Наномеханика лекарственно-целевого взаимодействия и антибактериальные обнаружения сопротивления

Summary

Приобретенная устойчивость к антибиотикам является одной из основных проблем общественного здравоохранения и в настоящее время упорядоченных по ВОЗ в качестве одного из самых серьезных угроз для жизни человека. Здесь мы описываем использование консольной технологии для количественной антибактериальные сопротивление, критичных к открытию новых и мощных средств против полирезистентных бактерий.

Abstract

Консольные датчик, который действует как преобразователь реакций между моделью бактериальной клеточной стенки матрицы иммобилизованным на его поверхности и антибиотиков в растворе, показал значительный потенциал в биохимических зондирования с беспрецедентной чувствительностью и специфичностью ^1-5. Препарат-мишень взаимодействия генерировать поверхностное напряжение, в результате чего кантилевер сгибать, а сигнал может быть проанализирован оптически при освещении лазером. Изменение поверхностного напряжения измеряется нано-точностью позволяет нарушениями биомеханики модель клеточной стенки бактерий цели, которые необходимо отслеживать в реальном времени. Несмотря на предложение значительные преимущества, несколькими массивами датчиков консольные никогда не применялась в количественном наркотиков целевой связывающих взаимодействий.

Здесь мы описываем использование кремний нескольких массивов консольные покрытые алкантиола самоорганизующихся монослоев имитируя бактериальной клеточной стенки матрицы количественно студенDy антибиотик связывающих взаимодействий. Чтобы понять влияние ванкомицин на механике клеточной стенки бактерий структур ^1,6,7. Мы разработали новую модель ^1, которая предлагает, чтобы изгиба кантилевера может быть описана двумя независимыми факторами, я), а именно химический фактор, который дается классическое изотермы адсорбции Ленгмюра, из которого мы рассчитаны термодинамические константы равновесия диссоциации (K _D) и II) геометрический фактор, по существу мерой того, насколько бактериальных рецепторов пептида распределены на поверхность кантилевера. Поверхностного распределения рецепторов пептида (P) используется для исследования зависимости геометрии и лиганда загрузка. Показано, что пороговое значение р ~ 10% является критическим для зондирования. , Ниже которого нет обнаруживаемых сигнала при изгибе выше это значение, тем изгиб сигнала увеличивается почти линейно, показывая, что стресс является продуктом местного химического связывания факторовTor и геометрического фактора в сочетании механических подключения отреагировал регионов и предоставляет новую парадигму дизайна мощных агентов по борьбе с Superbug инфекций.

Introduction

Молекулярного распознавания лежит в основе парадигмы большие участки биологии и медицины. В фармакологии, например цель мешать патологический путь путем охвата ключевого участника биохимического процесса, таких как transglycoslyation или транспептидации, который катализирует сшивающего бактериальных пептидов клеточной стенки. Препарат дизайна сводится до определения подходящей молекулой для нацеливания на определенную бактериальных сайте док, чтобы побудить их идеальной подгонки. Классический пример эмуляции успех этого подхода является ванкомицин (Ван), которая ориентирована на пептидогликана клеточной стенки, консервативных структурной особенностью бактерии. В возникающей грамположительные бактерии, пептидогликана матрица состоит из пептидов, заканчивающуюся последовательность лизин-D-аланин-D-аланин, привязанные через C55 липидов линкера ^8-10 здесь называют D-Ala. Эти обнаженные пептидов на пептидогликан прекурсоров являются основополагающими длямеханическая защита бактериальных клеток против суровых природных сил, а главное, не встречаются в клетках человека, что делает их идеальными целями для антибиотиков. Ван специфически связывается с С-конца клеточной стенки бактерий пептиды формирования умеренно сильный Ван-пептида сложные, как показано на рисунке 1. Это взаимодействие между Ван и подвергается пептидов блокирует действия transpeptidases и transglycosylases, которые катализируют сшивающего клеточных стенок ^1, эффективно останавливая их сшивания и поэтому nanomechanically ослабляет бактериальной клетки приводит к его смерти разрыве ^{1,6, 7.}

Появление устойчивых к ванкомицину Enterococcus (VRE) является возрастающей проблемой здравоохранения ¹¹ и потому, что в бактериальной резистентности энтерококков возникает из-за тонкое изменение амидной Линкагэ к сложноэфирной связью, ^8, это обманчиво простой структурных изменений на поверхности бактерии удаляет одну водородную связь с Van 'с док сайт с последующей модификацией кармана связывания. Важно то этот процесс приводит к изменению пентапептидную настоящее аланин терминала в восприимчивых к ванкомицину энтерококков (VSE), чтобы лизин-D-аланин-D-лактат ^10,12, здесь называются D-Lac, приводя к значительному снижению Ван-D-Lac аффинностью связывания по три порядка оказания Ван терапевтически неэффективны против инфекций Энтерококковый ^1, тревожный рост устойчивых к антибиотикам бактерий, поэтому вождение развития инновационных подходов к ускорению и восстановлению антибактериальной активности антибактериальных агентов или обнаружение более мощных препаратов против множественной лекарственной устойчивостью бактериальных инфекций.

на месте ссылок для дифференциальных измерений позволяет им специфического определения наркотиков целевой взаимодействий и, в силу их изготовления с помощью стандартных маршрутов обработки полупроводник, они поддаются для массового производства и распараллеливание для высокопроизводительного скрининга тысяч препаратов в час. В частУлар нескольких массивов датчиков консольные являются полезным инструментом для изучения устойчивости к антибиотикам ванкомицин - потому что сопротивление ванкомицин по существу механическая проблема ^1,6,7. Реакции между моделью бактериальных целевой клеточной стенки и Ван в растворе может быть обнаружено путем мониторинга изменений в клинически значимых стресса, индуцированного от наркотиков мишень-связывающего взаимодействия. Сгенерированный напряжение от поверхностных реакций которое проявляется в изгиба кантилевера сигнал анализируется оптически путем освещения датчиков с лазерным лучом. Кроме того, адаптируя восприимчивы покрытие бактериальной поверхности молекулы-мишени на верхней части кантилевера датчик, рядом с неограниченным количеством аналитов (Ван), специфических биохимических взаимодействий и биомеханики модель бактериальной клеточной стенки матрицы мониторинг в реальном времени. Помимо признания молекулярные события, есть несколько факторов, которые могут вызвать консольные датчики для Defнию, временные которые включают в себя - изменения температуры, неспецифического связывания или изменения показателя преломления раствора. Для учета неспецифические сигналы, на месте дифференциальные измерения выполняются где изгиб как измерительного и опорного консолей постоянно контролируются для анализа конкретных взаимодействий. Кроме того, обнаружение чувствительности консольные датчики, которые зависят от поверхности химических и геометрических может быть повышена путем настройки поверхностной плотности р (где р определяется как отношение площади, занимаемой захвата молекул на всю площадь верхней поверхности кантилевера охватываемых общей численности населения молекул, как определено методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) ^1.

Вот этот протокол подробно описано, как ванкомицин или любой другой антибиотик связывания с клеточной стенки бактерий предшественников аналогов (mucopeptides) клинически значимых концентрациях в буферный растворй сыворотке крови могут быть обнаружены с помощью наклеек технология консоли. Свежие поверхности золота используются, потому что самоорганизующихся монослоев (ЗРК), как правило, легко образуют стабильных слоев на чистое золото ^13,14. ЗРК обычно состоит из коротких молекул с тиолом ковалентно присоединен поверхности золота, тогда как целевой блок захвата на другом конце может свободно взаимодействовать с анализируемым веществом цели в растворе. Тиолов образуют гибкую систему особенно если учесть, что многие тиоловых соединений с различными концевыми группами химических являются коммерчески доступными или легко синтезированы в лаборатории. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что молекулы с тиолом фрагмента должны иметь правильную концевые группы, например, белок или пептид сопряжения, аминогруппа должна быть обращена внутрь для реакции с карбоновой группой тиола фрагмент привязаны на поверхность произойти. Здесь тиолами непосредственно конъюгированные с трипептид миметикам бактериальных липидов II от бacterial клеточной стенки целевых синтезированы твердые методологии с использованием коммерчески доступных предустановленной Ван-D-Ala и Ван-D-Lac смолы и стандартного Fmoc-защитную группу химии ^15. Хотя это описание ориентирована на ванкомицин, очевидно, что оно может быть распространено на другие антибиотики и действительно дальнейших исследованиях приглашаются ученые из разных областей особенно в области биохимии, фармакологии и материаловедение легко принять этот протокол для своих экспериментов.

Protocol

1. Подготовка консолей

1. Использование тефлоновой пинцетом погружают выбранного числа консольные чипы (каждый консольные измерения 500 мкм длиной, 100 мкм шириной и 0,9 мкм) в свежеприготовленный пираньи решение (в соотношении 1:1 H ₂ SO ₄ и H ₂ O ₂₎ в течение 20 мин .
2. Примерно через 20 минут удалить кантилевера чипы от пираний растворе и тщательно промойте их деионизированной воды и немедленно передать в свежеприготовленный пираньи решение. Повторите шаг 1.1 выше, если чипсы содержат пятна грязи в противном случае перейти к следующему шагу.
3. После тщательной очистки в деионизированной воде, промывают чистым этанолом и сушат кантилевера чипов на плите при температуре 75 ° С, чтобы удалить все следы воды. Проверьте их с помощью оптического микроскопа, чтобы подтвердить их чистоты.
4. Передача очищенный чипы для консольной испарительную камеру и откачивают, ориентации на достижение вакуумадавления 10 ^-7 мбар.
5. Как только необходимое давление вакуума достигается, флаг одной стороне каждой консольной матрицей с 2 ​​нм титан первый выступает в качестве адгезионного слоя перед дополнительным слоем золота 20 нм толщины. Чтобы подтвердить их толщины, используются кварцевые мониторе кристалл, помещенный непосредственно над источником сигнала.
6. Оставьте золото покрытием консольные фишки датчика в камере в течение 1-2 часов, чтобы охладиться под вакуумом до открытия.
7. Передача недавно выпаривали чипы для вакуумного хранения заполнены аргоном для предотвращения любых форм загрязнений.

2. Функционализация Консольные Chip

1. Во-первых, организовать микро-капилляры на стадии функционализации ² в зависимости от размера кантилевера шагом 250 мкм.
2. Затем вводят 2 мМ этанольного тиол растворы молекул целевой поверхности, т.е. бактериальных mucopeptides (D-Ala и D-Lac) и "инерциальнойалкантиола т 'заканчивающуюся триэтиленгликоль (ПЭГ), известный противостоять биомолекулярных адсорбции. ¹⁶ Каждый из капиллярной трубки должна содержать различные поверхность захвата молекул определяется случайным образом, чтобы избежать смещения пользователь.
3. Следующий инкубируют в течение 20 мин консолей в микрокапиллярах заполнены растворов, содержащих тиольные поверхность захвата молекул. Убедитесь, что решения молекулами поверхности захвата приурочены на каждый отдельный датчик консольные, чтобы избежать или свести к минимуму перекрестного загрязнения. Если этот процесс работает правильно, это должно систематически изменяют свежеприготовленного покрытый золотом консолей в химически активные датчики сформированы, позволяя ЗРК бактериальных мукопептида целей, которые образуют на поверхностях, покрытых золотом, как рецепторы.

3. Решение подготовка

1. Растворить 0,1 М моно-и ди-основные соли фосфата натрия в сверхчистой воде (18,2 мОм · см удельное сопротивление) и смесь тO получения значения рН 7,4.
2. Добавить 0,002% PS80 в буферных растворах, чтобы минимизировать агрегацию эффекты, вызванные неспецифических взаимодействий молекул лекарственного средства для посуды.
3. Развести препаратов с недавно буферном растворе до желаемой различных концентраций, которые позволят расчета K _г.
4. Фильтр свежеприготовленного препарата решений с использованием фильтра 0,2 мкм и обработать ультразвуком в течение 5 мин при комнатной температуре, после продувки аргоном.
5. Повторите процедуру с наркотиками в буферном сыворотки с использованием цельной сыворотки. Аккуратно вихрь в течение 15 мин с еще 5 мин, чтобы обеспечить полную растворимость.

4. Обнаружение поверхностного напряжения

1. Загрузите функционализированную сенсорного чипа консольные в жидкостную камеру проточную ячейку.
2. Выравнивание лазерное пятно на свободный конец каждого датчика и подтверждения выравнивания, нагревая жидкостной камере в течение 1 ° С. Все восемь золотых покрытием массивы датчиков консольные должны пройти комплексныеssive изгиба вниз из-за биметаллического эффекта, вызванного различия в скорости расширения кремния и золота.
3. После нагревания в течение примерно 10 мин, позволяют консоли остыть в течение еще 10 мин.
4. Вычислить изменение изгиба при максимальном изгибе сигналов между отдельными датчиками консольные и если относительное стандартное отклонение изгиба сигналов ≤ 5%, то принимают выравнивание как в противном случае желательно повторить процесс.
5. Далее, измерение резонансных частот всех восьми консолей, чтобы вычислить их жесткости пружины. Если изменение жесткости пружины между каждой консольной датчик в чип ≤ 1%, то принимают микросхеме последовательного механические свойства, в противном случае заменить датчик консольные чипа.
6. Затем с помощью жидкостной системой (модель Genie Plus) через шесть-ходовой клапан для достижения обмена жидкости в проточной ячейки в то время как сбор данных должна быть достигнута с использованием автоматизированной LabView такftware.
7. Для контроля изгиба кантилевера данных, используйте следующие протоколы измерений: I) вводят либо буферный раствор или сыворотки без препарата для контрольного измерения продолжительностью 5-30 минут, чтобы установить базовый; II) вводят лекарственный раствор в течение 30-60 мин; III) вводят 10 ммоль HCl мыть в течение 10-60 мин для диссоциации связан лекарственный комплекс, IV), наконец, вводят дополнительную стадию стирки с использованием буферного раствора в течение еще 5-30 мин, чтобы восстановить поверхность пептидов и восстановить базового сигнала. Всегда гарантировать, что все сигналы приобретенного при постоянной скорости потока жидкости из 30-180 мкл / мин и при фиксированной температуре 25 ° С в термостат.
8. Абсолютное изгиба сигналы всех восьми консолей следует контролировать с помощью последовательного временного мультиплексирования оптического метода луч с одним позиционно-чувствительный детектор.
9. Для анализа на изгиб сигналы от каждой концентрации препарата, в результате изгибания дифференциальный преобразуются в дифференциальные стресс между верхней и нижней сторонах кантилевера с использованием уравнения Стони.

Representative Results

Изменения напряжения измеряют с использованием нано-точность, с беспрецедентной чувствительностью к одной Н-связи удаления, будет использоваться для отслеживания нарушений модели бактериальной клеточной стенки биомеханических в реальном времени (2а-г). Предел обнаружения наркотиков чувствительность для Ван был исследован последовательно разбавляя его концентрации в нескольких шагах от 1000 мкм до ≤ 10 нМ, 10 нМ выявления (~ 15 нг / мл), а самая низкая определяемая концентрация порождает в среднем ~ -9 ± 2 нм в виде дифференциального сигнала изгиба (рис. 2в). Способность обнаруживать антибиотиков в физиологических среда дополнительно исследовали в сыворотке крови в клинически значимых диапазоне концентраций 3-27 мкМ ^17. После инъекции 7 мкМ Ван в сыворотке (90% фетальной телячьей сыворотки и 10% натрий-фосфатного буфера рН 7,4) во всех кантилеверов в идентичных условиях, дифференциальный сигналДала на сыворотке 105 ± 4 нм, а для консолей DLac покрытием, нет изгиба не наблюдалось (рис. 3). Значительного изгиба сигналов, наблюдаемых на DAla покрытием (восприимчивых к ванкомицину) кантилеверов вызванного сильным лекарственной мишень-связывающего взаимодействия. Однако для DLac покрытием (ванкомицину) консолей, наличие основного состояния отталкивания кислорода одинокая пара и снижение в связи NH ванкомицин связывающий карман ^10,12 способствует ослаблению препарата-целевого взаимодействия связывания что приводит к меньшей или нет консольные не гибки, особенно для нижней ванкомицин концентрации (рис. 3). Однако для высокой концентрации ванкомицин, мы наблюдаем измеримых изгиба сигналы для DLac. Кроме того, наши экспериментальные дизайн важен для ссылок на месте, где все окntilevers покрыты обе DAla и DLac одновременно подвержены тем же аналита в реальном времени.

Чтобы понять точную роль химии и геометрии, мы разработали модель ¹ описывающий корреляцию между растворителем и поверхностных взаимодействий механики. Это создает поверхностное напряжение:

при р> ПК и нуль в противном случае (1)

Первое слагаемое в уравнении (1) является изотермы адсорбции Ленгмюра, что составляет наркотиками мишень-связывающим события и второй член виде степенного закона описывающая крупномасштабные последствия механического напряженного формирования сети. Постоянное соответствует максимальное напряжение поверхности, когда все доступные сайты связывания заняты и К _D является поверхностью равновесной диссоциации минусыTANT на кантилевер. Анализа, как показано на рисунке 4 является результатом глобального фита уравнения (1) накладывается на измеренное дифференциальное выявление стрессовых сигналов; ~ 29,7 ± 1,0 и 14,1 ± 3,0 мН / м и К _D ~ 1,0 ± 0,3 или 800 ± 310 мкМ для D-Ala или DLac пептидов, где соответствует мера поверхностное напряжение, когда все доступные сайты связывания заняты. Повышенная чувствительность консольных была настроена путем систематического изменения пептид р плотности при мониторинге стресс данные в зависимости от р при концентрации антибиотиков установлена ​​на 10, 100 и 250 мкм соответственно (рис. 5). Процесс повторяют со стрессом как функцию концентрации Ван в то время как пептид плотности зафиксирована на р ~ 100%.

<IMG Alt = "Рисунок 1" FO: Content-ширина = "5 дюймов" SRC = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
Рисунок 1. Консольные обнаружения антибиотиков поверхности связывающих взаимодействий. а) Схематическое представление массива консольные датчика и режим, при котором лекарственное средство-мишень взаимодействий обнаружено nanomechanically. б) Химическое связывание взаимодействие молекулы лекарственного средства (Van) и бактериальный аналоговый мукопептида (D-Ala или D-Lac). в) механизм, посредством которого мутировал ванкомицин подвержены бактериями (VSE) приобретает устойчивость к ванкомицину, удалив одну Н-связи в карман связывания. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Отслеживание нарушений модели клеточной стенки бактерий биомеханики в реальном времени. а) Абсолютные изгиба сигналы D-Ala, D-Lac и ПЭГ покрытием консолей в фосфатный буфер и 250 мкм ванкомицин. Дифференциальных сигналов ПЭГ ссылки приведены в черных линий. Б) Дифференциальное изгиба сигналы D-Ala и D-Lac покрытием консолей в фосфатном буфере и 250 мкМ ванкомицин. С) отклонения дифференциального кантилевера в зависимости от дозы сигнал как функцию времени в присутствии ванкомицин концентрациях порядка 10 нМ (желтая линия), 100 нм (красная линия) и 1000 нМ (темно-красная линия) соответственно. г) дифференциального отклонения кантилевера сигналы для трех D-Ala покрытием датчиков как консольные функции времени в присутствии 10нМ ванкомицин. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Отслеживание нарушений модели бактериальной клеточной стенки биомеханических в реальном времени для D-Ala и D-Lac покрытием консолей в присутствии 7 мкМ ванкомицин в фетальной сыворотки теленка.

Рисунок 4. Исследование наномеханики лекарственно-мишень взаимодействий. График, показывающий измеренного перепада поверхностного напряжения в ответ D-Ala (черные кружки) и D-Lac (красный кружки) покрытием консолей в зависимости от ванкомицинКонцентрация в растворе [Ван]. Данные, описываемой уравнением (1) (сплошные линии). ¹

Рисунок 5. Оптимизация наномеханических чувствительность обнаружения рецептор-лиганд, исследуя зависимость нагрузки рецептор и геометрии с помощью смешанных монослоев. Измеренные дифференциальные поверхность реакции на стресс консольных датчиков в зависимости от D-Ala покрытия поверхности, стр. в присутствии фиксированной концентрации ванкомицина раствора при 10 мкМ (черная линия), 100 мкм (красная линия) и 250 мкм (зеленая линия).

Discussion

Эти результаты демонстрируют, что датчики консольные массива имеют чувствительность для обнаружения и количественного изменения в целевую наркотиков связывающие взаимодействия особенно в ванкомицину связано с удалением одной Н-связи из кармана связывания препарата. Мы показываем наномолярными чувствительность обнаружения Ван согласуется с предыдущими поверхностного плазмонного резонанса (SPR) исследования ^18,19, и покажи, что консольный метод может непосредственно выявления и количественной оценки молекул лекарства в крови в клинически значимых концентрациях, обычно применяются в клинической практике. Наши данные показывают, что стресс дифференциальных поверхность может быть описана уравнением продукта вида (1), то есть (I) химический термин, описывающий конкретный препарат-мишень-связывающим события, и (II) термин, описывающий геометрические механической связи между химическую реакцию участков поверхности, что означает, что местное химических взаимодействий отделить от глобальной механикаль взаимодействия кантилевера. В то время как химический термин определяется по классической изотермы адсорбции Лэнгмюра, геометрический термин показывает промывного механизма лекарственной целевой изменений, вызванных стрессом поверхности. Критическое шт порог ~ 10% (рис. 5) необходимо было обнаружить дифференциального изгиба кантилевера, показывая, что поверхность напряжение трансдуцированных коллективно когда относительно большую поверхность фракции занимают антибиотик молекул. Для р ≥ ПК, механические связи между химически преобразуются сайтов поверхность постепенно создали и ближнего отталкивания таких как стерических взаимодействий между узлами сети наномеханические приводит к увеличению изгиба вниз всей консоли. Он предположил, что наши наномеханические модель перколяции может играть важную роль в гликопептидного антибиотика способ действия в реальных бактерий. Эти данные подчеркивают высокую чувствительность консольной технологии сtudying режиме антибиотиков действия и представляют собой новый исследовательский инструмент для изучения препаратов для улучшения понимания операций антибиотиков в нано-масштабе, чтобы информировать и включить обнаружение мощного средства борьбы с проблемами Superbug инфекций. Чтобы подготовить консольные системы для воспроизводимого и чувствительные измерения, мы обратились набор целей в протоколе, в частности для загрузки образцов в микрожидкостной клетки и стандартных операционных процедур, чтобы количественные наномеханические обнаружений.

Значение консольной технологии по отношению к существующим методам

В заключение отметим, что в то время как эта технология была предложена более 25 лет назад, он не нашел свой путь в клинику из-за отсутствия тщательного и повторных измерений на медицинской точки зрения целей. Здесь мы продемонстрируем процедуры, которые устанавливают актуальность использования наномеханические консолей исследовать механикудр. Влияние антибиотиков на бактериальной клеточной стенки цели и обнаружить антибактериального сопротивления. Обычные методы скрининга препарата требуют определенного типа флуоресцентных или радиоактивных маркировки репортерной молекулой для измерения связывания аналита к своей цели, часто в связи с конкурентным или ферментативного анализа связывания белка и анализов ^20. Маркировка биомолекул является не только трудоемким и дорогим, но метка может также столкнуться с молекулярного взаимодействия, препятствуя сайте связывания, что приводит к ложным негативов. Кроме того, флуоресцентные соединения часто являются гидрофобными что может привести к фонового связывания и ложных срабатываний. Из-за этих ограничений, есть растущий интерес в романе без наклеек методы, которые позволяют практически любому молекулярному комплексу пройти обследование с минимальными развития анализа. Наиболее авторитетных без наклеек Surface Technologies в настоящее время являются SPR и кварцевый Microbalance (ПКМ). В отличие от SPR, которые измеряют йэлектронной диэлектрической постоянной, этикетка - технологии свободной консольные обнаруживает поверхностного натяжения порожденных взаимодействие лиганд-рецептор, который можно непосредственно измерить наномеханических сил, возникающих при специфического связывания лигандов с рецепторами на поверхности. Уникальность этих датчиков в том, что их чувствительность не зависит от диэлектрических свойств, вызванный массовыми изменения в связи с анализируемым веществом обязательный характер, как и в SPR QCM а на мельчайшие индуцированные изменения в плоскости поверхностного напряжения, что делает технологию уникально подходит для изучения наномеханики молекул препарата в клинически значимых концентраций антибиотика (3-27 мкм) ^17. Консоли также особенно хорошо подходит для малых молекул (например, фрагменты ДНК и наркотики) обнаружение в физиологических условиях, в том числе сложные среды, которые в значительной степени основании фармацевтической промышленности и, следовательно, служат в качестве дополнительного инструмента в лекарственных препаратах. Консольные технологии успешно применяются вобласти геномики ^3,5, газ зондирования ^21, протеомики ^22, и наркотики ^1. Кроме того, консоль изготовлены с использованием низкой стоимости кремниевых технологий и в связи с их совместимость с процессами микротехнологий, консолей может быть уменьшен для улучшения чувствительности и распараллеливания в большие массивы датчиков для нескольких скрининга лекарственного соединения и более высокую пропускную способность информационно-богатыми скрининга. Усовершенствование приборов и опытно-конструкторских позволит широкий спектр взаимодействия, которые будут проанализированы в реальном времени, чтобы помочь продвигать поиск нового поколения superdrugs для решения проблем с множественной лекарственной устойчивостью инфекций.

Критические шаги в протоколе

Разработка надежных протоколы измерений имеет центральное значение для применения этой технологии. Для достижения удовлетворительного количественного лекарственной заданных измерений и определить наименьшую концентрацию антибиотиков, тшляпы могут быть обнаружены в буфере или сыворотка крови, критические шаги в протоколе были учтены. Первая задача включает в себя настройки и оптимизации химических поверхности захвата для повышения специфичности консольные обнаружения и чувствительность. Безусловно, трансдукции поверхностное напряжение является коллективным явлением, требующих относительно большой доли поверхности, которые должны быть охвачены для установления соединения между химически активных областей. Показано, что путем варьирования плотности основных пептидов поверхность, критический порог ~ р ≥ 10%, определяется, где масштабы поверхностного напряжения как функция пептид плотности и ноль в противном случае (рис. 5). Важно, что эксперименты предназначены для исследования однородности напряжений по консолей, чтобы обеспечить максимальную отклонения сигнала для чувствительных измерений. Кроме того, эффективные протоколы регенерации поверхности должны быть на месте, таким образом, позволяя нескольким измерениям цикла и снизить затраты на каждого ТЭСT. При проектировании рецептором поверхности с помощью тиолированными гидрофобных концов, ориентации молекулы рецептора и расстояние между ними имеет жизненно важное значение, чтобы позволить самосборки плотной упаковки за счет ван-дер-Ваальса между молекулами для минимизации неспецифических взаимодействий. Кроме того, захват молекул должна содержать полиэтиленгликоль (PEG) линкер, чтобы некоторые части чувствительного матрица быть гидрофильными, чтобы предотвратить введение молекул в раствор аналита в реакцию непосредственно с непокрытой поверхностью золота. Молекулы ПЭГ линкером должны действуют как распорки для уменьшения стерических ограничений и, следовательно, позволить раствору аналитов специфически взаимодействовать с рецепторами на поверхности, чтобы вызвать измеримое изменение напряжения поверхности. Датчик консольной матрицы должны быть проанализированы с по крайней мере на месте измерения задания и сигнал отображается в режиме реального времени является дифференциальным отклонение, полученное вычитанием абсолютное отклонение от опорного кантилевера секEnsing консолей. Таким образом, ссылку консольные необходимо учитывать неспецифических взаимодействий, таких как изменение температуры, изменение показателя преломления или взаимодействий на нефункционализированных нижней кантилевера. Оптимизация расхода (~ 30-150 мкл / мин) образует важный шаг в протоколе, поскольку оно обеспечивает эффективный обмен жидкостей и достаточное устойчивый перенос массы раствора материалов. Конструкция жидкокристаллической ячейке должны позволить оптимального объема (5-80 мкл) для быстрой фильтрации чтобы совершенная жидкость обмена для преодоления ограничений, общественный транспорт. Скорость потока особенно важно при выполнении кинетических измерений ^23. Большие камеры объемом жидкости требуют неконтролируемой высокой скорости потока приводит к большим Требования к объему образца, которое неоправданно увеличивает стоимость анализа. Ранее мы использовали самотеком вводить различные образцы в камеру измерения жидкости. Самотеком имеет то преимущество, что самкиы не требуют никаких механических частей и, следовательно, не вносит дополнительных шумов в систему. Однако его существенным недостатком является то, что только надежно работает при относительно высоких расходах (~ 200 мкл / мин). Очевидно, что более низкий расход (≤ 1 мкл / мин) потребует ограниченных объемах образцов в единицу времени, но с другой стороны это делает реакцию гораздо медленнее и, следовательно, требует больше времени контакта. Кроме того, самотеком имеет большую дисперсию в его расход, поскольку это зависит от высоты разница между входом и выходом, которая уменьшается по мере растворов образцов потребляется в ходе эксперимента. Чтобы избежать проблем, самотеком, шприцевой насос должен быть использован. Преимущество использования шприца, что он позволяет с постоянной скоростью потока в течение длительного периода времени, что позволяет экспериментов, которые будут реализованы в более контролируемых условиях.

Ограничения протокола

Основной проблемой в получении воспроизводимыхд специфических биологических обнаружения с использованием консольной датчиков заключается в обеспечении того, чтобы свойства рецепторного слоя биохимически "активный" и равномерное для каждого анализа. Секрет экспериментальных успеха при тщательном предварительной обработки сенсорного чипа со стандартизированным очистки и иммобилизации протокол с линкером химические ориентировать молекулы рецептора в активную конформацию. В нашей текущей настройки, мы функционализировать консольные массивы, используя небольшие стеклянные капилляры, что может быть сопряжено с некоторыми недостатками и может быть проблематичным в некоторых случаях. Эти стеклянные капилляры открытый с обоих концов, и поэтому образец растворители могут легко испаряться. Например, если температура функционализации этапе не точно регулировать скорость испарения может значительно варьироваться в разное время особенно при использовании летучие растворители, такие как этанол. Существует также возможность небольшим изменением в инкубационный период от одного кантилевера в другой гИвен, что зондирования жидкостями должны быть загружены последовательно в капилляры. Другим фактором, ограничивающим капиллярного функционализации является отсутствие возможности обеспечить кантилеверов всегда вставляются в капилляры точно таким же образом. Кроме того, иногда кантилеверов должен быть вытащен несколько из капилляров, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение качестве жидких проб может протекать в чип тела. Мы можем решить эти проблемы за счет использования струйных сыщиков в качестве альтернативного способа нанесения поверхность, чтобы покрыть консолей. В то время как это позволило бы точный контроль образцов покрытия с возможностью расширения для больших массивов, наиболее распространенным недостатком является то, что мелкие капли, которые осаждаются на консолях может испариться в течение нескольких секунд и требует контролируемой влажностью. Таким образом, время инкубации не могут быть легко установлены, что может быть желательно для некоторых приложений. Тонкое взаимодействие таких факторов, как образце VOЛуме, время инкубации и скорость испарения оказывают непосредственное влияние на экспозицию из консолей к функционализации образца и ухода должны быть приняты для обеспечения оптимизированной химии поверхности для консоли анализа, как любое небольшое изменение в рецепторе молекулярная плотность будет иметь большое влияние на консольные ответ.

Экспериментальные изменения дизайна (то есть альтернативные методы или материалы)

Для преодоления основных проблем в процедуре получения воспроизводимых покрытие для будущего развития консольной технологии, различные стратегии необходимы, которые будут использовать консоль встроен в микроканалов. Идея состоит в том, что специальные чипы консольные должны быть сконструированы таким образом, что каждая консольная помещается в свой ​​собственный канал, чтобы онлайн на месте процедуры функционализации, где каналы рассматриваются в индивидуальном порядке. Эти экспериментальные модификации дизайна позволит покрытием процесс, который будет выполнятьЭд в контролируемых и закрытых условиях, когда воздействие растворителей точно контролируется инкубационного времени и расхода для автоматического захвата иммобилизации молекул на консольных чипов. То же каналы могут быть затем использованы для фактических экспериментов по связыванию, где все кантилеверов может подвергаться воздействию того же раствора аналита. Кроме того, процедура функционализацию консольные, консольно механизм считывания также нуждаются в улучшении. Оптический метод отклонения луча обладает высокой чувствительностью и оно успешно используется в атомно-силовой микроскопии (АСМ) технологии в течение многих лет. Тем не менее, для бесплатных приложений консольные стоя датчиком оптического считывания имеет некоторые недостатки, например, он не позволяет измерений в непрозрачных жидкостей, таких как кровь, выравнивание массива лазеров может быть трудоемким и утомительным и текущей конфигурации не может отличить между наклоном и вертикальные отклонения. Таким образом, будущее развитие cantilevER технологии должны будут рассмотреть аспекты общей конструкция датчика (например, геометрии консольные) и консольные для считывания надежные протоколы измерений, как в области и лабораторных условиях. Manalis и сотрудники разработали ²² новых типов датчиков полые консольные где консольной встроенных микрожидкостной канал внутри пучка, что позволяет устройству работать в вакууме высококачественной факторов. В этом режиме консоли выступают в качестве микровесов ^22, и, следовательно, больше не является необходимым иметь асимметрия между двумя сторонами по отношению к функционализации, что захват молекулы могут быть физически адсорбированный или ковалентно присоединенный непосредственно на кремний, обычно с использованием ЗРК или силаны ^24. Кантилеверов может быть изменен с тонким слоем полимера, который затем конъюгируют с антителами ²⁵ для биохимических зондирования.

Поиск и устранение неисправностей

Общие ProБлем связанные с консольной измерения является введение пузырьков воздуха в микрофлюидном проточной ячейки. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха вводят в жидкую клетку при монтаже чипа. Сигнал дрейфующих также еще одна распространенная проблема, вызванная различиями в температуре образцов. Консолей должны быть доведены до стабилизации перед измерениями предпринимаются. Все буферы, анализируемых и регенерации решения должны храниться в том же помещении, консольные инструмента, позволяющего все решения имеют одинаковую температуру. Несмотря на то, шприцевой насос может обеспечить очень точное и чрезвычайно низких скоростей потока, как правило, связаны с механический шум в консольном измерений. Поэтому очень важно разработать простой и эффективный подавления шумов, чтобы избежать ненужного шума в отклонение сигналов. Шум редуктор состоит из небольшой резервуар для жидкости расположен между шприцевой насос и жидкость клетка, которая поглощает тон механический шум от насоса. В связи с деликатным характером оптический детектор, система измерения консольные идеале должны работать в закрытом настройки, чтобы блокировать любые бродячих огней от вмешательства с оптической системой считывания. Кроме того, в качестве чувствительного слоя могут значительно уменьшить, если большое количество стадий промывки выполняются на консоли ограничивает срок службы микросхемы датчика.

Альтернативные или будущих приложений после овладения этой техникой

Консоли покрытые ЗРК заканчивающуюся амино-или карбоксильные группы могут быть использованы в качестве датчиков рН. Функциональные концевые группы протонирования и депротонирования в зависимости от рН раствора и может генерировать поверхностный заряд, который приводит кантилевер гнуть ^24. Учитывая, что кантилевер датчики могут отслеживать лекарственной целевой взаимодействий, связанных с дестабилизацией клеточной стенки бактерии ^1,6,7 жизни, они будут поэтому способствоватьпоиска и разработки нового поколения антибиотиков для борьбы с лекарственной устойчивостью инфекций. В будущем консолей будет использоваться в качестве микровесы для измерения массы и темпы роста отдельных клеток ^26. Консольные технология окажется полезной для изучения клеточных реакций на различные факторы роста или наркотиков. Она также будет предлагать новый инструмент для быстрого обнаружения нескольких биомаркеров, которая имеет непосредственное отношение в медицинских и точка-санитарной помощи приложений. Учитывая универсальность, малый размер, и устойчивость консольной датчики, они образуют чувствительный монитор вредных факторов окружающей среды. Они уже продемонстрировали свою чувствительность в выявлении токсичных и вредных газов, которые могут вырваться из лаборатории и промышленных объектов производства в окружающую среду, например, плавиковой кислоты ²⁷ или цианистый водород ^28.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements