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Neuroscience

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

doi: 10.3791/50716 Published: November 14, 2013

Summary

La función de las neuronas de mamíferos adultos nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La radiación ionizante inhibe el nacimiento de nuevas neuronas. Usando el ordenador guiada por tomografía irradiación focal (CFIR), la orientación anatómica tridimensional de poblaciones específicas progenitoras neurales ahora se puede utilizar para evaluar el papel funcional de la neurogénesis adulta.

Abstract

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante. Enfoques para inhibir la neurogénesis adulta a través de la entrega viral invasivo o animales transgénicos tienen potenciales factores de confusión que hacen que la interpretación de los resultados de estos estudios sean difíciles. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno investigar de forma no invasiva la función de grupos selectos de las neuronas adultas nacidas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante focal inhibe el nacimiento y la diferenciación de neuronas nuevas, y permite la orientación de las regiones específicas progenitoras neurales. Con el fin de iluminar el papel funcional potencial que la neurogénesis adulta hipotálamo desempeña en la regulación de procesos fisiológicos, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas nacidas en la eminencia media del hipotálamo. Se describe un método para C omputer guiada por tomografíaf ocal ir radiación (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa y exacta orientación en pequeños animales. CFIR utiliza guía de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis de radiación, minimiza la exposición a la radiación de las regiones del cerebro no focalizados, y permite la distribución de la dosis de conformación de haz con límites afilados. Este protocolo permite a uno a preguntarse cuestiones relativas a la función de las neuronas adultos nacidos, sino que también abre las áreas a las preguntas en las áreas de la radiobiología, la biología del tumor, y la inmunología. Estas herramientas radiológicas facilitará la traslación de los descubrimientos en el laboratorio a la cabecera del paciente.

Introduction

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Descubrimientos recientes han demostrado que el cerebro adulto de mamíferos puede someterse a un notable grado de plasticidad. Neuronas adultas nacidas se generan durante la edad adulta en nichos especializados del cerebro de los mamíferos 1. ¿Cuál es la función de estas neuronas adultas nacidas? Y más aún, es lo que desempeñan un papel en la fisiología y el comportamiento? Los estudios sobre este tema se han centrado tradicionalmente en la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular del hipocampo, sin embargo, estudios recientes han caracterizado la neurogénesis en otras regiones del cerebro tales como el hipotálamo 2 de mamífero. La neurogénesis se ha informado en el posnatal y el hipotálamo adulto 2-10, y la función de estas neuronas hipotalámicas recién nacidos sigue siendo un área activa de investigación.

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante para el campo de la neurociencia en general. La inhibición selectiva de especificaciónific poblaciones progenitoras neurales sigue siendo limitada por la falta de marcadores moleculares disponibles que son exclusivos de las poblaciones progenitoras neuronales individuales 11. Por lo tanto, la eliminación selectiva de las neuronas adultas nacidas de estos progenitores neurales a través de modificación genética dirigida sigue siendo difícil. Del mismo modo, la entrega viral para apuntar neuronas adultos nacidos sufre de posibles variables de confusión tales como la introducción de la lesión y la inflamación en el medio ambiente 12.

Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno evitar estos factores de confusión e investigar estas preguntas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante inhibe el nacimiento y la diferenciación de nuevas neuronas, y permite que un método no invasivo para apuntar las poblaciones progenitoras neurales 13-15. Recientemente, hemos descrito una región germinal de la eminencia media del hipotálamo de los mamíferos (ME) que hemos llamado la zona proliferativa hipotalámico (HPZ) 2 2. Para probar si la neurogénesis adulta en el ME hipotálamo regula el metabolismo y el peso, se trató de interrumpir este proceso. La eminencia media es una pequeña estructura unilateral en la base del tercer ventrículo a partir del cual se liberan hormonas reguladoras. Con el fin de inhibir la proliferación y posterior neurogénesis sin alterar las otras funciones fisiológicas de esta región del cerebro, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas recién nacidos en la eminencia media del hipotálamo 2.

Un número de grupos han empleado la radiación para suprimir la neurogénesis en regiones canónicas 14-28. Sin embargo, los enfoques radiológicos anteriores generalmente se han centrado en grandes áreas, o often involuntariamente también dirigido múltiples áreas del cerebro donde se ha reportado la neurogénesis, por lo que es difícil asociar de forma inequívoca los defectos de comportamiento observados con defectos en poblaciones específicas progenitoras neurales. La capacidad de irradiación más específico es proporcionado por plataformas radiológicos que combinan omputer imagen guiada por tomografía con c f ocal radiación rayos IR (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa orientación 29-36. Rayos de la radiación tan pequeñas como de 0,5 mm de diámetro están disponibles para dirigirse a poblaciones progenitoras neurales específicas 35. Esta metodología nos permite apuntar el ME hipotálamo y detener la proliferación y el bloque de la neurogénesis en animales pequeños. Después del tratamiento radiológico en estas poblaciones progenitoras, pruebas fisiológicas y de comportamiento se pueden realizar para iluminar la función potencial de las células adultos nacidos. Focalización focal es especialmente importante para nuestra aplicación, ya que elglándula pituitaria está situada cerca de la eminencia media del hipotálamo; irradiación de la hipófisis puede afectar la función hormonal y posteriormente confundir los resultados.

La base biológica para la supresión de la neurogénesis después de la irradiación sigue siendo poco clara. Estudios de radiación previos se han basado en grandes vigas de la zona, y han llegado a la conclusión de que la supresión de la neurogénesis está mediada a través de una respuesta inflamatoria 14, 37. Como tal, no está claro si la irradiación altamente focal podría suprimir la neurogénesis, ya que no provoca una respuesta inflamatoria sustancial. Sin embargo, estudios recientes realizados por nuestro grupo de la región clásico neurogénica en el hipocampo han demostrado que la irradiación altamente focal con una dosis de 10 Gy puede suprimir la neurogénesis durante al menos 4 semanas después de la irradiación 35.

Para interrogar a la función de las neuronas hipotalámicas adultos nacidos en la eminencia media, se utiliza una radiación de precisión device capaz de entregar imágenes de TC en combinación con haces de radiación de pequeño diámetro para inhibir ME neurogénesis. El uso de un tubo de rayos X unido a un pórtico que gira sobre un rango de 360 °, ofrecemos arco de haz del haz de micro irradiación con el uso de una etapa espécimen controlado robóticamente que permite la rotación de un sujeto animal durante el tratamiento de radiación (Figura 1) . Un detector de rayos X de alta resolución se utiliza para adquirir imágenes cuando el pórtico se encuentra en la posición horizontal 33. Para este estudio, las imágenes de TC fueron reconstruidos con un tamaño de voxel isotrópico de 0,20 mm. De imágenes de a bordo CT permitió la identificación de un objetivo, mientras que el animal está en la posición de tratamiento. El objetivo fue localizado mediante el software de planificación de la dosis de navegación CT, que estaba incluido en nuestra plataforma radiológica disponible en el mercado. Después de la localización de nuestro ROI por la TC, el animal se mueve a la posición de tratamiento apropiado por la platina robótico que tiene cuatro gradosrees de libertad (X, Y, Z, θ). A través de una combinación de ángulos de pórtico y de la etapa de robot, las vigas pueden ser entregados desde casi cualquier dirección con respecto al animal, y tratamientos de arco estereotácticas son posibles 29. Para estos y todos los otros estudios de imágenes, los ratones fueron colocados en un dispositivo de inmovilización que permite el suministro de gas isoflurano anestésico mientras se restringe el movimiento. La cama inmovilización es compatible CT, y se conecta a la platina robótico 34.

Esperamos que CFIR proporcionará avances conceptuales en una serie de áreas de investigación. A pesar de que utiliza la orientación radiológica de la eminencia mediana del hipotálamo como prueba de principio de esta técnica, CFIR se puede utilizar para dirigirse a cualquier región del cuerpo de cualquier organismo modelo pequeño, en principio. En las neurociencias, por ejemplo, prevemos esta técnica podría utilizarse para evaluar la función de las poblaciones progenitoras activamente proliferativas que se ha sugerido que exist en otros órganos circumventricular, tales como el área postrema 38, 39, órgano subfornical 40, y la pituitaria 41. Controversias de larga data en cuanto al papel funcional de la neurogénesis adulta y la identificación de un papel causal en el comportamiento pueden ahora ser mejor atendidos. En cantante, esta técnica podría abordar el papel de la neurogénesis adulta en el mantenimiento de el comportamiento robusto y estacional de canto de los pájaros 42, que ha sido obstaculizado por la capacidad de inhibir selectivamente la neurogénesis en regiones específicas del cerebro. La comprensión de este modelo de comportamiento robusto podría arrojar nueva luz sobre el papel de la neurogénesis adulta en la regulación de otras conductas de dimorfismo sexual. Alternativamente, en el campo metabólico, CFIR podría ser utilizado para explorar aspectos de la función de la proliferación de hepatocitos y su papel en el metabolismo y el balance energético. La posibilidad de que avance conceptual en múltiples disciplinas de investigación se ve reforzada por la introducción de esta técnica.

43, 44. Por lo tanto, se generaliza este protocolo CFIR con los pasos necesarios para todas las plataformas de investigación en lugar de los que son específicos para SARRP. Las ventajas de CFIR más de los enfoques radiológicos anteriores para inhibir la neurogénesis son que esta técnica permite la orientación de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis, la dosis de conformación minimiza la exposición a regiones del cerebro no focalizados, y la geometría del haz de alta precisión permite una distribución de dosis conforme con límites haz afilados. Planteamos cómo utilizar imágenes guiada por TC para apuntar la dosis a una región anatómica específica, y al hacerlo, la forma de visualizar la radiaciónDistribución de la dosis directamente en el tejido mediante la tinción inmunohistoquímica para γ-H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de DNA 35, 45-48. El uso de este enfoque para la irradiación selectiva de nichos neurogénicos puede tener implicaciones significativas en cuanto a revelar el papel funcional de las nuevas neuronas adultas nacidas en la fisiología y la enfermedad.

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Protocol

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Uso de los Animales

Obtener la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el empleo institucional de los protocolos de atención y de uso estándar. El protocolo actual fue desarrollado para estudios de irradiación focales sobre 5.5-10 semanas de edad adultos ratones C57BL6 / J, como se describió previamente (Figura 2) 2. Sin embargo, otras edades y especies de pequeños animales (ratas, hamsters, ardillas de tierra, etc) también pueden utilizarse, siempre que los protocolos de anestesia efectiva y un atlas de referencia radiográficos que permiten la identificación de la región de interés (ROI) se encuentran disponibles.

1. Calibración de guiada por TC Plataforma Radiológica

Realice las calibraciones basadas en películas para la dosis de radiación en la plataforma radiológica de antemano para cada tamaño del colimador y el tipo de filtro del tubo de rayos X utilizada. Con el fin de dirigir un haz de arco de la irradiación en el lugar de destino deseado, utilice el software de planificación de la dosis de radiación 49 dise en la mayoría de las plataformas comerciales de radiación para calcular el tiempo de entrega requerido en base a la dosis de radiación, la profundidad de la región de interés (ROI) en base a las tomografías computarizadas del ratón, y la velocidad de rotación de la plataforma robótica; detalles sobre este se quedan fuera de este protocolo, ya que difieren entre las plataformas de radiación. A los efectos de visualizar el hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3) con imagen de CT, operar el tubo de rayos X con un punto focal 0,4 mm y la energía del haz de 100 kVp con 1 mm de Al filtración. Para la irradiación focal de la HPZ, operar el tubo de rayos X a 225 kVp, 13 mA, y un punto focal de 1 mm con la filtración de 0,15 mm de Cu, para entregar 10 Gy de radiación a una profundidad de tejido de 0,6 cm durante un tratamiento tiempo de 4,6 min. Targeting entre diferentes regiones de interés requerirá calcular diferentes parámetros.

  1. Si el estudio de los efectos de la dieta rica en grasas sobre la neurogénesis en la eminencia media a lo descrito previamente 2, obtener C57B hembra de cuatro semanas de edad,L6 / J ratones de laboratorios Jackson ratón, y las casas cuatro ratones por jaula. Desconecte la alimentación de pienso normal a una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Permitir a los ratones para aclimatarse a la nueva vivienda y alimentación. Realizar el tratamiento CFIR en 5,5 semanas de edad. Transporte somete a la sala de operación que contiene la plataforma radiológica. Minimizar los niveles de estrés durante la transferencia. Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. A continuación, agregue un solo ratón en la cámara. De forma paralela, preparar almohadilla eléctrica (baja temperatura) para el post-tratamiento.
  2. Una vez que el ratón está bajo y ya no responde a la compresión del pie-pad, llevar el tema a la plataforma radiológica y colocar sobre la cama inmovilización de la fase de robótica. Coloca la boca del sujeto dentro de la taza anestesia ojiva, y los dientes en el protector bucal (Figura 1D). Acuéstese ratón sobre la cama inmovilización y comprobar para ver si se sigue manteniendo la insensibilidad. Si es así, con cinta adhesiva del ratón a la cama con cinta de gasa. Mientras la grabación pulsado el ratón para la cama, Asegúrese de que la cabeza se nivela a un plano horizontal. Esto se puede determinar tirando hacia arriba de las orejas y viendo si se nivelan. Una vez que el ratón está en la posición correcta, cierre la pantalla protectora de plomo.
  3. Adquirir la exploración de tomografía computarizada utilizando el software de a bordo de la plataforma radiológica del experimentador (esto será diferente entre las plataformas), que proporcionará un análisis estructural anatómico tridimensional del sujeto ratón. Compruebe si la cabeza del ratón está nivelado con el plano horizontal. Si no, repita los pasos 1.2 a 1.3 hasta que se estabilizó la cabeza del sujeto.
  4. Identificar el ROI imagen CT. Calcular la distancia de retorno de la inversión a la superficie del cráneo con un ángulo de 45 ° con el plano horizontal como se muestra en la Figura 3E.
  5. El uso de software de a bordo, toma una placa de rayos X de la asignatura ratón desde arriba, como se muestra en la figura 4A. A continuación, retire el ratón desde la plataforma radiológica, se puso el cojín de la calefacción, y el monitor hasta que activa.
  6. De las imágenes de TC coronal, el cálculo de la profundidad media anatómica retorno de la inversión de por lo menos tres ratones para determinar la dosificación de entrega. Como un ejemplo de un estudio previo 2 que se administró 10 Gy de irradiación para el hipotálamo ventrobasal, la profundidad de la ROI desde el cráneo (a partir de un ángulo de 45 °) es 0,66 cm (véase la figura 3E). Sabiendo eso, los investigadores utilizaron el software de planificación de dosis (DPS) instalado en su plataforma radiológico para calcular la velocidad de rotación adecuado y la duración del tratamiento para conseguir la dosis deseada al ROI.
  7. Después de determinar la duración del tratamiento y la velocidad de rotación de la fase de robótica con el software de planificación de dosis, medir distribuciones de dosis de los parámetros calculados con películas sensibles a la radiación Gafchromic incrustados en un modelo de ratón maqueta de plástico-el equivalente en agua. Para ello, insertar tres películas Gafchromic sensibles a la radiación entre los cuatro bloques de plásticos equivalentes a agua apiladas verticalmente 29 comose muestra en la Figura 4B.
  8. Coloque modelo de ratón maqueta que contiene películas Gafchromic en el escenario robótico, y ejecutar el haz de irradiación focal con los parámetros recién calculados. Por ejemplo, para apuntar el hipotálamo ventrobasal, los parámetros de entrada de 0,15 mm de filtro de Cu, 225 kVp, 13 mA, ajuste de 1 mm de diámetro del haz de radiación, 45 ° ángulo de pórtico, 1,3 ° / seg rotación, y 4,6 min para lograr un retorno de la inversión dosis radiológica de 10 Gy.
  9. Después de la irradiación, compruebe las películas para el patrón y la intensidad de la dosis de radiación. Para una rotación de ángulo de 360 ​​° con los parámetros enumerados para apuntar el hipotálamo ventrobasal, un anillo oscuro en la película por encima del isocentro, un pequeño punto crujiente en la película isocentro, y un anillo más ligero en la película por debajo de la isocentro correspondiente al cono- administración de haz de la radiación se observó (Figura 4B).
  10. Superponer isocentro película Gafchromic largo de los rayos X de los sujetos ratón a los que los parámetros eran calcalculado. El punto focal irradiado en el isocentro debe superponerse con la región ROI deseada como se muestra en la Figura 4C.

Método alternativo: Si la dificultad en la selección de ROI cerebral persiste, utilice contraste yodado inyectado por vía intratecal para mejorar la visualización de los ventrículos bajo las imágenes de TC. En aras de la brevedad, este procedimiento se deja fuera de este protocolo, pero se describe previamente 35, 50. Contraste de yodo proporcionará hitos ventriculares adicionales (Figura 5A).

2. Determinar la exactitud de irradiación de haz

Confirmar aún más la precisión CFIR haz mediante visualización directa del haz de radiación en el tejido 2, 35, 51. Para ello, lleve a cabo la inmunohistoquímica para detectar γH2AX 51, una proteína histona y un marcador precoz de ADN de doble filamento se rompe. Sujetos Ratón deben transcardially perfundidos y fijados dentro de la hora de la irradiación. Después de la irradiaciónación, la reparación del ADN sobreviene rápidamente, y los niveles de ΥH2Ax disminuyen significativamente 35.

  1. Repita los pasos 1.1 a 1.3.
  2. Después de que el destino se identifica en la TC, el tema del ratón se mueve bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Parámetros calculados de entrada (velocidad de rotación y duración del tratamiento para lograr la dosis deseada) desde el paso 1.6 en el software de la dosis de planificación y comenzar el tratamiento. El tratamiento se suministra con el pórtico se refirió a 45 ° respecto a la vertical, mientras que el ratón hace girar alrededor de un eje orientado verticalmente.
  3. Después de la irradiación, lleve a cabo la perfusión transcardial sobre temas de ratón. Realizar la perfusión dentro de una hora 52. Después de cerebros de perfusión, fix inmersión en el 4% PFA / PBS y mueva suavemente la noche a 4 ° C.
  4. A la mañana siguiente, lavado de 5 min en PBS 3x para eliminar fijador paraformaldehído. Luego, sumerja en el 30% de sacarosa en PBS 1x en una mecedora a 4 ° C.
  5. Agite suavemente a 4 º C (usdualmente 12-16 h), hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo. Esto sirve como un paso crioprotección. Una vez que el cerebro se hunden, retire el cerebro con una cuchara perforada para evitar el exceso de 30% sucrose/1x transferencia PBS. Rápidamente incrustar en medio de congelación en hielo seco. Agitar medio de congelación con puntas de pipeta y alinear cerebral en moldes de plástico.
  6. Una vez completamente congelado, transferir bloques cerebrales a -20 ° C congelador para su almacenamiento.
  7. El día en que se llevará a cabo la inmunohistoquímica, sección coronal a 40 micras de espesor, y flotan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS con un pincel fino. Secciones deben mantenerse en orden serial correcto para inmunotinción para determinar la cobertura de la irradiación de la región de destino.
  8. Precalentar 0,01 M de solución de citrato de sodio a 80 ° C en baño de agua en preparación para la etapa de recuperación de antígeno. Al mismo tiempo, mientras que el citrato de sodio se está calentando, realice 5 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS.
  9. Una vez solución de citrato de sodio es a 80 ° C, se sumergen secciones de cerebro iN la solución tampón de citrato de sodio. Dejar en baño de agua a 80 ° C durante 1 hora.
  10. Retire la sección y permita que la solución de citrato de sodio alcance la temperatura ambiente, a continuación, realizar tres lavados de 5 minutos en 0,01 M de PBS.
  11. Bloquee las secciones del cerebro durante 1 hora en PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra.
  12. Incubar las secciones del cerebro durante la noche en PBS-Triton que contienen 5% de suero normal de cabra con 1:700 concentración de ratón anti-fosfo-H2AX anticuerpo primario a 4 º C.
  13. Al día siguiente, realizan 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón.
  14. Incubar las secciones del cerebro de PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra con la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo 488 nm a 1:500 concentración durante 2 horas.
  15. Efectuar 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón.
  16. Realizar 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) mancha (1:5.000 en PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. A continuación, lavar las secciones del cerebro durante 5 min con PBS.
  17. Montar en electrostáticamente chmicroscopio arged desliza por la sección flotante en PBS. Limpie el exceso de PBS y permitir que se sequen. Cubreobjetos las diapositivas utilizando medio de montaje y deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.
  18. Tome fotografías de secciones coronales de serie con microscopio de fluorescencia. ΥH2Ax inmunotinción (verde) indica el sitio de la irradiación. DAPI (azul) es un colorante nuclear (Figura 5B).

3. Preparación de Ratón Temas de irradiación focal

Examine los resultados de inmunotinción ΥH2Ax. Una vez satisfecho con la calibración y la orientación del haz de irradiación, proceder con el experimento. En este punto, el tiempo total requerido para el tratamiento de un ratón (de la configuración de los animales a la finalización de la entrega de haz) es de aproximadamente 10-15 minutos para un tratamiento de 10 Gy con un haz de 1 mm.

  1. Orden de cuatro semanas de edad, los ratones hembras C57BL6 / J de los laboratorios Jackson Ratón. Casa de cuatro ratones por jaula, y cambie la comida de pienso normala una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Ratones sacador del oído para darles marcas de identificación únicos. Monitorizar la salud de los ratones diariamente. Nota: marcadores metálicos no pueden ser utilizados, ya que darán lugar a rayas artefactos en la CT.
  2. Pesar los ratones el día antes de la radioterapia o la farsa. Los ratones se dividieron en dos grupos para la radiación o el tratamiento simulado y asegurar que no hay una diferencia significativa en el peso entre las cohortes. En el día del tratamiento, cuando los ratones tienen seis semanas de edad, pesar de nuevo todos los ratones y registrar su masa. Transportar suavemente ambas cohortes a la plataforma radiológica. Tenga cuidado para reducir al mínimo los niveles de estrés.
  3. Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. Anestesie dos ratones, uno en el grupo de irradiación predeterminado, y otro en el grupo de control simulado. Preparar almohadilla térmica en el nivel bajo para el tratamiento postoperatorio.
  4. Siga los pasos 1.2 a 1.4 para el mouse para recibir irradiación. Para el ratón farsa, mantenga el ratón en la cámara de anestesia mientras que el tratamiento continúa. Hacer sure que cámara de anestesia es cerca de la plataforma CFIR así cualquier efecto sobre la radiación ambiental son factores pulg Después de que el destino se identifica en la TC, mueva el ratón sujetos bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Entrada calcula parámetros (velocidad de rotación y duración del tratamiento) en el software de planificación de dosis.
  5. Una vez que el tratamiento de irradiación se ha completado, regrese ambos, farsa y ratones irradiados con almohadilla de calefacción, y monitorear hasta que se despiertan.
  6. Volver tanto farsa y ratones irradiados a las instalaciones de los animales. Supervise todos los días. Pesar los ratones cada media semana. Para confirmar la irradiación de la zona proliferativa específica hipotalámico, administrar inyecciones intraperitoneales de BrdU (50 mg / kg), tres días después del tratamiento y examinar la neurogénesis entre grupos por colabeling de inmunohistoquímica para BrdU y un marcador neuronal un mes después de la exposición inicial de BrdU (Figura 6) 2.

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Representative Results

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Evaluar Targeting guiada por TC y Precisión

La calibración mecánica del sistema es crítica para asegurar que los haces de todos los varios ángulos se cruzan en un solo punto. La calibración se lleva a cabo con un método basado en la formación de imágenes semiautomático, donde la precisión de alineación de extremo a extremo se ha medido para ser de 0,2 mm 29. Esta precisión es muy crítico como el volumen de la estructura de la eminencia mediana del hipotálamo es pequeña 2. Para probar esta calibración, medimos las distribuciones de dosis con películas sensibles a la radiación Gafchromic incrustados en un plástico maqueta model mouse-agua equivalente 35 (Figura 4B). En pocas palabras, se tomó una tomografía axial computarizada del sujeto ratón, y nuestro sitio diana hipotalámico ventrobasal fue identificado. Se calcularon de entrega y velocidad de rotación, y el colimador y filtración apropiadas se adjuntan para asegurar 10 Gy de radiación fue entregado. Una maqueta model ratón diseñado desde un equivalen agua entonces la estructura t plástico incrustados con películas sensibles a la radiación Gafchromic sustituido por el verdadero sujeto del ratón para medir la distribución de la dosis en diferentes planos focales. Figura 4B muestra los resultados de pruebas de extremo a extremo de un tratamiento por arco con el haz de 1 mm de diámetro utilizando películas Gafchromic en una plataforma maqueta del ratón. El pórtico se fijó en un ángulo de 45 ° con respecto al modelo de ratón simulacro mientras que la platina robótico se hace girar alrededor de un eje orientado verticalmente, la generación de un "arco" o cono de radiación. La anchura total a la mitad del máximo (FWHM) es 2,31 mm, que es mayor que 1,0 mm desde los arcos incidan sobre la película en un ángulo. Teóricamente el tamaño del haz en este ángulo debe ser 2,0 mm. El punto de haz focal se muestra en la Figura 4 demuestra la alineación de precisión de vigas de diferentes direcciones. Esta película puede ser superpuesta sobre la verdadera materia del ratón, lo que demuestra la posición del haz y de precisión (Figura 4C).

e_content "> El uso de un colimador de 1 mm de diámetro, se utilizó una técnica de arco para entregar 10 Gy en el punto de destino en nuestro tema del ratón. Las mediciones previas 29 indican que esta técnica proporciona dosis muy bajas de radiación (<0,1 Gy) fuera de la 1 mm objetivo. El área de la glándula pituitaria y las estructuras circundantes se por lo tanto debidamente protegidos de la irradiación focal del hipotálamo ventrobasal. La precisión de la focalización del haz se ha medido en los estudios previos que estar dentro de 0,2 mm, tanto en líneas de trazos pruebas de 29 y 35 secciones de tejido .

Aunque no es necesario, CT guiada por la orientación del ROI se puede mejorar mediante un contraste yodado inyectado intratecal para mejorar CT guiada de metas para nuestra aplicación cerebral (Figura 5). Como se trata de un procedimiento invasivo y engorroso, este contraste no se utiliza a menudo, y no se describe en este protocolo. Detalles para este protocolo se pueden encontrar en Ford et al. 2011 y Chaichana et al. 2007. Las ventajas de este contraste yodado son que los ventrículos lateral y tercero se visualizaron claramente en tomografías computarizadas adquiridos en una plataforma radiológica CFIR (Figura 5A). El objetivo era la eminencia media, en la base del tercer ventrículo, y se identificó utilizando software de navegación guiada por tomografía computarizada y automáticamente importados en la interfaz de posicionamiento del robot. Estructuras óseas del cráneo se identificaron y se utilizan como puntos de referencia anatómicos para estudios posteriores en los que no se empleó contraste yodado.

Viga Orientación Validación con γ-H2AX

Para confirmar aún más nuestra guiada por TC orientación del eje hipotálamo ME, visualizamos la irradiación con haz de 1 mm en el tejido por examen indirecta de roturas de la doble hebra de ADN que se presentan después de la irradiación. Proteína histona H2AX es fosforilada después de rupturas de doble hebra de ADN. γ-H2AX se ha utilizado ampliamente en el cerebro y otros tejidos 46 -48, y el número de γ-H2AX + focos parece que se correlaciona bien con la dosis de radiación en un amplio intervalo de dosis de 51, 53. Se observó una clara visualización del haz siguiente γ-H2AX inmunotinción (Figura 5B). Tinción γ-H2AX resultante mostró la orientación precisa de la ubicación prevista. El borde del haz era también muy fuerte, de acuerdo con las mediciones de la puesta en marcha de física basados ​​en películas que indican una penumbra 20-80% de los 0,3 mm 54. Se midió previamente la distancia entre el objetivo pretendido y el centro de la viga, como se visualiza en las secciones de tejido 35. El centro de la viga fue compensado desde el objetivo pretendido por una distancia media de 0,19 ± 0,36 mm (desviación estándar) en 10 ratones irradiados después de tener los efectos de la contracción del tejido durante la fijación y el procesamiento 35.

El uso de un tratamiento del arco estereotáctico similar que consiste en un arco de 45 º respecto de la vertical, quedemostramos que éramos capaces de dirigir con eficacia el hipotálamo ventrobasal, sin irradiar otros nichos neurogénicos (Figuras 5C-D). La irradiación de las áreas circundantes fue mínima, y había un límite en exposición a la radiación como se demuestra por la película de GAF-crómico (Figura 4B) y γ-H2AX inmunotinción (Figuras 5B-D). El tejido dorsal a la hipotalámico ME muestra la tinción γ-H2AX luz (Figura 5B), porque los haces de radiación entran a través de esta región y también posiblemente a causa de la mejora por el hueso que recubre a pesar de que un haz de rayos X relativamente duro se utilizó (225 kVp, 0,15 mm de filtración de Cu).

Efectos sobre la neurogénesis

Al confirmar la especificidad de nuestra entrega radiación guiada por tomografía computarizada, se analizó el efecto de 10 Gy de irradiación sobre los niveles de ME neurogénesis. Los ratones adultos fueron alimentados con una dieta alta en grasas, recibieron la radioterapia o la farsa, y, posteriormente,Inyecciones de BrdU como se describió previamente a partir de las 6 semanas de edad 2. Los ratones fueron sacrificados para su análisis a las 10 semanas de edad, un mes después de la primera inyección de BrdU. Ratones adultos HFD alimentados irradiados exhibieron ~ 85% de inhibición de la neurogénesis ME comparación con los controles tratados con placebo (Figura 6A) 2. El núcleo arqueado, una estructura adyacente que bordean el sitio de la irradiación, se examinó para los cambios en la neurogénesis, y se encontró que no hay diferencia estadísticamente significativa entre los animales irradiados y controles simulados (Figura 6A) 2.

Función de los nacidos en adultos Mediana Eminencia hipotalámico neuronas

Los cambios en los ratones irradiados y la falsa fueron examinados después del tratamiento. Abrigo y respuesta al tacto de piel de aspecto normal. Un panel de la química y el panel de conteo sanguíneo completo se examinó una semana después de tratamiento por irradiación, y no se observó diferencia significativa (n = 9/group). En alimentados con mucha grasaratones, donde se observó una reducción de ~ 85% en los adultos las neuronas nacidas en el ME de un mes tras la irradiación (Figura 6), los ratones irradiados había disminuido el aumento de peso con el tiempo en comparación con el grupo simulado tratado (Figura 6C). Por el contrario, la normalidad-chow alimentado ratones de control, donde los niveles observados de ME neurogénesis fueron significativamente más bajos que sus homólogos alimentados con alto contenido de grasa 2, no tuvo una diferencia estadísticamente significativa en el peso entre el simulacro contra grupos irradiados (figura 6B). Curiosamente, esta ganancia de peso reducida en alto contenido de grasa ratones alimentados irradiado se acompaña de cambios en el metabolismo y la actividad como se describe anteriormente en detalle por nuestro grupo 2 (Figuras 6D-I).

Figura 1
Figura 1. Computer irradiación focal guiada por tomografía (CFIR) plataforma. (A) CFIR utiliza un dispositivo de radiación de precisión capaz de entregar la radiación guiada por TC con viguetas. Un ejemplo de una plataforma CFIR es la plataforma de investigación de la radiación de pequeños animales (SARRP). Con blindaje de plomo (como se muestra), el SARRP asciende a 81 pulgadas (altura) por 58 pulgadas (ancho) por 41 pulgadas (profundidad) a 5.170 libras. (B) El uso de un tubo de rayos X de doble fuente adjunto a un pórtico que gira 360 °, la SARRP utiliza un robot controlar platina que permite la rotación de un animal sujeto durante todo el tratamiento de radiación. (C) CFIR de hardware se compone de una fuente de rayos X, colimador, pórtico, el apoyo de los animales, la rotación platina robótico, y reproductor de imágenes electrónica de rotación. (D) El sujeto del ratón se coloca en una cama de inmovilización con el aporte de anestesia de gas en la platina robótica. De Armadura et al. 2010. (E) de hardware CFIR debe incluir conos colimadores personalizables para ir focal administración de la radiación de diferentes tamaños. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2
Figura 2. Paradigma experimental. Ratones hembra C57BL / 6 fueron encargados a laboratorios ratón Jackson, y se aclimataron a las jaulas residentes a las cuatro semanas de edad. Ratón sujetos fueron cambiados a una dieta alta en grasas ad libitum a las cinco semanas de edad, y se dividió en dos grupos de tratamiento: las cohortes irradiados o simuladas. Evaluaciones fisiológicos fueron tomadas longitudinalmente antes y después del tratamiento. Irradiación o tratamientos simulados se administraron a 5,5 semanas. Inyecciones intraperitoneales de BrdU se les dio a las seis semanas de edad como se ha descrito anteriormente 2.

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Figura 3. Región de interés de localización. La zona proliferativa hipotalámico (HPZ), una región neurogénica situado en la eminencia media del hipotálamo, se encuentra en el hipotálamo mediobasal ventral. (A) La región HPZ de interés (ROI) se destaca por retículos rojos en un volumen atlas referencia 3D Nissl del Portal Allen Atlas del Cerebro de datos (posición: 7.041, 7.211, 5.564) (disponible en http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) sección del cerebro coronal del ROI en ratones diecinueve días de edad. Inmunohistoquímica BrdU (verde) revela que el retorno de la inversión (punta de flecha blanca) contiene células proliferativas. La densidad de las células proliferativas en la HPZ se limita a la anterior a la posterior del eje, con mayor densidad en -1,75 mm Bregma. Las secciones de tejido son contador-teñidas con DAPI marcador nuclear (azul). Figura de Lee et al. 2012a.(CE) CT-proyección de imagen en una plataforma CFIR permite la orientación del HPZ ROI (retículos rojos) por el suministro de radiación de haz de arco. CT-imagen de ratón sujeto en el plano horizontal (C), plano sagital (D), y plano coronal (E). (E) Distancia desde la superficie del cráneo para el retorno de la inversión es de 0,62 cm (línea roja). Las barras de escala = 1 mm (A), 50 m (B) y 0,62 cm (CE). Haz click aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
Figura 4. Calibración de la entrega de la irradiación. (A) X-ray de un sujeto de ratón obtenido en el dispositivo de inmovilización en el escenario robótico SARRP. (B) ROI calculado coordina unare de entrada y la dirigida contra un modelo de ratón de burla. El modelo phantom se compone de películas sensibles a la radiación Gafchromic incrustados en un plástico equivalente de agua. Películas encuentran por encima, a, y bajo el isocentro ROI detectan la distribución de la dosis. Un 45 ° de arco haz de radiación desde el SARRP ofrece una distribución de dosis en forma de cono para el retorno de la inversión, y converge en el isocentro (punto de penumbra). (C) La superposición de la dosimetría de película adquirida con 1 mm de haz de radiación en el espectro con una placa de rayos X de un verdadero sujeto de ratón (línea amarilla). Círculo blanco (flecha) indica la dosis de radiación de 10 Gy focal dirigida a HPZ. La línea punteada esboza cerebro. Panel de Lee et al. 2012a.

La figura 5
Figura 5. La confirmación de la radiación de entrega. Imágenes de TC con contraste de yodo puede mejorar la visualización del rendimiento de la inversión si la TC normal no hace suffice. (Un) Sujetos ratón recibió yodo contrasta como se ha descrito previamente (Grupo de Lee et al. 2012). Las imágenes de TC en el plano coronal, horizontal y sagital se muestran de izquierda a derecha. (B) Confirmación de la administración de la radiación en el tejido se puede detectar mediante técnicas de inmunohistoquímica para γH2AX, un marcador de roturas de la doble hebra de ADN. γH2AX inmunotinción muestra administración de haces de radiación dirigida a la HPZ ROI en el hipotálamo mediobasal ventral. γH2AX inmunotinción no se observa en la zona subventricular de los ventrículos laterales (C), o la zona subgranular del hipocampo (D) de la misma materia ratón. (BD) Las secciones se counterstained con DAPI (De Lee et al. 2012a). Haga clic aquí para ver más grande la figura .


Figura 6. Inhibición focal de ME resultados neurogénesis en alteraciones en el peso y el metabolismo. (A) La eminencia media (ME), ubicado en el hipotálamo mediobasal ventral fue blanco de la irradiación. El núcleo arqueado (ARCN) es la estructura anatómica vecina. Un mes después del tratamiento, el porcentaje de neuronas de BrdU + Hu De simulada frente cohortes irradiados se cuantificaron por inmunohistoquímica en el ME y ARCN. Los niveles de ME neurogénesis se redujeron significativamente en comparación con las cohortes irradiado simulada (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Niveles de ARCN neurogénesis no fueron afectados (n = 3/cohort, ns = no significativo). (B) alimentado con comida normal (NC) y (C) de alto contenido de grasa (HFD) alimentado ratones fueron examinados longitudinalmente por alteraciones en el peso después de la irradiación o tratamiento simulado tratament (B, n = 12/cohort; C, n = 9/cohort). (DE) Un mes después del tratamiento, y la falsa irradiada tratada ratones alimentados con HFD-fueron examinados por espectroscopia de resonancia magnética cuantitativa para el análisis de la masa grasa y la masa magra%%. Ratones irradiados tenían masa grasa significativamente inferior% y la masa significativamente más% magra que controles simulados (n = 5, * = p <0,05). Masa total: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (irradiados) 18,86 ± 0,4 g; masa magra: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (irradiados) 13,9 ± 0,3 g; masa grasa: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( irradiados) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Irradiado y tratamiento simulado ratones adultos fueron colocados en un sistema global de seguimiento Lab Animal (ALMEJAS) para medir simultáneamente el consumo de alimentos, la actividad física y metabolismo de todo el cuerpo perfilado de dos semanas después del tratamiento. Después de la aclimatación en la cámara de pruebas, se observó que los ratones irradiados tener SIgnificantly mayor gasto de energía, la actividad total y el VO 2 (ml / kg / h) en comparación con controles simulados durante la parte oscura del día (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) No se observaron diferencias significativas en la tasa de intercambio respiratorio (RER) (n = 11, 12). Subfigura A se genera a partir de los datos publicados previamente en Lee et al. 2012a y Lee et al. 2012b. Subfiguras CI de Lee et al. 2012a. Haz click aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

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La irradiación focal guiada por tomografía computarizada (CFIR) es un enfoque novedoso y completo sistema capaz de entregar los campos de radiación a los objetivos en pequeños animales bajo control robótico utilizando CT-guía 32. La capacidad de CFIR para que emita haces altamente enfocados a los pequeños modelos animales proporciona nuevas oportunidades de investigación para colmar la investigación de laboratorio y la traducción clínica. En este trabajo se describe el enfoque CFIR para la entrega precisa de radiación para dirigirse específicamente a una población de progenitores neuronales del hipotálamo. Estamos aquí demostrar cómo calibrar y confirmar la especificidad de administración de radiación a través de la película de rayos X y en el tejido cerebral mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Además, se muestra cómo esta técnica se puede utilizar para inhibir la neurogénesis en una región específica del cerebro. Demostramos que somos capaces de dirigir el hipotálamo ventrobasal, e inhiben la neurogénesis en la eminencia media, sin alterar los niveles de neurogénesis en las estructuras adyacentes. La inhibición de la ME neurogénesis se acompaña de cambios en el metabolismo y la actividad, así como la reducción de la ganancia de peso en una dieta alta en grasa en irradiado contra grupos de tratamiento simulado (Figura 6) 2. Estos datos sugieren un papel para estas neuronas hipotalámicas adultos nacidos en la regulación del metabolismo y la homeostasis energética. Por otra parte, sugiere que una dieta alta en grasas en exceso puede alterar los circuitos metabólica fundamental, incluso en la edad adulta 3. Nuestros resultados representan una importante expansión en la conocida función de las neuronas adultas nacidas, y arroja luz sobre una nueva población de progenitores neuronales del hipotálamo 3. Advertencias potenciales a este enfoque son que irradiación inhibe la proliferación de células progenitoras en lugar de la neurogénesis per se y por lo tanto también es posible que los cambios fisiológicos post-tratamiento puede ser parcialmente explicada por la interrupción de otras génesis célula adulta. Los pasos futuros incluirán el desarrollo de herramientas genéticas para inhibir la proliferación de esta específica progenitoras neurales población, que aportará claridad sustancial para el papel funcional de estos progenitores y su juego progenie en la regulación de la fisiología 3.

Tomados en conjunto, sin embargo, esta plataforma radiológica sirve como un punto de partida importante en la realización de pantallas de medio rendimiento en progenitores neurales y su progenie. Esta técnica radiológica no se limita a cuestiones de investigación en las neurociencias, sin embargo, y se espera CFIR para expandir el avance conceptual en una serie de disciplinas de investigación. La reciente disponibilidad de plataformas radiológicos guiadas-CT comercialmente vendidos-ofrece una oportunidad para que los investigadores utilicen estas capacidades de esta plataforma para sus preguntas de investigación (Figura 1). Varias alternativas disponibles en el mercado que permiten a uno realizar guiada por imagen pequeña irradiación animal. Además, los sistemas de irradiación focales guiadas-CT también se pueden construir en casa, como era el caso con el sistema utilizado para estos sos estudios de Johns Hopkins 29-33, 35.

La ejecución de este grado de focalización focal requiere calibración y orientación de la ROI adecuado. Aunque esta técnica inicialmente tomar el entrenamiento con el fin de familiarizarse con la plataforma CFIR y su software dosis de planificación, el funcionamiento del dispositivo es bastante fácil después de entender el protocolo y las capacidades de la plataforma. Se recomienda que las prácticas de los operadores de calibración del haz de radiación en varias ocasiones antes de ejecutar el experimento longitudinal a gran escala. Dicho esto, una vez que domine el funcionamiento de CFIR, estudios de investigación deben moverse rápidamente.

Este protocolo CFIR aquí descrito utiliza guía de imagen volumétrica en tres dimensiones para la localización y la orientación de la dosis. Dosis Conformal minimiza la exposición a las regiones del cerebro no focalizados, y la geometría del haz de alta precisión permite la distribución de la dosis conforme con los límites de haz afilados. Esto permite que uno haga preguntas regardiendo la función de las neuronas adultos nacidos, sino que también abre las áreas de preguntas a la función de la proliferación celular en áreas como la fisiología, la biología del tumor, y la inmunología. Este método se puede ampliar de varias maneras con colorantes de contraste y la bioluminiscencia para mejorar la visualización 35, 56. Se están realizando esfuerzos para mejorar las capacidades del hardware CFIR más allá, y la plataforma ahora se está modificando para incluir un escáner de tomografía por emisión de positrones a bordo 56. Estos facilitarán la expansión de las herramientas disponibles para los investigadores y la ayuda en la traducción de los descubrimientos en el banco al lado de la cama.

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Disclosures

JW tiene una financiación de la investigación y de consulta acuerdos con Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Damos las gracias a C. Montojo, J. Reyes y M. Armadura de asesoramiento y asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de subvención F31 NS063550 (a DAL), un premio Basil O'Connor arranque Académico y subvenciones del Fondo Klingenstein y NARSAD (a SB). SB es un WM Keck Distinguido Académico Joven en la investigación médica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

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Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición
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Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

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