרינה, את עומק את האזור של העניין (ROI) המבוסס על סריקות CT של העכבר, ומהירות הסיבוב של הפלטפורמה רובוטית; פרטים בעניין זה נותרים בחוץ של פרוטוקול זה כפי שהם שונים בין פלטפורמות קרינה. לצורך המחשת ההיפותלמוס ventrobasal 2 (איור 3) עם ההדמיה CT, להפעיל את שפופרת רנטגן עם כתם 0.4 מ"מ מוקד ואנרגיה אלומת 100 kVp עם 1 מ"מ סינון אל. עבור הקרנת מוקד של HPZ, להפעיל את שפופרת רנטגן ב225 kVp, 13 mA, ובמקום מוקד 1 מ"מ עם סינון של 0.15 מ"מ Cu, כדי לספק 10 Gy של קרינה בעומק רקמה של 0.6 סנטימטר מעל טיפול זמן של 4.6 דקות. מיקוד בין ROIs שונה ידרוש חישוב פרמטרים שונים.

  1. אם לומד את ההשפעות של דיאטה עתירה שומן על נוירוגנזה ברוממות החציוני כפי שתואר 2 בעבר, לקבל נשי C57B ארבעה שבועות בןעכברי L6 / י ממעבדות ג'קסון מאוס, ובית ארבעה עכברים בכל כלוב. החלף מזון מאוכל רגיל לתזונה עתירה שומן בחמישה שבועות. לאפשר עכברים להסתגל לדיור ומזון חדשים. בצע טיפול CFIR ב5.5 שבועות ישנים. תחבורה מכפיפה לחדר הניתוח הכולל את פלטפורמת רדיולוגי. למזער את רמות לחץ בעת ההעברה. הכן את חדר הרדמה גז isoflurane. לאחר מכן, להוסיף עכבר אחת לחדר. במקביל, להכין כרית חימום (הגדרה נמוכה) שללאחר טיפול.
  2. ברגע שהעכבר נמצא תחת ואינו מגיב לדחיסת הרגל-pad, להביא את הנושא לפלטפורמת רדיולוגי ומניח על מיטת הקיבוע של השלב רובוטית. הנח את פיו של הנושא לתוך כוס ההרדמה האף קונוס, ושיניים לשומר הביס (1D איור). שכב עכבר על מיטת חוסר התנועה ולבדוק כדי לראות אם הוא ממשיך לשמור על חוסר תגובה. אם כן, קלטת את העכבר למיטה עם קלטת גזה. אמנם מקליט את העכבר למיטה, ודא שראשו מפולס למישור אופקי. זה יכול להיקבע על ידי משיכת האוזניים ולראות אם הם מפולסים. ברגע שהעכבר נמצא במיקום הנכון, סגור את מגן העופרת.
  3. לרכוש את סריקת מחשב טומוגרפיה באמצעות תוכנה של פלטפורמת רדיולוגי של הנסיין על הלוח (זה יהיה שונה בין פלטפורמות), אשר תספק סריקה מבנית אנטומיים תלת ממדית של נושא העכבר. בדקו אם ראש העכבר מפולס למישור האופקי. אם לא, חזור על שלבים 1.2-1.3 עד שראשו של הנושא מפולס.
  4. זהה את ההחזר על ההשקעה על ידי תמונת ה-CT. לחשב את המרחק מההחזר על השקעה על פני השטח של הגולגולת באמצעות זווית של ° 45 למישור האופקי, כפי שמוצג באיור 3E.
  5. שימוש בתוכנה על הלוח, לקחת את קרני ה-X של נושא העכבר מלמעלה, כפי שמוצג באיור 4 א. לאחר מכן, להסיר את העכבר מפלטפורמת רדיולוגי, לשים על כרית חימום, ולפקח עד פעיל.
  6. מתמונות CT העטרה, לחשב את העומק אנטומיים ROI הממוצע של לפחות שלושה עכברים על מנת לקבוע מינון מסירה. כדוגמא ממחקר קודם שבו 2 10 Gy של קרינה היה מנוהל על ההיפותלמוס ventrobasal, עומק את ההחזר על ההשקעה מהגולגולת (מזווית של ° 45) הוא 0.66 סנטימטר (ראה איור 3E). בידיעה, החוקרים השתמשו בתוכנת תכנון מינון (DPS) המותקנת בפלטפורמת רדיולוגי כדי לחשב את המהירות המתאימה לסיבוב ואורך הטיפול להשגת מינון הרצוי להחזר על ההשקעה.
  7. לאחר קביעת משך טיפול ומהירות סיבוב של הבמה רובוטית עם תוכנת מינון תכנון, למדוד הפצות מינון של הפרמטרים מחושבים עם סרטי קרינה רגישה GAFchromic המוטבע במודל חיקוי עכבר פלסטיק במים שווי ערך. כדי לעשות זאת, כדי לשבץ את שלושה סרטי קרינה רגישה GAFchromic בין ארבעה בלוקים נערמים אנכי מים שווי ערך פלסטיק 29 כמושמוצג באיור 4.
  8. הנח מודל עכבר מדומה המכיל סרטי GAFchromic על במה רובוטית, ולהפעיל את קרן הקרנת המוקד עם הפרמטרים מחושבים מחדש. לדוגמה, כדי למקד את ההיפותלמוס ventrobasal, קלט הפרמטרים של 0.15 מסנן Cu מ"מ, 225 kVp, 13 mA, הגדרת 1 מ"מ קוטר אלומת קרינה, זווית gantry 45 °, 1.3 סיבוב ° / sec, ו4.6 דקות כדי להשיג את ההחזר על ההשקעה מינון רדיולוגי של 10 Gy.
  9. בעקבות הקרנה, לבדוק סרטים לדפוס ועוצמת מינון קרינה. לסיבוב זווית 360 ° עם הפרמטרים המפורטים למקד את ההיפותלמוס ventrobasal, טבעת כהה בסרט מעל isocenter, נקודה פריכה קטנה בסרט isocenter, וטבעת בהירה יותר בסרט מתחת לisocenter המתאימה החרוט ממשל אלומת הקרינה יקויימו (איור 4).
  10. להרכיב סרט GAFchromic isocenter על צילומי רנטגן של נושאי עכבר ממנו הפרמטרים היו calמחושב על. המוקד המוקרן בisocenter צריך חפיפה עם אזור ההחזר הרצוי על ההשקעה כפי שמוצג באיור 4C.

שיטה חלופית: אם קושי במיקוד ROI המוח נמשך, השתמש ניגוד יוד מוזרק intrathecally כדי לשפר את ההדמיה של חדרים מתחת לתמונות CT. לשם קיצור, הליך זה נשאר בחוץ של פרוטוקול זה, אבל מתואר 35, 50 בעבר. לעומת זאת יוד יספק ציוני דרך נוספות חדרית (איור 5 א).

2. קביעת דיוק של ההקרנה Beam

נוסף לאשר דיוק קרן CFIR ידי הדמיה ישירה של אלומת הקרינה ברקמות 2, 35, 51. כדי לעשות זאת, לבצע אימונוהיסטוכימיה לזהות 51 γH2AX, חלבון היסטון וסמן מוקדם של הפסקות גדיל כפולות ה-DNA. נושאים מאוס חייבים להיות perfused transcardially וקבוע בתוך שעה אחת של קרינה. irradi הבאation, תיקון דנ"א במהירות ensues, והרמות של ΥH2Ax להקטין באופן משמעותי 35.

  1. חזור על שלבים 1.1-1.3.
  2. לאחר היעד מזוהה על CT, נושא ההזזה העכבר שבשליטת רובוטית ליישר יעד זה עם קורה משלוח הקרינה. פרמטרים של קלט מחושבים (מהירות סיבוב ואורך הטיפול להשגת מינון הרצוי) משלב 1.6 לתוך תוכנת מינון תכנון ולהתחיל בטיפול. טיפול מועבר עם gantry הצביע 45 ° מהאנכי בזמן שהעכבר מסתובב על ציר אנכי בכיוון.
  3. בעקבות הקרנה, לבצע זלוף transcardial בנושאי עכבר. בצע זלוף בתוך שעה אחת 52. בעקבות מוח זלוף, לתקן טבילה בPFA 4% / PBS ועדינות רוק הלילה בשעה 4 ° C.
  4. למחרת בבוקר, לשטוף 5 דקות ב3x PBS להסיר מקבע paraformaldehyde. לאחר מכן, לטבול בסוכרוז 30% ב 1x PBS על כיסא נדנדה ב 4 ° C.
  5. נער בעדינות על 4 מעלות צלזיוס (ually 12-16 שעה), עד שהמוח שוקע לתחתית צינור. זה משמש כצעד cryoprotection. ברגע שהמוח לשקוע, להסיר מוח עם כף מחוררת כדי למנוע 30% העברת PBS sucrose/1x עודפת. להטביע במהירות בהקפאה בינונית על קרח יבש. מערבולת מדיום הקפאה עם קצה פיפטה וליישר מוח בתבנית פלסטיק.
  6. ברגע קפוא לחלוטין, להעביר בלוקים מוח למקפיא -20 ° לאחסון.
  7. ביום שבי אימונוהיסטוכימיה תבוצע, סעיף coronally ב40 עובי מיקרומטר, ולצוף לתוך צלחת 24 גם מכילה PBS עם מכחול דק. צריכים להישמר סעיפים על מנת סידורי נכון עבור immunostaining לקבוע כיסוי הקרנה של אזור היעד.
  8. 0.01 Prewarm M פתרון נתרן ציטראט 80 מעלות צלזיוס באמבט מים כהכנה לצעד אחזור אנטיגן. במקביל, בעוד ציטרט הנתרן מתחמם, לבצע 5 שטיפות דקות 3x ב0.01 M PBS.
  9. ברגע שפתרון ציטרט הנתרן הוא על 80 מעלות צלזיוס, להטביע חלקים במוח in פתרון חיץ ציטרט הנתרן. השאר באמבט מים ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  10. הסר את הסעיף ולאפשר פתרון ציטרט הנתרן להגיע לטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לבצע שלוש שוטף של 5 דקות הליכה ב0.01 M PBS.
  11. לחסום חלקים במוח במשך שעה 1 ב-PBS-טריטון המכילה 5% נסיוב עזים נורמלים.
  12. סעיפי דגירה הלילה במוח ב-PBS-טריטון המכילים 5% נסיוב עזים נורמלים עם 1:700 ריכוז של נוגדן ראשוני עכבר אנטי phospho-H2AX ב 4 ° C.
  13. למחרת, לבצע 15 שוטף דקות 3x ב0.01 M-PBS טריטון.
  14. דגירה חלקים במוח-PBS טריטון המכיל 5% נסיוב עזים נורמלים עם נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומד עם fluorphore 488 ננומטר ב1:500 ריכוז במשך שעה 2.
  15. בצע 15 שוטף דקות 3x ב0.01 M-PBS טריטון.
  16. בצע כתם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:5,000 PBS) עבור 10 דקות לדמיין גרעין. לאחר מכן, לשטוף חלקים במוח למשך 5 דקות עם PBS.
  17. הר על אלקטרוסטטי chמיקרוסקופ arged מחליק על ידי סעיף צף בPBS. נגב את PBS העודף ולאפשר שקופיות לייבוש. Coverslip השקופיות באמצעות הרכבה בינונית ולאפשר את השקופיות לייבוש בחושך בטמפרטורת חדר למשך הלילה.
  18. קח תמונות של סעיפי העטרה סידוריים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. immunostaining ΥH2Ax (ירוק) עולה באתר של קרינה. DAPI (כחול) הוא כתם גרעיני (איור 5).

3. הכנת עכבר נושאים להקרנת הפוקוס

בחן את תוצאות immunostaining ΥH2Ax. ברגע שמרוצה מהכיול והמיקוד של אלומת הקרינה, להמשיך בניסוי. בשלב זה, את הסך כל הזמן הנדרש לטיפול בעכבר (מהגדרה של בעלי חיים להשלמת מסירת קרן) הוא כ 10-15 דקות לטיפול 10-Gy עם קרן 1 מ"מ.

  1. להזמין נקבות עכברי ארבעה שבועות בן C57BL6 / י ממעבדות ג'קסון מאוס. בית ארבעה עכברים בכל כלוב, ולעבור מזון מאוכל רגיללתזונה עתירה שומן בחמישה שבועות. עכברי אגרוף באוזן לתת להם סימני זיהוי ייחודיים. לפקח על בריאותם של עכברים יומיים. הערה: סמנים מתכתיים לא ניתן להשתמש כפי שהם יגרמו לפסי חפצים על CT.
  2. שוקל עכברים היום לפני טיפול קרינה או אחיזת עיניים. עכברי פיצול לשני מחזורים לקרינה או טיפול דמה ולהבטיח כי אין הבדל משמעותי במשקל בין קבוצות. ביום של טיפול, כאשר עכברים הם בן שישה שבועות, reweigh כל העכברים ולהקליט את המסה שלהם. בעדינות להעביר את שני הקבוצות לפלטפורמת רדיולוגי. תשמור על עצמך כדי למזער את רמות לחץ.
  3. הכן את חדר הרדמה גז isoflurane. הרדימי שני עכברים, אחד בקבוצת הקרינה שנקבעה מראש, ועוד בקבוצת ביקורת הדמה. הכן את כרית חימום שנקבעה בהגדרה הנמוכה לטיפול לאחר ניתוח.
  4. בצע את הפעולות 1.2-1.4 לעכבר כדי לקבל הקרנה. לעכבר הדמה, לשמור על עכבר בחדר הרדמה בזמן הטיפול קורה. הפוך surדואר שתא ההרדמה הנמצא בסמוך לפלטפורמת CFIR כך שום השפעה על קרינה סביבתית נלקחת פנימה אחרי היעד מזוהה על CT, להעביר נושא העכבר שבשליטת רובוטית ליישר יעד זה עם קורה משלוח הקרינה. קלט מחושב פרמטרים (מהירות סיבוב ומשך טיפול) לתוך תוכנת מינון תכנון.
  5. לאחר טיפול הקרנה יושלם, תחזור גם זיוף ועכברים מוקרנים לכרית חימום, ולפקח עד שהם מתעוררים.
  6. להחזיר שני דמה ועכברים מוקרנים למתקן חי. לפקח על כל יום. לשקול את העכברים כל חצי שבוע. כדי לאשר את ההקרנה של אזור שגשוג ההיפותלמוס הממוקד, להזריק intraperitoneal של BrdU (50 מ"ג / קילוגרם) נוירוגנזה שלושה ימים שלאחר טיפול ולבחון בין קבוצות על ידי colabeling של אימונוהיסטוכימיה לBrdU וחודש סמן עצבי אחד לאחר חשיפת BrdU ראשונית (איור 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מיקוד ודיוק מודרכים-CT הערכה

הכיול המכני של המערכת הוא חיוני להבטחה שקורות מזוויות שונות בכל מצטלבות בנקודה אחת. כיול בוצע עם שיטת הדמיה מבוססת אוטומטית למחצה, שבו דיוק יישור קצה לקצה כבר נמדד להיות 0.2 מ"מ 29. דיוק זה הוא קריטי מאוד כמו הנפח של מבנה רוממות החציוני ההיפותלמוס הוא קטן 2. כדי לבחון את הכיול הזה, מדדנו הפצות מינון עם סרטי קרינה רגישה GAFchromic המוטבע במודל מים שווי ערך פלסטיק דגם עכבר 35 (איור 4). בקצרה, CT-סריקה של נושא העכבר נלקחה, ואתר ההיפותלמוס ventrobasal היעד זוהה. משלוח ומהירות סיבוב חושבו, וcollimator והסינון המתאימים צורפו כדי להבטיח 10 Gy של קרינה נמסר. מודל חיקוי עכבר תוכנן מהמים equivalen מבנה פלסטיק לא משובץ עם סרטי קרינה רגישה GAFchromic לאחר מכן להחליף את נושא העכבר האמיתי למדידת תפוצת מינון במטוסי מוקד שונים. איור 4 מציג את תוצאות בדיקה מקצה לקצה מטיפול קשת עם קורה 1 מ"מ בקוטר באמצעות סרטי GAFchromic בפלטפורמה מדומה עכבר. Gantry הוקם בזווית של ° 45 ביחס למודל העכבר המדומה בזמן שלב הדגימה רובוטית היה מסובב סביב ציר בכיוון אנכי, שהניבו "קשת" או קונוס של קרינה. הרוחב המלא במחצית המרבית (FWHM) הוא 2.31 מ"מ, שהוא גדול יותר מ1.0 מ"מ מאז הקשתות לפגוע בסרט בזווית. באופן תיאורטי את גודל הקרן בזווית זו צריך להיות 2.0 מ"מ. מקום קורה המוקד מוצג באיור 4 מדגים יישור הדיוק של קורות מכיוונים שונים. הסרט הזה יכול להיות מעולף על גבי נושא העכבר האמיתי, המדגים את עמדת קרן ודיוק (איור 4C).

e_content "> שימוש collimator קרן בקוטר 1 מ"מ, טכניקת קשת הייתה בשימוש כדי לספק 10 Gy לנקודת היעד בנושא העכבר שלנו. מדידות קודמות 29 לציין כי טכניקה זו מספקת מינונים נמוכים מאוד של קרינה (<0.1 Gy) מחוץ ל1 יעד מ"מ. האזור של בלוטת יותרת המוח ומבנים שמסביב ולכן מוגן ביעילות מהקרנת מוקד של ההיפותלמוס ventrobasal. הדיוק של מיקוד הקרן כבר נמדד במחקרים קודמים להיות בתוך 0.2 מ"מ הן בפנטום בדיקות 29 וחלקי רקמות 35 .

אמנם לא נדרש, CT-מודרך מיקוד של ההחזר על ההשקעה יכולה להיות מוגבר על ידי ניגוד יוד intrathecal מוזרק כדי לשפר CT-מודרך מיקוד ליישום שלנו במוח (איור 5 א). כמו זה הוא הליך פולשני והמסורבל, הניגוד הזה לא נעשה שימוש לעתים קרובות, ולא תואר בפרוטוקול זה. ניתן למצוא את פרטים עבור פרוטוקול זה בפורד et al. 2011 וChaichana et al. 2007. היתרונות של ניגוד עם יוד זה הם שהחדרים לרוחב והשלישי באופן ברור הם דמיינו בסריקות CT שנרכשו על פלטפורמת CFIR רדיולוגי (איור 5 א). היעד היה רוממות החציוני, בבסיס של החדר השלישי, וזוהה באמצעות תוכנת ניווט מונחה CT ובאופן אוטומטי מיובא לממשק מיקום רובוט. מבני גולגולת גרמיים זוהו ומשמשים כציוני דרך אנטומיים ללימודים שלאחר מכן שבו ניגוד יוד לא היה מועסק.

Beam מיקוד אימות עם γ-H2AX

כדי לאשר עוד יותר מיקוד של ME ההיפותלמוס מודרך CT, אנו מדמיינים אלומת קרינת 1 מ"מ ברקמה על ידי בדיקה עקיפה של הפסקות גדילי הדנ"א כפולות שעולות הקרנה הבאה. חלבון היסטון H2AX פוספורילציה לאחר הפסקות פעמיים גדיל ה-DNA. γ-H2AX כבר בשימוש נרחב במוח וברקמות אחרות 46 -48, ומספר γ-H2AX + המוקדים מופיע לתאם גם עם קרינה במינון על פני טווח רחב של מינונים 51, 53. אנו הבחנו להדמיה ברורה של הקורה הבא immunostaining γ-H2AX (איור 5). מכתים γ-H2AX תוצאה הראה מיקוד מדויק של המיקום הצפוי. קצה הקורה היה גם חד ביותר, בהסכם עם מדידות המזמין פיסיקה מבוססת סרט שמצביעות עליו הילת 20-80% מ0.3 מ"מ 54. מדדנו בעבר את המרחק בין המטרה המיועדת והמרכז של הקרן כפי שדמיינו בקטעי הרקמה 35. המרכז של הקרן קוזז מהיעד שהתכוון למרחק ממוצע של 0.19 ± 0.36 מ"מ (סטיית התקן) ב10 עכברים מוקרנים לאחר הפקטורינג להשפעות של התכווצות רקמות במהלך קיבעון ועיבוד 35.

באמצעות טיפול קשת דמוי stereotactic בהיקף של קשת ב45 ° מהאנכי, אנחנולהראות שאנחנו נוכל למקד בצורה יעילה ההיפותלמוס ventrobasal, ללא הקרנת נישות עצביות אחרות (איורים 5 ג-D). ההקרנה של הסביבה הייתה מזערית, ולא היה גבול בחשיפה לקרינה כפי שהודגם על ידי סרט GAF-רומי (איור 4) וimmunostaining γ-H2AX (איורים 5 ב-D). גב הרקמות לההיפותלמוס ME תערוכות מכתים γ-H2AX אור (איור 5 ב), כי הקורות הקרינה נכנסות דרך אזור זה, ואולי גם בגלל השיפור על ידי העצם שכיסה על אף שקרן הרנטגן קשה יחסית הייתה בשימוש (225 kVp, 0.15 מ"מ סינון Cu).

השפעות על Neurogenesis

לאחר שאישר את הספציפיות של משלוח ההקרנה מונחה CT שלנו, בדקנו את ההשפעה של 10 Gy של קרינה ברמות הנוירוגנזה ME. עכברים בוגרים הואכלו בדיאטה עתירה שומן, קיבלו טיפול בקרינה או אחיזת עיניים, ואז לאחר מכןזריקות BrdU כפי שתוארו קודם לכן החל בשעה 6 שבועות 2. עכברים הוקרבו לבדיקה ב10 שבועות, חודש אחד לאחר הזרקת BrdU הראשונה. עכברי HFD-fed מבוגר מוקרנים הציגו ~ עיכוב 85% מME נוירוגנזה השוואה לקבוצת ביקורת שטופלה בדמה (איור 6 א) 2. גרעין מקושת, מבנה סמוך הגובל באתר הקרינה, נבדק שינויים בנוירוגנזה, ונמצא כי אין הבדל משמעותי סטטיסטי בין בעלי חיים המוקרנים ובקרות דמה (איור 6 א) 2.

פונקציה של חציון רוממות ההיפותלמוס נוירונים בוגרי יליד

שינויים בעכברים מוקרנים ודמה נבדקו לאחר טיפול. מעיל פרווה ותגובה למגע נראים נורמלים. פנל כימיה ולוח ספירת דם מלא נבדקו שבוע לאחר טיפול הקרנה, ולא נצפה הבדל משמעותי (n = 9/group). בהפד עתיר שומןעכברים שבו אנו נצפו הפחתה ~ 85% בנוירונים ME בוגרים שנולדו חודש לאחר הקרנה (איור 6 א), עכברים מוקרנים ירדו במשקל לאורך זמן בהשוואה לקבוצת טיפול הדמה (איור 6 ג). לעומת זאת, רגיל צ'או האכיל עכברי שליטה, שבו הרמות שנצפו שלי נוירוגנזה היו נמוכות באופן משמעותי מאשר עמיתיהם עתירים השומן האכילו 2 שלהם, לא היה לי הבדל משמעותי סטטיסטי במשקל בין העמדת פנים מול קבוצות מוקרנים (איור 6). מעניין לציין, כי עלייה במשקל מופחת זה בעכברים עתיר שומן מוקרנים האכילו מלווה בשינויים בחילוף חומרים ובפעילות כפי שתוארו לעיל בפירוט על ידי הקבוצה שלנו 2 (איורים 6 ד-I).

איור 1
איור 1. הקרנת מוקד מונחה טומוגרפיה מחשב פלטפורמה (CFIR). (ב) שימוש בשפופרת רנטגן מקור כפול המצורפת gantry שמסתובבת 360 °, SARRP משתמש ברובוט לשלוט שלב דגימה המאפשר סיבוב של נושא בעלי החיים לאורך כל טיפול בקרינה. (C) CFIR חומרה מורכבת מהמקור, collimator רנטגן, מסתובבת gantry, תמיכה בבעלי חיים, מסתובב שלב דגימה רובוטית, וכן imager האלקטרוני. (ד) נושא העכבר ממוקם במיטת חוסר תנועה עם קלט הרדמה בגז על הבמה הדגימה רובוטית. מהשריון ואח'. 2010. (ה) חומרת CFIR צריכה לכלול קונוסים collimating להתאמה אישית עבור ir המוקד משלוח קרינה בגדלים שונים. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. פרדיגמה ניסויית. עכברי נקבה C57Bl / 6 הוזמנו ממעבדות עכבר ג'קסון, והתאקלמו לכלובי תושב בארבעה שבועות. הנושא מאוס שעברו לדיאטה כרצונך מודעה עתירה שומן בחמישה שבועות, ופיצול לשתי קבוצות טיפול: קבוצות המוקרנת או אחיזת עיניים. הערכות פיסיולוגיות נלקחו longitudinally לפני ולאחר טיפול. טיפולי הקרנה או דמה ניתנו ב5.5 שבועות. זריקות BrdU intraperitoneal ניתנו בשישה שבועות כפי שתוארו קודם לכן 2.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
איור 3. אזור של לוקליזציה ריבית. אזור ההיפותלמוס השגשוג (HPZ), אזור עצבי הממוקם ברוממות החציוני ההיפותלמוס, ממוקם בהיפותלמוס mediobasal הגחון. (א) אזור HPZ של עניין (ROI) מודגש על ידי-שערות צלב אדומות ב3-D Nissl אטלס התייחסות נפח מאלן מוח אטלס נתונים הפורטל (מיקום: 7.041, 7.211, 5.564) (זמין מhttp:// mouse.brain-map.org /) 55. (ב) סעיף מוח עטרה של ההחזר על ההשקעה בעכברים תשע עשרה ימים בת. אימונוהיסטוכימיה BrdU (ירוק) מגלה כי את ההחזר על ההשקעה (חץ לבן) מכילה תאי שגשוג. הצפיפות של תאי שגשוג בHPZ מוגבלת בקדמי אל אחורי ציר, עם צפיפות הגבוהה ביותר ב-1.75 מ"מ גבחת. קטעי רקמה הם נגד מגואלות DAPI סמן גרעיני (כחול). איור מ-Lee et al. 2012a.(CE) CT-הדמיה על פלטפורמת CFIR מאפשרת מיקוד HPZ ROI (צלב אדום שערות-) על ידי משלוח קרינת קרן קשת. CT-דימוי של נושא העכבר במישור האופקי (C), מישור הסגיטלי (ד '), ומטוס העטרה (E). (ה) מרחק מפני שטח של הגולגולת להחזר על ההשקעה הוא 0.62 סנטימטר (קו אדום). ברים סולם = 1 מ"מ (), 50 מיקרומטר (ב '), ו0.62 סנטימטר (CE). לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 4
איור 4. כיול של משלוח הקרנה. () X-ray של נושא העכבר מאובטח במכשיר הקיבוע על הבמה רובוטית SARRP. (ב) את ההחזר על ההשקעה מחושבת קואורדינטותמחדש שהוזן וממוקד נגד מודל עכבר מדומה. דגם הפנטום מורכב מסרטי קרינה רגישה GAFchromic המוטבע בפלסטיק במים שווי ערך. סרטים ממוקמים לעיל, ובמסגרת isocenter ROI לזהות את חלוקת המנה. אלומת קרינת קשת 45 ° מSARRP מספקת הפצת מינון בצורת חרוט להחזר על ההשקעה, ומתכנסת בisocenter (נקודת הילה). גבי דבר (C) של dosimetry סרט שנרכש עם אלומת קרינת 1 מ"מ בפנטום עם קרני ה-X של נושא אמיתי עכבר (קו צהוב). העיגול לבן (חץ) מציין קרינת 10-Gy מינון focally ממוקד לHPZ. קו מקווקו מתאר מוח. לוח מ-Lee et al. 2012a.

איור 5
איור 5. אישור על משלוח קרינה. ההדמיה CT עם ניגוד יוד יכול לשפר את ההדמיה של ההחזר על ההשקעה, אם ההדמיה CT רגילה לא suffic דואר. () נושאים מאוס קיבלו יוד בניגוד כפי שתואר (לוח מ-Lee et al. 2012) בעבר. תמונות CT במישור העטרה, אופקי, ועל sagittal מוצגות משמאל לימין. אישור (ב) למשלוח קרינה ברקמות יכול להיות מזוהה על ידי אימונוהיסטוכימיה לγH2AX, סמן של הפסקות פעמיים גדילי דנ"א. immunostaining γH2AX תערוכות משלוח אלומת קרינה הממוקד לHPZ ההחזר על ההשקעה בהיפותלמוס mediobasal הגחון. immunostaining γH2AX לא נצפה באזור subventricular של החדרים לרוחב (ג), או אזור subgranular של ההיפוקמפוס (ד ') של אותו נושא העכבר. (BD) מדורי counterstained עם DAPI (מאת לי et al. 2012a). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

o: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 6
איור 6. עיכוב מוקד של ME תוצאות נוירוגנזה בשינויים במשקל ובחילוף חומרים. () רוממות החציוני (ME) ממוקמת בהיפותלמוס mediobasal הגחון הייתה ממוקדת עבור הקרנה. גרעין מקושת (ArcN) הוא המבנה האנטומי השכן. חודש לאחר טיפול, אחוז נוירונים BrdU + הו מהעמדת פן מול קבוצות מוקרנים היו לכמת ידי אימונוהיסטוכימיה בME וArcN. רמות הנוירוגנזה ME הופחתו באופן משמעותי במוקרן מול קבוצות דמה (n = 5/cohort, *** = p <0.0001). רמות הנוירוגנזה ArcN לא הושפעו (n = 3/cohort, NS = לא משמעותי). (ב) אוכל רגיל האכיל (NC) ו (ג) עתיר שומן האכיל עכברים (HFD) נבדק אורכים לשינויים במשקל הבא treatm הקרנה או אחיזת העינייםאף אוזן גרון (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) חודש לאחר טיפול, מוקרן וטיפול דמה עכברים שהוזנו-HFD נבדק על ידי ספקטרוסקופיה באמצעות תהודה מגנטית כמותיים לניתוח של% מסת שומן ו% מסה רזה. היו לי עכברים מוקרנים באופן משמעותי פחות% מסת שומן ויותר באופן משמעותי% מסה רזה מאשר בקרות דמה (n = 5, * = p <0.05). מסה כוללת: 18.86 ± 0.4 g (Sham) 21.0 ± 0.3 גרם, (מוקרן); מסה רזה: (Sham) 14.6 ± 0.2 גרם, (מוקרן) 13.9 ± גרם 0.3; שומן המוני: (Sham) 3.9 ± 0.2 גרם, ( 2.6 ± 0.3 גרם מוקרן) (n = 5, * = p <0.05). (FI) מוקרן ועכברים בוגרים טיפול דמה הונחו במערכה מקיפה מעבדה בבעלי חיים ניטור (צדפות) למדידות בו זמניות של צריכת מזון, פעילות גופנית, וחילוף חומרים של הגוף כולו פרופיל שבועיים לאחר טיפול. בעקבות הסתגלות בחדר הבדיקות, עכברים מוקרנים נצפו להיות siהוצאה gnificantly יותר אנרגיה, פעילות הכוללת, וVO 2 (מיליליטר / קילוגרם / שעה) בהשוואה לקבוצת ביקורת דמה במהלך החלק האפל של היום (n = 11, 12; * = p <0.05). (G) לא נצפה הבדל משמעותי בקצב הנשימה חליפין (RER) (n = 11, 12). Subfigure מופק מנתונים שפורסמו בעבר בLee et al. 2012a וLee et al. 2012b. Subfigures CI מ-Lee et al. 2012a. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקרנה מודרכת-CT מוקד (CFIR) היא רומן גישת מערכת שלמה מסוגל לספק שדות קרינה למטרות בבעלי חיים קטנים שבשליטה רובוטית באמצעות CT-הדרכה 32. היכולת של CFIR לספק אלומה ממוקדת מאוד למודלים של בעלי חיים קטנים מספקת הזדמנויות מחקר חדשות לגשר מחקר במעבדה ותרגום קליני. מאמר זה מתאר את גישת CFIR למסירת קרינה מדויקת למקד אוכלוסייה עצבית ההיפותלמוס במיוחד. אנו מדגימים כאן כיצד לכייל ולאשר סגוליות משלוח קרינה באמצעות סרט X-ray וברקמת מוח על ידי אימונוהיסטוכימיה.

בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לעכב נוירוגנזה באזור מסוים במוח. אנו מראים כי אנו מסוגלים למקד את ההיפותלמוס ventrobasal, ומעכבים את הנוירוגנזה ברוממות החציוני, מבלי לשנות את רמות הנוירוגנזה במבנים סמוכים. עיכוב של Mנוירוגנזה E מלווה בשינויים בחילוף חומרים ובפעילות, כמו גם עלייה במשקל מופחת בדיאטה עתירה שומן במוקרן מול קבוצות טיפול דמה (איור 6) 2. נתונים אלה מצביעים על תפקיד לנוירונים ההיפותלמוס בוגרים שנולדו אלה בויסות חילוף חומרים של הומאוסטזיס ואנרגיה. יתר על כן, זה מצביע על כך שדיאטה עתירה שומן עודף יכולה לשנות את המעגלים מטבוליים קריטיים גם בבגרות 3. התוצאות שלנו מייצגות התרחבות חשובה על הפונקציה הידועה של מבוגר יליד נוירונים, ושופך אור על אוכלוסייה חדשה ההיפותלמוס עצבי אב 3. אזהרות פוטנציאל לגישה זו הן כי קרינת מעכב התפשטות אב ולא נוירוגנזה כשלעצמה, ולכן ייתכן גם כי שינויים פיסיולוגיים שלאחר טיפול עשוי להיות מוסבר בחלקו על ידי שיבוש בראשית תא בוגר אחר. צעדים עתידיים יכללו פיתוח של כלים גנטיים כדי לעכב את ההתפשטות של p האב הזה הספציפי העצביopulation, אשר יספק בהירות משמעותית לתפקיד הפונקציונלי האבות האלה ולשחק צאצאיהם ברגולציה של פיזיולוגיה 3.

יחדיו, עם זאת, פלטפורמת רדיולוגי הזה משמש כנקודת מוצא חשובה בביצוע מסכי תפוקה בינונית על אבות עצביים וצאצאיהם. טכניקה רדיולוגית זו אינה מוגבלת למחקר שאלות בתחום מדעי המוח, לעומת זאת, ואנו מצפים CFIR להרחיב מראש הרעיוניים במספר הדיסציפלינות המחקריות. הזמינויות האחרונות של פלטפורמות רדיולוגי מודרכים-CT מסחרי נמכרות מספקת הזדמנות לחוקרים להשתמש ביכולות של הפלטפורמה הזו אלה לשאלות המחקר שלהם (איור 1). כמה חלופות זמינות מסחרי שמאפשר אחד לבצע הקרנת חיה קטנה דימוי מודרך. יתר על כן, יכולות גם להיות בנויים מערכות הקרנת מוקד מודרכת-CT בבית, כפי שהיה במקרה של המערכת המשמשת לים אלהtudies באוניברסיטת ג'ונס הופקינס 29-33, 35.

ביצוע תואר זה של מיקוד מוקד דורש כיול ומיקוד של ההחזר על ההשקעה ראוי. אמנם שיטה זו תהיה בתחילה לקחת את האימונים כדי להכיר את פלטפורמת CFIR ותוכנת מינון התכנון שלה, מבצע של המכשיר הוא די קל לאחר הבנת הפרוטוקול והיכולות של הפלטפורמה. מומלץ כי נהלי מפעיל כיול אלומת הקרינה מספר פעמים לפני הפעלת ניסוי אורך בקנה מידה מלאה. שאמרו, ברגע ששולטים בפעולה של CFIR, מחקרים צריכים לנוע במהירות.

פרוטוקול CFIR זה שתואר במסמך זה משתמש בהדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה ומיקוד של המינון. מינון קונפורמי ממזער את החשיפה לאזורים במוח nontargeted, וגיאומטריה קורה דיוק גבוה מאפשרת להפצת מינון קונפורמי עם גבולות חדים קרן. זה מאפשר לשאול שאלות regarding הפונקציה של מבוגר יליד נוירונים, אבל גם פותח אזורים לשאלות לתפקיד של התפשטות תאים בתחומים כגון פיזיולוגיה, ביולוגיה של גידול, ואימונולוגיה. בשיטה זו ניתן להרחיב בכמה דרכים עם צבעי ניגוד ופליטת אור כדי לשפר את ההדמיה 35, 56. מאמצים נמצאים כעת בעיצומו כדי לשפר את יכולות חומרת CFIR נוספות, ועכשיו הפלטפורמה היא להיות שונה כדי לכלול סורק פוזיטרונים פליטת פוזיטרונים על לוח 56. אלה יאפשר את הרחבת הכלים העומדים לרשות חוקרים וסיוע בתרגום תגליות בספסל לצד המיטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש JW מימון מחקר וייעוץ הסכמים עם Xstrahl, Inc

Acknowledgments

אנו מודים לג Montojo, ג'רייס, ומ 'שריון לקבלת ייעוץ וסיוע טכניים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים אמריקאים לבריאות מענק NS063550 F31 (לDAL), פרס בזיל אוקונור Starter Scholar ומענקים מקרן Klingenstein וNARSAD (לSB). SB הוא צעיר נכבד Scholar קק WM במחקר רפואי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).
חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter