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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

A função dos neurônios de mamíferos nascido de adultos continua a ser uma área ativa de pesquisa. A radiação ionizante inibe o nascimento de novos neurônios. Usando computador guiada por tomografia irradiação focal (CFIR), segmentação anatômica tridimensional de populações específicas progenitoras neurais agora pode ser usado para avaliar o papel funcional da neurogênese adulta.

Abstract

A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo. Abordagens para inibir adulto neurogenesis via entrega viral invasiva ou animais transgénicos têm potenciais confunde que tornam a interpretação dos resultados a partir destes estudos difícil. Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem que se investigue de forma não invasiva a função de selecionar grupos de neurônios nascido de adultos por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. Radiação ionizante Focal inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios e permite a segmentação de regiões específicas progenitoras neurais. A fim de esclarecer o papel funcional potencial que a neurogênese adulta hipotálamo desempenha na regulação de processos fisiológicos, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios nascido de adultos na eminência mediana do hipotálamo. Nós descrevemos um método para C omputer guiada por tomografiaf ocal ir radiação (CFIR) entrega para permitir anatômico preciso e exato visando em pequenos animais. CFIR usa orientação imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose de radiação, minimiza a exposição à radiação de regiões cerebrais nontargeted, e permite a distribuição da dose conformada com fronteiras nítidas feixe. Este protocolo permite fazer perguntas sobre a função dos neurônios nascido de adultos, mas também abre as áreas de perguntas em áreas de radiobiologia, biologia do tumor, e imunologia. Estas ferramentas radiológicos irá facilitar a tradução de descobertas no banco à cabeceira.

Introduction

Descobertas recentes demonstraram que o cérebro de mamíferos adultos pode ser submetido a um notável grau de plasticidade. Neurônios-nascido adultas são gerados durante a vida adulta em nichos especializados do cérebro dos mamíferos 1. Qual é a função desses neurônios nascido de adultos? E mais ainda, que eles desempenham um papel na fisiologia e comportamento? Estudos sobre o tema têm, tradicionalmente focada na zona subventricular dos ventrículos laterais ea zona subgranular do hipocampo, no entanto, estudos recentes têm caracterizado a neurogênese em outras regiões do cérebro, como o hipotálamo dos mamíferos 2. Neurogenesis foi avaliado no pós-natal e adulto hipotálamo 2-10, e a função destes neurónios hipotalâmicos-nascidos ainda uma área activa de investigação.

A caracterização funcional de neurônios nascido de adultos continua a ser um desafio significativo para o campo da neurociência em geral. Inibição seletiva de especificaçãoIFIC populações progenitoras neurais permanece limitada pela falta de marcadores moleculares disponíveis, que são únicas para populações progenitoras neurais individuais 11. Assim, a eliminação seletiva dos neurônios nascido de adultos destes progenitores neurais através de segmentação genética continua difícil. Da mesma forma, a entrega viral para atingir os neurônios nascido de adultos sofre de potenciais variáveis ​​de confusão, tais como a introdução de lesão e inflamação no ambiente 12.

Novas ferramentas radiológicos estão surgindo, no entanto, que permitem contornar essas confunde e investigar essas questões por meio da segmentação anatômica exato e preciso em pequenos animais. A radiação ionizante inibe o nascimento e diferenciação de novos neurônios, e permite que um método não invasivo para atingir populações progenitoras neurais 13-15. Recentemente, descrevemos uma região germinal da eminência mediana do hipotálamo dos mamíferos (ME) que denominou a zona proliferativa hipotálamo (ZAP) 2 2. Para testar se a neurogênese adulta dentro do ME hipotálamo regula o metabolismo e do peso, buscou-se interromper esse processo. A eminência mediana é uma pequena estrutura unilateral na base do terceiro ventrículo a partir do qual as hormonas reguladoras são libertados. A fim de inibir a proliferação e neurogênese posterior sem alterar as outras funções fisiológicas desta região do cérebro, desenvolvemos uma técnica de irradiação focal não-invasivo para inibir seletivamente o nascimento de neurônios adultos recém-nascidos na eminência mediana do hipotálamo 2.

Vários grupos têm utilizado a radiação para suprimir a neurogênese em regiões canônicas 14-28. No entanto, as abordagens radiológicos anteriores geralmente alvo de grandes áreas, ou often involuntariamente também alvejado várias áreas do cérebro onde foi reportado a neurogênese, o que torna difícil para associar de forma inequívoca quaisquer defeitos comportamentais observadas com defeitos em populações específicas progenitoras neurais. A capacidade de irradiação mais direcionado é fornecido pelo plataformas radiológicos que combinam c omputer imagem guiada por tomografia com f ocal ir feixe de radiação (CFIR) entrega para permitir anatômica mira de precisão 29-36. Feixes de radiação tão pequenas quanto 0,5 mm de diâmetro estão disponíveis para atingir populações progenitoras neurais específicos 35. Esta metodologia permite-nos atingir o ME hipotálamo e prender proliferação e bloqueiam a neurogênese em pequenos animais. Após o tratamento radiológico nestas populações progenitoras, testes fisiológicos e comportamentais podem ser realizados para esclarecer a função potencial de células-nascido adultos. Segmentação focal é especialmente importante para a nossa aplicação, desde oglândula pituitária está localizado perto da eminência mediana do hipotálamo; irradiação da hipófise pode afetar a função hormonal e, posteriormente, confundir os resultados.

A base biológica para a supressão da neurogênese após irradiação ainda permanece obscuro. Estudos de radiação anteriores têm contado com grandes vigas área, e concluíram que a supressão da neurogênese é mediada através de uma resposta inflamatória 14, 37. Como tal, não está claro se a irradiação altamente focal poderia suprimir a neurogênese, uma vez que não evocar uma resposta inflamatória substancial. No entanto, estudos recentes do nosso grupo do clássico região neurogénica no hipocampo têm demonstrado que a irradiação altamente focal com uma dose de 10 Gy, pode suprimir a neurogénese durante pelo menos 4 semanas após a irradiação 35.

Para interrogar a função dos neurônios do hipotálamo nascido de adultos na eminência mediana, usamos uma radiação precisão device capaz de fornecer imagens CT em combinação com feixes de radiação de pequeno diâmetro para inibir a neurogênese ME. Utilizando um tubo de raio-X acoplado a um pórtico que gira ao longo de um intervalo de 360 °, que entregam arco de feixe do feixe de micro irradiação com o uso de uma fase de amostra controlado roboticamente, que permite a rotação de um sujeito animal durante o tratamento de radiação (Figura 1) . Uma maior resolução do detector de raios-X é utilizado para a aquisição de imagens, quando o pórtico está na posição horizontal 33. Para este estudo, imagens de TC foram reconstruídos com um tamanho de voxel isotrópico de 0,20 mm. No bordo de imagem CT permitiu a identificação de um alvo, enquanto o animal está na posição de tratamento. O alvo foi localizado usando o software de planejamento de dose de navegação CT, que foi incluído com a nossa plataforma radiológicos disponíveis comercialmente. Depois de localizar o nosso ROI por imagem CT, o animal foi movido para a posição de tratamento adequado pelo estágio espécime robótico que tem quatro grausRees de liberdade (X, Y, Z, θ). Através de uma combinação de ângulos de pórtico e estágio robô, vigas podem ser entregues a partir de quase qualquer direção em relação ao animal, e tratamentos de arco-like estereotáxica são possíveis 29. Para estes e todos os outros estudos de imagiologia, os ratos foram colocados num dispositivo de imobilização, que permite a libertação de gás anestésico de isoflurano durante a restringir o movimento. A cama de imobilização é CT compatível, e se conecta ao palco espécime robótico 34.

Esperamos que CFIR proporcionará avanços conceituais em um número de áreas de investigação. Apesar de usarmos segmentação radiológica da eminência mediana do hipotálamo como prova de princípio desta técnica, CFIR pode ser usado para atingir qualquer região do corpo de qualquer modelo pequeno organismo em princípio. Nos ciências neurológicas, por exemplo, prever que esta técnica pode ser utilizada para avaliar a função de populações progenitoras activamente proliferativas que têm sido sugeridos para exist em outros órgãos circumventricular, tais como a área postrema 38, 39, 40 do órgão subfornical e na hipófise 41. Controvérsias de longa data sobre o papel funcional da neurogênese adulta e identificação de um papel causal no comportamento também pode agora ser melhor abordados. Em aves canoras, esta técnica pode abordar o papel da neurogênese adulta na manutenção do comportamento robusto e sazonal do canto dos pássaros 42, que tem sido dificultado pela capacidade de inibir seletivamente a neurogênese em regiões específicas do cérebro. Compreender este modelo comportamental robusto pode lançar uma nova visão sobre o papel da neurogênese adulta na regulação de outros comportamentos sexualmente dimórficos. Em alternativa, no campo metabólica, CFIR pode ser usada para explorar aspectos do papel de proliferação dos hepatócitos e o seu papel no metabolismo e no balanço de energia. A possibilidade de avanço conceptual em várias disciplinas de investigação é aumentada pela introdução desta técnica.

43, 44. Por isso, nós generalizamos este protocolo CFIR com passos necessários para todas as plataformas de pesquisa, em vez de os específicos para SARRP. As vantagens das abordagens mais CFIR radiológicos anteriores para inibir a neurogénese são que esta técnica permite a orientação da imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose, a dose conformada minimiza a exposição de regiões cerebrais nontargeted, e geometria do feixe de alta precisão permite a distribuição da dose com conformado limites feixe afiadas. Nós delineamos como usar imagens CT-guiada para atingir a dose a uma região anatômica específica, e ao fazê-lo, como visualizar a radiaçãodose de distribuição diretamente no tecido usando coloração imuno-histoquímica para γ-H2AX, um marcador de DNA quebras de fita dupla 35, 45-48. A utilização desta abordagem para a irradiação seletiva de nichos neurogênicos podem ter implicações significativas na revelando o papel funcional de novos neurônios nascido de adultos sobre a fisiologia e doenças.

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Protocol

Uso animal

Obter a aprovação do Comitê Animal Care e Use institucional para tratamento padrão e de uso de protocolos. O protocolo corrente foi desenvolvido para estudos de irradiação focais sobre 5.5-10 semanas de idade adultos ratinhos C57BL6 / J, tal como descrito anteriormente (Figura 2) 2. No entanto, outras idades e de pequenas espécies animais (ratos, hamsters, esquilos, etc) também podem ser usados, desde que os protocolos de anestesia efetivos e um atlas de referência radiográficas que permitam identificar a região de interesse (ROI) estão disponíveis.

1. Calibração de Plataforma Radiológica CT-guiada

Realizar calibrações baseadas em filme para a dose de radiação na plataforma radiológico com antecedência para cada tamanho de colimador e tipo de filtro tubo de raios-X usados. A fim de atingir um raio de arco de irradiação no local de destino desejado, use o software de planejamento de dose de radiação 49 available na maioria das plataformas comerciais de radiação para calcular tempo de entrega exigido com base na dose de radiação, a profundidade da região de interesse (ROI) com base em tomografias computadorizadas do mouse, ea velocidade de rotação da plataforma robótica; detalhes sobre este são deixados de fora deste protocolo como eles diferem entre as plataformas de radiação. Para efeitos de visualização do hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3), com imagens de RM, operar o tubo de raios-X com um ponto focal de 0,4 mm e a energia do feixe de 100 kVp, com 1 milímetro Al filtração. Para irradiação focal da ZAP, opere o tubo de raios-X a 225 kVp, 13 mA, e um ponto focal de 1 mm com filtração de 0,15 milímetros Cu, para entregar 10 Gy de radiação a uma profundidade de tecido de 0,6 centímetros ao longo de um tratamento tempo de 4,6 minutos. Segmentação entre diferentes ROIs exigirá cálculo diferentes parâmetros.

  1. Se estudar os efeitos da dieta rica em gordura sobre a neurogênese na eminência mediana, como descrito anteriormente 2, obter quatro semanas de idade, do sexo feminino C57BCamundongos L6 / J de laboratórios Jackson mouse e casa quatro ratos por gaiola. Interruptor de alimentos a partir de ração normal para uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Permitir camundongos se adapte à nova moradia e alimentação. Realizar tratamento CFIR em 5,5 semanas de idade. Transporte submete à sala de operação que contém a plataforma radiológica. Minimizar os níveis de estresse durante a transferência. Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Em seguida, adicione um único rato na câmara. Em paralelo, preparar almofada de aquecimento (baixa definição) para o pós-tratamento.
  2. Uma vez que o mouse está sob e não mais respondendo a compressão pé-almofada, trazer o assunto para a plataforma radiológica e coloque na cama imobilização da fase robótico. Coloque a boca do sujeito no copo anestesia nariz-cone, e dentes no guarda mordida (Figura 1D). Colocar o plano do mouse em cima da cama de imobilização e verificar para ver se ele continua a manter apatia. Se assim for, fita para baixo do mouse para a cama com fita de gaze. Enquanto gravando o mouse para a cama, Certifique-se o chefe é nivelado a um plano horizontal. Isto pode ser determinado, puxando para cima das orelhas e ver se eles estão niveladas. Uma vez que o mouse está na posição correta, feche o escudo protetor de chumbo.
  3. Adquirir a verificação do computador-tomografia usando software on-board de plataforma radiológico do experimentador (isto irá variar entre plataformas), que irá proporcionar uma varredura estrutural anatômica tridimensional do assunto mouse. Verifique se a cabeça do rato é nivelado ao plano horizontal. Se não, repita os passos de 1,2-1,3 até a cabeça do sujeito é nivelado.
  4. Identificar ROI imagem CT by. Calcular a distância de ROI para a superfície do crânio com um ângulo de 45 ° em relação ao plano horizontal, como mostrado na Figura 3E.
  5. Usando o software on-board, tirar um raio-X do assunto rato por cima, como mostrado na Figura 4A. Em seguida, retire do mouse a partir da plataforma radiológica, colocar almofada de aquecimento, e monitorar até ativa.
  6. A partir das imagens coronais CT, calcular a profundidade média ROI anatómica de pelo menos três ratos a fim de determinar a dosagem de entrega. Como um exemplo de um estudo anterior em que 2 10 Gy de radiação foi administrada para o hipotálamo ventrobasal, a profundidade da ROI do crânio (a partir de um ângulo de 45 °) é de 0,66 cm (Ver Figura 3E). Sabendo disso, os pesquisadores usaram o software de planejamento de dose (DPS) instalado em sua plataforma radiológica para calcular a velocidade de rotação adequado e duração do tratamento para atingir dose desejada para o ROI.
  7. Após a determinação da duração do tratamento e da velocidade de rotação da fase robótico com o software de dose-planeamento, medir distribuições de dose dos parâmetros calculados com películas sensíveis à radiação GAFchromic incorporados num modelo simulado-rato de plástico equivalente de água. Para fazer isso, incorporar três filmes sensíveis à radiação GAFchromic entre quatro empilhadas verticalmente blocos de plástico equivalente de água 29 comomostrado na Figura 4B.
  8. Coloque modelo de simulação do mouse contendo filmes GAFchromic no palco robótico, e executar o feixe de irradiação focal com os parâmetros recém-calculados. Por exemplo, para visar a ventrobasal hipotálamo, introduzir os parâmetros de filtro de 0,15 milímetros de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de diâmetro do feixe de radiação ambiente, 45 ° de ângulo de pórtico, 1,3 ° / s de rotação, e de 4,6 min para se obter um ROI a dose radiológica de 10 Gy.
  9. Após a irradiação, verifique filmes para padrão e intensidade da dose de radiação. Para um ângulo de rotação de 360 ​​°, com os parâmetros listados para atingir o hipotálamo ventrobasal, um anel escuro na película acima isocentro, uma pequena mancha nítida no filme isocentro, e um anel mais leve na película abaixo do isocentro correspondente para o cone administração do feixe de irradiação serão observados (Figura 4B).
  10. Sobreponha isocentro filme GAFchromic sobre os raios-X de objetos do rato a partir do qual os parâmetros foram callada. O ponto focal irradiado no isocentro deve sobrepor-se com a região de ROI desejada, como mostrado na Figura 4C.

Método alternativo: Se a dificuldade em atingir o ROI cérebro persistir, utilize contraste iodado injetado por via intratecal para melhorar a visualização dos ventrículos em imagens de CT. Por uma questão de brevidade, este procedimento é deixado de fora deste protocolo, mas é descrito anteriormente 35, 50. Contraste de iodo irá fornecer marcos ventriculares adicionais (Figura 5A).

2. Determinar a precisão de irradiação

Além disso confirmar a precisão do feixe CFIR pela visualização direta do feixe de radiação no tecido 2, 35, 51. Para fazer isso, execute imunohistoquímica para detectar γH2AX 51, uma proteína histona e um marcador precoce de rupturas de filamentos duplos de DNA. Assuntos do mouse deve ser transcardially perfundidos e fixados dentro de uma hora de irradiação. Após irradiation, reparo do DNA rapidamente se segue, e os níveis de ΥH2Ax diminuir significativamente 35.

  1. Repita os passos de 1,1-1,3.
  2. Depois que o alvo é identificado no CT, o tema do mouse é movido sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada parâmetros calculados (velocidade de rotação e tempo de tratamento para atingir dose desejada) a partir do passo 1.6 em software dose de planejamento e começar o tratamento. O tratamento é entregue com o pórtico apontou para 45 ° em relação à vertical, enquanto o mouse gira sobre um eixo orientado verticalmente.
  3. Após a irradiação, realizar perfusão transcardial sobre assuntos do mouse. Realize perfusão dentro de uma hora 52. Após perfusão, correção imersão cérebros em PFA 4% / PBS e abane durante a noite a 4 ° C.
  4. Na manhã seguinte, lavar 5 min em PBS, 3x para remover paraformaldeído fixador. Em seguida, imerso em 30% de sacarose em PBS 1x num agitador a 4 ° C.
  5. Agite suavemente a 4 ° C (usdualmente 12-16 h), até que o cérebro se afunda até o fundo do tubo. Isto serve como um passo crioproteção. Uma vez que os cérebros afundar, remova cérebro com uma colher perfurada para evitar excesso de 30% sucrose/1x transferência PBS. Rapidamente incorporar no congelamento médio em gelo seco. Agitar meio de congelamento com ponteira e alinhar cérebro em moldes de plástico.
  6. Uma vez completamente congelado, transferir blocos de cérebro de -20 ° C congelador para armazenamento.
  7. No dia em que será realizada imuno-histoquímica, a secção coronal em 40 mM de espessura, e flutuam em uma placa de 24 poços contendo PBS com um pincel fino. Seções devem ser mantidos em ordem serial correta para a imunocoloração para determinar a cobertura de irradiação da região de destino.
  8. Pré-aquecer 0,01 M de solução de citrato de sódio a 80 ° C em banho de água em preparação para o passo de recuperação de antigénio. Simultaneamente, enquanto o citrato de sódio é o aquecimento, executar lavagens de 5 min 3x em 0,01 M de PBS.
  9. Uma vez que uma solução de citrato de sódio é de 80 ° C, submergir secções cerebrais in a solução tampão de citrato de sódio. Deixar em banho de água a 80 ° C durante 1 hora.
  10. Retirar secção e permita que a solução de citrato de sódio para atingir a temperatura ambiente, em seguida, executar três lavagens de 5 minutos em 0,01 M de PBS.
  11. Bloquear secções do cérebro durante 1 h em PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal.
  12. Incubar secções do cérebro durante a noite em PBS contendo Triton-5% de soro de cabra normal com concentração de 1:700 de ratinho anti-fosfo-H2AX anticorpo primário a 4 ° C.
  13. No dia seguinte, 15 min executar lavagens 3x em PBS 0,01 M, Triton.
  14. Incubar secções cerebrais PBS-Triton, contendo 5% de soro de cabra normal com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugada com 488 nm fluorphore na concentração de 1:500 durante 2 horas.
  15. Execute 15 min lavagens 3x em 0,01 M PBS-Triton.
  16. Realizar 4 '(DAPI) mancha-diamidino-2-fenilindole ,6 (1:5000 em PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. Em seguida, lavam secções do cérebro durante 5 min com PBS.
  17. Montar em eletrostática chmicroscópio arged desliza por seção flutuante em PBS. Limpe o excesso de PBS e deixar as lâminas secar. Lamela as lâminas, utilizando o meio de montagem e de permitir que as lâminas seca no escuro e à temperatura ambiente durante a noite.
  18. Tire fotos de cortes coronais de série com microscópio de fluorescência. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica local de irradiação. DAPI (azul) é uma mancha nuclear (Figura 5B).

3. Preparação de Rato Assuntos para irradiação focal

Examine os resultados de positividade ΥH2Ax. Uma vez satisfeito com a calibração e direcionamento do feixe de radiação, prosseguir com o experimento. Neste ponto, o tempo total necessário para tratar de um ratinho (a partir de instalação de animais para a conclusão de administração do feixe) é de aproximadamente 10-15 minutos para um tratamento de 10 Gy com um raio de 1 mm.

  1. Encomende quatro semanas de idade camundongos fêmeas C57BL6 / J de laboratórios Jackson do Mouse. Casa de quatro ratos por gaiola, e mudar comida de ração normala uma dieta de alto teor de gordura às cinco semanas de idade. Camundongos soco orelha para dar-lhes as marcas de identificação únicos. Monitorar a saúde dos ratos diariamente. Nota: marcadores metálicos não pode ser utilizado à medida que vai resultar em estrias artefactos no CT.
  2. Pesar camundongos um dia antes de o tratamento de radiação ou farsa. Camundongos divididos em dois grupos de radiação ou tratamento placebo e garantir que não há diferença significativa de peso entre coortes. No dia do tratamento, quando os ratos estão seis semanas de idade, pesar novamente todos os ratos e registrar sua massa. Gentilmente transportar ambos os grupos para a plataforma radiológica. Tome cuidado para minimizar os níveis de estresse.
  3. Prepare isoflurano câmara de anestesia gás. Anestesiar dois ratos, um no grupo irradiação pré-determinado, e outro no grupo controle farsa. Prepare almofada de aquecimento definido na baixa definição para o tratamento pós-operatório.
  4. Siga os passos de 1,2-1,4 para o mouse para receber a irradiação. Para o mouse farsa, mantenha o mouse na câmara de anestesia enquanto o tratamento está acontecendo. Faça sure que câmara anestesia é perto da plataforma CFIR assim quaisquer efeitos sobre a radiação ambiente são tidos dentro Após o alvo é identificado na CT, mova o mouse assunto sob controle robótico para alinhar esta meta com o feixe de radiação entrega. Entrada de parâmetros (velocidade de rotação e duração do tratamento) calculado em software dose de planejamento.
  5. Uma vez que o tratamento de irradiação for concluída, voltar tanto farsa e os ratos irradiados a almofada de aquecimento, e monitorar até que eles acordam.
  6. Retornar tanto farsa e ratos irradiados para biotério. Monitorar todos os dias. Pesa-se a ratinhos cada meia semana. Para confirmar a irradiação da zona proliferativa hipotálamo alvo, administrar injeções intraperitoneais de BrdU (50 mg / kg), três dias após o tratamento e examinar a neurogênese entre grupos por colabeling de imuno-histoquímica para BrdU e um marcador neuronal de um mês após a exposição inicial BrdU (Figura 6) 2.

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Representative Results

Avaliando Targeting CT-guiada e Precisão

A calibração mecânica do sistema é crítico para assegurar que os feixes de vários ângulos todos se intersectam num ponto único. A calibração foi realizada com um método baseado na imagem semi-automático, onde a precisão do alinhamento extremidade-a-extremidade foi medido como sendo de 0,2 milímetros 29. Esta precisão é muito crítico que o volume da estrutura da eminência mediana do hipotálamo é pequeno 2. Para testar essa calibração, medimos as distribuições de dose com filmes sensíveis à radiação GAFchromic embutidos em um plástico modelo mock-rato equivalente de água 35 (Figura 4B). Resumidamente, uma tomografia computadorizada do assunto rato foi tomada, e nosso site alvo hipotalâmico ventrobasal foi identificado. Entrega e velocidade de rotação foram calculados, eo colimador e filtração adequada foram anexados para garantir 10 Gy de radiação foi entregue. Um modelo de mock-rato desenhado a partir de uma equivalen água estrutura t de plástico encaixado com películas sensíveis à radiação GAFchromic foi então substituído por objecto reais rato para medir a distribuição da dose em diferentes planos focais. Figura 4B mostra end-to-end resultados de testes de um tratamento com o arco de raio de 1 mm de diâmetro, usando filmes GAFchromic em uma plataforma de mock-mouse. O pórtico foi fixado a um ângulo de 45 ° com respeito ao modelo de simulação do rato, enquanto a fase espécime robótico foi rodado em torno de um eixo orientado verticalmente, gerando um "arco" ou cone de radiação. A largura total a meia altura (FWHM) é 2.31 mm, que é maior do que 1,0 milímetros uma vez que os arcos de colidir com a película segundo um ângulo. Teoricamente, o tamanho do feixe neste ângulo deverá ser 2,0 mm. O ponto focal do feixe mostrado na Figura 4 mostra o alinhamento de precisão das vigas a partir de diferentes direcções. Este filme pode ser sobreposto em cima do sujeito real rato, demonstrando a posição do feixe e precisão (Figura 4C).

e_content "> Usando um 1 milímetro colimador de feixe de diâmetro, uma técnica de arco foi usado para entregar 10 Gy para o ponto de destino em nosso assunto mouse. medições anteriores 29 indicam que esta técnica fornece doses muito baixas de radiação (<0,1 Gy) fora o 1 alvo mm. A área da glândula pituitária e estruturas circundantes é, portanto, eficazmente protegidos da irradiação focal do hipotálamo ventrobasal. A exactidão da orientação do feixe foi medido em estudos anteriores ser de 0,2 mm, tanto em fantasma testa 29 e secções de tecido 35 .

Embora não seja exigido, CT-guiada alvo do ROI pode ser reforçada por um contraste iodado intratecal injetado para melhorar CT-guiada direcionamento para a nossa aplicação cérebro (Figura 5A). Como este é um procedimento invasivo e incômodo, esse contraste não é usado com freqüência, e não os descritos neste protocolo. Detalhes sobre este protocolo pode ser encontrada em Ford et al. 2011 e Chaichana et al. De 2007. As vantagens deste contraste iodado são que os ventrículos laterais e terceiro são claramente visualizados em TC adquiridos numa plataforma radiológica CFIR (Figura 5A). O alvo era a eminência mediana, na base do terceiro ventrículo, e foi identificada usando o software de navegação guiada por tomografia computadorizada e importados automaticamente para a interface de posicionamento do robô. Estruturas cranianas ósseos foram identificados e usados ​​como marcos anatômicos para estudos posteriores, onde contraste iodado não foi empregada.

Boca Segmentação Validação com γ-H2AX

Para confirmar ainda mais a nossa segmentação do ME hipotálamo guiada por tomografia computadorizada, que visualizou o feixe de irradiação de 1 mm no tecido através de um exame indireto de quebras de DNA de fita dupla que surgem após a irradiação. Proteína histona H2AX é fosforilada após DNA quebras das fitas duplas. γ-H2AX tem sido amplamente utilizado no cérebro e outros tecidos 46 -48, e o número de γ-H2AX + focos parece correlacionar-se bem com a dose de radiação ao longo de uma ampla gama de doses de 51, 53. Observamos clara visualização do feixe seguinte γ-H2AX immunostaining (Figura 5B). Coloração γ-H2AX resultante mostrou direccionamento preciso do local esperado. A borda do feixe também foi extremamente acentuada, de acordo com medições de comissionamento física baseados em filmes que indicam uma penumbra 20-80% de 0,3 milímetros 54. Previamente, medido a distância entre o alvo pretendido e o centro do feixe, como visualizado em secções de tecido 35. O centro do feixe foi deslocado do alvo pretendido por uma distância média de 0,19 ± 0,36 mm (desvio padrão) em 10 ratos irradiados depois de factoring para efeitos do encolhimento do tecido durante a fixação e processamento 35.

Utilizando um tratamento de arco estereotaxia como consistindo de um arco de 45 ° em relação à vertical, quemostrar que eram capazes de atingir eficazmente o hipotálamo ventrobasal, sem irradiação outros nichos neurogênicos (Figuras 5C-D). A irradiação de áreas circundantes foi mínima, e havia um limite de exposição a radiação tal como demonstrado pela película GAF-crómico (Figura 4B) e γ-H2AX imunocoloração (figuras 5B-D). O dorso do tecido para o hipotálamo ME mostra luz γ-H2AX coloração (Figura 5B), porque os feixes de radiação entrar através desta região e também, possivelmente, devido a melhoramento por sobrepondo o osso, apesar de um feixe de raios X foi usado relativamente duro (225 kVp, 0,15 milímetros filtração Cu).

Efeitos sobre a neurogênese

Ao confirmar a especificidade da nossa entrega irradiação guiada por TC, examinamos o efeito de 10 Gy de irradiação sobre os níveis de ME neurogênese. Camundongos adultos foram alimentados com uma dieta rica em gordura, recebeu o tratamento com radiação ou simulada, e posteriormenteInjecções de BrdU como anteriormente descrito a partir das 6 semanas de idade 2. Ratos foram sacrificados para exame com 10 semanas de idade, um mês após a primeira injeção de BrdU. Camundongos adultos HFD-alimentados irradiados exibiram ~ 85% de inibição da neurogênese ME em comparação com os controles tratados com placebo (Figura 6A) 2. O núcleo arqueado, uma estrutura adjacente na fronteira com o site irradiação, foi examinado por mudanças na neurogênese, e encontrado para ter nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os animais irradiados e controles sham (Figura 6A) 2.

Função do Adulto-nascido Eminência Mediana Hypothalamic Neurônios

Mudanças em ratos irradiados e sham foram examinados após o tratamento. Casaco de pele e resposta ao toque parecia normal. Um painel de química e painel de hemograma foi analisado, uma semana após o tratamento de irradiação, e não foi observada diferença significativa (n = 9/group). Em fed high-fatcamundongos, onde observou-se uma redução de ~ 85% nos neurônios ME nascido de adultos de um mês após a irradiação (Figura 6A), ratos irradiados tinham diminuído o ganho de peso ao longo do tempo em comparação com a farsa grupo tratado (Figura 6C). Em contraste, normais-chow alimentados ratos de controle, onde os níveis observados de ME neurogênese foram significativamente menores do que os seus homólogos alto teor de gordura alimentados 2, não teve diferença estatisticamente significativa de peso entre farsa contra grupos irradiados (Figura 6B). Curiosamente, este ganho de peso reduzido em irradiado elevado teor de gordura ratinhos alimentados é acompanhada por mudanças no metabolismo e actividade como anteriormente descritas em detalhe pelo nosso grupo 2 (Figuras 6D-I).

Figura 1
Figura 1. Computador guiada por tomografia irradiação focal plataforma (CFIR). (A) CFIR utiliza um dispositivo de radiação precisão capaz de entregar irradiação CT-guiada com vigotas. Um exemplo de uma plataforma CFIR é a plataforma de pesquisa de radiação de pequenos animais (SARRP). Com protecção de chumbo (como mostrado), o SARRP é de 81 polegadas (altura) por 58 polegadas (largura) por 41 cm (de profundidade) em 5170 £. (B) Utilizando uma fonte dupla tubo de raio-X acoplado a um pórtico que roda 360 °, o SARRP utiliza uma controlar roboticamente fase amostra que permite a rotação de um sujeito animal durante todo o tratamento com radiação. (C) CFIR hardware é composto por um raio-X fonte, colimador, pórtico, animal suporte, girando fase espécime robótico, e imager eletrônico rotativo. (D) O tema do mouse é colocado em uma cama imobilização com entrada anestesia gás no palco espécime robótico. De Armour et al. 2010. (E) hardware CFIR deve incluir cones colimação personalizáveis ​​para ir focal entrega de radiação de diferentes tamanhos. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Paradigma Experimental. Feminino C57BL / 6 foram ordenados a partir de laboratórios de Jackson do rato, e aclimatadas para gaiolas residentes em quatro semanas de idade. Rato assunto foram transferidos para um ad libitum dieta rica em gordura em cinco semanas de idade, e divididos em dois grupos de tratamento: As coortes irradiados ou sham. Avaliações fisiológicas foram feitas longitudinalmente antes e após o tratamento. Tratamentos de irradiação ou sham foram administradas em 5,5 semanas. Injeções de BrdU intraperitoneais foram dadas às seis semanas de idade, como descrito anteriormente 2.

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Figura 3. Região de interesse de localização. Zona proliferativa hipotálamo (HPZ), uma região neurogénica localizado na eminência mediana do hipotálamo, está localizado no hipotálamo mediobasal ventral. (A) A região HPZ de interesse (ROI) é destacado por mira vermelhas em um volume de referência atlas 3-D Nissl do Cérebro Portal Allen atlas de dados (posição: 7.041, 7.211, 5.564) (disponível a partir de http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) seção cérebro Coronal do ROI em ratos dezenove dias de idade. Imunohistoquímica BrdU (verde) revela que o ROI (seta branca) contém células proliferativas. A densidade de células proliferativas no HPZ é restrito no sentido antero-posterior do eixo, com uma densidade mais alta de -1,75 mm bregma. As secções de tecido são contra-corados com DAPI marcador nuclear (azul). Figura de Lee et al. 2012a.(CE), CT-imagem em uma plataforma CFIR permite visando o ROI ZAP (cruz-cabelos vermelhos) pela entrega radiação do arco. CT-imagem do sujeito do mouse no plano horizontal (C), plano sagital (D), eo plano coronal (E). (E) Distância a partir da superfície do crânio para o ROI é de 0,62 cm (linha vermelha). Barras de escala = 1 mm (A), 50 mm (B), e 0,62 cm (CE). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 4
Figura 4. Calibração de entrega irradiação. (A) de raio-X de um rato sujeito fixada no dispositivo de imobilização na fase robótico SARRP. (B) coordenadas calculadas ROI umre introduzidos e direcionados contra um modelo de simulação do mouse. O modelo phantom é composta de filmes sensíveis à radiação GAFchromic embutidos em um plástico equivalente à água. Películas localizado acima, a, e sob o isocentro ROI detectar a distribuição de dose. A 45 ° arco feixe de radiação do SARRP oferece uma distribuição de dose em forma de cone para o ROI, e converge no isocentro (spot penumbra). (C) A superposição de dosimetria de filme adquirido com feixe de radiação de 1 mm em fantasma com um raio-X de um sujeito rato real (linha amarela). Círculo branco (seta) indica radiação de 10 Gy de dose focally alvejado a ZAP. A linha pontilhada descreve cérebro. Painel de Lee et al. 2012a.

Figura 5
Figura 5. A confirmação da radiação de entrega de imagem. CT com contraste de iodo pode melhorar a visualização do ROI se imagens normais CT não suffice. (A) Indivíduos rato recebeu iodo contrasta como anteriormente descrito (Painel de Lee et al. 2012). Imagens de tomografia computadorizada no plano coronal, horizontal e sagital são apresentados a partir da esquerda para a direita. (B) A confirmação da entrega de radiação no tecido pode ser detectado por imuno-histoquímica para γH2AX, um marcador de ADN quebras de cadeia dupla. γH2AX immunostaining mostra entrega feixe de radiação direcionada para a ZAP ROI no hipotálamo mediobasal ventral. γH2AX imunocoloração não é observada na zona subventricular dos ventrículos laterais (C), ou a zona subgranular do hipocampo (D), da mesma matéria rato. (BD) As seções são contrastado com DAPI (De Lee et al. 2012a). Clique aqui para ver maior figura .


Figura 6. Inibição focal de mim resultados neurogênese em alterações no peso e metabolismo. (A) A eminência mediana (ME) localizada no hipotálamo mediobasal ventral foi alvo de irradiação. O núcleo arqueado (CCCC) é a estrutura anatómica vizinha. Um mês após o tratamento, a porcentagem de neurônios BrdU + Hu de fraude contra grupos irradiados foram quantificados por imunohistoquímica no ME e CCCC. Níveis de ME neurogênese foram significativamente reduzidos em irradiado contra grupos sham (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Níveis de ARCN neurogênese não foram afetados (n = 3/cohort, ns = não significativo). (B) ração normal alimentado (NC) e (C) alto teor de gordura alimentado (DH) ratos foram examinados longitudinalmente para alterações no peso após irradiação ou simulada tratament (B, n = 12/cohort; C, n = 9/cohort). (DE) Um mês após o tratamento, irradiado e sham tratado camundongos HFD-alimentados foram examinadas por espectroscopia de ressonância magnética para análise quantitativa de% massa gorda e massa magra%. Ratinhos irradiados teve significativamente menos massa gorda% e significativamente mais% em massa magra do que os controlos sham (n = 5, * = p <0,05). Massa total: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (irradiado) 18,86 ± 0,4 g; massa magra: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (irradiados) de 13,9 ± 0,3 g; Fat massa: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( irradiados) de 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Irradiadas e com tratamento simulado ratos adultos foram colocados em um Sistema de Monitoramento Global Lab Animal (CLAMS) para medição simultânea da ingestão alimentar, atividade física e metabolismo do corpo inteiro de perfil de duas semanas após o tratamento. Após a aclimatação na câmara de teste, os ratinhos irradiados foram observados para ter significantly maior gasto de energia, a actividade total, e VO 2 (ml / kg / hr) em relação aos controlos simulados durante a parte escura do dia (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) Nenhuma diferença significativa foi observada na taxa de troca respiratória (RER) (n = 11, 12). A subfigura é gerada a partir dos dados anteriormente publicados em Lee et al. 2012a e Lee et al. 2012b. Subfiguras CI de Lee et al. 2012a. Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

Irradiação focal CT-guiada (CFIR) é uma abordagem nova e completa do sistema capaz de fornecer campos de radiação a alvos em pequenos animais sob controle robótico usando CT-orientação 32. A capacidade de CFIR para entregar vigas altamente concentrado para pequenos modelos animais proporciona novas oportunidades de pesquisa para colmatar pesquisas de laboratório e tradução clínica. Este artigo descreve a abordagem CFIR para entrega radiação preciso para atingir especificamente uma população progenitor neural hipotalâmica. Demonstramos aqui como calibrar e confirmar a entrega especificidade radiação via filme de raios-X e no tecido cerebral por imuno-histoquímica.

Além disso, mostramos como esta técnica pode ser utilizada para inibir a neurogénese em uma região específica do cérebro. Nós demonstramos que somos capazes de atingir o hipotálamo ventrobasal, e inibir a neurogênese na eminência mediana, sem alterar os níveis de neurogênese em estruturas adjacentes. Inibição de ME a neurogênese é acompanhada por alterações no metabolismo e atividade, bem como o ganho de peso reduzido em uma dieta rica em gordura em irradiado contra os grupos de tratamento sham (Figura 6) 2. Estes dados sugerem um papel para esses neurônios do hipotálamo nascido de adultos na regulação do metabolismo e da homeostase energética. Além disso, ele sugere que um excesso de dieta rica em gordura pode alterar os circuitos metabólica crítica mesmo na idade adulta 3. Nossos resultados representam uma importante expansão na função conhecida de neurônios nascido de adultos, e lança luz sobre uma nova população de células progenitoras neurais do hipotálamo 3. Ressalvas potenciais para esta aproximação é que a irradiação inibe a proliferação de células progenitoras em vez de neurogénese per se e, assim, também é possível que as alterações fisiológicas de pós-tratamento pode ser parcialmente explicada por rompimento de outra génese célula adulta. Passos futuros incluem o desenvolvimento de ferramentas genéticas para inibir a proliferação desta específico neural progenitor população, que proporcionará clareza substancial para o papel funcional destes progenitores e suas brincadeiras progênie na regulação da fisiologia 3.

Tomados em conjunto, no entanto, esta plataforma radiológica serve como um importante ponto de partida na realização de telas de médio rendimento em progenitores neurais e seus descendentes. Esta técnica radiológica não se limita a pesquisar questões nas neurociências, no entanto, e esperamos CFIR para expandir o avanço conceitual em uma série de disciplinas de pesquisa. A recente disponibilidade de comercialmente vendidos plataformas radiológicos CT-guiada oferece uma oportunidade para os pesquisadores de usar esses recursos desta plataforma para suas questões de pesquisa (Figura 1). Várias alternativas estão comercialmente disponíveis, que permitem realizar a irradiação dos animais pequenos guiada por imagem. Além disso, os sistemas de irradiação focal guiadas por TC também pode ser construído em casa, como foi o caso com o sistema utilizado para estes sSTUDOS da Johns Hopkins 29-33, 35.

Realizar este grau de segmentação focal requer calibração e segmentação da ROI adequado. Embora esta técnica irá inicialmente receber treinamento, a fim de se familiarizar com a plataforma CFIR e seu software dose de planejamento, operação do dispositivo é bastante fácil depois de compreender o protocolo e as capacidades da plataforma. Recomenda-se que as práticas de operação de calibrar o feixe de radiação várias vezes antes de executar experimento longitudinal em grande escala. Dito isto, uma vez fluente na operação de CFIR, estudos de investigação deve se mover rapidamente.

Este protocolo CFIR aqui descrita usa a orientação da imagem volumétrica tridimensional para a localização e orientação da dose. Dose de conformal minimiza a exposição a regiões do cérebro nontargeted e geometria do feixe de alta precisão permite a distribuição de dose conformado com limites feixe afiadas. Isto permite que se fazer perguntas regarding a função dos neurônios nascido de adultos, mas também abre as áreas de perguntas ao papel da proliferação celular em áreas como a fisiologia, a biologia do tumor, e imunologia. Este método pode ser expandido de várias maneiras com corantes de contraste e bioluminescência para melhorar a visualização 35, 56. Esforços estão em andamento para melhorar as capacidades de hardware CFIR mais, ea plataforma está sendo modificado para incluir um scanner on-board a tomografia por emissão de pósitrons 56. Estes irão facilitar a expansão das ferramentas disponíveis para pesquisadores e ajuda na tradução de descobertas no banco ao lado da cama.

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Disclosures

JW tem um financiamento e de consulta de pesquisa acordos com Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Agradecemos C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por Institutos Nacionais de Saúde dos EUA concessão F31 NS063550 (para DAL), um prêmio Basil O'Connor Iniciado Scholar e subvenções do Fundo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB é um WM Keck Distinguished Scholar Jovem em Pesquisa Médica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição
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Lee, D. A., Salvatierra, J.,… More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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