Summary
Abbiamo adattato una serie di protocolli per la misurazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono essere applicate in vari modelli cellulari amebe e di mammifero per studi qualitativi e quantitativi.
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) comprendono una gamma di molecole contenenti ossigeno reattive e di breve durata, che sono interconvertiti o eliminati sia catalitica o spontaneamente in modo dinamico. A causa delle brevi durate di più ROS e la diversità delle loro fonti e localizzazioni subcellulari, un quadro completo può essere ottenuto solo da misure accurate utilizzando una combinazione di protocolli. Qui, vi presentiamo una serie di tre protocolli diversi con OxyBurst Green (OBG) rivestite perline, o dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), di monitorare qualitativamente e quantitativamente diversi ROS in fagociti professionali come Dictyostelium. Abbiamo ottimizzato le perline procedure di rivestimento e perle di OBG rivestite occasione e la microscopia diretta di visualizzare dinamicamente intraphagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula. Abbiamo identificato lipopolisaccaride (LPS) da E. coli come stimolatore potente per la generazione di ROS in Dictyostelium. Inoltre, Dtempo reale eveloped, saggi medio-throughput utilizzando DHE e AUR per misurare quantitativamente superossido intracellulare ed extracellulare H 2 O 2 produzione, rispettivamente.
Introduction
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici quali la difesa ospite, la segnalazione, lo sviluppo del tessuto e la risposta al danno, così come l'ipertensione e il cancro. Il macchinario ossidasi phagosomal NADPH ben studiato è dedicato alla generazione di ROS rapido, conosciuto come il burst ossidativo, per uccidere i batteri ingeriti in phagosomes neutrofili '1. Inoltre, la perdita di elettroni come sottoprodotto della catena respiratoria mitocondriale è stato precedentemente ritenuto responsabile solo per una fonte regolamentata di ROS. Ma di recente, è stato identificato come un importante meccanismo per contribuire all'uccisione intraphagosomal dei batteri nei macrofagi del mouse 2. Negli ultimi anni, l'ameba sociale, Dictyostelium, è diventata un modello potente e popolare per studiare i meccanismi cellulari intrinseche della risposta immunitaria innata. Infatti, Dictyostelium e fagociti umani condividono un sorprendentemente elevato livello di conservazione in moleculamacchinari r responsabili per i batteri rilevamento, fagocitazione e uccidendo 3,4. Gli omologhi di proteine ed enzimi legati alla produzione di ROS o di detossificazione, come ossidasi NADPH, catalasi, superossido dismutasi, possono essere trovati in umano e Dictyostelium. Come l'ameba più studiato, Dictyostelium presenta diversi vantaggi unici rispetto sistema modello mammiferi. Crescono a temperatura ambiente senza la necessità di CO 2, con un tempo di raddoppio di 8-10 ore. Possono essere facilmente mantenute come colture aderenti o sospensione. Inoltre, grazie alla loro genoma aploide completamente sequenziato e annotato, e alla manipolazione genetica facile, Dictyostelium è diventata una molto attraente sperimentale organismo modello.
In studi precedenti, vari derivati clorurati e fluorurati di fluoresceina (collettivamente noti come OxyBurst verde, OBG) che emettono fluorescenza dopo ossidazione da ROS, sono stati utilizzati come reporter ROS. Cell-permeante estDerivati erified vengono utilizzati per misurare citoplasmatica ROS, che destrano-o derivati cellule impermeant accoppiati a proteine sono utilizzati per misurare extracellulare ROS. In particolare, perline OBG BSA-rivestite sono già stati utilizzati per rilevare phagosomal produzione di ROS in cellule di mammifero 5. Tuttavia, l'approccio lettore-su micropiastra può solo dare una curva di generazione di ROS mediata da una popolazione di cellule. Con la presente protocollo base Dictyostelium, un fagocita professionale, e le condizioni sperimentali ottimizzate, otteniamo fagocitosi stabile ed efficiente senza coniugando qualsiasi opsonina sulle perline. DHE è stato utilizzato in vari sistemi modello, come neutrofili e macrofagi mammiferi, per rilevare la produzione di ROS 6-9. Nel frattempo, vi sono alcune controversie sulla specificità e sensibilità del metodo 8,10. Come una versione migliorata del Amplex Red, l'intensità di fluorescenza di RUA è meno sensibile al pH, che lo rende più adatto da misurareROS in ambienti nonneutral o debolmente acide. AUR è stato recentemente applicato in diversi sistemi di mammifero 11,12, ma il suo uso in modelli non mammiferi, che spesso richiedono mezzi di crescita debolmente acido, non è stato ancora riportato. Inoltre, non esiste un protocollo pubblicato per quantitativamente e dinamicamente misurare la produzione di ROS e la localizzazione nel ameba sociale Dictyostelium.
L'obiettivo del set di protocolli presentato è quello di fornire una soluzione semplice e versatile per il controllo di diversi ROS e la loro localizzazione, e in seguito invia intuizioni meccanismi cellulari ROS-correlati. Per il saggio OBG, abbiamo usato la microscopia diretta a monitorare l'intero processo di generazione phagosomal ROS, dopo l'assorbimento di perline OBG rivestite da cellule di Dictyostelium, e fornito un nuovo approccio per studiare il meccanismo di uccisione intraphagosomal dei batteri. Abbiamo ottimizzato medio-throughput DHE e AUR saggi in Dictyostelium, per misurare superox intracellulareide extracellulare e H 2 O 2 produzione, rispettivamente, utilizzando LPS come un potente stimolatore ROS. Si noti che LPS è stato recentemente mostrato di aumentare l'attività battericida del Dictyostelium verso batteri fagocitati 13. Inoltre, il trattamento con DEDTC e catalasi esplicitamente confermato che questi due metodi specificamente misurano diversi tipi e localizzazioni subcellulari di ROS in Dictyostelium. Infine, il saggio OBG può essere adattato a qualsiasi cellula fagocitica aderente per ulteriori opsonizzare le perline con ligandi per recettori di fagocitosi di cellule animali. In linea di principio, i saggi DHE e AUR può anche essere ottimizzati per misure in qualsiasi cella aderenti o non aderenti sotto appropriate condizioni sperimentali.
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Protocol
1. Visualizzazione e misurazione qualitativa del ROS Produzione in fagosomi
Le perle OBG-rivestite devono essere preparati in anticipo. Le procedure di rivestimento perline e la tecnica di sovrapposizione agar sono adattati dai riferimenti pubblicati 5,14.
- Aggiungere 1 ml di sospensione di 3,0 micron sfere di silice carbossilati (circa 1,8 x 10 9 sfere) in una provetta da 1,5 ml, lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex.
- Risospendere le sfere in 1 ml di PBS contenente 25 mg / ml cianammide (per attivare le perle di silice carbossilati di legarsi in modo covalente prelabeled BSA), incubare su una ruota per 15 minuti.
- Lavare 3x con 1 ml di tampone di accoppiamento (0,1 M borato di sodio, pH 8,0) mediante rotazione rapida (centrifugare a piena velocità in una mini centrifuga da tavolo per 5 sec oppure centrifugare a 2000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo) e vortex per rimuovere l'eccesso cyanamide.
- Mescolare le perline lavati con 500 ml di coupling tampone contenente 1 mg di OxyBurst Green (OBG) H2HFF (diidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA, riempire il tubo con gas di azoto da un gas-can standard prima tappatura, e incubare su una ruota per 14 ore (una notte) a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le perline 2x con 1 ml di tampone di tempra (250 mM glicina in PBS) per rimuovere reagito OBG, e due volte con tampone di accoppiamento per rimuovere il tampone quenching dalla rotazione veloce e vortex.
- Aggiungere 1 ml di tampone di accoppiamento contenenti 50 mg di Alexa Fluor 594 succinimidyl estere di coniugare al BSA. Riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e incubare su una ruota per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le perline 3x con 1 ml di tempra buffer giro veloce e vortex per fermare la reazione, poi lavare le perle 3x con 1 ml di PBS da giro veloce e vortex.
- Infine, risospendere le sfere in 1 ml di PBS con 2 ml di 10% w / v azide per conservazione a lungo termine. Misurare la concentration di perline in sospensione con un emocitometro (solitamente intorno 1-2 x 10 9 perline / ml), riempire il tubo con azoto prima del livellamento, e conservare a 4 ° C al buio.
- L'efficienza del rivestimento della fluoresceina OBG può essere verificata controllando lo spettro di emissione con eccitazione a 500 nm. Quando ossidato da H 2 O 2 in presenza di perossidasi di rafano (HRP), l'intensità di fluorescenza di perline ossidati, al picco di emissione (538 nm), è 11-12x superiore a quella di perline rivestite nonoxidized.
- Harvest esponenziale crescita delle cellule Dictyostelium da un piatto di 10 centimetri Petri, piastra diverse densità di celle su tre centimetri piatti con un materiale plastico otticamente trasparente o con fondo di vetro, e crescere durante la notte. Scegli i piatti che sono circa l'80% confluenti per l'esperimento. Un protocollo dettagliato per la coltivazione di cellule di Dictyostelium è stato pubblicato il 15.
- Sostituire il terreno di coltura con LoFlo medio (LF), incubare per2 ore prima dell'esperimento al fine di diminuire l'autofluorescenza extracellulare e intraendosomal del terreno di coltura HL5C.
- Parallelamente, sciogliere 10 ml 1,5% Bacto agar in mezzo LF, versare l'agar su una superficie piana (cioè una lastra di vetro di 10 cm x 10 cm) in modo da formare uno strato di agar dello spessore di circa 1 mm attendere 10-15 min a solidificare. Tagliare lo strato di agar in 2 cm x 2 centimetri quadrati e posto in LF medio per un uso successivo.
- Nel frattempo, preparare la filatura-disk o microscopio a campo largo, impostare la temperatura della camera ambientale a 22 ° C e regolare le impostazioni per questo esperimento. (Vedi ulteriori commenti nella discussione).
- Dopo 2 ore di incubazione, aspirare il terreno LF dal piatto 3 cm, ma il monostrato cellulare dovrebbe ancora essere coperta da una pellicola sottile di supporto. Diluire le perle rivestite da 1,5 x 10 7 perline / ml e aggiungere 10 ml sullo strato di cellule.
- Prendete un foglio agar quadrato, drenare i liquidi in eccesso, ma mantenere bagnato. Mettere delicatamente the agar quadrato sulla parte superiore dello strato di cellule. Non spostare la piazza agar quando è sdraiato sulle cellule. L'agar molle viene utilizzato per aumentare il contatto tra le perle e cellule, migliorando così l'assorbimento, ed inoltre comprime leggermente le cellule, mantenendoli meglio nel piano focale dell'obiettivo.
- Mettere il coperchio sul piatto, posizionarlo sul palco microscopio, e automaticamente scattare foto nei canali rosso, verde e fase ogni 1 min per 2 ore o più.
- Selezionare e concentrarsi su eventi cellulari che contengono l'intero processo di fagocitosi. Unire i 3 canali ottimizzati e assemblare le immagini in un filmato utilizzando software professionale di elaborazione delle immagini. Quantificare intensità di fluorescenza di ciascun perline selezionati canali rosso e verde, e il rapporto di verde / rosso rifletterà la phagosomal dinamica ROS produzione delle cellule.
2. Throughput medio quantitativa e misurazione dei intracellulare Superossido Produzione
- Raccogliere one 80% piatto confluenti di Dictyostelium in 10 ml di terreno HL5C. Cellule Centrifuga Dictyostelium a 850 xg per 5 minuti, con attenzione e completamente aspirare eccesso di terreno. Risospendere le cellule in tampone SS6.4 [0.12 M sorbitolo in tampone Sorensen (14,69 mM KH 2 PO 4 e 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], contare le celle e diluire ad una densità finale di 6 x 10 6 cellule / ml (vedi ulteriori commenti nella discussione).
- Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una non trasparente 96 pozzetti bianco (vedi ulteriori commenti nella discussione).
- Diluire DHE magazzino (30 mM in DMSO) 500 volte con SS6.4, pipetta 50 ml di DHE diluito in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale, se necessario. La concentrazione finale di DHE è di 30 micron. La reazione inizia immediatamente.
- Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche.
- Utilizzare il punto "top lettura & # end34; modalità di un lettore di fluorescenza per micropiastre, con fluorescenza eccitazione / emissione a 522 nm nm/605, letto ogni 2 min per 1 ora, medio shake 5 sec / min, a 22 ° C.
3. Quantitativa e High Throughput Misura della extracellulare H 2 O 2 Produzione
- Seguire gli stessi passi descritti in 2.1 e 2.2.
- Preparare HRP diluita con l'aggiunta di 5 ml di HRP magazzino (100 U / ml in acqua distillata) in 10 ml di SS6.4, vortex o capovolgere la provetta per mescolare bene e tenere in ghiaccio per un uso successivo. La soluzione di HRP diluita è di 0,05 U / ml.
- Preparare la miscela di reazione AUR miscelando il magazzino AUR (AUR 10 mM in DMSO) e la soluzione di HRP diluita in tampone SS6.4 alle concentrazioni finali di 6,25 mM, e 0.005 U / ml, rispettivamente. A titolo di esempio, per preparare la miscela di reazione per 40 reazioni, mescolare 1.600 ml di SS6.4 con 400 ml di HRP diluita e 2,5 ml di soluzione madre AUR.
- Aggiungere 50 ml di mix AURTure in ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, se necessario. Ora la reazione si inneschi.
- Stimoli o inibitori possono essere aggiunti a questo punto, o in altri punti temporali in funzione delle esigenze specifiche.
- Utilizzare il punto finale modalità "lettura top" di un lettore di fluorescenza piatto micro, con fluorescenza di eccitazione / emissione a 530 nm nm/590, leggere ogni 2 min per 1 ora, medio scossa 5 sec / min, a 22 ° C.
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Representative Results
La generazione di ROS in fagosomi può essere visualizzato qualitativamente e dinamicamente mediante microscopia (S1 File). La fluorescenza rossa emessa da Alexa Fluor 594 è pH-sensibile e rimane costante nell'ambiente phagosomal, mentre l'ossidazione di OBG aumenta la fluorescenza nel canale verde. Gli spettri di emissione di in vitro ossidato e perline OBG rivestite nonoxidized sono confrontati in Figura 1B, mostrando un significativo aumento di intensità dopo l'ossidazione. Per facilitare la visualizzazione degli eventi live, i due canali vengono unite e le conseguenti variazioni di colore da rosso ad arancione durante la fagocitosi da parte delle cellule di tipo selvatico AX2 entro 1 min di assorbimento. L'aumento della fluorescenza verde indica la generazione di ROS eventualmente direttamente nel phagosome. Utilizzando un lettore per micropiastre, medio-capacità di misurazione quantitativa superossido intracellulare ed extracellulare H 2 O 2 produzione sono presenti in Figuri 2C e la Figura 3B, rispettivamente. Produzione basale di ROS da cellule AX2, probabilmente dal metabolismo ossido-riduttivo regolare, può essere misurata. Quando le cellule vengono stimolate con LPS, i segnali per la produzione di ROS sono significativamente aumentati in entrambi i saggi. Inoltre, nel saggio DHE, la diminuzione della fluorescenza blu (dihydroethidium) e l'aumento di fluorescenza rossa (etidio) segnali sono inversamente correlati, come previsto. La localizzazione della produzione ROS misurati sia DHE e saggi AUR sono confermati in Figura 2D e Figura 3C, rispettivamente. Aggiunta di DEDTC (una membrana permeabile superossido dismutasi (SOD) inibitore) 16, aumentato il segnale DHE e diminuito il segnale AUR in modo dose-dipendente, indicando che DEDTC causato l'accumulo del substrato SOD superossido e l'esaurimento del prodotto SOD H 2 O 2 previsto dalla reazione mostrato nella Figura 2A. Lalternatively, aggiungendo catalasi (una membrana impermeant H 2 O 2 quencher), il segnale intracellulare superossido dai dati analitici DHE non viene influenzata, mentre l'H 2 O 2 extracellulare segnale dal saggio AUR diminuito in modo dose-dipendente.
Figura 1. Principio e l'uso del test OBG (OxyBurst verde). A) fluoresceina OBG e Alexa Fluor 594 sono accoppiati covalentemente alla superficie di 3 micron sfere di silice con BSA. L'emissione di fluorescenza da OBG fluoresceina indica l'ossidazione da ROS, mentre il segnale da Alexa Fluor 594 aiuta a localizzare le perline e serve come controllo per la fluorescenza quantificazione. B) Test in vitro per l'efficienza del rivestimento. H 2 O 2 e HRP sono utilizzati per ossidare le perline rivestite in vitro. Sotto excitzione a 500 nm, le perline ossidati mostra un picco significativo di emissione a 538 nm rispetto a quella di perline nonoxidized, con un rapporto di intensità di almeno 11-12 volte.
Figura 2. Principio e l'uso del saggio DHE (Dihydroethedium). A) Sintesi delle reazioni biochimiche legate alla DHE e AUR saggi. B) nel citoplasma, la membrana DHE permeante ha eccitazione e di emissione picchi a 370/420 nm, rispettivamente. Come risultato di ossidazione da superossido, etidio è in grado di intercalare nel DNA nucleare e mitocondriale ed è spostato di eccitazione ed emissione picchi a 522/605 nm, rispettivamente. L'intensità di fluorescenza di etidio corrisponde alla quantità di produzione di superossido all'interno delle cellule. C) Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolate con LPS, il super dinamicoproduzione di ossido da cellule AX2 è significativamente superiore al livello basale da cellule non stimolate AX2 e lo sfondo della reazione in tampone. La diminuzione della fluorescenza blu e l'aumento di fluorescenza rossa sono inversamente correlati come previsto. D) Quando trattate con varie concentrazioni di DEDTC (un inibitore permeante superossido dismutasi membrana), la pendenza (RFU / min) di etidio produzione aumenta in modo dose- modo dipendente, mentre il trattamento con catalasi (una membrana impermeant H 2 O 2 quencher) non influenza la produzione di superossido. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Principio e l'uso del test AUR (Amplex Ultrared). A) La membrana impermeant AUR can essere ossidato nella sua forma fluorescente resorufina, AUR-ox, da H 2 O 2 in presenza di una perossidasi (eccitazione e di emissione picchi a 530 e 590 nm, rispettivamente). L'intensità di fluorescenza di RUA-ox corrisponde alla quantità di H 2 O 2 prodotta all'esterno delle cellule. B) Un esperimento rappresentativo mostra che, quando stimolate con LPS, la dinamica H 2 O 2 produzione da cellule AX2 è significativamente superiore al basale a partire da cellule AX2 stimolate e la reazione di sfondo. C) Quando trattate con diverse concentrazioni di DEDTC o catalasi, la pendenza (RFU / min) di AUR-ox diminuisce la produzione in modo dose-dipendente, a causa di inibizione della H 2 O 2 produzione di superossido intracellulare ed extracellulare esaurimento di H 2 O 2, rispettivamente. Clicca qui per ingrandirefigura.
File S1. Film di produzione phagosomal ROS dinamica in cellule di Dictyostelium. Il film time-lapse è stato registrato per 40 minuti al microscopio dal vivo, utilizzando un ingrandimento 60X. Durante il primo minuto dopo l'assorbimento da parte fagocitosi, la fluorescenza della fluoresceina OBG perle rivestite passa da rosso ad arancione brillante, indicando che i ROS sono state probabilmente prodotte direttamente all'interno dei phagosomes. Clicca qui per vedere film .
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Discussion
Rispetto ai metodi precedentemente descritti, il saggio OBG visualizza dinamicamente il processo di phagosomal generazione di ROS a livello di singola cellula, invece di misurare un segnale medio ROS da una popolazione di cellule. Tali metodi popolazione calcolo della media tendono a oscurare le informazioni critiche causate dalla fagocitosi nonsynchronous. Abbiamo adattato con successo DHE e AUR saggi di Dictyostelium e ottimizzato i protocolli. Soprattutto, abbiamo specificato i tipi e localizzazioni subcellulari di ROS misurato da questi due saggi. Nel loro insieme, l'intero insieme di protocolli di misura ROS per Dictyostelium fornisce un sistema utile e potente per studiare i meccanismi cellulari ROS-correlati, come l'immunità innata, differenziamento cellulare e di segnalazione intracellulare.
Per il saggio OBG, la preparazione di perle rivestite è critica per il successo dell'esperimento. A causa della complessità del recettore-mediata fagocitica assorbimento in mammifericella n, le particelle devono essere opsonizzati (ad esempio con IgG) per innescare l'ingestione. Bassa efficienza di assorbimento nelle cellule di mammifero limita fortemente la visualizzazione di singoli eventi di generazione phagosomal ROS. Il tasso di fagocitosi in Dicytostelium è stato osservato essere 10-20 volte superiore in un macrofago 17, e con la presente protocollo abbiamo ottenuto robusto ed efficiente fagocitosi senza coniugando qualsiasi opsonina sulle perline. Questo non solo semplifica la procedura tallone-coating, ma riduce i rischi di ossidazione del colorante fluoresceina OBG durante la manipolazione. Poiché OBG fluoresceina può essere ossidato dalla luce e ossigeno, il reagente deve essere protetto dall'esposizione alla luce ambiente e aria il più possibile (per esempio utilizzare un foglio di alluminio per coprire il tubo, e riempire il tubo con azoto o altro gas inerte), particolarmente per la conservazione a lungo termine.
Per l'imaging dal vivo, le cellule possono essere placcati in vari piatti con otticamente cfondi Lear. Mentre Dictyostelium aderisce leggermente migliore di plastica, la maggior parte delle cellule di mammifero (vedi sotto) aderiscono ugualmente bene al vetro. Un altro passo importante per l'imaging ottimale è di incubare cellule Dictyostelium in mezzo LF (bassa fluorescenza di fondo) per almeno 2 ore prima di procedere con le operazioni di imaging. Poiché il segnale di fluorescenza sfondo verde del terreno di coltura (HL5C) deve essere impoverito dai loro compartimenti endosomiali per evitare interferenze con il segnale generato da perline rivestite ossidati. Si raccomanda inoltre di svolgere almeno un esperimento pilota per ottimizzare le impostazioni del microscopio (ad esempio intensità del laser, tempo di esposizione, ecc), soprattutto per il canale verde. Le perle emettono costantemente forte fluorescenza rossa durante l'intero esperimento, ma la fluorescenza verde aumenta per reazione con ROS immediatamente dopo la fagocitosi e piattaforma entro 5-10 min. Perciò è meglio regolare le impostazioni per la green canale vicino alla fine dell'esperimento quando la fluorescenza verde dalla maggior parte delle perline può essere completamente visualizzato. Una volta che le impostazioni sono ottimizzate, salvarla per futuri esperimenti al fine di ottenere risultati riproducibili.
Durante il test di OBG, le cellule sane dovrebbero continuare la loro motilità casuale e non arrotondare. Altrimenti, questo è indicativo di danno cellulare, che può essere causata sia dalla essiccazione del agar molle o da eccessiva intensità del laser. Pertanto, mantenere abbastanza liquido sul agar molle per la durata dell'intero esperimento e anche mantenere il tempo intensità del laser e l'esposizione più basso possibile.
Nei saggi AUR e DHE, la pendenza delle curve lettura della fluorescenza mostra una relazione dose-dipendente alla quantità di cellule usate in ogni pozzetto entro un certo intervallo. Al fine di ottenere i risultati più riproducibili, è indispensabile utilizzare identico numero di cellule per ogni condizione di un esperimento. Inoltre,a causa di variazioni nelle dimensioni delle cellule tra diversi tipi di cellule, è altamente suggerito che durante gli esperimenti pilota, varie diluizioni sono testati per ottenere un monostrato di cellule dopo il collegamento sul fondo del pozzo. Per le cellule AX2 Dictyostelium, 3 x 10 5 cellule formano un monostrato e questo densità cellulare vale anche per molti altri di tipo selvatico e mutante ceppi Dictyostelium. Per ottenere la conta delle cellule accurati, è meglio contare dopo centrifugazione, non prima, poiché la centrifugazione e risospensione pellet passaggi possono comportare la perdita di cellule. Utilizziamo un contatore automatico cella per contare dopo risospendere il pellet cellulare (funziona meglio con densità cellulare superiore 6 x 10 6 cellule / ml), poi diluire con precisione i campioni di cellule a 6 x 10 6 cellule / ml.
Per i saggi DHE e AUR, segnali bassi potrebbero essere dovuti all'utilizzo di piastre a 96 pozzetti non ottimali, e, quindi, si consiglia di utilizzare bianchi non trasparenti piastre da 96 pozzetti. Rispetto al nero o trasparentepiastre ORL, il segnale fluorescente catturato intensifica la riflessione sulla superficie bianca, aumentando notevolmente il rapporto segnale-rumore. Lo svantaggio di piastre non trasparenti bianchi è, a volte, segnali fluorescenti forti possono perdere in pozzetti adiacenti. Tuttavia, utilizzando 100 ml di volume di reazione e la concentrazione sonda descritto, non abbiamo rilevato alcun segnale che fuoriesce sia DHE e saggi AUR. Inoltre, si consiglia di eseguire alcuni esperimenti pilota per ottimizzare la sensibilità fluorescenza del lettore di piastre. Migliore per il dosaggio DHE e AUR Prendendo il lettore di piastre SynergyMX come esempio, sensibilità 100 e 70 di lavoro, rispettivamente. Inoltre, è importante monitorare l'eccitazione ed emissione specifico spettri nelle condizioni dell'esperimento, con le cellule. Infatti, abbiamo osservato uno spostamento del massimo di emissione per AUR a 590 nm, rispetto ai 581 nm menzionati dal costruttore. Infine, abbiamo ottenuto risultati leggermente migliori eccitando a 530 nm invece di 568nm suggerito dal produttore.
Rispetto ad una soluzione stock AUR, la soluzione stock DHE è molto più inclini a ossidazione, anche se protetto dalla luce a -20 ° C. Quindi, è meglio usare lo stock DHE entro 10 giorni dopo la dissoluzione di polvere. Se il colore della soluzione cambia da grigio al viola o rosa, scartarla e preparare fresco di polvere 18.
Nel saggio AUR, sia AUR e HRP potrebbero essere prese da macropinocitosi. Pertanto il segnale fluorescente risultante dall'ossidazione H 2 O 2 può anche essere parzialmente generato all'interno delle macropinosomes. Tuttavia, poiché la AUR e HPR non penetrano le membrane cellulari, il segnale misurato all'interno delle macropinosomes dal saggio AUR è ancora topologicamente equivalente ad un segnale extracellulare, al contrario di un segnale generato nel citosol.
Sulla base di una serie di test preliminari per entrambi DHE e saggi AUR,appare importante utilizzare un buffer semplice che non contiene glucosio o altri componenti Media biologiche, perché fortemente interferiscono con entrambi i saggi e producono un segnale fluorescente artefatti alta. Pertanto, usiamo tampone fosfato Sorensen integrato con 0,12 M sorbitolo, un osmolyte nondigestible utilizzato per impostare un osmolarità simile al mezzo di coltura Dictyostelium 19. Si noti che l'elevato contenuto di sale di buffer iso-osmotica utilizzati per le cellule di mammifero, come PBS, è dannoso per Dictyostelium.
I protocolli qui presentati non possono misurare tutti i possibili ROS, come l'ipoclorito, radicali idrossile e ossigeno singoletto, e le loro localizzazioni subcellulari. Un quadro più completo della produzione di ROS è ancora limitata dalla disponibilità e lo sviluppo di sonde specifiche.
Questo insieme di protocolli può essere facilmente adattato ad altre cellule, tra cui fagociti di mammifero, con la seguente modificzione. Ad esempio nel saggio OBG, mezzo senza FCS e rosso fenolo può essere utilizzato per ottenere una bassa bassa fluorescenza. In DHE e AUR saggi, tampone PBS può essere usata al posto di SS6.4, e il numero di cellule piastrate in ciascun pozzetto per ottenere uno strato confluente può essere adattato per tentativi, a seconda della loro dimensione. Le concentrazioni di HRP, RUA e DHE possono anche essere ottimizzati in esperimenti pilota per conseguire i risultati più sensibili. Tuttavia, i possibili effetti negativi del DMSO devono essere testati utilizzando aumento delle concentrazioni di AUR e / o reagenti DHE. Abbiamo testato DHE e AUR saggi di successo con un altro protozoo, Acanthamoeba castellanii e con una linea di topi BV2 cellule microglia. Inoltre, l'analisi e DHE AUR può anche essere usato per misurare la generazione di ROS durante interazioni ospite-patogeno, ad esempio durante l'infezione di Dictyostelium o Acanthamoeba da micobatteri marinum.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Siamo grati al Dott. Karl-Heinz Krause e Vincent Jaquet per aiuto e consiglio per impostare questi protocolli, e ringraziamo anche Christoph Bauer e Jérôme Bosset dalla piattaforma Bioimmagini del PRN e il Dr. Navin Gopaldass per il loro supporto tecnico. La ricerca è supportata da una sovvenzione ProDoc della National Science Foundation svizzero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| OxyBURST Green H2HFF BSA | Invitrogen | O-13291 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | |
| Carboxylated silica beads | Kisker Biotech | PSi-3.0COOH | |
| HL5C medium | ForMedium | HLC0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| Bacto agar | BD | 204010 | |
| Dihydroethidium | Sigma | 37291-25MG | |
| Amplex UltraRed | Invitrogen | A36006 | |
| Horseradish peroxidase | Roche | 10108090001 | |
| Diethyldithiocarbamate (DEDTC) | Sigma | D3506-100G | |
| Catalase | Sigma | C9322-1G | |
| Cyanamide | Sigma | 187364-25G | |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L2630-25G | |
| EQUIPMENT | |||
| ibidi μ-Dish 35 mm, high | ibidi | 81156 | Bottom made of optically clear plastic |
| MatTek dish 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | Bottom made of a glass coverslip |
| Scepter Cell Counter | Merck Millipore | PHCC00000 | |
| White 96 well plate | Nunc | 236108 | |
| Centrifuge | SORVALL | Legend RT | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy Mx | |
References
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