Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Funksjonell Avhør av Adult Hypothalamus Neurogenesis med Focal Radiologisk Hemming

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Funksjonen av voksen-fødte pattedyr nevroner er fortsatt et aktivt område på etterforskningen. Ioniserende stråling hemmer fødselen av nye nerveceller. Ved hjelp av computer tomografi styrt fokus bestråling (CFIR), kan tredimensjonal anatomisk målretting av spesifikke nevrale stamceller populasjoner nå brukes til å vurdere den funksjonelle rollen som voksen neurogenesis.

Abstract

Den funksjonelle karakterisering av voksen-født nevroner er fortsatt en betydelig utfordring. Tilnærminger for å hemme voksen neurogenesis via invasiv viral levering eller transgene dyr har potensielle confounds som gjør tolkningen av resultatene fra disse studiene vanskelig. Nye radiologiske verktøy dukker opp, men som tillater en å invasivt undersøke funksjonen av utvalgte grupper av voksne fødte nevroner gjennom nøyaktig og presis anatomisk målretting i små dyr. Focal ioniserende stråling hemmer fødselen og differensiering av nye nerveceller, og tillater målretting av spesifikke nevrale stamceller regioner. For å belyse potensialet funksjonell rolle som voksen hypothalamus neurogenesis spiller i reguleringen av fysiologiske prosesser, har vi utviklet en ikke-invasiv brennvidde bestråling teknikk for å selektivt hemme fødselen av voksne fødte nevroner i hypothalamus median eminense. Vi beskriver en fremgangsmåte for C omputer tomografi-ledetf ocal ir stråling (CFIR) levering for å muliggjøre presis og nøyaktig anatomisk målretting i små dyr. CFIR bruker tredimensjonale volumet image veiledning for lokalisering og målretting av stråledosen, reduserer stråling til nontargeted områder av hjernen, og gjør det mulig for konforme dose distribusjon med skarpe strålegrenser. Denne protokollen gjør det mulig å stille spørsmål angående funksjon av voksne fødte nevroner, men åpner også områder til spørsmål knyttet til strålebiologi, tumorbiologi og immunologi. Disse radiologiske verktøy vil forenkle oversettelsen av funn på benken til sengen.

Introduction

Nylige oppdagelser har vist at den voksne hjernen hos pattedyr kan gjennomgå en bemerkelsesverdig grad av plastisitet. Voksen fødte nevroner genereres gjennom hele voksenlivet i spesialiserte nisjer av pattedyrhjernen en. Hva er funksjonen til disse voksne fødte nevroner? Og mer så, de spiller en rolle i fysiologi og atferd? Studier på dette området har tradisjonelt fokusert på subventricular sone av den laterale ventriklene og subgranular sonen av hippocampus, men nyere studier har preget neurogenesis i andre områder av hjernen som for eksempel pattedyr hypothalamus to. Neurogenesis har blitt rapportert i barsel og voksen hypothalamus 2-10, og funksjonen til disse nyfødte hypothalamus nevroner er fortsatt et aktivt område på etterforskningen.

Den funksjonelle karakterisering av voksen-født nevroner er fortsatt en betydelig utfordring for nevrovitenskap feltet generelt. Selektiv hemming av specific nevrale stamceller bestander er fortsatt begrenset av mangel på tilgjengelige molekylære markører som er unike for enkelt nevrale stamceller populasjoner 11. Dermed selektiv sletting av voksne fødte nevroner fra disse nevrale stamceller via genetisk målretting er fortsatt vanskelig. Likeledes, lider viral levering å målrette voksen fødte nevroner fra potensielle konfunderende variabler som innføre skade og betennelse i miljøet 12.

Nye radiologiske verktøy dukker opp, men som tillater en å omgå disse confounds og undersøke disse spørsmålene gjennom nøyaktig og presis anatomisk målretting i små dyr. Ioniserende stråling hemmer fødselen og differensiering av nye nerveceller, og gjør at en ikke-invasiv metode for å målrette nevrale stamceller populasjoner 13-15. Nylig har vi beskrevet en germinal region av pattedyr hypothalamus median eminense (ME) som vi kalte hypothalamus proliferativ sone (HPZ) 2 2. For å teste om voksen neurogenesis innenfor hypothalamus ME regulerer stoffskiftet og vekt, forsøkte vi å forstyrre denne prosessen. Median dominans er en liten unilateral struktur på bunnen av den tredje ventrikkel for regulatoriske hormoner frigjøres. For å hindre spredning og påfølgende neurogenesis uten å endre de andre fysiologiske funksjoner i denne hjernen regionen, har vi utviklet en ikke-invasiv brennvidde bestråling teknikk for å selektivt hemme fødselen av nyfødte voksne nevroner i hypothalamus median eminense to.

En rekke grupper har ansatt stråling for å undertrykke neurogenesis i kanoniske regioner 14-28. Imidlertid har tidligere radiologiske tilnærminger generelt målrettet store områder, eller Often utilsiktet også rettet flere hjerneområder hvor neurogenesis har blitt rapportert, noe som gjør det vanskelig å entydig knytte eventuelle atferds defekter observert med defekter i spesifikke nevrale stamceller populasjoner. Muligheten for mer målrettet bestråling er levert av radiologiske plattformer som kombinerer c omputer tomografi styrt bildebehandling med f ocal bjelke ir stråling (CFIR) levering for å muliggjøre presis anatomisk målgruppe 29-36. Stråling bjelker så små som 0,5 mm i diameter er tilgjengelige for å målrette spesifikke nevrale stamceller populasjoner 35. Denne metoden gjør det mulig for oss å målrette hypothalamus ME og arrestere spredning og blokkere neurogenesis i små dyr. Etter radiologisk behandling på følgende progenitor populasjoner, kan fysiologiske og atferdsmessige tester utføres for å belyse potensialet funksjon av voksen-fødte celler. Focal målretting er spesielt viktig for vår søknad sidenhypofysen ligger nær hypothalamus median eminense, bestråling av hypofysen kan påvirke hormonelle funksjon og senere forvirre resultater.

Det biologiske grunnlaget for undertrykkelse av neurogenesis etter bestråling er fremdeles uklart. Tidligere stråling studier har stolt på store bjelker i området, og har konkludert med at undertrykkelsen av neurogenesis gjennom en inflammatorisk respons 14, 37 er mediert. Som sådan er det uklart om svært focal bestråling kunne undertrykke neurogenesis, siden den ikke fremkalle en betydelig inflammatorisk respons. Imidlertid har nyere studier av vår gruppe av den klassiske nevrogen regionen i hippocampus viste at svært focal bestråling med en dose på 10 Gy kan undertrykke neurogenesis i minst fire uker etter bestråling 35.

Å avhøre funksjonen av voksne fødte hypothalamus nevroner i median eminense, bruker vi en presisjon stråling device stand til å levere CT-avbildning i kombinasjon med liten diameter stråling bjelker for å hemme ME neurogenesis. Ved hjelp av et røntgen-rør festet til en portalkraner som roterer over et område på 360 °, vi leverer bue-formede mikro bestrålingsstråle med bruk av en robotstyrt prøvetrinn som tillater rotasjon av et dyr gjenstand under strålebehandling (figur 1) . En høy oppløsning røntgendetektor anvendes for å skaffe bilder når portalen er i den horisontale stilling 33. For denne studien, ble CT-bilder rekonstruert med en isotrop voxel størrelse på 0,20 mm. CT-avbildning Bygde tillot identifikasjon av et mål samtidig som dyret er i behandlingsposisjonen. Målet ble lokalisert ved hjelp av CT navigasjon dose-planlegging programvare, som ble levert med våre kommersielt tilgjengelig radiologisk plattform. Etter å lokalisere avkastningen med CT-avbildning ble dyret beveget seg til den aktuelle behandlingsposisjon ved robotprøvetrinn som har fire graderRees frihets (X, Y, Z, θ). Gjennom en kombinasjon av portalkraner og robot stadium vinkler, kan bjelkene bli levert fra nesten hvilken som helst retning i forhold til dyret, og stereotaktisk lysbue-lignende behandlinger er mulig 29. For disse og alle andre avbildningsstudier ble musene plassert i en immobilisering enhet som tillater levering av isofluran anestesi gass mens begrense bevegelse. Immobilisering seng er CT-kompatibel, og kobles til robotprøvestadiet 34.

Vi forventer at CFIR vil gi konseptuelle fremskritt i en rekke forskningsområder. Selv om vi bruker radiologisk målretting av hypothalamus median eminense som bevis på prinsippet om denne teknikken, kan CFIR brukes til å målrette en region av kroppen av alle små modellorganisme i prinsippet. I nevrovitenskap, for eksempel, ser vi for oss denne teknikken kan brukes til å vurdere funksjonen til aktivt proliferative progenitor populasjoner som har blitt foreslått å eksist i andre circumventricular organer, slik som i området postrema 38, 39, subfornical organ 40, og hypofysen 41.. Langvarige kontroverser om den funksjonelle rollen til voksen neurogenesis og identifisere en kausal rolle i atferd kan også nå bli bedre ivaretatt. I sangfuglen, kan denne teknikken ta rollen som voksen neurogenesis i å opprettholde robuste og sesong oppførsel av fuglesang 42, som har vært hemmet av muligheten til å selektivt hemme neurogenesis i bestemte områder av hjernen. Forstå dette robust atferdsmodellen, kan kaste nytt innsikt i rollen som voksen neurogenesis i å regulere andre seksuelt dimorfe atferd. Alternativt, i den metabolske feltet, CFIR kan brukes til å utforske sider ved den rollen hepatocytter spredning og dens rolle i stoffskiftet og energibalansen. Muligheten for konseptuelle forhånd i flere forskningsdisipliner er forbedret med introduksjonen av denne teknikken.

43, 44. Derfor generaliserer vi denne CFIR protokollen med trinn som kreves for alle forskningsplattformer snarere enn de som spesifikt for SARRP. Fordelene med CFIR enn tidligere radiologiske metoder for å hemme neurogenesis er at denne teknikken gir tredimensjonal volumet image veiledning for lokalisering og målretting av dosen, minimerer konforme dose eksponering for nontargeted områder av hjernen, og høy presisjon bjelke geometri tillater konforme dose distribusjon med skarpe bjelke grenser. Vi skissere hvordan å bruke CT-veiledet bildebehandling for å målrette dosen til et bestemt anatomisk region, og når du gjør det, hvordan å visualisere strålingdose distribusjon direkte i vevet ved hjelp av immunhistokjemisk farging for γ-H2AX, en markør av DNA dobbel-strandet pauser 35, 45-48. Bruken av denne tilnærmingen for selektiv bestråling av nevrogene nisjer kan ha betydelige implikasjoner i å avsløre den funksjonelle rollen til nye voksne fødte nevroner på fysiologi og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal Usage

Innhente godkjenning fra institusjonelle Animal Care og bruk komité for standard pleie og bruke protokoller. Den nåværende protokollen ble utviklet for fokale bestråling studier på 5,5 til 10 uker gamle C57BL6 voksen / J-mus, som tidligere beskrevet (figur 2) 2. Men andre aldre og små dyrearter (rotter, hamstere, bakken ekorn, osv.) kan også brukes, forutsatt at effektive anestesiprotokoller og en røntgen referanse atlas slik at identifisering av regionen av interesse (ROI) er tilgjengelig.

En. Kalibrering av CT-veiledet Radiologisk Platform

Utfør filmbaserte kalibreringer for stråledose på radiologisk plattformen på forhånd for hver kollimator størrelse og type X-ray tube filter brukes. For å målrette en bue stråle av stråling på ønsket målområde, bruker stråledose-planlegging programvare 49 available på de fleste kommersielle stråling plattformer for å beregne nødvendig leveringstid basert på stråledosen, dybden av regionen av interesse (ROI) basert på CT-skanninger av musen, og rotasjonshastigheten av robot-plattformen, er detaljer om dette utelatt av denne protokollen som de skiller mellom stråling plattformer. For det formål å visualisere ventrobasal hypothalamus 2 (figur 3) med CT-avbildning, betjene røntgenrør med en 0,4-mm brennvidde sted og stråleenergi på 100 kVp med 1 mm Al filtrering. For fokal bestråling av HPZ, drive X-ray tube ved 225 kVp, 13 mA, og en 1-mm brennvidde flekk med filtrering på 0,15 mm Cu, for å levere 10 Gy av stråling ved en vev dybde på 0,6 cm i løpet av en behandlings tid 4,6 min. Målretting mellom ulike ROIs vil kreve beregning ulike parametere.

  1. Hvis studere virkningene av høy-fett diett på neurogenesis i median eminense som tidligere beskrevet to, få fire ukers gammel kvinnelig C57BL6 / J mus fra Jackson Muse laboratorier og husholdning fire mus per bur. Slå mat fra normal chow til en høy-fett diett på fem uker gamle. Tillat mus for å akklimatisere seg til nye boliger og mat. Utfør CFIR behandling på 5,5 uker gammel. Transport av fag til operasjonsrommet som inneholder den radiologiske plattformen. Minimer stressnivå under overføringen. Forbered isofluran gass anestesi kammer. Deretter legger du et enkelt muse inn kammer. Parallelt forbereder oppvarming pad (lav innstilling) for etterbehandling.
  2. Når musen er ikke lenger under og svare på fot-pad komprimering, bringe faget til radiologisk plattform og plasser på immobilisering seng av robot scenen. Plasser temaet munn til nese-cone anestesi cup, og tennene i bittet vakt (figur 1D). Lå muse flatt på immobilisering seng og sjekke for å se om det fortsetter å opprettholde svarer. Hvis så, tape ned mus til sengs med gasbind tape. Mens taping nede muse til sengen, Pass på at hodet er jevnet med en horisontalplanet. Dette kan bestemmes ved å trekke i ørene og å se om de er i vater. Når musen er i riktig posisjon, lukke ledelsen beskyttende skjold.
  3. Erverve datamaskinen-tomografi skanning ved hjelp av on-board software av eksperimentator er radiologisk plattform (dette vil variere mellom plattformer), som vil gi et tredimensjonalt anatomisk strukturelle skanning av musen faget. Sjekk for å se om musen hodet er jevnet med horisontalplanet. Hvis ikke, gjenta trinn 01.02 til 01.03 fram til motivets hode er jevnet.
  4. Identifiser avkastningen ved CT-bilde. Beregn avstand fra ROI til overflaten av hodet ved hjelp av en 45 ° vinkel i forhold til horisontalplanet slik det er vist i figur 3E.
  5. Ved hjelp av on-board-programvare, ta et røntgenbilde av musen gjenstand ovenfra, som vist i figur 4A. Deretter fjerner musen fra radiologisk plattform, sette på varmepute, og overvåke inntil aktiv.
  6. Fra de koronale CT-bilder, beregne gjennomsnittlig avkastning anatomiske dybde på minst tre mus for å kunne fastslå levering dosering. Som et eksempel fra en tidligere studie 2, der 10 Gy bestråling ble administrert til ventrobasal hypothalamus, er dybden av avkastningen fra skallen (fra en 45 ° vinkel) 0,66 cm (se figur 3E). Å vite at, brukte forskerne en dose planlegging programvare (DPS) installert på radiologisk plattform for å beregne riktig rotasjonshastighet og lengde på behandling for å oppnå ønsket dose til ROI.
  7. Etter å bestemme behandlingsvarighet og rotasjonshastighet av robot scenen med doseplanlegging programvare, måle dosefordelinger av de beregnede parametre med GAFchromic stråling-sensitive filmer innebygd i et plast mock-mus modell vann-ekvivalent. For å gjøre dette, legge tre GAFchromic strålefølsomme filmer mellom fire vertikalt stablet vann-ekvivalent plast blokker 29 somvist i figur 4B.
  8. Plasser mock musemodell som inneholder GAFchromic filmer på robot scenen, og kjøre det sentrale bestråling strålen med nyberegnede parametere. For eksempel, for å målrette ventrobasal hypothalamus, innspill parametrene av 0,15 mm Cu filter, 225 kVp, 13 mA, 1 mm i diameter stråleinnstilling, 45 ° gantry vinkel, 1,3 ° / sek rotasjon, og 4,6 min for å oppnå en avkastning radiologisk dose på 10 Gy.
  9. Etter bestråling, kontrollerer filmer for mønster og intensiteten av strålingsdose. For en 360 ° vinkelrotasjon med parameterne er oppført for å målrette ventrobasal hypothalamus, en mørk ring i filmen over isomidtpunktet, en liten skarp flekk på isomidtpunktet film, og en lettere ring i filmen under isomidtpunktet svarende til kjegle strålen administrering av bestrålingen vil bli observert (figur 4B).
  10. Legg over isomidtpunktet GAFchromic film over de røntgen av muse fag fra parametere som var cal-delte. Den bestrålte navet ved isomidtpunktet bør overlappe med det ønskede ROI region som vist i figur 4C.

Alternativ metode: Hvis vanskeligheter i målretting hjernen ROI vedvarer, bruker jod kontrast injiseres intratekalt å forbedre visualisering av ventriklene etter CT-bilder. For korthets skyld er denne prosedyren utelatt i denne protokollen, men er tidligere beskrevet 35, 50. Jod kontrast vil gi ytterligere ventrikulære landemerker (Figur 5A).

2. Bestemme Nøyaktighet av Bestråling Beam

Ytterligere bekreft CFIR bjelke nøyaktighet ved direkte visualisering av strålingsstråle i vevet 2, 35, 51.. For å gjøre dette, utføre immunhistokjemi å oppdage γH2AX 51, en ​​histone protein og en tidlig markør for DNA dobbel tråd pauser. Muse fagene må transcardially perfundert og løst innen en time av bestråling. Etter irradiasjon, DNA-reparasjon raskt følger, og nivåer av ΥH2Ax reduseres betraktelig 35.

  1. Gjenta trinn 01.01 til 01.03.
  2. Etter målet er identifisert på CT, er musen motivet beveget seg i henhold robot kontroll for å justere dette målet med stråling levering strålen. Inngangs beregnede parametre (rotasjonshastighet og lengde på behandling for å oppnå ønsket dose) fra trinn 1,6 til doseplanlegging programvare og begynne behandlingen. Behandling leveres med portal pekte på 45 ° fra vertikal mens musen roterer om en vertikalt orientert akse.
  3. Etter bestråling, utføre transcardial perfusjon på mus fag. Utfør perfusjon innen én time 52. Etter perfusjon, nedsenking fix hjerner i 4% PFA / PBS og rist over natten ved 4 ° C.
  4. Følgende morgen, vaske 5 min i PBS 3x å fjerne paraformaldehyde fiksativ. Deretter senkes i 30% sukrose i 1x PBS på en rocker ved 4 ° C.
  5. Rist på fire grader (ossmanuelt 12-16 timer), til hjernen synker ned på bunnen av røret. Dette tjener som en kryobeskyttelse trinn. Når hjernen vask, fjerne hjernen med en perforert skje til å hindre overflødig 30% sucrose/1x PBS overføring. Raskt bygge inn i frysemedium på tørris. Swirl frysing medium med pipettespissen og justere hjernen i plast mold.
  6. Når helt frosset, overføres hjerne blokker til -20 ° C fryseren for lagring.
  7. På den dag da immunhistokjemi skal utføres, med delen coronally ved 40 mikrometer tykkelse, og flyter inn i en 24-brønners plate inneholdende PBS med et tynt pensel. Seksjoner bør holdes i riktig serie For farging å bestemme bestråling dekning av målområdet.
  8. Prewarm 0,01 M natrium-citrat-løsning til 80 ° C i vannbad i forberedelse for antigen gjenfinning trinn. Samtidig, mens natriumsitrat varmer, utføre 5 min vasker 3x i 0,01 M PBS.
  9. Når natrium-citrat-løsning er ved 80 ° C, senk hjerneseksjoner in natrium-sitrat-bufferløsning. La i vannbad ved 80 ° C i 1 time.
  10. Fjern-delen og tillater natriumcitrat-løsning for å nå romtemperatur, og deretter utfører tre 5-minutters vaskinger i 0,01 M PBS.
  11. Blokk hjerneseksjoner i 1 time i PBS-Triton inneholdende 5% normalt geiteserum.
  12. Inkuber hjerneseksjoner over natten i PBS-Triton inneholdende 5% normalt geiteserum med 1:700 konsentrasjon av mus anti-fosfo-H2AX primært antistoff ved 4 ° C.
  13. Den neste dag, utføre 15 min vasker 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkuber hjerneseksjoner PBS-Triton inneholdende 5% normalt geiteserum med geit-anti-mus-sekundært antistoff konjugert med 488 nm fluorphore på 1:500 konsentrasjon i 2 timer.
  15. Utfør 15 min vasker 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  16. Utfør 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) flekken (1:5,000 i PBS) for 10 min å visualisere kjernen. Deretter vaskes hjerneseksjoner i 5 min med PBS.
  17. Monter på elektro lmarged mikroskop lysbilder av flytende delen i PBS. Tørk av overflødig PBS og la lysbilder tørke. Dekkglass skinnene ved hjelp av monteringsmedium og lar lysbildene tørke i mørke ved romtemperatur over natten.
  18. Ta bilder av serie koronale seksjoner med fluorescerende mikroskop. ΥH2Ax farging (grønn) viser stedet av bestråling. DAPI (blå) er en kjernefarge (Figur 5B).

Tre. Utarbeidelse av Mouse Emner for Focal Bestråling

Undersøke ΥH2Ax farging resultater. Når fornøyd med kalibrering og målretting av bestrålingen strålen, fortsette med forsøket. På dette tidspunkt, er den totale tid som kreves for å behandle en mus (fra oppsettet dyr til gjennomføring av strålen leverings) er omtrent 10 til 15 min for en 10 Gy behandling med et 1-mm strålen.

  1. Bestill fire uker gamle C57BL6 / J hunnmus fra Jackson Mouse laboratorier. Hus fire mus per bur, og bytte mat fra normal chowtil en høy-fett diett i fem uker gamle. Ear punsj mus for å gi dem unike kjennetegn. Overvåke helsen til mus daglig. Merk: metalliske markører, kan ikke brukes da de vil resultere i streker gjenstander på CT.
  2. Vei mus dagen før stråling eller sham behandling. Split mus i to kohorter for stråling eller sham behandling og sikre at det ikke er noen signifikant forskjell i vekt mellom kohorter. På dagen for behandling, når mus er seks uker gamle, reweigh alle mus og spille inn sin masse. Forsiktig transportere begge kohorter til radiologisk plattformen. Vær nøye med å minimere stress nivåer.
  3. Forbered isofluran gass anestesi kammer. Anesthetize to mus, en i den forutbestemte gruppe bestråling, og en annen i sham kontrollgruppen. Forbered oppvarming pad satt på lav innstilling for postoperativ behandling.
  4. Følg trinn 01.02 til 01.04 for musen for å motta bestråling. For humbug musen, holde musen i anestesi kammer mens behandlingen pågår. Gjør sure at anestesi kammeret er nær CFIR plattform slik at eventuelle effekter på ambient stråling er tatt i. Etter målet er identifisert på CT, flytte musen fag under robot kontroll for å justere dette målet med stråling levering strålen. Inngang beregnet parametre (rotasjonshastighet og lengde av behandlingen) i doseplanlegging programvare.
  5. Når bestråling behandling er utført, kommer både humbug og bestrålte mus til varmepute, og overvåke inntil de våkner opp.
  6. Returner både humbug og bestrålte mus til dyr anlegget. Overvåke hver dag. Vei musene hver halv uke. For å bekrefte bestråling av målrettet hypothalamus proliferativ sonen, administrere intraperitonale injeksjoner av BrdU (50 mg / kg) tre dager etter behandling og undersøke nevrogenesen mellom grupper av colabeling av immunhistokjemi for BrdU og en neuronal markør én måned etter innledende BrdU eksponering (figur 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdere CT-veiledet målretting og nøyaktighet

Den mekaniske kalibrering av systemet er kritisk for å sikre at strålene fra ulike vinkler alle skjærer hverandre i et enkelt punkt. Kalibrering ble utført med en halv-automatisk avbildnings-baserte metode, hvor ende-til-ende-justeringsnøyaktighet har blitt målt til å være 0,2 mm 29. Denne nøyaktigheten er sterkt kritisk som volumet av hypothalamus median dominans struktur er lite 2.. For å teste denne kalibreringen, målte vi dosefordelinger med GAFchromic strålefølsomme filmer innebygd i en vann-ekvivalent plast mock-mus modell 35 (Figur 4B). Kort fortalt ble en CT-scan av musen faget tatt, og vår ventrobasal hypothalamus målområde ble identifisert. Levering og rotasjonshastighet ble beregnet, og den aktuelle kollimator og filtrering ble festet for å sikre 10 Gy av stråling ble gitt. En mock-mus modell utviklet fra en vann-equivalen t plast struktur innebygd med GAFchromic strålefølsomme filmene ble deretter byttet ut med den ekte mus motivet som skal måles dose fordeling på ulike fokus flyene. Figur 4B viser ende-til-ende-testresultater fra en bue behandling med en-mm-diameter bjelke hjelp GAFchromic filmer i en mock-mus-plattformen. Den gantry ble satt til en 45 ° vinkel med hensyn til den mock musemodellen mens robotprøvetrinn ble rotert rundt en vertikalt orientert akse, genererer en "bue" eller kjegle av stråling. Den fulle bredde ved halv maksimum (FWHM) er 2,31 mm, som er større enn 1,0 mm, siden de buer hemmende på filmen i en vinkel. Teoretisk størrelsen trålen mot denne vinkelen bør være 2,0 mm. Det sentrale bjelke sted er vist i Fig. 4 viser presisjonsjustering av stråler fra forskjellige retninger. Denne film kan legges over på toppen av den virkelige mus emne, som viser stråleposisjon og presisjon (figur 4C).

e_content "> Ved hjelp av en 1 mm diameter bjelke kollimator, ble en bue teknikk som brukes til å levere 10 Gy til målepunktet i vår mus faget. Tidligere målinger 29 tyder på at denne teknikken gir svært lave doser av stråling (<0,1 Gy) utenfor en mm mål. Arealet av hypofysen og omkringliggende strukturer er derfor effektivt skjermet fra focal bestråling av ventrobasal hypothalamus. Nøyaktigheten av strålen målretting har blitt målt i tidligere studier for å være innenfor 0,2 mm både i fantom tester 29 og vevssnitt 35 .

Selv om det ikke er nødvendig, kan CT-veiledet målretting av avkastningen bli styrket av en injisert intratekal jod kontrast for å forbedre CT-veiledet målretting for hjernen vår søknad (figur 5A). Ettersom dette er en invasiv og tungvint prosedyre, er dette derimot ikke brukes ofte, og er ikke beskrevet i denne protokollen. Detaljer for denne protokollen kan bli funnet i Ford et al. 2011 og Chaichana et al. 2.007. Fordelene med denne jodholdige kontrast er at de laterale og tredje ventrikkel er tydelig visualisert i CT ervervet på en CFIR radiologisk plattformen (figur 5A). Målet var median eminense, ved foten av den tredje ventrikkel, og ble identifisert ved hjelp av CT-veiledet navigasjonsprogramvare og automatisk importert til roboten posisjonering grensesnittet. Beinhjernestrukturer ble identifisert og brukt som anatomiske landemerker for senere studier der jod kontrast ikke ble ansatt.

Beam Targeting Validering med γ-H2AX

For ytterligere å bekrefte vår CT styrt målretting av hypothalamus ME, visualisert vi 1-mm bestrålingsstråle i vev ved indirekte undersøkelse av dobbelt-strengede DNA-brudd som oppstår etter bestråling. H2AX histone protein fosforyleres etter DNA dobbel-strand pauser. γ-H2AX har vært mye brukt i hjernen og andre vev 46 -48, og antallet γ-H2AX + foci synes å korrelere bra med stråledosen over et vidt område av doser, 53 51. Vi har observert klar visualisering av strålen etter γ-H2AX farging (figur 5B). Resulterende γ-H2AX flekker viste presis målretting av forventet plassering. Strålen kanten var også ekstremt skarp, i samråd med filmbaserte fysikk commissioning målinger som indikerer en 20-80% penumbra på 0,3 mm 54. Vi har tidligere målte avstand mellom de tiltenkte mål og sentrum av strålen som visualisert i vevet seksjoner 35. Sentrum av bjelken ble forskjøvet fra den tilsiktede målet ved en midlere avstand på 0,19 ± 0,36 mm (standard avvik) i 10 bestrålte mus etter betraktning for virkninger av vev krymping under fiksering og prosessering 35..

Ved hjelp av en stereotaktisk-aktig bue behandling bestående av en bue på 45 ° fra vertikal, viviser vi var i stand til å effektivt målrette ventrobasal hypothalamus, uten å bestråle andre nevrogene nisjer (Tall 5C-D). Bestråling av omkringliggende områder var minimal, og det var en grense på stråling som demonstrert av GAF-krom film (Figur 4B) og γ-H2AX farging (Tall 5B-D). Vevet dorsal til hypothalamus ME viser lys γ-H2AX farging (figur 5B), fordi stråle bjelker inn gjennom dette område og også muligens på grunn av forsterkning av de overliggende ben, selv om et relativt hardt røntgenstråle ble brukt (225 kVp, 0,15 mm Cu filtrering).

Effekter på Neurogenesis

Når du bekrefter det spesielle ved vår CT-veiledet bestråling levering, undersøkte vi effekten av 10 Gy bestråling på nivåer av ME neurogenesis. Voksne mus ble matet en fettrik diett, fikk stråling eller sham behandling, og deretter senereBrdU injeksjoner som tidligere beskrevet som begynner ved 6 uker gamle 2. Mus ble ofret for eksamen ved 10 uker gammel, en måned etter at den første BrdU injeksjon. Bestrålt HFD-matet voksne mus utstilt ~ 85% hemming av ME neurogenesis sammenlignet med sham-behandlede kontroller (figur 6A) 2. Den bueformede kjerne, en tilstøtende struktur som grenser til bestråling området, ble kontrollert for endringer i neurogenesis, og ble funnet å ha noen statistisk signifikant forskjell mellom bestrålte dyr og sham kontroller (figur 6A) 2.

Funksjon av Adult fødte Median Eminence Hypothalamus Neuroner

Endringer i bestrålte og humbug mus ble undersøkt etter behandling. Pels og respons på berøring dukket normal. En kjemi panel og komplett blodprosent panel ble undersøkt én uke etter bestråling behandling, og ingen signifikant forskjell ble observert (n = 9/group). I høy-fett matetmus hvor vi observerte en ~ 85% reduksjon i voksen-født ME nevroner én måned etter bestråling (Figur 6A), hadde bestrålt mus redusert vektøkning over tid i forhold til sham behandlede gruppen (figur 6C). I kontrast, normal-chow matet kontroll mus, der observerte nivåer av ME neurogenesis var betydelig lavere enn sine høy-fett matet kolleger to, hadde ikke en statistisk signifikant forskjell i vekt mellom humbug versus bestrålte grupper (figur 6B). Interessant nok er dette redusert vektøkning hos bestrålt med høyt fettinnhold tilføres musene ledsaget av endringer i stoffskiftet og aktivitet som tidligere er beskrevet i detalj av gruppen vår 2 (figurene 6D-I).

Figur 1
Figur 1. CT-veiledet focal bestråling (CFIR) plattform. (A) CFIR utnytter en presisjonsstrålingsanordning i stand til å levere CT-styrt bestråling med små bjelker. Et eksempel på en CFIR plattformen er den lille dyret stråling forskningsplattform (SARRP). Med bly skjerming (som vist), står SARRP på 81 inches (høyde) med 58 inches (bredde) ved 41 inches (dybde) på 5,170 pounds. (B) Ved å bruke en dobbelt kilde røntgenrør festet til en portalkraner som kan roteres 360 °, vil SARRP benytter en robotically kontrollere prøvetrinn som tillater rotasjon av et dyr gjenstand gjennom strålebehandling. (C) CFIR metall er sammensatt av en røntgenkilde, kollimator, roterende gantry, dyr støtte, roterende robotprøvetrinn, og elektronisk kamera. (D) Et muse emnet anbringes i en immobilisering seng med gassanestesi inngang på robotprøvetrinn. Fra Armour et al. 2010. (E) CFIR hardware bør omfatte tilpassparallell kjegler for focal ir stråling levering av forskjellige størrelser. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Eksperimentell paradigme. Kvinne C57BL / 6 mus ble bestilt fra Jackson mus laboratorier, og aklimatisert bosatt bur på fire uker gammel. Mus emnet ble byttet til en ad libitum høy-fett diett i fem uker gamle, og delt inn i to behandlingsgrupper: de bestrålte eller humbug kohorter. Fysiologiske Vurderingene ble tatt lengde før og etter behandling. Bestråling eller humbug behandlinger ble administrert med 5,5 uker. Intraperitoneale BrdU injeksjoner ble gitt på seks uker gamle som tidligere beskrevet 2..

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Figur 3. Region av interesse lokalisering. Den hypothalamus proliferativ sone (HPZ), en nevrogen region som ligger i hypothalamus median eminense, ligger i ventrale mediobasal hypothalamus. (A) Den HPZ region av interesse (ROI) er markert med rødt trådkors i en 3-D Nissl referanse atlas volum fra Allen Brain Atlas Portal (posisjon: 7,041, 7,211, 5,564) (tilgjengelig fra http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) Koronal hjernen delen av ROI i nitten dager gamle mus. BrdU immunhistokjemi (grønn) viser at ROI (hvit pilspiss) inneholder proliferative celler. Tettheten av proliferative celler i HPZ er begrenset i den fremre til bakre akse, med densitet høyest ved -1,75 mm Bregma. Vevssnitt er kontra farget med DAPI atom markør (blå). Figur av Lee et al. 2012a.(CE) CT-avbildning på en CFIR plattformen tillater rettet mot HPZ ROI (røde trådkors) etter arc strålebehandling levering. CT-bilder av mus underlagt i horisontalplanet (H), sagittal plan (D), og koronale planet (E). (E) Avstand fra overflaten av hodeskallen til ROI er 0.62 cm (rød linje). Scale barer = 1 mm (A), 50 mikrometer (B), og 0,62 cm (CE). Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. Kalibrering av bestråling levering. (A) X-ray av en mus emne sikret i immobilisering enhet på SARRP robot scenen. (B) Beregnet ROI koordinererre lagt inn og målrettet mot en mock mus modell. Den fantom-modellen er sammensatt av GAFchromic strålingssensitive filmer innebygd i en vann-ekvivalent plast. Filmer som ligger ovenfor, ved, og under ROI isomidtpunktet oppdage dosefordeling. En 45 ° lysbuestråling strålen fra SARRP leverer en kjegleformet dose distribusjon til avkastningen, og konvergerer på isomidtpunktet (penumbra spot). (C) overliggende dosimetri-film kjøpt med en-mm stråling strålen i fantom med en X-ray av en ekte mus emne (gul linje). Hvit sirkel (pil) viser 10-Gy stråledosen focally målrettet mot HPZ. Prikket linje skisserer hjernen. Panel fra Lee et al. 2012a.

Figur 5
Figur 5. Bekreftelse på Radiation Levering CT bildebehandling med jod kontrast. Kan forbedre visualisering av ROI hvis CT bildebehandling normalt ikke 'tilstrekkelige. (A) Muse pasientene fikk jod kontraster som tidligere beskrevet (Panel av Lee et al. 2012). CT-bildene i den koronale, horisontal, og sagittalplan er vist fra venstre til høyre. (B) Bekreftelse av stråling levering i vev kan bli detektert ved immunohistokjemi for γH2AX, en markør DNA-dobbelt-trådede pauser. γH2AX farging viser stråling strålen levering målrettet til ROI HPZ i ventral mediobasal hypothalamus. γH2AX farging er ikke observert i subventricular sone av den laterale ventrikler (C), eller den subgranular sone av hippocampus (D) av den samme mus faget. (BD) Seksjoner er kontra med DAPI (Fra Lee et al. 2012a). Klikk her for å se større figur .


Figur 6. Focal hemming av ME neurogenesis resultater i endringer i vekt og metabolisme. (A) Median eminense (ME) som ligger i ventral mediobasal hypothalamus var målrettet for bestråling. Den bueformede kjerne (ArcN) er nabo anatomisk struktur. En måned etter behandling, var prosentandelen av BrdU + Hu nevroner fra humbug versus bestrålte kohorter kvantifisert ved immunhistokjemi i ME og ArcN. Nivåer av ME neurogenesis ble betydelig redusert i bestrålt versus humbug kohorter (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Nivåer av ArcN neurogenesis ble ikke påvirket (n = 3/cohort, ns = ikke signifikant). (B) Normal chow matet (NC) og (C) høy-fett matet (HFD) mus ble undersøkt i lengderetningen for endringer i vekt etter bestråling eller humbug behandlinent (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) En måned etter behandling, bestrålt og humbug behandlet HFD-matet mus ble undersøkt av kvantitative magnetisk resonans spektroskopi for analyse av% fettmasse og% lean mass. Bestrålte mus hadde signifikant mindre% fettmasse, og betydelig mer% lean masse enn sham-kontroller (n = 5, * = p <0,05). Total masse: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (Irradiated) 18.86 ± 0,4 g; Lean masse: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (Irradiated) 13,9 ± 0,3 g, fett masse: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( Bestrålt) 2,6 ± 0,3 (n = 5, * = p <0,05). (FI) Bestrålt og simuleringsbehandlede voksne mus ble plassert i en omfattende Lab Animal Monitoring System (muslinger) for samtidige målinger av matinntak, fysisk aktivitet, og hele kroppen metabolske profilering to uker etter behandling. Etter akklimatisering i testkammeret, ble det bestrålte musene observert å ha SIgnificantly større energiforbruk, total aktivitet og VO 2 (ml / kg / t) sammenlignet med sham kontroller under den mørke del av dagen (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) Ingen signifikant forskjell ble observert i luft valutakurs (RER) (n = 11, 12). Subfigure A er generert fra data som tidligere er publisert i Lee et al. 2012a og Lee et al. 2012b. Subfigures CI fra Lee et al. 2012a. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CT-veiledet focal bestråling (CFIR) er en ny og komplett system tilnærming som kan levere strålefelt til mål i små dyr under robot kontroll ved hjelp av CT-veiledning 32. Evnen til CFIR å levere svært fokusert bjelker til små dyremodeller gir nye forskningsmuligheter for å bygge bro laboratorieforskning og klinisk oversettelse. Dette notatet beskriver CFIR tilnærming for presis stråling levering spesifikt mot en hypothalamus nevrale stamceller befolkningen. Vi viser her hvordan du kalibrere og bekrefte stråling levering spesifisitet via X-ray film og i hjernevevet ved immunhistokjemi.

I tillegg, viser vi hvordan denne teknikken kan brukes til å inhibere neurogenesis i et bestemt område i hjernen. Vi viser at vi er i stand til å målrette ventrobasal hypothalamus, og hemme neurogenesis i median eminense, uten å endre nivåer av neurogenesis i tilstøtende strukturer. Hemming av ME neurogenesis er ledsaget av endringer i stoffskiftet og aktivitet, samt redusert vektøkning på en høy-fett diett i bestrålt versus humbug behandlingsgruppene (figur 6) 2. Disse dataene antyder en rolle for disse voksne fødte hypothalamus nevroner i å regulere metabolismen og energi homeostase. Dessuten tyder det på at et overskudd høy-fett diett kan endre kritisk metabolske kretsene selv i voksen alder tre. Våre resultater representerer en viktig utvidelse av den kjente funksjon av voksne fødte nevroner, og belyser en ny hypothalamus nevrale stamceller befolkning tre. Potensielle advarsler til denne tilnærmingen er at bestråling hemmer stamfar spredning snarere enn nevrogenesen per se, og er dermed også mulig at fysiologiske endringer etter behandling kan være delvis forklares av forstyrrelse av annen voksen celle genesis. Fremtidig trinn vil omfatte utvikling av genetiske verktøy for å inhibere proliferasjonen av denne bestemte neurale stamcelle population, noe som vil gi betydelig klarhet til den funksjonelle rollen disse stamfedre og deres avkom spille i reguleringen av fysiologi tre.

Tatt sammen, derimot, fungerer dette radiologisk plattformen som et viktig utgangspunkt i å utføre medium throughput skjermer på nevrale stamceller og deres avkom. Denne radiologiske teknikken er ikke begrenset til problemstillinger i nevrovitenskap, imidlertid, og vi forventer CFIR å utvide den konseptuelle forhånd i en rekke forskningsdisipliner. Den nylig tilgjengeligheten av kommersielt solgt CT-guidede radiologiske plattformer gir en mulighet for forskere til å bruke disse mulighetene i denne plattformen for sine forskningsspørsmål (figur 1). Flere alternativer er kommersielt tilgjengelig som tillater en å utføre bildestyrt små dyr bestråling. Videre kan CT-guidede fokale bestråling systemer også bygges i huset, slik tilfellet var med det systemet som brukes for disse s vartudies ved Johns Hopkins 29-33, 35.

Utføre denne graden av fokus målretting krever skikkelig kalibrering og målretting av ROI. Selv om denne teknikken vil i første omgang ta opplæring for å bli kjent med CFIR plattformen og dens dose-planlegging programvare, er ganske enkelt etter å forstå protokollen og evner av plattformen drift av enheten. Det anbefales at operatøren praksis kalibrering stråling strålen flere ganger før du kjører fullskala lengde eksperiment. Som sagt, når flytende i driften av CFIR, bør forskningsstudier bevege seg raskt.

Denne CFIR protokollen beskrevet heri benytter tredimensjonal volumetbilde veiledning for lokalisering og målretting av dosen. Konforme dose reduserer eksponering for nontargeted områder av hjernen, og høy presisjon bjelke geometri tillater konforme dose distribusjon med skarpe strålegrenser. Dette gjør det mulig å stille spørsmål angång funksjonen av voksne fødte nevroner, men åpner også områder til spørsmål til rollen som celleproliferasjon i områder som fysiologi, tumorbiologi og immunologi. Denne metoden kan utvides på forskjellige måter med kontrast fargestoffer og bioluminescens å forbedre visualisering 35, 56. Det arbeides nå med å forbedre CFIR maskinvare evner videre, og plattformen blir nå endret til å omfatte et on-board positronemisjonstomografi scanner 56. Disse vil legge til rette for utvidelse av verktøy tilgjengelig for forskere og bistand i å oversette funn på benken til sengen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW har en forskningsmidler og konsultasjonsavtaler med Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Vi takker C. Montojo, J. Reyes, og M. Armour for teknisk rådgivning og bistand. Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institutes of Health stipend F31 NS063550 (til DAL), en Basil O'Connor Starter Scholar Award og stipend fra Klingenstein Fondet og NARSAD (til SB). SB er en WM Keck Distinguished Young Scholar i medisinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Tags

Neuroscience nevrale stamceller (NSCs) kroppsvekt Strålebehandling bildestyrt Metabolism Energy Metabolism Neurogenesis celleproliferasjon Neurosciences Bestråling Radiologisk behandling Computer-tomografi (CT) bildebehandling Hypothalamus hypothalamus Proliferativ Zone (HPZ) Median Eminence (ME) Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)
Funksjonell Avhør av Adult Hypothalamus Neurogenesis med Focal Radiologisk Hemming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J.,… More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter