Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Funktionell Förhör av Adult Hypothalamic neurogenes med Focal Radiological Hämning

Published: November 14, 2013 doi: 10.3791/50716
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4, 2,5
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Funktionen för vuxna födda nervceller däggdjurs förblir ett aktivt område för utredning. Joniserande strålning hämmar uppkomsten av nya nervceller. Med hjälp av datortomografi-guidad fokal bestrålning (CFIR), kan tredimensionella anatomiska inriktning på specifika neurala stamceller populationer nu användas för att bedöma den funktionella rollen av vuxen neurogenes.

Abstract

Den funktionella karakterisering av vuxna födda nervceller är fortfarande en stor utmaning. Metoder för att hämma vuxen neurogenes via invasiv viral leverans eller transgena djur har potentiella blandar ihop som gör tolkningen av resultaten från dessa studier är svårt. Nya radiologiska verktyg växer fram, men som tillåter en att icke-invasivt undersöka funktionen av utvalda grupper av vuxna födda nervceller genom noggrann och exakt anatomisk inriktning på små djur. Focal joniserande strålning hämmar födelsen och differentiering av nya nervceller, och tillåter inriktning av specifika neurala stamceller regioner. För att belysa den potentiella funktionella roll som vuxna hypotalamus neurogenes spelar i regleringen av fysiologiska processer, utvecklade vi en icke-invasiv samlingspunkt bestrålning teknik för att selektivt hämma uppkomsten av vuxna födda nervceller i hypotalamus median eminens. Vi beskriver en metod för C omputer tomografi styrdf OCAL ir strålning (CFIR) leverans för att möjliggöra exakt och noggrann anatomisk inriktning på små djur. CFIR använder tredimensionella volymetriska bildstyrning för lokalisering och inriktning av stråldosen, minimerar strålningsexponering för icke-målbestämd hjärnregioner, och möjliggör konforma dosfördelning med skarpa balk gränser. Detta protokoll gör att man kan ställa frågor om funktionen av vuxna födda nervceller, men också öppnar områden för frågor av radiobiologi, tumörbiologi och immunologi. Dessa radiologiska verktyg kommer att underlätta översättningen av upptäckter på bänken till sängkanten.

Introduction

Nya upptäckter har visat att den vuxna däggdjurshjärnan kan genomgå en anmärkningsvärd grad av plasticitet. Vuxna födda nervceller genereras under hela vuxenlivet i specialiserade nischer i däggdjurshjärnan 1. Vad är funktionen av dessa vuxna födda nervceller? Och mer så, de spelar en roll i fysiologi och beteende? Studier av detta ämne har traditionellt fokuserat på subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna och subgranular zonen i hippocampus, men har nya studier karaktäriseras neurogenes i andra hjärnregioner som däggdjur hypotalamus 2. Neurogenes har rapporterats i postnatal och vuxna hypotalamus 2-10, och funktionen av dessa nyfödda hypotalamus nervceller är fortfarande ett aktivt område för utredning.

Den funktionella karakterisering av vuxna födda nervceller fortfarande en betydande utmaning för neurovetenskap fältet i allmänhet. Selektiv hämning av specific neurala stamceller populationer fortfarande begränsad av bristen på tillgängliga molekylära markörer som är unika för enskilda neurala stamceller populationer 11. Således återstår svåra selektiv radering av vuxna födda nervceller från dessa neurala stamceller via genetisk inriktning. Likaså lider viralt leverans att rikta vuxna födda nervceller från potentiella störfaktorer såsom att införa skada och inflammation i miljön 12.

Nya radiologiska verktyg växer fram, men som tillåter en att kringgå dessa blandar ihop och utreda dessa frågor genom noggrann och exakt anatomisk inriktning på små djur. Joniserande strålning hämmar födelsen och differentiering av nya nervceller, och gör en icke-invasiv metod för att rikta neurala stamceller populationer 13-15. Nyligen beskrev vi en stilbildande region av däggdjur hypotalamus median eminence (ME) som vi kallas hypotalamus proliferativ zonen (HPZ) 2 2. För att testa om adult neurogenes i den hypotalamiska ME reglerar metabolismen och vikt, sökte vi att störa denna process. Den median eminens är en liten ensidig struktur vid basen av den tredje ventrikeln från vilken reglerande hormoner frigörs. För att förhindra spridning och efterföljande neurogenes utan att ändra de andra fysiologiska funktioner i denna hjärnregion, utvecklade vi en icke-invasiv samlingspunkt bestrålning teknik för att selektivt hämma uppkomsten av nyfödda vuxna nervceller i hypotalamus median eminens 2.

Ett antal grupper har använt strålning för att undertrycka neurogenes i kanoniska områdena 14-28. Däremot har tidigare radiologiska metoder generellt riktade stora områden, eller often oavsiktligt också riktade flera områden i hjärnan där neurogenes har rapporterats, vilket gör det svårt att entydigt knyta eventuella beteendemässiga brister som observerats med defekter i specifika neurala stamceller populationer. Möjligheten till mer riktad strålning ges av radiologiska plattformar som kombinerar c omputer tomografi styrd avbildning med f OCAL stråle ir strålning (CFIR) leverans för att möjliggöra noggrann anatomisk inriktning 29-36. Strålar så små som 0,5 mm i diameter finns att rikta specifika neurala stamceller populationer 35. Denna metod gör det möjligt för oss att rikta hypotalamus ME och arrestera spridning och blockera neurogenes i små djur. Efter radiologisk behandling på dessa progenitorceller populationer kan fysiologiska och beteendemässiga tester utföras för att belysa de potentiella funktion av vuxna födda celler. Focal inriktning är särskilt viktigt för vår ansökan eftersomhypofysen ligger nära hypothalamus median eminens, bestrålning av hypofysen kan påverka hormonfunktion och därefter förväxla resultat.

Den biologiska grunden för undertryckande av neurogenes efter bestrålning är fortfarande oklart. Tidigare studier strålning har förlitat sig på stora området balkar, och har dragit slutsatsen att undertryckandet av neurogenes förmedlas genom ett inflammatoriskt svar 14, 37. Som sådan är det oklart om mycket fokus bestrålning kunde dämpa neurogenes, eftersom den inte framkallar en betydande inflammatorisk reaktion. Men senare studier av vår grupp av den klassiska neurogen regionen i hippocampus visat att mycket fokus bestrålning med en dos av 10 Gy kan dämpa nybildning av nervceller i minst 4 veckor efter bestrålning 35.

Att förhöra funktionen av vuxna födda hypotalamus nervceller i median eminens, använder vi en precisionsstrålning dEvice kan leverera CT i kombination med strålar med liten diameter för att hämma MIG neurogenes. Med användning av ett röntgenrör fäst vid en gantry som roterar över ett område av 360 °, levererar vi arc-beam mikro bestrålning stråle med användning av en robot styrd prov stadium som tillåter rotation hos en djurpatient under strålningsbehandling (figur 1) . En röntgendetektor med hög upplösning användes för att förvärva bilder när gantry är i horisontellt läge 33. För denna studie var CT-bilder rekonstrueras med en isotrop voxelstorlek av 0,20 mm. Ombord CT medgav identifiering av ett mål under det att djuret är i behandlingsposition. Målet lokaliserades med hjälp av CT-navigering dos-planering programvara, som ingick i vår kommersiellt tillgänglig radiologiska plattform. Efter att lokalisera vår ROI med CT, var djuret flyttas till lämplig behandling läge av robot provet scenen som har fyra graderrees frihets (X, Y, Z, θ). Genom en kombination av portal och robotscenvinklar, kan balkar levereras från nästan alla håll i förhållande till djuret, och stereotaktiska båge-liknande behandlingar är möjliga 29. För dessa och alla andra som avbildar studier, mössen placeras i en immobilisering enhet som tillåter leverans av bedövningsmedel isofluran gas samtidigt begränsa rörelse. Immobilisering sängen är CT-kompatibel, och ansluter till robotprovet stadiet 34.

Vi förväntar oss att CFIR ger konceptuella framsteg inom ett antal forskningsområden. Även om vi använder radiologisk inriktning av hypotalamus median eminens som bevis på principen för denna teknik, kan CFIR användas för att rikta varje region i kroppen av alla små modellorganism i princip. I neurosciencesna exempelvis föreställer vi denna teknik skulle kunna användas för att utvärdera funktionen av aktivt proliferativa gångarpopulationer som har föreslagits för att exist på andra circumventricular organ, såsom området postrema 38, 39, subfornikala organet 40, och hypofysen 41. Mångåriga kontroverser kring den funktionella rollen av vuxen neurogenes och identifiera en kausal roll i beteende kan också nu att hanteras bättre. I song kan denna teknik upp den roll vuxen neurogenes i att upprätthålla den robusta och säsongs beteende fågelsång 42, som har hindrats av förmågan att selektivt inhibera neurogenes i specifika hjärnregioner. Att förstå denna robusta beteendemodellen kan kasta nytt insikt i den roll som vuxen neurogenes i regleringen av andra sexuellt dimorfa beteenden. Alternativt kan i den metaboliska fältet CFIR skulle kunna användas för att undersöka aspekter av rollen av hepatocytproliferation och dess roll i metabolism och energibalans. Möjligheten för konceptuella framsteg inom flera forskningsdiscipliner förstärks genom införandet av denna teknik.

43, 44. Därför generalisera vi denna CFIR protokoll med åtgärder som krävs för alla forskningsplattformar snarare än specifika för SARRP. Fördelarna med CFIR över tidigare radiologiska metoder för att hämma neurogenes är att denna teknik möjliggör tredimensionella volymetriska bildstyrning för lokalisering och inriktning av dosen, minimerar konform dos exponering för icke-målbestämd hjärnregioner, och hög precision beam geometri möjliggör konform dosfördelning med skarpa balk gränser. Vi beskriva hur man använder CT-guidad imaging att rikta dosen till en specifik anatomisk region, och på så sätt hur man kan visualisera strålningdosera fördelning direkt i vävnad med hjälp av immunhistokemisk färgning för γ-H2AX, en markör för DNA-dubbelsträngade avbrott 35, 45-48. Användningen av denna metod för selektiv bestrålning av neurogena nischer kan få betydande konsekvenser i att avslöja den funktionella rollen av nya vuxna födda nervceller om fysiologi och sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal Usage

Erhålla godkännande från institutionella Animal Care och användning kommittén för standardvård och använda protokollen. Det nuvarande protokollet var utvecklad för fokala bestrålningsstudier på 5,5 till 10 veckor gamla vuxna C57BL6 / J-möss, såsom beskrivits tidigare (figur 2) 2. Men andra åldrar och små djurarter (råtta, hamstrar, slipade ekorrar, etc.) kan också användas, förutsatt att effektiva anestesiprotokoll och en radiografiska referensatlas som möjliggör identifiering av regionen av intresse (ROI) är tillgängliga.

1. Kalibrering av CT-guidad Radiological Platform

Utför filmbaserade kalibreringar för stråldos på den radiologiska plattform i förväg för varje kollimator storlek och typ av röntgenröret filter som används. För att rikta en båge stråle av strålning vid den önskade målplatsen, använd stråldos-planering programvara 49 available på de flesta kommersiella strålnings plattformar för att beräkna erforderlig leveranstid baserat på stråldosen, djupet av regionen av intresse (ROI) baserat på datortomografi av musen, och rotationshastigheten hos robotplattform, är information om detta lämnas ut i detta protokoll som de skiljer mellan strålnings plattformar. I syfte att visualisera ventrobasal hypotalamus 2 (Figur 3) med CT, driva röntgenrör med en 0,4-mm brännvidd plats och strålenergi på 100 kVp med 1 mm Al filtrering. För bränn bestrålning av HPZ, manövrera röntgenröret vid 225 kVp, 13 mA, och en 1-mm fokal fläck med filtrering av 0,15 mm Cu, för att leverera 10 Gy av strålning vid en vävnad djup av 0,6 cm över en behandling tid av 4,6 min. Inriktning mellan olika ROI kommer att kräva att beräkna olika parametrar.

  1. Om att studera effekterna av fettrik kost på neurogenes i median eminens som tidigare beskrivits 2, få fyra veckor gamla kvinnliga C57BL6 / J möss från Jackson Mus laboratorier och hus fyra möss per bur. Växla mat från normal chow till en fettrik kost på fem veckor gamla. Låt möss för att anpassa sig till nya bostäder och mat. Utför CFIR behandling på 5,5 veckor gamla. Transport utsätter driften rummet som innehåller den radiologiska plattformen. Minimera stress under överföringen. Förbered isofluran gas anestesi kammare. Lägg sedan till en enda mus i kammaren. Parallellt framställa värmedyna (låg inställning) för efterbehandling.
  2. När musen är i och inte längre svarar på mul-pad kompression, föra ärendet till den radiologiska plattformen och placera på immobilisering sängen av robot scenen. Placera föremål mun in i noskonen anestesi cup, och tänderna i bettet skyddet (figur 1D). Lägg musen platt på immobilisering sängen och kolla om det fortsätter att upprätthålla inga reaktioner. Om så är fallet, tejpa ner musen till sängen med gasbinda tejp. Medan tejpa ner musen till sängen, Se till att huvudet är utjämnas till ett horisontellt plan. Detta kan bestämmas genom att dra upp öronen och se om de har kompenserats. När musen är i rätt läge, stänger ledningen skyddande sköld.
  3. Skaffa dator-tomografi skanning med ombord programvara av försöksledaren s radiologisk plattform (detta kommer att skilja sig åt mellan olika plattformar), som kommer att ge en tredimensionell anatomisk strukturell genomsökning av mus ämne. Kontrollera för att se om musen huvud utjämnas mot horisontalplanet. Om inte, upprepa steg från 1,2 till 1,3 tills motivet huvud är planat.
  4. Identifiera ROI av CT-bild. Beräkna avståndet från ROI på ytan av skallen med hjälp av en 45 ° vinkel mot horisontalplanet enligt figur 3E.
  5. Med användning ombord programvara, ta en röntgenbild av musen ämne från ovan såsom visas i fig. 4A. Ta sedan bort musen från den radiologiska plattform, sätta på värmedyna, och övervaka dess aktiva.
  6. Från de koronala CT-bilder, beräkna medel ROI anatomisk djup av åtminstone tre möss för att bestämma leverans dosering. Som ett exempel från en tidigare studie 2 där 10 Gy av bestrålning administrerades till ventrobasal hypotalamus, är djupet på ROI från skallen (från en 45 ° vinkel) 0,66 cm (Se figur 3E). Att veta att forskarna använde dosplanering programvara (DPS) installerat på sin radiologiska plattform för att beräkna lämplig rotationshastighet och längd av behandling för att uppnå önskad dos till ROI.
  7. Efter bestämning behandlingstiden och rotationshastighet robot scenen med den dos-planering programvara, mäta dos fördelningar av de beräknade parametrarna med GAFchromic strålningskänsliga filmerna inbäddade i ett vatten-ekvivalent plast mock-musmodell. För att göra detta, bädda tre GAFchromic strålningskänsliga filmer mellan fyra vertikalt staplade vatten motsvarande plast block 29 somvisas i figur 4B.
  8. Placera mock musmodell som innehåller GAFchromic filmer på robot scenen, och kör i fokus bestrålning balken med de nyligen beräknade parametrarna. Till exempel, för att rikta ventrobasal hypotalamus, inmatning parametrarna för 0,15 mm Cu-filter, 225 kVp, 13 mA, 1-mm strålning diameter stråle inställning 45 ° gantry vinkel, 1,3 ° / sek rotation och 4,6 min för att uppnå en ROI radiologisk dos av 10 Gy.
  9. Efter bestrålning, kolla filmer för mönster och intensitet strålningsdos. För en 360 ° vinkel rotation med de parametrar som anges för att rikta ventrobasal hypotalamus, en mörk ring i filmen ovanför isocentret, en liten skarp fläck på isocentret filmen, och en ljusare ring i filmen nedan isocentret motsvarar kon- balk administration av bestrålningen kommer att observeras (Figur 4B).
  10. Lagra isocenter GAFchromic film över röntgen av mus ämnen från vilka parametrar var calnade. Den bestrålade brännpunkt vid isocentrum bör överlappa med den önskade ROI region som visas i figur 4C.

Alternativ metod: Om svårigheter att rikta hjärn ROI kvarstår använder jod kontrast injiceras intratekalt att förbättra visualisering av ventriklarna i CT-bilder. För enkelhetens skull, är detta förfarande lämnas utanför protokollet, men har tidigare beskrivits 35, 50. Jod kontrast kommer att ge ytterligare landmärken ventrikulära (Figur 5A).

2. Bestämma Noggrannhet för bestrålning Beam

Vidare bekräftar CFIR balk noggrannheten genom direkt visualisering av strålknippet i vävnad 2, 35, 51. För att göra detta, utföra immunohistokemi för att upptäcka γH2AX 51, en ​​histon protein och en tidig markör för DNA-dubbelsträngbrott. Mus ämnen måste transcardially perfusion och fastställas inom en timme efter bestrålning. Efter irradiation, DNA-reparation snabbt inträder, och nivåer av ΥH2Ax minska avsevärt 35.

  1. Upprepa steg från 1,1 till 1,3.
  2. Efter målet identifieras på CT, är musen ämne flyttas under robotstyrning att anpassa målet med strålningen leveranstrålen. Input beräknade parametrar (rotationshastighet och längd på behandling för att uppnå önskad dos) från steg 1.6 i dos-planering programvara och påbörja behandling. Behandling levereras med gantry pekade på 45 ° från vertikallinjen, medan musen roterar kring en vertikalt orienterad axel.
  3. Efter bestrålning, utföra transcardial perfusion på mus ämnen. Utför perfusion inom en timme 52. Efter perfusion, nedsänkning fix hjärnor i 4% PFA / PBS och försiktigt rocka natten vid 4 ° C.
  4. Följande morgon, tvätta 5 min i PBS 3x för att ta bort paraformaldehyd fixativ. Sedan, sänk ned i 30% sackaros i 1 x PBS på en rocker vid 4 ° C.
  5. Skaka försiktigt vid 4 ° C (ossellt 12-16 h), tills hjärnan sjunker till botten av röret. Detta fungerar som ett kryoskydd steg. När hjärnor sjunka, ta bort hjärnan med en perforerad sked för att förhindra överskott av 30% sucrose/1x PBS överföring. Snabbt bädda in i frysmedium på torris. Snurra frysmedium med pipettspetsen och rikta in hjärnan i plastform.
  6. En gång helt fryst, överföra hjärnblock till -20 ° C frys för förvaring.
  7. Dagen då immunhistokemi utförs avsnitt koronalt vid 40 | im tjocklek, och flyta in i en 24-brunnsplatta innehållande PBS med en tunn pensel. Avsnitten bör förvaras i rätt serienummer för att immunfärgning att avgöra bestrålning täckning av målområde.
  8. Förvärm 0,01 M natriumcitrat-lösning till 80 ° C i vattenbad i förberedelsen för antigenåtervinning steg. Samtidigt, medan natriumcitrat värmer, utför 5 min tvättar 3x i 0,01 M PBS.
  9. När natriumcitratlösning är vid 80 ° C, översvämmas hjärnsektioner in natrium citrat-buffertlösning. Lämna i vattenbad vid 80 ° C under 1 timme.
  10. Ta bort avsnitt och låta natriumcitratlösning nå rumstemperatur, sedan utföra tre 5-minuters tvättar i 0,01 M PBS.
  11. Blockera hjärnsektioner under 1 timme i PBS-Triton innehållande 5% normalt getserum.
  12. Inkubera hjärnsektioner över natt i PBS-Triton innehållande 5% normalt getserum med 1:700 koncentrationen av mus-anti-fosfo-H2AX primära antikroppen vid 4 ° C.
  13. Nästa dag, utför 15 min tvättar 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  14. Inkubera hjärnsektioner PBS-Triton innehållande 5% normalt getserum med get-anti-mus sekundär antikropp konjugerad med 488 nm fluorphore vid 1:500 koncentration under 2 timmar.
  15. Utför 15 min tvättar 3x i 0,01 M PBS-Triton.
  16. Utför 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) Fläck (1:5000 i PBS) under 10 min för att visualisera kärnan. Därefter tvättar hjärnsektioner under 5 min med PBS.
  17. Montera på elektro charged objektglas av flytsektionen i PBS. Torka bort överflödigt PBS och låt objektglasen torka. Täckglas bilderna med hjälp av monteringsmedium och låta bilderna torka i mörker vid rumstemperatur över natten.
  18. Ta bilder av serie koronala sektioner med fluorescensmikroskop. ΥH2Ax immunfärgning (grön) visar platsen för bestrålning. DAPI (blå) är en nukleär fläck (Figur 5B).

3. Beredning av Mouse ämnen för Focal bestrålning

Undersök ΥH2Ax immunfärgning resultat. När nöjd med kalibreringen och inriktning av strålningsstråle, fortsätta med experimentet. Vid denna punkt, den totala tid som krävs för att behandla en mus (från djurformat till fullbordandet av strålen leverans) är ungefär 10 till 15 min för en 10-Gy behandling med en 1 mm-stråle.

  1. Beställ fyra veckor gamla C57BL6 / J honmöss från Jackson Mouse laboratorier. Hus fyra möss per bur, och byta mat från normal chowtill en fettrik kost på fem veckor gamla. Öron punch möss för att ge dem unika identifieringsmärken. Övervaka hälsa möss dagligen. Anm: metalliska markörer kan inte användas, eftersom de kommer att resultera i strimmor artefakter på CT.
  2. Väg möss dagen före strålning eller simulerad behandling. Split möss i två kohorter för strålning eller simulerad behandling och se till att det inte finns någon signifikant skillnad i vikt mellan kohorter. På dagen för behandling, när möss är sex veckor gamla, väg på nytt alla möss och registrera deras massa. Transportera försiktigt båda kohorterna till den radiologiska plattformen. Var noga med att minimera stress.
  3. Förbered isofluran gas anestesi kammare. Bedöva två möss, en i den förutbestämda bestrålning grupp, och en annan i simulerad kontrollgrupp. Förbered värmedyna inställd på låg inställning för postoperativ behandling.
  4. Följ steg 1,2-1,4 för musen för att ta emot strålning. För bluff musen, håll musen i anestesi kammare medan behandlingen pågår. Gör sure som anestesi kammare är nära CFIR plattformen så några effekter på omgivande strålning vägas in Efter målet identifieras på CT, flytta musen fråga som robotstyrning att anpassa målet med strålningen leveranstrålen. Ingång beräknade parametrar (rotationshastighet och längd av behandling) i dos-planering programvara.
  5. När strålningsbehandling är klar, återvänder både bluff och bestrålade möss till värmedyna, och bevaka tills de vaknar.
  6. Avkastningen både bluff och bestrålade möss till djuranläggning. Övervaka varje dag. Väg mössen varje halv vecka. För att bekräfta bestrålning av riktade hypotalamus proliferativ zon, administrera injektion i bukhålan BrdU (50 mg / kg) tre dagar efter behandling och undersöka neurogenes mellan grupper genom colabeling av immunohistokemi för BrdU och en neuronal markör en månad efter initial BrdU exponering (Figur 6) 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bedöma CT-guidad inriktning och Noggrannhet

Den mekaniska kalibrering av systemet är kritisk för att säkerställa att strålarna från olika vinklar alla skär varandra i en enda punkt. Kalibrering utfördes med en halvautomatisk imaging-baserad metod, där end-to-end inriktningsnoggrannhet har uppmätts till 0,2 mm 29. Denna noggrannhet är mycket kritisk eftersom volymen av hypotalamus median eminens struktur är liten 2. För att testa denna kalibrering, mätte vi dosen med GAFchromic strålningskänsliga filmer som är inbäddade i ett med vatten ekvivalent plast mock-musmodell 35 (Figur 4B). I korthet var en CT-scan av musen ämnet tas, och vår ventrobasal hypotalamus målplatsen identifierades. Leverans-och rotationshastighet beräknades, och lämplig kollimator och filtrering fästes för att se till 10 Gy av utstrålning levererades. En mock-musmodell designad från en vatten-equivalen t plaststruktur inbäddad med GAFchromic strålningskänsliga filmer ades sedan i stället för det verkliga mus motivet som ska mätas dosfördelning vid olika fokalplan. Figur 4B visar end-to-end-testresultat från en båge behandling med strålen 1 mm diameter med användning av GAFchromic filmer i en mock-mus-plattform. Traversen sattes till en 45 ° vinkel med avseende på den mock musmodell medan robotpreparat skede roterades kring en vertikalt orienterad axel, generera en "båge" eller kon av strålning. Den full bredd vid halva maximala (FWHM) är 2,31 mm, vilket är större än 1,0 mm eftersom bågarna inkräkta på filmen i en vinkel. Teoretiskt strålstorleken vid denna vinkel bör vara 2,0 mm. Bränn strålpunkt som visas i figur 4 demonstrerar precisions inriktning av strålar från olika riktningar. Denna film kan överlagras på toppen av den verkliga mus ämne, vilket demonstrerar strålpositionen och precision (figur 4C).

e_content "> Med hjälp av en 1 mm stråldiameter kollimator, en båge teknik användes för att leverera 10 Gy till målpunkten i vår mus ämne. Tidigare mätningar 29 indikerar att denna teknik ger mycket låga doser av strålning (<0,1 Gy) utanför 1 mm mål. Området hypofysen och omgivande strukturer är därför effektivt avskärmad från fokal bestrålning av ventrobasal hypotalamus. Noggrannheten av balken målinriktning har uppmätts i tidigare studier att vara inom 0,2 mm i både fantom testar 29 och vävnadssnitt 35 .

Även om det inte behövs, CT-guidad inriktning på ROI kan förbättras genom en injicerad intratekal jod kontrast för att förbättra CT-guidad inriktning för vår hjärna applikation (Figur 5A). Eftersom detta är en invasiv och omständligt förfarande, är denna skillnad inte används ofta, och som inte beskrivs i detta protokoll. Detaljer om detta protokoll finns i Ford et al. 2011 och al. Chaichana et 2007. Fördelarna med denna joderade kontrastmedel är att de laterala och tredje kamrarna är tydligt visualiseras i CT-scanning som förvärvats på ett CFIR radiologisk plattform (figur 5A). Målet var medianen eminens, vid basen av den tredje ventrikeln, och identifierades med hjälp av CT-guidad navigeringsprogram och importeras till robotpositionering gränssnittet automatiskt. Beniga kraniella strukturer identifierades och användes som anatomiska landmärken för senare studier där jod kontrast inte var anställd.

Beam Inriktning Validering med γ-H2AX

För att ytterligare bekräfta vår CT-guided targeting av hypotalamus ME, visualiserade vi 1-mm bestrålning stråle i vävnad genom indirekt undersökning av dubbelsträngade DNA-brott som uppstår efter bestrålning. H2AX histon protein fosforyleras efter DNA dubbel-strängbrott. γ-H2AX har brett använts i hjärna och andra vävnader 46 -48 och antalet av γ-H2AX + foci tycks korrelera väl med strålningsdos inom ett brett intervall av doser 51, 53. Vi observerade tydlig visualisering av strålen efter γ-H2AX immunfärgning (figur 5B). Resulte γ-H2AX färgning visade exakt inriktning av den förväntade platsen. Balken kanten var också mycket skarp, i överenskommelse med filmbaserade fysik driftsättning mätningar som visar på en 20-80% halvskugga av 0,3 mm 54. Vi mätte tidigare avståndet mellan det avsedda målet och centrum av strålen som visualiseras i vävnadssektionerna 35. I mitten av balken uppvägdes av det avsedda målet med ett medelavstånd på 0,19 ± 0,36 mm (standardavvikelse) på 10 bestrålade möss efter facto för effekter av vävnads krympning under fixering och bearbetning 35.

Med hjälp av en stereotaktisk liknande båge behandling bestående av en båge på 45 ° från vertikallinjen, vivisar vi kunde effektivt rikta den ventrobasal hypotalamus, utan att bestråla andra neurogena nischer (figur 5C-D). Bestrålning av omgivande områden var minimal, och det fanns en gräns på strålningsexponeringen vilket framgår av GAF-kromfilm (Figur 4B) och γ-H2AX immunfärgning (figur 5B-D). Vävnaden dorsala till hypotalamus ME visar ljus γ-H2AX färgning (figur 5B) på grund av att strålarna som kommer in genom denna region och eventuellt också på grund av förbättringen av det överliggande benet, även om en relativt hård röntgenstråle användes (225 kVp, 0,15 mm Cu filtrering).

Effekter på neurogenes

Vid bekräftar specificiteten hos vår CT-guidad bestrålning leverans, undersökte vi effekten av 10 Gy av bestrålning på nivåer av ME neurogenesis. Vuxna möss matades med en diet med hög fetthalt mottog strålning eller skenbehandling, och därefterBrdU injektioner som tidigare beskrivits som börjar vid 6 veckor gamla 2. Möss offrades för undersökning vid 10 veckor, en månad efter den första BrdU injektionen. Bestrålade HFD-fed vuxna möss uppvisade ~ 85% hämning av ME neurogenes jämfört med placebo-behandlade kontroller (Figur 6A) 2. Den bågformade kärnan, en intilliggande struktur gränsar bestrålningen platsen undersöktes var för förändringar i neurogenes, och visade sig ha ingen statistiskt signifikant skillnad mellan de bestrålade djuren och skenkontroller (figur 6A) 2.

Funktion av vuxna födda Median Eminence Hypothalamic Nervceller

Förändringar i bestrålade och bluff möss undersöktes efter behandling. Päls och svar röra verkade normalt. En kemipanel och fullständig blodstatus panel undersöktes en vecka efter strålbehandling, och ingen signifikant skillnad observerades (n = 9/group). I fettrik matademöss, där vi observerat en minskning av vuxna födda ME neuroner ~ 85% en månad efter bestrålning (Figur 6A), hade bestrålade möss minskade viktökningen över tiden jämfört med den skenbehandlade gruppen (figur 6C). Däremot normal-chow matade kontrollmöss, där observerade halter av MIG neurogenes var betydligt lägre än deras fettrik matade motsvarigheter 2, hade inte en statistiskt signifikant skillnad i vikt mellan bluff mot bestrålade grupper (Figur 6B). Intressant nog är detta minskad viktökning hos bestrålat fettrik matade möss som åtföljs av förändringar i ämnesomsättningen och aktivitet som tidigare beskrivits i detalj av vår grupp 2 (figur 6D-I).

Figur 1
Figur 1. Datortomografi styrd fokus bestrålning (CFIR) plattform. (A) CFIR använder en precisionsstrålning enhet kan leverera CT-guidad bestrålning med små strålar. Ett exempel på en CFIR plattform är litet djur strålning forskningsplattform (SARRP). Med bly avskärmning (enligt bilden), står SARRP på 81 inches (höjd) med 58 inches (bredd) med 41 inches (djup) vid 5,170 pounds. (B) Med användning av en dubbel källa röntgenröret fäst vid en gantry som roterar 360 °, använder SARRP en robotically styra provet stadium som tillåter rotation hos en djurpatient över hela strålningsbehandling. (C) CFIR hårdvaran består av en röntgenstrålekälla, kollimator, roterande gantry, djur-stöd, roterande robotic preparatfasen och elektronisk imager. (D) Musen ämne placeras i en immobilisering säng med gas anestesi ingång på robot provet scenen. Från Armour et al. 2010. (E) CFIR hårdvara bör omfatta anpassnings kollimerande koner för fokal ir strålning leverans av olika storlek. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Experimentell paradigm. Kvinna C57BL / 6 möss beställdes från Jackson mus laboratorier, och acklimatiserad till bosatta burar på fyra veckor gammal. Mus ämne var bytt till en ad libitum fettrik kost vid fem veckors ålder, och delas upp i två behandlingsgrupper: de bestrålade eller sken årskullar. Fysiologiska bedömningar togs längdled före och efter behandling. Bestrålning eller simulerade behandlingar administrerades på 5.5 veckor. Intraperitoneala BrdU injektioner gavs vid sex veckor som tidigare beskrivits 2.

pload/50716/50716fig3.jpg "/>
Figur 3. Region av intresse lokalisering. Hypotalamus proliferativa zonen (HPZ), en neurogen region som ligger i hypotalamus median eminens, ligger i den ventrala mediobasal hypotalamus. (A) Den HPZ regionen av intresse (ROI) är markerad med rött hårkors i en 3-D Nissl referens atlas volym från Allen Brain Atlas Data Portal (läge: 7.041, 7.211, 5.564) (tillgänglig från http:// mouse.brain-map.org / ) 55. (B) Coronal hjärna avsnitt av ROI i nitton dagar gamla möss. BrdU immunohistokemi (grön) visar att ROI (vit pilspets) innehåller proliferativa celler. Densiteten av proliferativa celler i HPZ begränsas i främre till bakre axeln, med densitet högst vid -1.75 mm Bregma. Vävnadssnitt är kontra färgas med DAPI nukleära markör (blå). Bild från Lee et al. 2012a.(CE) CT-avbildning på en CFIR plattform tillåter inriktning på HPZ ROI (röda hårkors) med båge strålbehandling leverans. CT-bilden av mus ämne i det horisontella planet (C), sagittalplanet (D), och frontalplanet (E). (E) avståndet från ytan av skallen till ROI är 0,62 cm (röd linje). Skala barer = 1 mm (A), 50 m (B), och 0.62 cm (CE). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. Kalibrering av bestrålning leverans. (A) röntgen av en mus föremål fäst i immobilisering anordning på SARRP robotic skede. (B) Beräknad ROI samordnar enre inmatad och riktat mot en fingerad musmodell. Fantom modell består av GAFchromic strålningskänsliga filmer som är inbäddade i ett med vatten ekvivalent plast. Filmer som ligger ovanför, på och under ROI fokus, upptäcka dosfördelning. En 45 ° båge strålknippet från SARRP levererar en konformad dosfördelningen som ROI, och konvergerar vid isocentret (penumbra plats). (C) överlagring av dosimetri-film som förvärvats med 1-mm stråle streckat med en röntgenbild av en riktig mus ämne (gula linjen). Vit cirkel (pil) visar 10-Gy stråldos focally riktade till HPZ. Prickad linje konturer hjärnan. Panel från Lee et al. 2012a.

Figur 5
Figur 5. Bekräftelse av strålning Delivery. CT med jod kontrast kan förbättra visualisering av ROI, om normal CT inte suffice. (A) Mus individer fick jod kontraster som tidigare beskrivits (panel från Lee et al. 2012). CT-bilder i koronala, horisontella, och sagittalplanet visas från vänster till höger. (B) Bekräftelse av strålning leverans i vävnad kan påvisas genom immunohistokemi för γH2AX, en markör för DNA dubbelsträngade pauser. γH2AX immunfärgning visar stråle leverans riktade till ROI HPZ i ventrala mediobasal hypotalamus. γH2AX immunofärgning observeras inte i subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna (C), eller den subgranular zon av hippocampus (D), av samma mus ämne. (BD) Sektioner motfärgas med DAPI (Från Lee et al. 2012a). Klicka här för att visa en större bild .


Figur 6. Focal hämning av ME neurogenes resulterar i förändringar i vikt och metabolism. (A) Median berömmelse (ME) ligger i den ventrala mediobasal hypotalamus var riktad för bestrålning. Den bågformiga kärnan (ArcN) är angränsande anatomisk struktur. En månad efter behandling, andelen BrdU + Hu nervceller från bluff kontra bestrålade kohorter kvantifierades genom immunhistokemi i ME och ArcN. Nivåer av ME neurogenes reducerades signifikant bestrålat kontra falska kohorter (n = 5/cohort, *** = p <0,0001). Nivåer av ArcN neurogenes påverkades inte (n = 3/cohort, ns = ej signifikant). (B) Normal chow matas (NC) och (C) fettrik matas (HFD) möss undersöktes på längden för förändringar i vikt efter bestrålning eller simulerad treatment (B, n = 12/cohort, C, n = 9/cohort). (DE) En månad efter behandling, bestrålade och sken behandlad HFD-matade möss undersöktes av kvantitativ magnetisk resonansspektroskopi för analys av% fettmassa och% muskelmassa. Bestrålade möss hade betydligt mindre% fettmassa och betydligt mer% muskelmassa än skenkontroller (n = 5, * = p <0,05). Total massa: (Sham) 21,0 ± 0,3 g, (bestrålat) 18,86 ± 0,4 g, muskelmassa: (Sham) 14,6 ± 0,2 g, (bestrålat) 13,9 ± 0,3 g, fettmassa: (Sham) 3,9 ± 0,2 g, ( bestrålade) 2,6 ± 0,3 g (n = 5, * = p <0,05). (FI) Bestrålade och skenbehandlade vuxna möss placerades i en omfattande Lab Animal Monitoring System (musslor) för samtidig mätning av födointag, fysisk aktivitet, och hela kroppen metabolisk profilering två veckor efter behandling. Efter acklimatisering i testkammaren, var bestrålade möss observerades ha significantly större energiförbrukning, total aktivitet, och VO 2 (ml / kg / h) jämfört med skenkontroller under den mörka delen av dagen (n = 11, 12, * = p <0,05). (G) Ingen signifikant skillnad observerades i den andningsväxelkurs (RER) (n = 11, 12). Delfigur A genereras från data som tidigare publicerats i Lee et al. 2012a och Lee et al. 2012b. Subfigures CI från Lee et al. 2012a. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CT-guidad fokal bestrålning (CFIR) är ett nytt och komplett system tillvägagångssätt kan leverera strålningsfält till målen i små djur under robotkontroll med hjälp av CT-vägledning 32. Möjligheten att CFIR att leverera mycket fokuserade strålar till små djurmodeller ger nya forskningsmöjligheter för att överbrygga laboratorieforskning och klinisk översättning. Detta dokument beskriver CFIR strategi för exakt strålning leverans att särskilt inrikta en hypotalamus neurala progenitorceller befolkning. Vi visar här hur man kalibrerar och bekräfta strålning leverans specificitet via röntgenfilm och i hjärnvävnad genom immunohistokemi.

Dessutom visar vi hur denna teknik kan användas för att inhibera neurogenes i ett visst område i hjärnan. Vi visar att vi kan rikta ventrobasal hypotalamus, och hämmar nybildning av nervceller i median berömmelse, utan att ändra nivåerna av neurogenes i närliggande strukturer. Inhibering av ME neurogenes åtföljs av förändringar i ämnesomsättningen och aktivitet samt minskad viktökning på en fettrik kost i bestrålat kontra hycklar behandlingsgrupperna (Figur 6) 2. Dessa data tyder på en roll för dessa vuxna födda hypotalamus nervceller i regleringen av ämnesomsättningen och energi homeostas. Dessutom föreslår den att ett överskott fettrik kost kan förändra kritisk metabolic kretsar även i vuxen ålder 3. Våra resultat är en viktig expansion på den kända funktion av vuxna födda nervceller, och belyser en ny hypotalamus neurala progenitorceller befolkning 3. Potentiella gropar vid detta tillvägagångssätt är att bestrålning inhiberar progenitor proliferation snarare än neurogenes i sig och sålunda är också möjligt att fysiologiska förändringar efter behandling kan delvis förklaras av störning av annan vuxen cell genes. Framtida åtgärder kommer att omfatta utveckling av genetiska verktyg för att förhindra spridningen av denna specifika neurala progenitorceller pBefolknings, vilket kommer att ge betydande klarhet till den funktionella roll dessa stamfäder och deras avkomma spela i regleringen av fysiologi 3.

Sammantaget dock tjänar detta radiologiska plattform som en viktig utgångspunkt i att utföra medel genomströmning skärmar på neurala stamceller och deras avkomma. Denna radiologisk teknik är inte begränsad till forskningsfrågor inom neurovetenskap, dock, och vi förväntar oss CFIR att utöka den konceptuella framsteg i ett antal forskningsdiscipliner. Den senaste tidens tillgången på kommersiellt sålda CT-guidad radiologiska plattformar ger en möjlighet för forskare att använda dessa funktionerna i denna plattform för sina forskningsfrågor (Figur 1). Flera alternativ är kommersiellt tillgängliga som tillåter en att utföra bildstyrd litet djur bestrålning. Vidare kan CT-styrda fokala bestrålningstider system även byggas i huset, så som var fallet med det system som används för dessa studies på Johns Hopkins 29-33, 35.

Utföra denna grad av fokal inriktning kräver korrekt kalibrering och inriktning av ROI. Även denna teknik kommer initialt att ta utbildning för att bli bekant med CFIR plattformen och dess dos-planering programvara, är driften av enheten ganska lätt efter att förstå protokollet och kapacitet av plattformen. Det rekommenderas att operatören praxis kalibrering strålen flera gånger innan att köra fullskalig longitudinella experiment. Som sagt, en gång flytande i driften av CFIR, bör forskningsstudier rör sig snabbt.

Denna CFIR protokoll som beskrivs här använder tredimensionella volymetriska bildstyrning för lokalisering och inriktning av dosen. Konform dos minimerar exponering för icke-målbestämd hjärnregioner, och hög precision beam geometri möjliggör konform dosfördelning med skarpa balk gränser. Detta tillåter en att ställa frågor regarding funktionen av vuxna födda nervceller, men också öppnar områden för frågor till rollen av celltillväxt inom områden som fysiologi, tumörbiologi och immunologi. Denna metod kan utvidgas på flera sätt med kontrastfärger och mareld att förbättra visualisering 35, 56. Arbetet pågår nu för att förbättra CFIR hårdvara kapacitet ytterligare, och plattformen har nu modifierats för att inkludera en ombord positronemissionstomografi scanner 56. Dessa kommer att underlätta utbyggnaden av verktyg tillgängliga för forskare och hjälp att översätta upptäckter på bänken till sängkanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JW har en forskningsfinansiärer och samrådsavtal med Xstrahl, Inc.

Acknowledgments

Vi tackar C. Montojo, J. Reyes, och M. Armour för teknisk rådgivning och assistans. Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag F31 NS063550 (till DAL), en Basil O'Connor Startat Scholar Award och bidrag från Klingenstein fonden och NARSAD (till SB). SB är en WM Keck Distinguished Young Scholar i medicinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SARRP research platform Xstrahl RS225A http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker Xstrahl Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film IPS GAFchromic ETB2
Mouse phantom Gammex 457 Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody Millipore, Inc. 05-636 clone JBW301
High-fat rodent diet Research Diets D12492i 60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane Baxter Healthcare Corporation 10019-360-40
0.01 M Sodium citrate Fisher Scientific 1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
DAPI Fisher Scientific nuclear counterstain
Mounting medium Fisher Scientific Vectashield or Gelvatol is preferred

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
  2. Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic niche. Nat. Neurosci. 15, 700-702 (2012).
  3. Lee, D. A., Blackshaw, S. Functional implications of hypothalamic neurogenesis in the adult mammalian brain. Int. J. Dev. Neurosci. 30, 615-621 (2012).
  4. Pencea, V., Bingaman, K. D., Wiegand, S. J., Luskin, M. B. Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum, septum, thalamus, and. 21, 6706-6717 (2001).
  5. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310, 679-6783 (2005).
  6. Pierce, A. A., Xu, A. W. De novo neurogenesis in adult hypothalamus as a compensatory mechanism to regulate energy balance. J. Neurosci. 30, 723-7230 (2010).
  7. Ahmed, E. I., et al. Pubertal hormones modulate the addition of new cells to sexually dimorphic brain regions. Nat. Neurosci. 11, 995-997 (2008).
  8. Xu, Y., et al. Neurogenesis in the ependymal layer of the adult rat 3rd ventricle. Exp. Neurol. 192, 251-264 (2005).
  9. Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Evidence for constitutive neural cell proliferation in the adult murine hypothalamus. J. Comp. Neurol. 505, 209-220 (2007).
  10. Perez-Martin, M., et al. IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats. Eur. J. Neurosci. 31, 1533-1548 (2010).
  11. Shimogori, T., et al. A genomic atlas of mouse hypothalamic development. Nat. Neurosci. 13, 767-775 (2010).
  12. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
  13. Limoli, C. L., et al. Radiation response of neural precursor cells: linking cellular sensitivity to cell cycle checkpoints, apoptosis and oxidative stress. Radiat. Res. 161, 17-27 (2004).
  14. Monje, M. L., Mizumatsu, S., Fike, J. R., Palmer, T. D. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat. Med. 8, 955-962 (2002).
  15. Wojtowicz, J. M. Irradiation as an experimental tool in studies of adult neurogenesis. Hippocampus. 16, 261-266 (2006).
  16. Mizumatsu, S., et al. Extreme sensitivity of adult neurogenesis to low doses of X-irradiation. Cancer Res. 63, 4021-4027 (2003).
  17. Snyder, J. S., Hong, N. S., McDonald, R. J., Wojtowicz, J. M. A role for adult neurogenesis in spatial long-term memory. Neuroscience. 130, 843-8452 (2005).
  18. Santarelli, L., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301, 805-809 (2003).
  19. Saxe, M. D., et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17501-17506 (2006).
  20. Duan, W., et al. Sertraline slows disease progression and increases neurogenesis in N171-82Q mouse model of Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 30, 312-322 (2008).
  21. Rola, R., et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice. Exp. Neurol. 188, 316-330 (2004).
  22. Hellstrom, N. A., Bjork-Eriksson, T., Blomgren, K., Kuhn, H. G. Differential recovery of neural stem cells in the subventricular zone and dentate gyrus after ionizing radiation. Stem Cells. 27, 634-641 (2009).
  23. McGinn, M. J., Sun, D., Colello, R. J. Utilizing X-irradiation to selectively eliminate neural stem/progenitor cells from neurogenic regions of the mammalian brain. J. Neurosci. Methods. 170, 9-15 (2008).
  24. Panagiotakos, G., et al. Long-term impact of radiation on the stem cell and oligodendrocyte precursors in the brain. PLoS One. 2, e588 (2007).
  25. Shinohara, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Tada, E., Fike, J. R. Apoptosis in the subependyma of young adult rats after single and fractionated doses of X-rays. Cancer Res. 57, 2694-2702 (1997).
  26. Tada, E., Parent, J. M., Lowenstein, D. H., Fike, J. R. X-irradiation causes a prolonged reduction in cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience. 99, 33-41 (2000).
  27. Tada, E., Yang, C., Gobbel, G. T., Lamborn, K. R., Fike, J. R. Long-term impairment of subependymal repopulation following damage by ionizing irradiation. Exp. Neurol. 160, 66-77 (1999).
  28. Hopewell, J. W., Cavanagh, J. B. Effects of X irradiation on the mitotic activity of the subependymal plate of rats. Br. J. Radiol. 45, 461-465 (1972).
  29. Matinfar, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Image-guided small animal radiation research platform: calibration of treatment beam alignment. Phys. Med. Biol. 54, 891-905 (2009).
  30. Matinfar, M., et al. Small animal radiation research platform: imaging, mechanics, control and calibration. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 10, 926-934 (2007).
  31. Matinfar, M., Iordachita, I., Ford, E., Wong, J., Kazanzides, P. Precision radiotherapy for small animal research. Med. Image Comput. Comput. Assist. Interv. 11, 619-626 (2008).
  32. Matinfar, M., Iordachita, I., Wong, J., Kazanzides, P. Robotic Delivery of Complex Radiation Volumes for Small Animal Research. IEEE Int. Conf. Robot. Autom. 2010, 2056-2061 (2010).
  33. Wong, J., et al. small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 71, 1591-1599 (2008).
  34. Armour, M., Ford, E., Iordachita, I., Wong, J. CT guidance is needed to achieve reproducible positioning of the mouse head for repeat precision cranial irradiation. Radiat. Res. 173, 119-123 (2010).
  35. Ford, E. C., et al. Localized CT-guided irradiation inhibits neurogenesis in specific regions of the adult mouse brain. Radiat. Res. 175, 774-783 (2011).
  36. Redmond, K. J., et al. A radiotherapy technique to limit dose to neural progenitor cell niches without compromising tumor coverage. J. Neurooncol. 104, 579-587 (2011).
  37. Fike, J. R., Rola, R., Limoli, C. L. Radiation response of neural precursor cells. Neurosurg. Clin. N. Am. 18, 115-127 (2007).
  38. Bauer, S., Hay, M., Amilhon, B., Jean, A., Moyse, E. In vivo neurogenesis in the dorsal vagal complex of the adult rat brainstem. Neuroscience. 130, 75-90 (2005).
  39. Hourai, A., Miyata, S. Neurogenesis in the circumventricular organs of adult mouse brains. J. Neurosci. Res. 91, 757-770 (2013).
  40. Bennett, L., Yang, M., Enikolopov, G., Iacovitti, L. Circumventricular organs: a novel site of neural stem cells in the adult brain. Mol. Cell. Neurosci. 41, 337-347 (2009).
  41. Gleiberman, A. S., et al. Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6332-6337 (2008).
  42. Goldman, S. A., Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2390-2394 (1983).
  43. Chow, J. C., Leung, M. K., Lindsay, P. E., Jaffray, D. A. Dosimetric variation due to the photon beam energy in the small-animal irradiation: a Monte Carlo study. Med. Phys. 37, 5322-5329 (2010).
  44. Maeda, A., et al. In vivo optical imaging of tumor and microvascular response to ionizing radiation. PLoS One. 7, e42133 (2012).
  45. Vasireddy, R. S., et al. Evaluation of the spatial distribution of gammaH2AX following ionizing radiation. J. Vis. Exp. (42), e2203 (2010).
  46. Short, S. C., et al. DNA repair after irradiation in glioma cells and normal human astrocytes. Neuro. Oncol. 9, 404-411 (2007).
  47. Gavrilov, B., et al. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347, 1048-1052 (2006).
  48. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165, 155-164 (2006).
  49. Jacques, R., Taylor, R., Wong, J., McNutt, T. Towards real-time radiation therapy: GPU accelerated superposition/convolution. Comput. Methods Programs Biomed. 98, 285-292 (2010).
  50. Chaichana, K. L., Levy, A. P., Miller-Lotan, R., Shakur, S., Tamargo, R. J. Haptoglobin 2-2 genotype determines chronic vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Stroke. 38, 3266-3271 (2007).
  51. Mah, L. J., et al. Quantification of gammaH2AX foci in response to ionising radiation. J. Vis. Exp. (38), e1957 (2010).
  52. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  53. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  54. Tryggestad, E., Armour, M., Iordachita, I., Verhaegen, F., Wong, J. W. A comprehensive system for dosimetric commissioning and Monte Carlo validation for the small animal radiation research platform. Phys. Med. Biol. 54, 5341-5357 (2009).
  55. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  56. Tuli, R., et al. Development of a novel preclinical pancreatic cancer research model: bioluminescence image-guided focal irradiation and tumor monitoring of orthotopic xenografts. Transl. Oncol. 5, 77-84 (2012).

Tags

Neurovetenskap neurala stamceller (NSCs) kroppsvikt strålbehandling bild-Guided metabolism energiomsättning neurogenes Cell Proliferation neurovetenskap bestrålning radiologisk behandling dator-tomografi (CT) imaging Hypothalamus Hypothalamic proliferativ Zone (HPZ) Median Eminence (ME) smådjurs Radiation Research Platform (SARRP)
Funktionell Förhör av Adult Hypothalamic neurogenes med Focal Radiological Hämning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D. A., Salvatierra, J.,… More

Lee, D. A., Salvatierra, J., Velarde, E., Wong, J., Ford, E. C., Blackshaw, S. Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition. J. Vis. Exp. (81), e50716, doi:10.3791/50716 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter