ड्रग लक्ष्य सहभागिता और जीवाणुरोधी प्रतिरोध जांच की nanomechanics

Summary

एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है और वर्तमान में मानव जीवन के लिए सबसे बड़ी खतरों में से एक के रूप में कौन से स्थान पर है. यहाँ हम प्रतिरोधी बैक्टीरिया बहुऔषध के खिलाफ उपन्यास और शक्तिशाली एजेंटों की खोज के लिए महत्वपूर्ण जीवाणुरोधी प्रतिरोध, जिसका अंदाजा ब्रैकट प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन.

Abstract

समाधान में इसकी सतह और एंटीबायोटिक दवाओं पर स्थिर मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार मैट्रिक्स के बीच प्रतिक्रियाओं की एक ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करता है जो ब्रैकट सेंसर, अभूतपूर्व संवेदनशीलता और विशिष्टता ^1-5 से जैव रासायनिक संवेदन अनुप्रयोगों में काफी क्षमता दिखाई है. दवा लक्ष्य बातचीत ब्रैकट मोड़, जिससे सतह तनाव उत्पन्न, और यह एक लेजर द्वारा प्रबुद्ध है जब संकेत ऑप्टिकली विश्लेषण किया जा सकता है. नैनो पैमाने परिशुद्धता के साथ मापा सतह तनाव में बदल मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार के बायोमैकेनिक्स के अवरोधों वास्तविक समय में ट्रैक को लक्षित करता है की अनुमति देता है. काफी फायदे की पेशकश के बावजूद, कई ब्रैकट सेंसर सरणियों दवा लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत बढ़ाता में लागू नहीं किया गया है.

यहाँ, हम मात्रात्मक छात्र को बैक्टीरिया कोशिका दीवार मैट्रिक्स नकल उतार alkanethiol आत्म इकट्ठे monolayers साथ लेपित सिलिकॉन कई ब्रैकट सरणियों के उपयोग पर रिपोर्टवि एंटीबायोटिक बाध्यकारी बातचीत. बैक्टीरिया कोशिका दीवार संरचनाओं ^1,6,7 के यांत्रिकी पर vancomycin के प्रभाव को समझने के लिए. हम झुकने कि ब्रैकट दो स्वतंत्र कारकों द्वारा वर्णित किया जा सकता का प्रस्ताव है जो एक नया मॉडल ¹ विकसित की है, मैं) अर्थात् एक शास्त्रीय Langmuir सोखना इज़ोटेर्म द्वारा दिया जाता है जो एक रासायनिक कारक है, जो हम से thermodynamic संतुलन लगातार पृथक्करण की गणना (कश्मीर _घ) और ii) ज्यामितीय कारक, बैक्टीरियल पेप्टाइड रिसेप्टर्स ब्रैकट सतह पर वितरित कर रहे हैं कि कैसे की अनिवार्य रूप से एक उपाय है. पेप्टाइड रिसेप्टर्स (पी) की सतह वितरण ज्यामिति और ligand लोडिंग की निर्भरता की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह पी के एक मूल्य सीमा ~ 10% संवेदन अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है कि दिखाया गया है. इस मूल्य से ऊपर, झुकने संकेत है कि तनाव खुलासा, लगभग रैखिक बढ़ जाती है, जबकि कोई detectable झुकने संकेत है जो नीचे एक स्थानीय रासायनिक बंधन कारकों का एक उत्पाद हैटो और एक ज्यामितीय कारक प्रतिक्रिया व्यक्त क्षेत्रों के यांत्रिक कनेक्टिविटी द्वारा संयुक्त और superbug संक्रमण का मुकाबला करने के लिए शक्तिशाली एजेंटों की डिजाइन के लिए एक नए प्रतिमान प्रदान करता है.

Introduction

जीव विज्ञान और चिकित्सा के आणविक मान्यता प्रतिमान underpins बड़े swathes. औषध विज्ञान में, उदाहरण के लिए लक्ष्य ऐसे transglycoslyation या बैक्टीरिया कोशिका दीवार पेप्टाइड्स की crosslinking catalyzes कि transpeptidation के रूप में एक जैव रासायनिक प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण भागीदार लक्षित करके एक रोग मार्ग के साथ हस्तक्षेप करने के लिए है. दवा डिजाइन इसलिए एक सही फिट प्रेरित करने के लिए एक विशिष्ट जीवाणु डॉकिंग साइट को लक्षित करने के लिए एक उपयुक्त अणु को परिभाषित करने के लिए कम है. इस दृष्टिकोण की सफलता नकल एक क्लासिक उदाहरण पेप्टीडोग्लायकन सेल दीवार, एक जीवाणु की एक संरक्षित संरचनात्मक सुविधा जो लक्ष्य vancomycin (वान), है. एक नवजात ग्राम पॉजिटिव जीवाणु में, पेप्टीडोग्लायकन मैट्रिक्स अनुक्रम डी आला करार दिया यहाँ एक C55 के लिपिड लिंकर ^8-10 के माध्यम से सीमित लाइसिन-D-Alanine-D-Alanine, में समाप्त पेप्टाइड्स के होते हैं. पेप्टीडोग्लायकन व्यापारियों पर ये उजागर पेप्टाइड्स के लिए मौलिक हैंकठोर पर्यावरण बलों के खिलाफ बैक्टीरियल कोशिकाओं के यांत्रिक संरक्षण, और महत्वपूर्ण बात, उन्हें एंटीबायोटिक दवाओं के लिए आदर्श लक्ष्य बना रही है, मानव कोशिकाओं में पाए जाते हैं. वान विशेष रूप से एक मामूली मजबूत वान पेप्टाइड बनाने बैक्टीरिया कोशिका दीवार पेप्टाइड्स के सी टर्मिनस को बांध चित्र 1 में दिखाया के रूप में जटिल. वैन और सामने आ पेप्टाइड्स ^{ब्लॉक,} प्रभावी ढंग से तिर्यक से उन्हें रोक और इसलिए nanomechanically टूटना ^1,6 द्वारा अपनी मौत के लिए अग्रणी बैक्टीरिया कोशिका को कमजोर, सेल दीवारों ¹ के पार से जोड़ने उत्प्रेरित जो transpeptidases और transglycosylases की कार्रवाई के बीच यह बातचीत ^7.

vancomycin प्रतिरोधी उदर (VRE) के उद्भव एक बढ़ती स्वास्थ्य समस्या ¹¹ है और enterococci में बैक्टीरियल प्रतिरोध एक एमाइड लिन की सूक्ष्म परिवर्तन के कारण पैदा होती है क्योंकिएक एस्टर उठाना ^8, जीवाणु हटाता बाध्यकारी जेब के बाद संशोधन के साथ वैन की डॉकिंग साइट से एक भी हाइड्रोजन बांड की सतह पर इस deceptively सरल संरचनात्मक परिवर्तन करने Kage. महत्वपूर्ण बात है कि इस प्रक्रिया से वान डी लाख बंधन संबंध में एक महत्वपूर्ण कमी उपज, यहाँ डी लाख करार दिया, एक लाइसिन-D-Alanine-D-लैक्टेट ^10,12 को vancomycin के अतिसंवेदनशील उदर (VSE) में pentapeptide टर्मिनल alanine उपस्थित बदल Enterococcal संक्रमण ^1, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया की भारी वृद्धि के खिलाफ उपचारात्मक अप्रभावी परिमाण प्रतिपादन वैन के आदेश तीन इसलिए प्रतिरोधी जीवाणु बहुऔषध खिलाफ जीवाणुरोधी एजेंटों की जीवाणुरोधी गतिविधि या अधिक शक्तिशाली दवाओं की खोज में तेजी लाने और बहाल करने के लिए नवीन दृष्टिकोण का विकास गाड़ी चला रहा है संक्रमण.

सीटू संदर्भ में उपयोग करता है और प्रति घंटे दवाओं की. खास मेंular कई ब्रैकट सेंसर सरणियों vancomycin के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण हैं - vancomycin के लिए प्रतिरोध अनिवार्य रूप से एक यांत्रिक समस्या ^1,6,7 है. समाधान में एक मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार लक्ष्य और वैन के बीच प्रतिक्रियाओं दवा लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत से प्रेरित नैदानिक ​​प्रासंगिक तनाव में परिवर्तन की निगरानी से पता लगाया जा सकता है. एक ब्रैकट झुकने संकेत में ही प्रकट होता है, जो सतह प्रतिक्रियाओं से उत्पन्न तनाव एक लेजर बीम के साथ रोशन सेंसर द्वारा ऑप्टिकली विश्लेषण किया जाता है. इसके अलावा ब्रैकट सेंसर के शीर्ष पर बैक्टीरियल सतह लक्ष्य अणुओं की ग्रहणशील कोटिंग द्वारा सिलाई, analytes की एक संयुक्त राष्ट्र के सीमित संख्या (वान), विशिष्ट जैव रासायनिक बातचीत के करीब है और मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार मैट्रिक्स के बायोमैकेनिक्स वास्तविक समय में निगरानी रखी जाती है. इसके अलावा आणविक मान्यता घटना से, डीईएफ़ ब्रैकट सेंसर पैदा कर सकता है कि कई कारक हैंतापमान विविधताओं, unspecific बाध्यकारी या समाधान का अपवर्तनांक का परिवर्तन - जिसमें शामिल लेवल,. , अविशिष्ट संकेतों के लिए खाते में मापने और संदर्भ cantilevers दोनों के झुकने लगातार विशिष्ट बातचीत का विश्लेषण करने के लिए निगरानी कर रहे हैं जहां सीटू अंतर माप में प्रदर्शन कर रहे हैं. इसके अलावा, सतह chemistries और ज्यामिति पर निर्भर करती है जो ब्रैकट सेंसर का पता लगाने संवेदनशीलता पी ब्रैकट के पूरे ऊपर की सतह क्षेत्र पर कब्जा अणुओं के कब्जे सतह क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है, जहां सतह घनत्व पी (ट्यूनिंग द्वारा बढ़ाया जा सकता है एक्स - रे Photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) के ¹ द्वारा निर्धारित रूप में अणुओं की कुल आबादी से कवर किया.

यहाँ इस प्रोटोकॉल का विवरण कैसे बफर समाधान में नैदानिक ​​प्रासंगिक सांद्रता में बैक्टीरिया कोशिका दीवार अग्रदूत एनालॉग (mucopeptides) के लिए बाध्य vancomycin के या किसी भी अन्य एंटीबायोटिक एकएन डी रक्त सीरम लेबल से मुक्त ब्रैकट प्रौद्योगिकी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है. आत्म इकट्ठे monolayers (SAMs) आसानी से साफ सोना ^13,14 पर स्थिर परतों के रूप में करते हैं क्योंकि ताजा सोने की सतहों उपयोग किया जाता है. SAMs आम तौर पर दूसरे छोर पर वांछित कैप्चरिंग इकाई स्वतंत्र रूप से समाधान में analyte के लक्ष्य के साथ बातचीत करने की अनुमति दी है, जबकि covalently सोने की सतह पर संलग्न एक thiol आधा भाग के साथ छोटे अणु होते हैं. Thiols विशेष रूप से विभिन्न रासायनिक अंत समूहों के साथ कई thiol यौगिकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं या आसानी से एक प्रयोगशाला में संश्लेषित कर रहे हैं यह देखते हुए कि एक लचीला प्रणाली के रूप में. हालाँकि, ध्यान एक thiol आधा भाग अणुओं के साथ सही अंत समूहों होनी चाहिए कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, एक प्रोटीन या पेप्टाइड संयुग्मन में उदाहरण के लिए, एमिनो समूह पर सीमित thiol आधा भाग के कार्बोक्जिलिक समूह के साथ प्रतिक्रिया के लिए अंदर की ओर का सामना करना चाहिए घटित होने की सतह. इधर, thiols ख से बैक्टीरियल लिपिड द्वितीय के त्रिपेपटाइड mimetics साथ सीधे संयुग्मित थेacterial कोशिका दीवार का उपयोग कर ठोस चरण कार्यप्रणाली से संश्लेषित लक्ष्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वांग-D-अला और वांग-डी लाख रेजिन और मानक Fmoc की रक्षा समूह के रसायन विज्ञान के ¹⁵ preloaded. इस विवरण vancomycin के लिए ध्यान केंद्रित किया है, यह स्पष्ट रूप से अन्य एंटीबायोटिक दवाओं के लिए बढ़ाया जा सकता है और वास्तव में आगे के अध्ययन के विभिन्न विशेष रूप से जैव रसायन, औषध विज्ञान में खेतों, और आसानी से अपने खुद के प्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाने के लिए सामग्री विज्ञान के शोधकर्ताओं द्वारा आमंत्रित किया जाता है.

Protocol

1. Cantilevers की तैयारी

1. Teflon चिमटी विसर्जित ब्रैकट चिप्स के चयनित संख्या का उपयोग करते हुए 20 मिनट के लिए एक नया तैयार पिरान्हा समाधान (अनुपात 1:1 में एच ₂ एसओ ₄ और ₂ एच ओ ₂₎ में (100 मीटर चौड़ा और 0.9 माइक्रोन मोटी लंबी 500 माइक्रोन, मापने प्रत्येक ब्रैकट) .
2. लगभग 20 मिनट पिरान्हा समाधान से ब्रैकट चिप्स हटाने और विआयनीकृत पानी के साथ उन्हें अच्छी तरह कुल्ला और तुरंत एक नया तैयार पिरान्हा समाधान में स्थानांतरण के बाद. चिप्स अन्यथा अगले कदम के लिए आगे बढ़ना गंदगी के धब्बे होते हैं अगर ऊपर 1.1 कदम दोहराएँ.
3. विआयनीकृत पानी में पूरी तरह से सफाई के बाद, शुद्ध इथेनॉल के साथ कुल्ला और पानी के किसी भी निशान को दूर करने के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर ब्रैकट चिप्स सूखी. उनकी सफाई की पुष्टि के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उन्हें निरीक्षण किया.
4. एक वाष्पीकरण कक्ष को साफ ब्रैकट चिप्स स्थानांतरण और नीचे पंप, एक निर्वात का लक्ष्य रखा10 ^-7 मिलीबार का दबाव.
5. मोटी 20 एनएम सोने की एक अतिरिक्त परत से पहले एक आसंजन परत के रूप में कार्य करने के लिए पहले एक 2 एनएम टाइटेनियम के साथ प्रत्येक ब्रैकट सरणी की वैक्यूम दबाव प्राप्त हो जाने के बाद, कोट एक तरफ. उनकी मोटाई की पुष्टि करने के लिए, सीधे लक्ष्य स्रोत से ऊपर रखा क्वार्ट्ज क्रिस्टल की निगरानी का उपयोग करें.
6. उद्घाटन से पहले वैक्यूम के अंतर्गत शांत करने के लिए 1-2 घंटे के लिए सदन में सोने लेपित ब्रैकट सेंसर चिप्स छोड़ दें.
7. संदूषण के किसी भी रूप को रोकने के लिए आर्गन से भरा एक वैक्यूम भंडारण पोत को हौसले से सुखाया चिप्स स्थानांतरण.

2. ब्रैकट चिप functionalization

1. सबसे पहले, 250 माइक्रोन के ब्रैकट पिच आकार के अनुसार ² एक functionalization के मंच पर सूक्ष्म केशिका ट्यूब की व्यवस्था.
2. फिर सतह लक्ष्य अणुओं की 2 मिमी ethanolic thiol समाधान, यानी बैक्टीरिया mucopeptides (डी अला और डी लाख) इंजेक्षन, और एक 'inerटी 'alkanethiol biomolecular सोखना विरोध करने के लिए जाना जाता triethylene glycol (खूंटी) में समाप्त. ¹⁶ केशिका tubings के प्रत्येक उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह से बचने के लिए बेतरतीब ढंग से निर्धारित एक मिश्रित सतह पर कब्जा अणुओं को शामिल करना चाहिए.
3. Microcapillaries में 20 मिनट cantilevers के लिए अगला सेते सतह पर कब्जा अणुओं युक्त thiol समाधान के साथ भरा. सतह पर कब्जा अणुओं का समाधान पार संदूषण से बचने या कम करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति ब्रैकट सेंसर पर सीमित कर रहे हैं सुनिश्चित करें. इस प्रक्रिया को सही ढंग से कार्यरत है, तो इसे व्यवस्थित रिसेप्टर्स के रूप में सोने लेपित सतहों पर फार्म बैक्टीरियल mucopeptide लक्ष्य के SAMs अनुमति देकर गठन रासायनिक सक्रिय सेंसर में नया तैयार सोने लेपित cantilevers में परिवर्तन करना चाहिए.

3. समाधान तैयारी

1. Ultrapure पानी (MΩ 18.2 · सेमी प्रतिरोधकता) और मिश्रण टी में 0.1 एम मोनो और Di-बुनियादी सोडियम फास्फेट लवण भंग7.4 का पीएच मान उपज ओ.
2. कांच के बने पदार्थ के लिए दवा अणुओं की अविशिष्ट बातचीत के कारण एकत्रीकरण प्रभाव को कम करने के लिए बफर समाधान के लिए PS80 की 0.002% जोड़ें.
3. कश्मीर _घ की गणना सक्षम हो जाएगा कि वांछित अलग सांद्रता के हौसले बफर समाधान के साथ दवाओं पतला.
4. 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग हौसले से तैयार दवा समाधान फ़िल्टर और आर्गन साथ मिटाने से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए sonicate.
5. पूरे सीरम का उपयोग कर बफर सीरम में दवा के साथ प्रक्रिया दोहराएँ. पूरी विलेयता सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त 5 मिनट से 15 मिनट के लिए धीरे भंवर.

4. सतह तनाव जांच

1. एक तरल प्रवाह सेल चेंबर में एक functionalized ब्रैकट सेंसर चिप लोड.
2. प्रत्येक संवेदक के मुक्त अंत पर लेजर हाजिर संरेखित और 1 डिग्री सेल्सियस के लिए तरल कक्ष को गर्म करके संरेखण की पुष्टि सभी आठ स्वर्ण लेपित ब्रैकट सेंसर सरणियों व्यापक गुजरना चाहिएssive नीचे क्योंकि सिलिकॉन और सोने के विस्तार की दरों में अंतर की वजह से द्विधात्विक प्रभाव के झुकने.
3. लगभग 10 मिनट के लिए गर्म करने के बाद, cantilevers के आगे 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
4. झुकने के संकेत के सापेक्ष मानक विचलन ≤ 5% तो अन्यथा प्रक्रिया को दोहराने वांछनीय के रूप में संरेखण स्वीकार है व्यक्तिगत ब्रैकट सेंसर के बीच और अगर अधिकतम झुकने संकेतों पर झुकने भिन्नता की गणना.
5. अगला, सभी आठ cantilevers की गुंजयमान आवृत्तियों उनके वसंत स्थिरांक की गणना करने के उपाय. एक चिप के भीतर प्रत्येक ब्रैकट सेंसर के बीच निरंतर वसंत की भिन्नता ≤ 1% तो लगातार यांत्रिक गुणों अन्यथा ब्रैकट चिप सेंसर की जगह होने के रूप में चिप स्वीकार है.
6. अगला, डाटा अधिग्रहण एक स्वचालित Labview के इतने प्रयोग कर प्राप्त किया जाना चाहिए, जबकि प्रवाह कक्ष के भीतर तरल मुद्रा प्राप्त करने के लिए एक छह तरह वाल्व के माध्यम से एक fluidic प्रणाली (मॉडल जिन्न प्लस) का उपयोग करेंftware.
7. डेटा झुकने ब्रैकट पर नजर रखने के लिए, निम्न माप प्रोटोकॉल का उपयोग करें: मैं) एक आधारभूत स्थापित करने के लिए 5-30 मिनट के लिए स्थायी नियंत्रण माप के लिए दवा के बिना बफर समाधान या सीरम या तो इंजेक्षन ii) 30-60 मिनट के लिए दवा समाधान इंजेक्षन, iii) बाध्य दवा जटिल अलग कर देना करने के लिए 10-60 मिनट के लिए 10 मिमी एचसीएल धोने इंजेक्षन, iv) अंत में सतह पेप्टाइड्स पुनर्जीवित करने और आधारभूत संकेत बहाल करने के लिए एक और 5-30 मिनट के लिए बफर समाधान का उपयोग कर एक और धोने कदम इंजेक्षन. हमेशा सभी संकेतों 30-180 μl / मिनट की लगातार तरल प्रवाह की दर के नीचे और एक तापमान नियंत्रित कैबिनेट में 25 डिग्री सेल्सियस के निर्धारित तापमान पर अर्जित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं.
8. सभी आठ cantilevers की पूर्ण झुकने संकेतों को एक ही स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर के साथ ऑप्टिकल किरण विधि मल्टिप्लेक्स धारावाहिक समय उपयोग पर नजर रखी जानी चाहिए.
9. दवा के प्रत्येक एकाग्रता से झुकने संकेतों का विश्लेषण करने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप अंतर bendings एक अंतर stres में परिवर्तित कर रहे हैंस्टोनी के समीकरण का उपयोग ब्रैकट के ऊपरी और निचले पक्षों के बीच है.

Representative Results

एक भी एच बंधन हटाए जाने को अभूतपूर्व संवेदनशीलता के साथ नैनो पैमाने परिशुद्धता का उपयोग करके मापा तनाव परिवर्तन, वास्तविक समय (आंकड़े 2a-घ) में मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार बायोमैकेनिक्स के अवरोधों को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. वान के लिए दवा का पता लगाने संवेदनशीलता की सीमा क्रमानुसार ~ -9 के एक औसत ± को जन्म दे रही सबसे कम detectable एकाग्रता के रूप में 10 एनएम (~ 15 एनजी / एमएल) का खुलासा, 1000 माइक्रोन से ≤ 10 एनएम के लिए कदम में इसकी सांद्रता गिराए द्वारा जांच की गई 2 अंतर झुकने संकेत (चित्रा 2c) के रूप में एनएम. शारीरिक वातावरण में एंटीबायोटिक दवाओं का पता लगाने की क्षमता आगे 3-27 माइक्रोन ¹⁷ के एक चिकित्सकीय प्रासंगिक एकाग्रता रेंज में सीरम में जांच की गई. समान शर्तों के तहत सभी cantilevers भर सीरम में 7 माइक्रोन वान (90% भ्रूण बछड़ा सीरम प्लस 10% सोडियम फास्फेट बफर पीएच 7.4), के लिए अंतर संकेत के इंजेक्शन परसीरम में डाला था 105 ± 4 एनएम DLac लेपित cantilevers के लिए, कोई झुकने (चित्रा 3) मनाया गया. Dala लेपित (vancomycin के अतिसंवेदनशील) cantilevers के लिए मनाया काफी झुका संकेत मजबूत दवा लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत की वजह से हैं. हालांकि DLac लेपित (vancomycin प्रतिरोधी) cantilevers, vancomycin के बंधन जेब ^10,12 में ऑक्सीजन लोन जोड़ी और कम एनएच बांड की जमीन राज्य प्रतिकर्षण की उपस्थिति के लिए कम समय में जो परिणाम दवा लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत के कमजोर करने के लिए योगदान या कोई ब्रैकट विशेष रूप से कम vancomycin के सांद्रता (चित्रा 3) के लिए, झुकने. हालांकि, उच्च vancomycin के एकाग्रता के लिए, हम DLac लिए measureable झुकने संकेतों का पालन. इसके अलावा, हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन सीटू संदर्भित में के लिए महत्वपूर्ण है, जहां सभी सीएDala और DLac दोनों के साथ लेपित ntilevers एक साथ वास्तविक समय में एक ही विश्लेष्य के संपर्क में हैं.

रसायन शास्त्र और ज्यामिति की सटीक भूमिका को समझते हैं, हम विलायक बातचीत और सतह यांत्रिकी के बीच संबंध का वर्णन एक मॉडल ¹ बनाया गया. यह सतह तनाव पैदा करता है:

p> पीसी और नहीं तो शून्य (1) के लिए

समीकरण में पहले कार्यकाल (1) दवा लक्ष्य बाध्यकारी घटनाओं के लिए लेखांकन और दूसरे कार्यकाल के बल नेटवर्क के गठन का बड़े पैमाने पर यांत्रिक परिणामों का वर्णन शक्ति कानून का रूप है, Langmuir सोखना इज़ोटेर्म है. सभी सुलभ बाध्यकारी साइटों पर कब्जा कर रहे हैं जब लगातार एक अधिकतम सतह तनाव से मेल खाती है और कश्मीर _घ सतह संतुलन हदबंदी विपक्ष हैब्रैकट पर उग्रवादी. चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में विश्लेषण खुलासा मापा अंतर तनाव संकेतों पर आरोपित समीकरण की वैश्विक फिट (1) का परिणाम है, एक ~ 29.7 ± 1.0 या 14.1 ± 3.0 करोड़ / मी और कश्मीर _घ ~ 1.0 ± 0.3 या 800 ± 310 सतह तनाव का एक उपाय के लिए एक मेल खाती सब सुलभ बाध्यकारी साइटों पर कब्जा कर रहे हैं, जहां डी आला या DLac पेप्टाइड्स के लिए माइक्रोन. ब्रैकट की बढ़ी संवेदनशीलता एंटीबायोटिक सांद्रता (चित्रा 5) क्रमश: 10, 100 पर तय हो गई है, और 250 माइक्रोन जबकि पी के एक समारोह के रूप में तनाव डेटा की निगरानी करते हुए व्यवस्थित पेप्टाइड घनत्व पी अलग से देखते था. पेप्टाइड घनत्व पी पर तय हो गई है, जबकि ~ 100% प्रक्रिया वान सांद्रता के एक समारोह के रूप में तनाव के साथ दोहराया गया था.

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चित्रा 1. एंटीबायोटिक सतह बाध्यकारी बातचीत की ब्रैकट पता लगाने. दवा लक्ष्य बातचीत nanomechanically पता चला रहे हैं, जिसमें से एक ब्रैकट संवेदक सरणी और मोड के एक) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ख) एक दवा अणु (वान) और बैक्टीरियल mucopeptide अनुरूप (डी आला या डी लाख) के बीच रासायनिक बंधन बातचीत. ग) एक उत्परिवर्तित vancomycin के अतिसंवेदनशील बैक्टीरिया (VSE) बाध्यकारी जेब में एच बांड एक भी हटा कर vancomycin के लिए प्रतिरोध का अधिग्रहण जिसके द्वारा. तंत्र बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. वास्तविक समय में मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार बायोमैकेनिक्स के अवरोधों ट्रैकिंग. एक) डी आला, डी लाख और फॉस्फेट बफर और 250 माइक्रोन vancomycin में खूंटी लेपित cantilevers की निरपेक्ष झुकने का संकेत है. अंतर खूंटी संदर्भ संकेतों काले लाइनों में दिखाए जाते हैं. ख) डी अला और फॉस्फेट बफर और 250 माइक्रोन vancomycin में डी लाख लेपित cantilevers के समय के एक समारोह के रूप में एक खुराक निर्भर संकेत की. ग) अंतर ब्रैकट विक्षेपन की विभेदक झुकने संकेत एक के रूप में क्रमश: 10 एनएम (पीली लाइन), 100 एनएम (लाल रेखा) और 1000 एनएम (गहरे लाल रेखा) के क्रम में vancomycin के सांद्रता की उपस्थिति में. घ) तीन के लिए अंतर ब्रैकट विक्षेपन संकेत डी आला लेपित ब्रैकट सेंसर 10 की उपस्थिति में समय का समारोहएनएम vancomycin के. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3. एक डी अला और बछड़ा भ्रूण सीरम में 7 माइक्रोन vancomycin की उपस्थिति में डी लाख लेपित cantilevers के लिए वास्तविक समय में मॉडल बैक्टीरिया कोशिका दीवार बायोमैकेनिक्स के अवरोधों की ट्रैकिंग.

4 चित्रा. दवा लक्ष्य बातचीत की nanomechanics जांच. डी आला (काला हलकों) और डी लाख (लाल हलकों) vancomycin के रूप में एक समारोह लेपित cantilevers के लिए मापा अंतर सतह तनाव प्रतिक्रिया दिखा प्लॉटसमाधान में एकाग्रता [वान]. डेटा समीकरण (1) (ठोस लाइनों) द्वारा वर्णित हैं. ¹

चित्रा 5. मिश्रित monolayers के माध्यम रिसेप्टर लदान और ज्यामिति की निर्भरता की जांच से रिसेप्टर ligand के बातचीत के nanomechanical संवेदनशीलता का पता लगाने के अनुकूलन. में निश्चित vancomycin के सांद्रता की उपस्थिति में एक डी आला के समारोह सतह कवरेज, पी के रूप में ब्रैकट सेंसर से मापा अंतर सतह तनाव प्रतिक्रियाओं 10 माइक्रोन (काला लाइन), 100 माइक्रोन (लाल रेखा), और 250 माइक्रोन (ग्रीन लाइन) पर समाधान.

Discussion

इन परिणामों ब्रैकट सरणी सेंसर विशेष रूप से दवा के बंधन जेब से एक भी एच बंधन का विलोपन के साथ जुड़े vancomycin के विरोध में दवा लक्ष्य बाध्यकारी बातचीत में परिवर्तन का पता लगाने और यों तो संवेदनशीलता है कि प्रदर्शित करता है. हम पिछले भूतल plasmon अनुनाद (एसपीआर) पढ़ाई ^18,19 के साथ समझौते में वैन का एक nanomolar पता लगाने संवेदनशीलता दिखाने के लिए, और नियमित नैदानिक ​​व्यवहार में लागू के रूप में ब्रैकट विधि सीधे नैदानिक ​​प्रासंगिक सांद्रता में रक्त में दवा अणुओं का पता लगाने और यों सकता है प्रकट करते हैं. हमारे डेटा अंतर सतह तनाव यानी (i) के विशिष्ट दवा लक्ष्य बाध्यकारी घटनाओं, और बीच में यांत्रिक कनेक्टिविटी का वर्णन (ii) ज्यामितीय अवधि का वर्णन एक रासायनिक अवधि रासायनिक प्रतिक्रिया व्यक्त की एक उत्पाद के फार्म समीकरण (1), द्वारा वर्णित किया जा सकता है कि सुझाव सतह साइटों, जिसका अर्थ है कि वैश्विक मैकेनिक से दसगुणा स्थानीय रासायनिक बातचीतब्रैकट के अल बातचीत. रासायनिक अवधि शास्त्रीय Langmuir सोखना इज़ोटेर्म द्वारा दिया जाता है, ज्यामितीय अवधि दवा लक्ष्य प्रेरित सतह तनाव परिवर्तन का एक percolative तंत्र का पता चलता है. एक अपेक्षाकृत बड़े सतह अंश एंटीबायोटिक अणु के कब्जे में है जब महत्वपूर्ण दहलीज पीसी ~ 10% (चित्रा 5) है कि सतह तनाव दिखा, झुकने अंतर ब्रैकट का पता लगाने के लिए आवश्यक था सामूहिक transduced है. पी के लिए ≥ पीसी, रासायनिक तब्दील सतह साइटों के बीच यांत्रिक कनेक्टिविटी धीरे - धीरे स्थापित किया है, और इस तरह के nanomechanical के नेटवर्क के नोड्स के बीच steric बातचीत के रूप में कम दूरी प्रतिकारक बातचीत पूरे ब्रैकट के नीचे झुकने में वृद्धि को जन्म देता है. यह हमारे nanomechanical टपकन मॉडल असली बैक्टीरिया में कार्रवाई की glycopeptide एंटीबायोटिक मोड में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं कि अनुमान लगाया है. इन निष्कर्षों के लिए ब्रैकट प्रौद्योगिकी की उच्च संवेदनशीलता को उजागरकार्रवाई के एंटीबायोटिक्स 'मोड tudying और superbug संक्रमण की समस्याओं को नियंत्रित करने के लिए शक्तिशाली दवाओं की खोज को सूचित और सक्षम करने के लिए नैनो पैमाने पर एंटीबायोटिक दवाओं के संचालन की समझ में सुधार करने के लिए दवाओं के अध्ययन के लिए एक उपन्यास अनुसंधान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील मापन के लिए ब्रैकट प्रणाली तैयार करने के लिए, हम विशेष रूप से microfluidic सेल और मात्रात्मक nanomechanical detections के अनुमति देने के लिए मानक संचालन प्रक्रिया में नमूना लोड करने के लिए, प्रोटोकॉल में लक्ष्यों का एक सेट को संबोधित किया है.

मौजूदा तरीकों के संबंध में ब्रैकट प्रौद्योगिकी का महत्व

संक्षेप में हम इस तकनीक का अधिक से अधिक 25 साल पहले प्रस्तावित किया गया था, जबकि यह क्योंकि चिकित्सकीय प्रासंगिक ठिकानों पर सावधान और दोहराव माप की कमी के क्लिनिक में अपना रास्ता नहीं मिला है कि बाहर बिंदु. यहाँ हम मैकेनिक की जांच के लिए nanomechanical उपयोग कर cantilevers की प्रासंगिकता को स्थापित प्रक्रियाओं है कि प्रदर्शितबैक्टीरिया कोशिका दीवार ठिकानों पर और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अल प्रभाव. पारंपरिक दवा स्क्रीनिंग तरीकों अक्सर एक प्रतियोगी या एंजाइमी बाध्यकारी परख और प्रोटीन assays के ²⁰ के सिलसिले में अपने लक्ष्य के लिए एक analyte के बंधन, को मापने के लिए एक पत्रकार के अणु के फ्लोरोसेंट या रेडियोधर्मी लेबलिंग के कुछ प्रकार की आवश्यकता होती है. Biomolecules के लेबल न केवल समय लेने वाली और महंगा है, लेकिन लेबल भी झूठी नकारात्मक करने के लिए अग्रणी, बाध्यकारी साइट निरोधक द्वारा आणविक बातचीत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट यौगिकों अक्सर पृष्ठभूमि बाध्यकारी और झूठी सकारात्मक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो हाइड्रोफोबिक हैं. इन सीमाओं के कारण, लगभग किसी भी आणविक जटिल न्यूनतम परख विकास के साथ जांच की जा करने की अनुमति है कि उपन्यास लेबल मुक्त तकनीक में एक बढ़ती रुचि है. वर्तमान में सबसे स्थापित लेबल से मुक्त सतह प्रौद्योगिकियों एसपीआर और क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance (QCM) हैं. एसपीआर के विपरीत कि उपाय वेंई ढांकता हुआ निरंतर, एक लेबल - मुक्त ब्रैकट प्रौद्योगिकी सीधे सतह रिसेप्टर्स के लिए ligands के विशिष्ट बंधनकारी द्वारा उत्पन्न nanomechanical बलों के उपाय कर सकते हैं जो एक ligand-रिसेप्टर बातचीत के द्वारा उत्पन्न की सतह तनाव का पता लगाता है. इन सेंसरों की विशिष्टता प्रौद्योगिकी विशिष्ट अध्ययन के लिए अनुकूल है, जिससे उनकी संवेदनशीलता एसपीआर और QCM में बल्कि में विमान सतह के तनाव में एक सूक्ष्मतम प्रेरित परिवर्तन पर के रूप में बाध्यकारी विश्लेष्य के कारण बड़े पैमाने पर परिवर्तन के कारण ढांकता हुआ गुणों पर निर्भर नहीं करता है चिकित्सकीय प्रासंगिक एंटीबायोटिक सांद्रता (3-27 सुक्ष्ममापी) ¹⁷ पर दवा अणुओं की nanomechanics. Cantilevers भी विशेष रूप से अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर दवा उद्योग का आधार है और इसलिए दवाओं की खोज में एक पूरक उपकरण के रूप में काम करेगा जो परिसर के वातावरण सहित शारीरिक शर्तों के तहत छोटे अणु (जैसे डीएनए टुकड़े और दवाओं के रूप में) का पता लगाने के लिए अनुकूल हैं. ब्रैकट प्रौद्योगिकी सफलतापूर्वक लागू किया गया हैजीनोमिक्स ^3,5 के क्षेत्र, गैस संवेदन ^21, प्रोटिओमिक्स ^22, और दवाओं ^1. इसके अलावा, cantilevers के कम लागत सिलिकॉन प्रौद्योगिकी और प्रक्रियाओं microfabrication के साथ अपनी संगतता के कारण का उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं, cantilevers के कई दवा यौगिक स्क्रीनिंग और उच्च throughput जानकारी युक्त स्क्रीनिंग assays के लिए सेंसर की बड़ी सरणियों में सुधार संवेदनशीलता और parallelization के लिए छोटी की जा सकती है. उपकरण और प्रयोगात्मक डिजाइन के सुधार बातचीत की एक विस्तृत विविधता प्रतिरोधी संक्रमण बहुऔषध की समस्याओं से निपटने के लिए superdrugs की एक नई पीढ़ी के लिए खोज अग्रिम में मदद करने के लिए वास्तविक समय में विश्लेषण किया जा करने की अनुमति देगा.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

मजबूत माप प्रोटोकॉल के विकास के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. संतोषजनक मात्रात्मक दवा लक्ष्य माप प्राप्त करने के लिए और टी एंटीबायोटिक दवाओं के सबसे कम एकाग्रता का निर्धारणटोपी प्रोटोकॉल के भीतर सीरम, महत्वपूर्ण कदम संबोधित कर रहे थे बफर या रक्त में पाया जा सकता है. पहला काम ट्यूनिंग और ब्रैकट पता लगाने विशिष्टता और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए सतह पर कब्जा chemistries के अनुकूलन शामिल है. इसमें शक नहीं, सतह तनाव पारगमन प्रतिक्रियाशील रासायनिक क्षेत्रों के बीच संपर्क स्थापित करने के लिए कवर किया जाना है सतह का एक अपेक्षाकृत बड़े अंश की आवश्यकता होती है, एक सामूहिक घटना है. हम अंतर्निहित सतह पेप्टाइड्स के घनत्व, एक महत्वपूर्ण दहलीज अलग से ~ पी ≥ 10%, निर्धारित किया जाता है पता चलता है कि जहां एक पेप्टाइड घनत्व के समारोह और नहीं तो शून्य (चित्रा 5) के रूप में सतह तनाव पैमाने. यह प्रयोगों संवेदनशील मापन के लिए अधिकतम संकेत deflections को सुनिश्चित करने के लिए cantilevers के साथ तनाव की एकरूपता की जांच के लिए तैयार कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कुशल सतह उत्थान प्रोटोकॉल जिससे कई चक्र माप की अनुमति, जगह में हो सकता है और प्रत्येक tes के लिए लागत को कम करने की जरूरत हैटी. Thiolated हाइड्रोफोबिक अंत का उपयोग कर एक रिसेप्टर सतह डिजाइन करते समय, उन दोनों के बीच रिसेप्टर अणु और रिक्ति के उन्मुखीकरण के अणुओं के बीच वान डेर-वाल्स बातचीत के कारण घने पैकिंग के आत्म विधानसभा अविशिष्ट बातचीत कम करने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, कब्जा अणुओं संवेदन मैट्रिक्स का कुछ हिस्सा uncoated सोने की सतह के साथ सीधे प्रतिक्रिया से analyte के समाधान में अणुओं की प्रविष्टि को रोकने के लिए हाइड्रोफिलिक होने की अनुमति देने के लिए एक polyethylene glycol (खूंटी) लिंकर शामिल करना चाहिए. खूंटी लिंकर अणुओं स्पेसर steric बाधाओं को कम करने और इसलिए समाधान analytes measureable सतह तनाव परिवर्तन प्रेरित करने के लिए सतह रिसेप्टर्स के साथ विशेष रूप से बातचीत करने की अनुमति के रूप में कार्य करना चाहिए. ब्रैकट सरणी सेंसर सीटू संदर्भ माप में कम से कम एक साथ assayed और वास्तविक समय में प्रदर्शित संकेत एक अंतर विक्षेपन है, एस से संदर्भ ब्रैकट का पूर्ण विक्षेपन घटाकर प्राप्त किया जाना चाहिएcantilevers ensing. इस प्रकार एक संदर्भ ब्रैकट जैसे तापमान परिवर्तन, अपवर्तनांक या ब्रैकट nonfunctionalized नीचे पर बातचीत में परिवर्तन के रूप में अविशिष्ट बातचीत के लिए खाते में करने के लिए आवश्यक है. यह तरल पदार्थ के कुशल विनिमय और समाधान सामग्री की पर्याप्त स्थिर जन परिवहन सुनिश्चित करता है क्योंकि प्रवाह दर (~ 30-150 μl / मिनट) के अनुकूलन प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम के रूप. एक तरल सेल का डिजाइन तेजी से प्रवाह की दर के लिए अधिकतम मात्रा (5-80 μl) जन परिवहन सीमाओं को पार करने के लिए सही तरल विनिमय सक्षम करने की अनुमति मिलनी चाहिए. गतिज माप ²³ प्रदर्शन करते हुए प्रवाह दर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. बड़ी मात्रा में तरल कक्षों अनावश्यक परख की कीमत बढ़ जाती है जो बड़े नमूना मात्रा आवश्यकताओं, के लिए अग्रणी बेकाबू उच्च प्रवाह दर की आवश्यकता होती है. पहले हम माप तरल चेंबर में विभिन्न नमूनों इंजेक्षन गुरुत्वाकर्षण प्रवाह का इस्तेमाल किया है. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह फायदा है कि यह हरिणीकिसी भी यांत्रिक भागों की आवश्यकता नहीं है और इसलिए इस प्रणाली में अतिरिक्त शोर परिचय नहीं है. हालांकि, इसकी महत्वपूर्ण नुकसान है कि यह केवल अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह दर (~ 200 μl / मिनट) पर मज़बूती से काम करता है. जाहिर है, एक कम प्रवाह दर (≤ 1 μl / मिनट) प्रति इकाई समय सीमित नमूना संस्करणों की आवश्यकता होगी, लेकिन दूसरी ओर यह प्रतिक्रियाओं बहुत धीमी बनाता है और इसलिए लंबे समय तक संपर्क समय की आवश्यकता है. यह प्रवेश और नमूना समाधान के प्रयोग के दौरान खपत होती है के रूप में कम हो जाती है, जो दुकान के बीच ऊंचाई अंतर पर निर्भर करता है के रूप में इसके अलावा, गुरुत्वाकर्षण प्रवाह अपने प्रवाह की दर में एक बड़े विचरण है. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह समस्याओं से बचने के लिए, एक सिरिंज पंप इस्तेमाल किया जाना चाहिए. एक सिरिंज पंप का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह प्रयोग एक अधिक नियंत्रित वातावरण में महसूस किया जा करने के लिए अनुमति देने के समय की एक लंबी अवधि में एक निरंतर प्रवाह दर की अनुमति देता है.

प्रोटोकॉल की सीमाएं

एक एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्राप्त करने में बड़ी चुनौतीब्रैकट सेंसर का उपयोग घ विशिष्ट जैविक पहचान रिसेप्टर परत के गुणों को biochemically "सक्रिय" और हर परख के लिए एक समान है कि यह सुनिश्चित करने में निहित है. प्रायोगिक सफलता के लिए रहस्य पूरबी उनके सक्रिय रचना में रिसेप्टर अणु linker के chemistries के साथ एक मानकीकृत सफाई और स्थिरीकरण प्रोटोकॉल के साथ सेंसर चिप की एक सावधान pretreatment में है. हमारे मौजूदा सेटअप में, हम कुछ कमियां के अधीन किया जा सकता है और कुछ मामलों में समस्याग्रस्त किया जा सकता है, जो छोटे कांच capillaries, का उपयोग कर ब्रैकट सरणियों functionalize. ये कांच capillaries के दोनों सिरों पर खुले हैं और इसलिए नमूना विलायकों आसानी से लुप्त हो सकते हैं. Functionalization के मंच का तापमान सही नियंत्रित नहीं है अगर इथेनॉल की तरह अस्थिर सॉल्वैंट्स का उपयोग विशेष रूप से जब उदाहरण के लिए, वाष्पीकरण की दर अलग अलग समय पर काफी भिन्न हो सकते हैं. एक ब्रैकट से एक और जी के लिए ऊष्मायन समय में मामूली बदलाव की संभावना भी हैसंवेदन तरल पदार्थ नलिकाओं में लगातार लोड करने के लिए है कि iven. केशिका functionalization में अन्य कारक सीमित cantilevers हमेशा ठीक उसी तरह केशिकाओं में डाला जाता है कि यह सुनिश्चित करने की क्षमता की कमी है. इसके अलावा, कभी कभी cantilevers के तरल नमूने चिप शरीर पर बह कर सकते हैं के रूप में पार प्रदूषण को रोकने के क्रम में केशिकाओं से थोड़ा बाहर निकाला जाना है. हम कोट cantilevers के लिए एक विकल्प के सतह कोटिंग प्रक्रिया के रूप में इंकजेट स्पॉटर रोजगार से इन समस्याओं को हल कर सकते हैं. यह विशाल श्रेणी के लिए स्केलिंग की संभावना के साथ नमूना कोटिंग की सटीक नियंत्रण की अनुमति होगी जबकि, सबसे आम दोष cantilevers पर जमा कर रहे हैं कि छोटे बूंदों सेकंड के भीतर लुप्त हो सकता है और एक नियंत्रित नमी वातावरण की आवश्यकता है. इसलिए, ऊष्मायन समय कुछ अनुप्रयोगों के लिए वांछनीय हो सकता है, जो आसानी से समायोजित नहीं किया जा सकता. ऐसे नमूने वो जैसे कारकों की सूक्ष्म परस्पर क्रियाlume, ऊष्मायन समय और वाष्पीकरण दर functionalization के नमूने लिए cantilevers की जोखिम पर सीधा प्रभाव पड़ता है और रिसेप्टर आणविक घनत्व में कोई भी छोटा सा बदलाव ब्रैकट पर एक बड़ा असर नहीं होगा के रूप में देखभाल ब्रैकट assays के लिए अनुकूलित सतह chemistries सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए प्रतिक्रिया.

प्रायोगिक डिजाइन संशोधनों (यानी वैकल्पिक तकनीक या सामग्री)

ब्रैकट प्रौद्योगिकी के भविष्य के विकास के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कोटिंग प्रक्रिया प्राप्त करने में प्रमुख चुनौती पर काबू पाने के लिए, विभिन्न रणनीतियों microfluidic चैनलों में एकीकृत cantilevers उपयोग होता है कि आवश्यक हैं. विचार यह है कि विशेष ब्रैकट चिप्स चैनलों को व्यक्तिगत रूप से संबोधित कर रहे हैं जहां सीटू functionalization प्रक्रियाओं में ऑनलाइन अनुमति देने के लिए प्रत्येक ब्रैकट अपनी ही चैनल में रखा गया है कि इस तरह डिजाइन किया जाना चाहिए है. इन प्रयोगात्मक डिजाइन संशोधनों कोटिंग प्रक्रिया को पूरा करने की अनुमति होगीविलायक के लिए जोखिम ठीक ऊष्मायन समय और ब्रैकट चिप्स पर कब्जा अणुओं के स्वचालित स्थिरीकरण के लिए प्रवाह की दर से नजर रखी है, जहां एक नियंत्रित और बंद वातावरण में एड. एक ही चैनल तो सभी cantilevers ही विश्लेष्य समाधान से अवगत कराया जा सकता है, जहां वास्तविक बाध्यकारी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्रैकट functionalization प्रक्रिया के अलावा, ब्रैकट readout के तंत्र में भी सुधार की आवश्यकता होगी. ऑप्टिकल किरण विक्षेपन विधि बेहद संवेदनशील है और यह कई वर्षों के लिए परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, मुफ्त खड़े ब्रैकट सेंसर अनुप्रयोगों के लिए ऑप्टिकल readout के कुछ कमियां है, उदाहरण के लिए यह इस तरह के रक्त के रूप में अपारदर्शी तरल पदार्थ में माप की अनुमति नहीं है, लेज़रों की एक सरणी के संरेखण समय लेने वाली और कठिन हो सकता है और मौजूदा विन्यास को अलग नहीं कर सकते झुकने और ऊर्ध्वाधर deflections के बीच. इस प्रकार cantilev के भविष्य के विकासएर प्रौद्योगिकी सामान्य सेंसर डिजाइन (जैसे ब्रैकट geometries) और खेतों और प्रयोगशाला वातावरण में दोनों मजबूत माप प्रोटोकॉल के लिए ब्रैकट readout के पहलुओं पर विचार करना होगा. Manalis और सहकर्मियों ²² डिवाइस उच्च गुणवत्ता वाले कारकों के साथ एक निर्वात में संचालित करने की अनुमति, cantilevers के बीम के अंदर एक एम्बेडेड microfluidic चैनल है जहां खोखला ब्रैकट सेंसर के उपन्यास प्रकार विकसित किया है. इस मोड में, cantilevers Microbalance ²² के रूप में कार्य है, और इसलिए यह एक इस प्रकार कब्जा अणुओं physisorbed किया जा सकता है या covalently सिलिकॉन पर सीधे जुड़ी है, जो आम तौर पर SAMs या silanes का उपयोग कर, functionalization के संबंध में दोनों पक्षों के बीच विषमता है करने के लिए जरूरी नहीं रह जाता ^24. cantilevers भी तो जैव रासायनिक संवेदन के लिए एंटीबॉडी ^{25 से} संयुग्मित है जो एक पतली बहुलक परत के साथ संशोधित किया जा सकता है.

समस्या निवारण

एक आम समर्थकब्रैकट माप के साथ जुड़े blem microfluidic प्रवाह सेल में हवाई बुलबुले की शुरूआत है. केयर चिप बढ़ते जबकि कोई हवाई बुलबुले तरल सेल में पेश कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. सिग्नल बहती भी नमूने के तापमान में अंतर की वजह से एक आम समस्या है. cantilevers के मापन किए जाते हैं पहले स्थिर करने के लिए equilibrated होना चाहिए. ब्रैकट साधन सब समाधान ही तापमान है करने की अनुमति के रूप में सभी बफ़र्स, analytes और उत्थान के समाधान में एक ही कमरे में संग्रहित किया जाना चाहिए. सिरिंज पंप बहुत ही सटीक और बेहद कम प्रवाह दर को प्रदान कर सकते हैं, यह आम तौर पर ब्रैकट माप में यांत्रिक शोर के साथ जुड़ा हुआ है. यह विक्षेपन संकेतों में अनावश्यक शोर से बचने के लिए एक सरल और प्रभावी शोर reducer के लिए चिंतन करना इसलिए महत्वपूर्ण है. शोर reducer सिरिंज पंप और टी अवशोषित जो तरल सेल, के बीच स्थित छोटे तरल जलाशय के होते हैंपंप से वह यांत्रिक शोर. क्योंकि ऑप्टिकल डिटेक्टर की संवेदनशील प्रकृति के कारण, ब्रैकट माप प्रणाली आदर्श ऑप्टिकल readout प्रणाली के साथ हस्तक्षेप से किसी भी आवारा रोशनी ब्लॉक करने के लिए एक संलग्न सेटअप में संचालित किया जाना चाहिए. धोने के कदम की एक बड़ी संख्या में सेंसर चिप का जीवनकाल सीमित cantilevers पर प्रदर्शन कर रहे हैं इसके अलावा, अगर संवेदन परतों की गुणवत्ता काफी कम कर सकते हैं.

माहिर के बाद वैकल्पिक या भविष्य अनुप्रयोगों इस तकनीक

एक एमिनो या कार्बोक्सिल समूह में समाप्त SAMs साथ लेपित Cantilevers पीएच सेंसर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कार्यात्मक अंत समूहों protonate या deprotonate समाधान के पीएच पर निर्भर करता है और ²⁴ के आगे झुकना ब्रैकट ओर जाता है कि एक सतह प्रभारी उत्पन्न कर सकते हैं. ब्रैकट सेंसर जीवन बैक्टीरिया ^1,6,7 की कोशिका दीवार की अस्थिरता के साथ जुड़े दवा लक्ष्य बातचीत को ट्रैक कर सकते हैं, वे इसलिए में मदद मिलेगी देखते हुएखोज और दवा प्रतिरोधी संक्रमण का मुकाबला करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की एक नई पीढ़ी के विकास के लिए. Microbalances सामूहिक और एकल कक्षों ²⁶ की वृद्धि दर को मापने के रूप में भविष्य cantilevers में इस्तेमाल किया जाएगा. ब्रैकट प्रौद्योगिकी विभिन्न विकास कारकों या दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद साबित होगा. यह भी चिकित्सा और बिंदु का ध्यान अनुप्रयोगों में तत्काल प्रासंगिकता है जो कई बायोमार्कर का तेजी से पता लगाने के लिए एक उपन्यास उपकरण की पेशकश करेगा. बहुमुखी प्रतिभा, छोटे आकार, और ब्रैकट सेंसर की मजबूती को देखते हुए, वे हानिकारक पर्यावरणीय कारकों की एक संवेदनशील मॉनिटर बनेगी. वे पहले से ही इस तरह के Hydrofluoric एसिड ²⁷ या हाइड्रोजन साइनाइड ²⁸ के रूप में वातावरण में प्रयोगशाला और औद्योगिक उत्पादन इकाइयों से बच सकते हैं विषाक्त और हानिकारक गैसों का पता लगाने में उनकी संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements