Nanomekanik av drog-mål Interaktioner och antibakteriell resistens Detection

Summary

Förvärvad resistens mot antibiotika är ett stort hälso-problem och är för närvarande rankad av WHO som ett av de största hoten mot människors liv. Här beskriver vi användningen av fribärande teknik för att kvantifiera antibakteriell resistens, kritisk för upptäckten av nya och kraftfulla medel mot multiresistenta bakterier.

Abstract

Den fribärande sensorn, som fungerar som en omvandlare av reaktioner mellan modell bakteriecellväggen matris immobiliseras på ytan och antibiotiska läkemedel i lösning, har visat stor potential i biokemiska avkänning applikationer med oöverträffad känslighet och specificitet ^1-5. De drog-mål interaktioner genererar ytan stress, vilket gör den fribärande att böja, och signalen kan analyseras optiskt när den belyses med en laser. Förändringen i ytpåverkan mätt med nano-skala precision låter störningar i biomekanik modell bakteriecellväggen mål kan spåras i realtid. Trots att erbjuda betydande fördelar, har flera fribärande sensoruppsättningarna aldrig tillämpats i kvantifiera drog-målbindande interaktioner.

Här rapporterar vi om användningen av kisel flera fribärande arrayer belagda med alkantiol själv monoskikt härmar bakteriecellväggskomponent matris att kvantitativt study antibiotiska bindningsinteraktioner. För att förstå effekten av vancomycin på mekaniken i bakteriella strukturer cellvägg ^1,6,7. Vi utvecklade en ny modell ^1, som föreslår att fribärande böjning kan beskrivas med två oberoende faktorer, i) nämligen en kemisk faktor, som ges av en klassisk Langmuir adsorptionsisoterm, från vilken vi beräknar termodynamiska jämviktsdissociationskonstanten _(Kd) och ii) en geometrisk faktor, i huvudsak ett mått på hur bakteriella peptidreceptorer fördelas på fribärande ytan. Ytan Fördelningen av peptidreceptorer (p) används för att undersöka beroendet av geometri och ligand lastning. Det visas att ett tröskelvärde av p ~ 10% är kritisk för tillämpningar för avkänning. Under vilket det inte finns någon påvisbar böjning signal medan över detta värde, ökar böjningen signalen nästan linjärt, avslöjar att stress är en produkt av en lokal kemisk bindning FACtor och en geometrisk faktor kombinerat med mekanisk anslutning av reagerade regioner och ger ett nytt paradigm för design av kraftfulla medel för att bekämpa Superbugen infektioner.

Introduction

De molekylära erkännande paradigm underbygger stora delar av biologi och medicin. I farmakologi, till exempel att målet är att störa en patologisk väg genom att rikta en viktig deltagare i en biokemisk process som transglycoslyation eller transpeptidering som katalyserar tvärbindningen av bakteriella peptider cellvägg. Drogen konstruktionen reduceras därför att definiera en lämplig molekyl för att rikta en särskild bakterie dockning plats för att inducera en perfekt passform. Ett klassiskt exempel efterlikna framgången med detta tillvägagångssätt är vankomycin (Van), som riktar sig peptidoglykan cellväggen, en konserverad strukturellt särdrag av en bakterie. I en begynnande Gram-positiv bakterie består peptidoglykan matrisen av peptider som slutar i sekvensen Lysin-D-alanin-D-alanin, tjudrad via en C55 ^8-10 lipid linker här benämnda D-Ala. Dessa exponerade peptider på peptidoglykanet prekursorer är grundläggande förmekaniskt skydd av bakterieceller mot svåra miljömässiga krafter, och viktigare, inte finns i mänskliga celler, vilket gör dem idealiska mål för antibiotika. Van binder specifikt till C-terminalen av de bakteriella peptider cellväggen bildar en måttligt stark Van-peptid komplex såsom visas i fig. 1. Detta samspel mellan Van och de exponerade peptider blockerar agerande transpeptidaser och transglycosylases, som katalyserar tvärbindningen av cellväggarna ^1, vilket effektivt stoppar dem från tvärbindning och därför nanomechanically försvagar bakterie leder till dess död genom bristning ^{1,6, 7.}

Uppkomsten av vankomycinresistenta Enterococcus (VRE) är ett ökande vården problem ¹¹ och på grund av att resistenta bakterier inom Enterococci uppkommer på grund av subtil förändring av en amid linkage till en esterkoppling ^8, denna bedrägligt enkel strukturförändring vid ytan av bakterien tar bort en enda vätebindning från Van 's dockning site med åtföljande förändringen av bindningsfickan. Huvudsakligen denna process förändrar pentapeptiden nuvarande terminalen alanin i vankomycin mottagliga Enterococcus (VSE) till en lysin-D-alanin-D-Laktat ^10,12, här kallad D-Lac, vilket ger en betydande minskning i Van-D-Lac bindningsaffinitet genom tre tiopotenser rendering Van terapeutiskt ineffektiva mot enterokockinfektioner ^1, Den alarmerande ökningen av antibiotikaresistenta bakterier är därför driver utvecklingen av innovativa metoder för att påskynda och återställa den antibakteriella aktiviteten av antibakteriella medel eller upptäckten av mer kraftfulla läkemedel mot multiresistent bakterie infektioner.

in situ referenser för differentiella mätningar ger dem möjlighet att specifikt upptäcka narkotika-mål växelverkan och, i kraft av sin tillverkning via vanliga vägar halvledarbehandling, de är lämpade för massproduktion och parallellisering för high-throughput screening av tusentals av läkemedel per timme. I particular flertal fribärande sensoruppsättningarna är användbara verktyg för att studera antibiotikaresistens mot vankomycin - eftersom resistens mot vankomycin är i huvudsak ett mekaniskt problem ^1,6,7. Reaktionerna mellan en modell bakteriecellväggen mål och Van i lösning kan detekteras genom att övervaka förändringar i kliniskt relevant stressinducerad från drog-målbindande interaktioner. Den genererade stress från ytreaktioner som yttrar sig i en fribärande böjning signalen analyseras optiskt genom att belysa sensorer med en laserstråle. Dessutom genom att skräddarsy receptiv beläggning av bakteriella molekyler ytmål ovanpå cantilever sensor, nära till ett obegränsat antal analyter (Van), de specifika biokemiska interaktioner och biomekanik modell bakteriella cellväggen matrisen övervakas i realtid. Bortsett från den molekylära igenkänningsdomänen händelsen, det finns flera faktorer som kan orsaka fribärande sensorer för att deflect, som omfattar - temperaturvariationer, ospecifik bindning eller ändringar av brytningsindex av lösningen. Att stå för ospecifika signaler, in situ differentiella mätningar utförs där böjningen av både mät-och utliggare referens kontinuerligt övervakas för att analysera specifika interaktioner. Vidare kan detektering känslighet för fribärande sensorer som är beroende av ytans kemiska sammansättningar och geometri ökas genom avstämning av p ytdensitet (där p definieras som förhållandet mellan den yta som upptogs av fånga molekyler till hela ovanarean av konsolen omfattas av den totala populationen av molekyler som bestäms genom röntgen fotoelektronspektroskopi (XPS) ^1.

Här Detta protokoll beskriver hur vancomycin eller något annat antibiotikum bindas till bakteriernas prekursorcell vägg analoger (mucopeptides) vid kliniskt relevanta koncentrationer i buffrad lösning ennd blodserum kan detekteras med hjälp av etikett-fri fribärande teknik. Färska guldytor används eftersom själv-monoskikt (SAM) tenderar att lätt bilda stabila skikt på rent guld ^13,14. SAM består typiskt av korta molekyler med en tioldel kovalent fäst vid guldytan medan den önskade fånga enheten på den andra änden är tillåtet att fritt interagera med analyten mål i lösning. Tioler bildar ett flexibelt system speciellt med tanke på att många tiolföreningar med olika grupper kemiska slut är kommersiellt tillgängliga eller kan lätt syntetiseras i ett laboratorium. Dock bör försiktighet iakttas för att säkerställa att molekyler med en tioldel måste ha rätt ändgrupper, till exempel i ett protein eller peptid konjugation, bör aminogruppen inför inåt för reaktionen med karboxylgruppen av tioldelen tjudrad på ytan för att inträffa. Här var tioler direkt konjugerad med tripeptidanaloger härmare av bakteriell lipid II från bacterial cellväggen mål syntetiseras genom fast fas-metod med hjälp av kommersiellt tillgängliga förinstallerade Wang-D-Ala och Wang-D-Lac-hartser och standardavvikelsen Fmoc-skyddande grupp kemi ^15. Även om denna beskrivning är fokuserad mot vankomycin, klart det kan utsträckas till andra antibiotika och faktiskt ytterligare studier är inbjudna av forskare från olika områden framför allt i biokemi, farmakologi och materialvetenskap enkelt anta detta protokoll för sina egna experiment.

Protocol

Ett. Framställning av utliggare

1. Använda Teflon pincett doppa utvalt antal fribärande chips (varje fribärande mäter 500 ^ m långa, 100 ^ m bred och 0,9 ^ m tjock) till en nyframställd Piranha-lösning (vid förhållandet 01:01 H ₂ SO ₄ och H ₂ O ₂₎ under 20 min .
2. Efter ca 20 min bort fribärande marker från Piranha lösningen och skölj dem noga med avjoniserat vatten och omedelbart överföra till en nygjord piraya lösning. Upprepa steg 1.1 ovan om markerna innehåller fläckar av smuts annars fortsätt till nästa steg.
3. Efter en grundlig rengöring i avjoniserat vatten, skölj med ren etanol och torka konsolpartierna chips på en värmeplatta vid 75 ° C för att avlägsna eventuella spår av vatten. Inspektera dem med hjälp av ett optiskt mikroskop för att bekräfta deras renhet.
4. Överför de rengjorda fribärande chips till en förångningskammare och pumpa ner, inriktning för att uppnå ett vakuumtryck på 10 ^-7 mbar.
5. När tillräckligt vakuum trycket uppnåtts, täcker ena sidan av varje fribärande array med en 2 nm titan först fungerar som en adhesionsskikt innan ett extra lager av 20 nm guld tjockt. För att bekräfta deras tjocklek, använd kvartskristall monitor placerad direkt över målet källan.
6. Lämna guldbelagda chips fribärande sensor i kammaren under 1-2 timmar för att svalna under vakuum före öppnandet.
7. Överför nyligen förångade marker till ett vakuum lagring kärl fyllt med argon för att förhindra varje form av föroreningar.

2. Cantilever Chip Funktionalisering

1. Först ordnar mikro-kapillärrör på en funktionalisering stadium ² i enlighet med den fribärande punkttäthet av 250 um.
2. Sedan injicera 2 mM etanolisk tiol lösningar av molekyler ytmål, dvs bakteriella mucopeptides (D-Ala och D-Lac), och en "Inert 'alkantiol slutar i trietylenglykol (PEG) känd för att motstå biomolekylär adsorption. ¹⁶ Var och en av de kapillära rören bör innehålla en blandad ytmolekyler fånga bestäms slumpmässigt för att undvika användaren partiskhet.
3. Nästa inkubera i 20 min utliggare i mikrokapillärer fylld med tiol lösningar innehållande ytan fånga molekyler. Se till att lösningar av ytmolekyler capture är begränsade till varje enskild konsol sensor för att undvika eller minimera korskontamination. Om detta förfarande används korrekt, bör det förändrar systematiskt nylagade guldbelagda utliggare i kemiskt aktiva sensorer som bildas genom att låta SAMs av bakteriella mucopeptide mål att bilda den guldbelagda ytor som receptorer.

Tre. Solution Förberedelser

1. Lös 0,1 M mono-och di-basiska salterna natrium fosfat i ultrarent vatten (18,2 Mohm · cm resistivitet) och blanda to ge ett pH-värde av 7,4.
2. Lägg 0,002% av PS80 till de buffrade lösningar för att minimera aggregering som orsakas av ospecifika interaktioner av läkemedelsmolekyler till glas.
3. Späd droger med nyligen buffrade lösningar på de önskade olika koncentrationer som möjliggör beräkning av _Kd.
4. Filtrera de nyberedd läkemedelslösningar med användning 0,2 | im filter och sonikera under 5 min vid rumstemperatur innan spolning med argon.
5. Upprepa proceduren med drogen i buffrat serum med hela serum. Vortexa försiktigt under 15 min med ytterligare 5 min för att säkerställa fullständig löslighet.

4. Surface spänningsdetektion

1. Ladda en funktionaliserad chip fribärande sensorn i ett vätskeflöde cellkammare.
2. Justera laserpunkten på den fria änden av varje sensor och bekräfta inriktningen genom att värma upp vätskan kammare för en ° C. Alla åtta guldbelagda fribärande sensorsystem bör genomgå omfattandessive nedåtriktad böjning på grund av den bimetalliska effekt som orsakas av skillnaderna i expansionsgrad av kisel och guld.
3. Efter upphettning under ca 10 min, låta utliggare svalna under ytterligare 10 min.
4. Beräkna böjning variationen på de maximala böj signaler mellan enskilda fribärande sensorer och om den relativa standardavvikelsen för böjande signalerna är ≤ 5% sedan acceptera anpassningen som önskvärt annars upprepa processen.
5. Nästa, mäta resonansfrekvenser alla åtta utliggare att beräkna sina fjäderkonstanterna. Om variationen av fjäderkonstanten mellan varje fribärande sensorn inom ett chip är ≤ 1% sedan acceptera chipet ha konsekventa mekaniska egenskaper annars byt ut sensorn fribärande chip.
6. Sedan använder du en fluidisk systemet (Model Genie Plus) via en sex-vägs ventil för att uppnå den flytande valuta i flödet cellen medan datainsamling bör uppnås med hjälp av en automatiserad LabView såftware.
7. För övervakning av fribärande böjning uppgifterna, använd följande mätprotokoll: i) injicera antingen buffertlösning eller serum utan läkemedel för kontrollmätning varar 5-30 minuter att upprätta en baslinje, ii) injicera drogen lösning för 30-60 min, iii) injicera 10 mM HCl tvätt för 10-60 min att dissociera bundet läkemedel komplex, iv) slutligen injicera en ytterligare tvätt steg med buffertlösning för en annan 5-30 minuter att regenerera ytan peptider och att återställa baslinjen signalen. Se alltid till att alla signaler förvärvas under konstant hastighet på vätskeflödet av 30-180 l / min och vid fast temperatur av 25 ° C i en temperatur-kontrollerad skåp.
8. De absoluta bockning signaler samtliga åtta utliggare bör övervakas med hjälp av seriell tidsmultiplexad optisk stråle metoden med ett enda läge känslig detektor.
9. För att analysera de böjande signalerna från varje koncentration av läkemedel, är de resulterande differentiella böjningar omvandlas till en differentiella stress mellan de övre och nedre sidorna av fribärande hjälp Stoney ekvation.

Representative Results

Den stress förändring mätt med nano-skala precision med oöverträffad känslighet för en enda H-bindning deletion, utnyttjas för att spåra störningar av modell bakteriella biomekanik cellvägg i realtid (figur 2a-d). Gränsen av läkemedel känslighet för Van undersöktes genom seriespädning dess koncentrationer i steg från 1,000 um till ≤ 10 nM, avslöjar 10 nM (~ 15 ng / ml) som den lägsta detekterbara koncentrationen ger upphov till ett genomsnitt på ~ -9 ± 2 nm som de differentiella böj signaler (Figur 2c). Förmågan att detektera antibiotika under fysiologiska miljön undersöktes ytterligare i serum vid en kliniskt relevant koncentration intervallet 3-27 iM ^17. Vid injektion av 7 uM Van i serum (90% fetalt kalvserum plus 10% natriumfosfatbuffert, pH 7,4) i alla utliggare under identiska betingelser, den differentiella signalen förDAla i serum var 105 ± 4 nm medan DLac belagda utliggare, ingen böjning observeras (Figur 3). De stora bockning signaler observerades för Dala bestruket (vancomycin känslig) utliggare orsakas av den starka drogen-målbindande interaktioner. Men för DLac bestruket (vancomycinresistenta) utliggare, förekomsten av mark-state repulsion av syre ensamt par och den reducerade NH bindningen i vankomycin bindningsfickan ^10,12 bidrar till försvagningen av drog-målet bindningsväxelverkningar vilket resulterar i mindre eller ingen fribärande bockning, särskilt för lägre vankomycin koncentrationer (Figur 3). Men för höga vankomycin koncentration, observerar vi mätbara böj signaler för DLac. Dessutom är vår experimentell design viktigt för in situ referenser där alla cantilevers belagda med både DAla och DLac samtidigt utsätts för samma analyt i realtid.

För att förstå den exakta rollen för kemi och geometri, utformade vi en modell ¹ som beskriver sambandet mellan lösningsmedel interaktioner och mekanik yta. Detta ger ytan stressen:

för p> pc och annars noll (1)

Den första termen i ekvation (1) är den Langmuir adsorptionsisoterm, står för drog-målbindande händelser och den andra termen är makt lag som anger de storskaliga mekaniska konsekvenser av stressade nätverksbildning. Konstanten a motsvarar maximal yta stress när alla tillgängliga bindningsställen är ockuperat och _Kd är ytan jämvikt dissociation consTant på fribärande. Analysen som visas i figur 4 är resultatet av den globala passning av ekvation (1) överlagras på uppmätta differentiella stressen avslöjar, en ~ 29,7 ± 1,0 eller 14,1 ± 3,0 mN / m och _Kd ~ 1,0 ± 0,3 eller 800 ± 310 iM för D-Ala eller DLac peptider, där A motsvarar ett mått på ytan stress när alla tillgängliga bindningsställen är upptagna. Den förbättrade känslighet fribärande stämdes genom att systematiskt variera peptiden densiteter p medan du övervakar stressen data som en funktion av p medan antibiotikakoncentrationer fastställts till 10, 100, och 250 pm, respektive (Figur 5). Processen upprepades med stress som en funktion av Van koncentrationer medan peptid densiteter fastställdes vid p ~ 100%.

<img alt = "Bild 1" fo: innehåll-width = "5in" src = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
Figur 1. Cantilever detektering av antibiotiska yta bindningsreaktioner. a) Schematisk representation av en fribärande sensoruppsättning och läge genom vilket läkemedlet-target interaktioner detekteras nanomechanically. b) Kemisk bindningsväxelverkan mellan en läkemedelsmolekyl (Van) och den bakteriella mucopeptide analog (D-Ala eller D-Lac). c) Den mekanism genom vilken en muterad vankomycin känsliga bakterier (VSE) förvärvar resistens mot vankomycin genom att ta bort en enda H-bindningen i bindningsfickan. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Spårning av störningar i modellen bakteriella biomekanik cellvägg i realtid. a) Absoluta bockning signaler av D-Ala, D-Lac och PEG belagda utliggare i fosfatbuffert och 250 iM vankomycin. De differentiella PEG referenssignaler visas med svarta linjer. B) Differential bockning signaler av D-Ala och D-Lac belagda utliggare i fosfatbuffert och 250 pM vancomycin. C) Den differentiella fribärande Avböjning av ett dosberoende signalen som en funktion av tiden i närvaro av vankomycin koncentrationer i storleksordningen 10 nm (gul linje), 100 nm (röd linje) och 1000 Nm (mörk röd linje) respektive. d) differentiella fribärande nedböjning signaler för tre D-Ala belagda fribärande sensorer som funktion av tiden i närvaro av 10nM vankomycin. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Spårning av störningar av modellen bakteriella biomekanik cellvägg i realtid för en D-Ala och D-Lac belagda utliggare i närvaro av 7 iM vancomycin i vaden fetalt serum.

Figur 4. Undersöka Nanomekanik av drog-mål interaktioner. Plot visar den uppmätta differentiella svaret yta stress för D-Ala (svarta cirklar) och D-Lac (röda cirklar) belagda utliggare som en funktion av vankomycinkoncentration i lösning [Van]. Uppgifterna beskrivs av ekvation (1) (heldragna linjer). ^Ett

Figur 5. Optimering av nanomechanical detekteringskänslighet av receptor-ligand-interaktioner genom att undersöka beroendet av receptor lastning och geometri via blandade monoskikt. Uppmätta differentiella yta stressvar av fribärande sensorer som en funktion av D-Ala yttäckning, s. i närvaro av fasta vankomycin koncentrationer i lösning vid 10 ^ M (svart linje), 100 ^ M (röd linje) och 250 um (grön linje).

Discussion

Dessa resultat visar att fribärande array sensorer har sensitivitet för att detektera och kvantifiera förändringar i drog-mål bindningsväxelverkningar speciellt i vankomycinresistens samband med strykningen av en enda H-bindningen från läkemedlets bindningsfickan. Vi visar en nanomolär detektionskänslighet av Van i överensstämmelse med tidigare ytplasmonresonans (SPR) studierna ^18,19, och avslöjar att den fribärande metoden direkt kan påvisa och kvantifiera läkemedelsmolekyler i blodet vid kliniskt relevanta koncentrationer som rutinmässigt används i klinisk praxis. Våra data tyder på att skillnaden ytpåverkan kan beskrivas med en produkt formulär ekvation (1), dvs (i) en kemisk term som beskriver de specifika drogen-målbindande händelser, och (ii) en geometrisk term som beskriver den mekaniska anslutningen mellan kemiskt reagerat yta platser, vilket innebär att lokala kemiska interaktioner frikoppla från den globala mekanikeral interaktioner av den fribärande. Medan den kemiska termen ges av den klassiska Langmuir adsorptionsisoterm, avslöjar den geometriska termen en percolative mekanism av drog-målet inducerade förändringar ytpåverkan. Den kritiska tröskel pc ~ 10% (figur 5) var nödvändig för att detektera den differentiella fribärande böjning, vilket visar att ytpåverkan transduceras kollektivt när en relativt stor yta fraktion är ockuperat av antibiotiska molekyler. För p ≥ pc, den mekaniska anslutningen mellan kemiskt transformerade ytan platser successivt etablerat, och de korta avstånd motbjudande interaktioner såsom steriska interaktioner mellan noderna i nanomechanical nätet ger upphov till ökande nedböjning av hela konsolen. Det spekuleras om att vår nanomechanical perkolationsmodell kan spela en viktig roll i den glykopeptidantibiotikum verkningssätt i reala bakterier. Dessa resultat understryker den höga känsligheten hos fribärande teknik för studying antibiotika 'verkningssätt och representerar ett nytt forskningsverktyg för att studera droger för att förbättra förståelsen av operationerna antibiotika på nanonivå för att informera och möjliggöra upptäckten av kraftfulla läkemedel för att kontrollera problemen med Superbug infektioner. För att förbereda fribärande systemet för reproducerbara och känsliga mätningar, har vi riktat en uppsättning mål i protokollet, särskilt för provladdning i mikroflödessystem cell och standardrutiner för att tillåta kvantitativa nanomechanical upptäckter.

Betydelsen av fribärande teknik med avseende på befintliga metoder

Sammanfattningsvis vill vi påpeka att medan denna teknik föreslogs mer än 25 år sedan, har det inte funnit sin väg in i kliniken på grund av bristen på noggranna och repetitiva mätningar på medicinskt relevanta mål. Här visar vi de förfaranden som fastställer relevansen av att använda nanomechanical utliggare att undersöka mekanikeral inflytande av antibiotika på bakteriens målen cellväggen och att upptäcka antibakteriell resistens. Konventionella drug screening metoder kräver någon typ av fluorescerande eller radioaktiv märkning av en reportermolekyl för att mäta bindningen av en analyt till sitt mål, ofta i samband med en kompetitiv eller enzymatisk bindningsanalys och proteinanalyser ^20. Märkning av biomolekyler är inte bara tidsödande och dyr men etiketten kan också störa den molekylära interaktionen genom att blockera bindningsstället, vilket leder till falskt negativa resultat. Dessutom, fluorescerande föreningar är ofta hydrofoba vilket kan leda till bakgrunden bindande och falska positiva. På grund av dessa begränsningar finns det ett ökande intresse för nya etikett-fria tekniker som tillåter praktiskt taget alla molekylärt komplex som skall screenas med minimal analysutveckling. De mest etablerade etikett-fri yta teknik är för närvarande SPR och kvartskristallmikrovåg (QCM). I motsats till SPR som mäter the dielektricitetskonstant, en etikett - gratis fribärande teknologi detekterar ytan stammen som genereras av en ligand-receptor interaktion, vilket direkt kan mäta nanomechanical krafter som genereras av den specifika bindningen av ligander till ytreceptorer. Det unika med dessa sensorer är att deras känslighet inte förlitar sig på dielektriska egenskaper orsakade av mass förändring beror på analyten bindande i SPR och QCM utan snarare på en minsta inducerad förändring i planet yta stress, vilket gör tekniken unikt anpassad för att studera de Nanomekanik av läkemedelsmolekyler vid kliniskt relevanta antibiotikakoncentrationer (3-27 iM) ^17. Utliggare är också särskilt väl lämpad för små molekyler (t.ex. DNA-fragment och droger) upptäckt under fysiologiska förhållanden, inklusive komplexa miljöer vilket är till stor del grunden för den farmaceutiska industrin och kommer därför att fungera som ett kompletterande verktyg i läkemedelsutveckling. Cantilever teknik har framgångsrikt använts iområdena genomik ^3,5, gasmätning ^{21, 22} proteomik och droger ^1. Dessutom är utliggare fabricerade användning av låg-teknik kostar kisel och på grund av deras förenlighet med mikrofabrikationslaboratorier processer, kan utliggare miniatyriseras för förbättrad känslighet och parallellisering i stora matriser av sensorer för flera läkemedel förening screening och högre genomströmning informationsrik analyser screening. Förbättringar av instrumentering och experimentell design tillåter en mängd olika interaktioner som skall analyseras i realtid för att hjälpa för att söka efter en ny generation av superdrugs att angripa problemen med multiresistenta infektioner.

Kritiska steg i protokollet

Utvecklingen av robusta mätprotokoll är central för de tillämpningar av denna teknologi. För att uppnå tillfredsställande kvantitativa drog-mål mätningar och för att bestämma den lägsta koncentrationen av antibiotika thatt kunde detekteras i buffert eller blodserum kritiska steg inom protokollet behandlades. Den första uppgiften handlar om trimning och optimering av kemiska ytan fånga för att öka specificitet fribärande upptäckt och känslighet. Onekligen är ytpåverkan transduktion ett kollektivt fenomen, som kräver en relativt stor andel av ytan som ska täckas för att upprätta en anslutning mellan kemiskt reaktiva regioner. Vi visar att genom att variera densiteten hos den underliggande ytan peptiderna, ett kritiskt tröskelvärde ~ p ≥ 10%, bestäms där ytan stressen skala som en funktion av peptid densitet och annars noll (fig 5). Det är viktigt att experiment syftar till att undersöka enhetligheten i stressen längs konsolerna för att säkerställa maximal signal omläggning för känsliga mätningar. Dessutom effektiva ytan förnyelse protokoll måste vara på plats, vilket möjliggör multipla cykel mätningar och att minska kostnaderna för varje test. Även utformningen av en receptor ytan med tiolerad hydrofob ände, är orienteringen av receptormolekylen och avståndet mellan dem viktigt att tillåta självorganisering av tät packning tack vare Van-der-Waals växelverkan mellan molekylerna att minimera ospecifika interaktioner. Vidare bör fånga molekylerna innehåller en polyetylenglykol (PEG) linker för att tillåta någon del av den avkännande matrisen att vara hydrofil för att förhindra införande av molekyler i analytlösningen från att reagera direkt med den obelagda guldytan. PEG linkermolekyler måste agera som distanser för att minska steriska restriktioner och därför låt lösningen analyter att interagera specifikt med ytreceptorer att inducera mätbar förändring yta stress. Den fribärande array Sensorn måste analyseras med minst en in situ referens mätning och signalen visas i realtid är en differential omläggning, som erhålls genom att subtrahera absoluta böjning av hänvisningen fribärande från sEnsing utliggare. Således en referens cantilever är viktigt att ta hänsyn till icke-specifika interaktioner såsom temperaturförändringar, förändringar i brytningsindex eller interaktionerna funktionaliserad undersidan av konsolen. Optimering av flöde (~ 30-150 l / min) bildar ett kritiskt steg i protokollet eftersom det garanterar ett effektivt utbyte av vätskor och en tillräckligt stadig masstransport av lösning material. Utformningen av en flytande cell måste tillåta optimal volym (5-80 pl) för snabba flödeshastigheter för att möjliggöra perfekt flytande valuta för att övervinna begränsningar masstransport. Flödeshastigheten är särskilt kritisk när de utför kinetiska mätningar ^23. Stor volym vätskekamrarna kräver okontrollerbara höga flöden som leder till stora krav på provvolym, som i onödan ökar priset för analysen. Tidigare har vi använt gravitationsflöde att injicera olika prover till mätinstrumentets vätskekammaren. Gravity flöde har den fördelen att det does kräver inga mekaniska delar och därför inte införa ytterligare brus i systemet. Dock är dess betydande nackdel att den bara fungerar tillförlitligt vid relativt höga flödeshastigheter (~ 200 | il / min). Självklart skulle ett lägre flöde (≤ 1 ul / min) kräver begränsade provvolymer per tidsenhet men å andra sidan det gör reaktionerna mycket långsammare och kräver därför längre kontakttider. Dessutom har gravitationsflöde en stor varians i dess flödeshastighet eftersom det beror på höjdskillnaden mellan inloppet och utloppet, som minskar med provlösningarna förbrukas under experimentet. För att undvika problem tyngdkraftsflöde, bör en sprutpump användas. Fördelen med användning av en sprutpump är att det tillåter en konstant flödeshastighet under en lång tidsperiod så att de experiment som skall förverkligas i en mer kontrollerad miljö.

Begränsningar av protokollet

Den stora utmaningen i att få en reproducerbar end specifik biologisk upptäckt med hjälp av fribärande sensorer ligger i att säkerställa att egenskaperna hos receptorskiktet är biokemiskt "aktiv" och enhetlig för varje analys. Hemligheten till experimentell framgång ligger i en noggrann förbehandling av sensorchipet med en standardiserad rengöring och immobilisering protokoll med länkare kemier att orientera receptormolekylerna i sin aktiva konformation. I vår nuvarande setup, functionalize vi fribärande arraysanvändande litet glas kapillärer, vilket skulle kunna bli föremål för vissa nackdelar och kan vara problematisk i vissa fall. Dessa glaskapillärer är öppna i båda ändarna och därför provet lösningsmedlen kan förångas lätt. Om exempelvis temperaturen på funktionalisering stadium ej exakt kontrolleras, kan avdunstningshastigheten variera avsevärt vid olika tidpunkter speciellt vid användning av flyktiga lösningsmedel som etanol. Det finns också en möjlighet till liten variation i inkubationstid från en fribärande till ett annat gftersom att avkänningsparametrarna vätskorna måste laddas efter varandra in i kapillärerna. Den andra begränsande faktorn vid kapillär funktionalisering är bristen på förmågan att säkerställa att utliggare alltid är införda in i kapillärerna på exakt samma sätt. Dessutom ibland utliggare måste dras ut en aning från kapillärerna för att förhindra korskontaminering när det flytande prov kan strömma in på chip kroppen. Vi kan lösa dessa problem genom att använda bläckstråleskrivare observatörer som en alternativ ytbeläggning förfarande att belägga utliggare. Även om det skulle tillåta den exakta styrningen av prov beläggning med möjlighet att skala upp för stora matriser, är den vanligaste nackdelen att de små droppar som avsätts på utliggare kan avdunsta inom några sekunder och kräver en kontrollerad luftfuktighet. Därför kan inkubationstiden inte justeras lätt, vilket kan vara önskvärt för vissa tillämpningar. Den subtila samspelet mellan de faktorer som prov voLume, inkubationstid och avdunstningshastighet har direkt inverkan på exponeringen av konsolerna till funktionalisering provet och försiktighet måste vidtas för att säkerställa en optimerad yta kemier för fribärande analyser som någon liten variation i receptor molekylära densitet kommer att ha en stor inverkan på den fribärande svar.

Experimentella konstruktionsändringar (dvs. alternativa tekniker eller material)

För att övervinna den stora utmaningen i att erhålla reproducerbar beläggning förfarande för den framtida utvecklingen av den fribärande teknik, olika strategier krävs som skulle använda konsoler integrerade i mikroflödessystem kanaler. Tanken är att särskilda fribärande marker bör utformas så att varje konsol placeras i en egen kanal så att nätet i situ funktionalisering förfaranden där kanalerna är adresseras individuellt. Dessa experimentella konstruktionsändringar skulle tillåta beläggning process som skall utföraed i en kontrollerad och sluten miljö Om exponeringen för lösningsmedlet noggrant övervakas av inkubationstiden och flödeshastighet för automatiserad immobilisering av infångningsföreningar molekyler på fribärande marker. Samma kanaler kan sedan användas för själva bindningsexperimenten där alla utliggare kan utsättas för samma analytlösningen. Förutom fribärande funktionalisering förfarandet skulle fribärande avläsning mekanismen behöver också förbättras. Den optiska strålavböjande metod är mycket känslig och det har använts med framgång i atomkraftsmikroskopi (AFM)-teknik under många år. Men för de fria sensor stående fribärande applikationer den optiska avläsningen har vissa nackdelar, till exempel att det inte tillåter mätningar i ogenomskinliga vätskor såsom blod, kan anpassningen av en rad lasrar vara tidskrävande och omständlig och den aktuella konfigurationen kan inte skilja mellan lutande och vertikala nedböjning. Således den framtida utvecklingen av cantilevER-tekniken kommer att behöva överväga aspekter av den allmänna sensorns konstruktion (t.ex. fribärande geometrier) och den fribärande avläsning för robusta mätprotokoll både inom de områden och miljöer laborationer. Manalis och medarbetare ²² har utvecklat nya typer av ihåliga fribärande sensorer där konsolerna har en inbäddad mikroflödessystem kanal inuti balken, vilket gör att enheten att drivas i ett vakuum med högkvalitativa faktorer. I detta läge, utliggare fungera som microbalance ^22, och därför är det inte längre nödvändigt att ha en asymmetri mellan de två sidorna med avseende på funktionalisering, alltså fånga molekyler kan physisorbed eller kovalent direkt på kisel, typiskt med SAMs eller silaner ^24. De utliggare kan också modifieras med ett tunt polymerskikt som sedan konjugeras till antikroppar ²⁵ för biokemisk avkänning.

Felsökning

En gemensam problem i samband med de fribärande mätningarna är införandet av luftbubblor i mikroflödessystem flödescellen. Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att inga luftbubblor införes i den flytande cellen medan monteringen av chipet. Signal drifting är också ett annat vanligt problem som orsakas av skillnaderna i temperatur av prov. De utliggare måste de återfå stabilisera innan mätningarna görs. Alla buffertar, analyter och lösningar förnyelse måste lagras i samma rum som den fribärande instrument för att möjliggöra alla lösningar som har samma temperatur. Även sprutpumpen kan ge mycket exakta och extremt låga flöden, är det i allmänhet i samband med mekaniskt ljud i konsolpartierna mätningarna. Det är därför viktigt att utforma en enkel och effektiv brusreducerare att undvika onödigt brus i avböj signalerna. Den brusreducerare består av små vätskereservoar belägen mellan sprutpumpen och den flytande cellen, som absorberar tHan mekaniska ljud från pumpen. På grund av den känsliga naturen av optisk detektor, bör den fribärande mätsystemet helst köras i en sluten setup för att blockera alla herrelösa ljus från att störa optiskt avläsningssystem. Dessutom kan kvaliteten på de avkännande skikten minska avsevärt om ett stort antal tvättsteg utförs på utliggare begränsar livslängden på sensorchipet.

Alternativa eller framtida ansökningar efter behärska denna teknik

Utliggare belagda med SAMs slutar i en amino-eller karboxyl-grupp kan användas som pH-sensorer. De funktionella ändgrupper protonera eller deprotonera beroende på lösningens pH och kan generera en ytladdning som leder den fribärande att böja ^24. Med tanke på att de fribärande sensorerna kan spåra narkotika-mål interaktioner vid destabilisering av cellväggen livets bakterier ^1,6,7, kommer de således att hjälpa isökandet och för utvecklingen av en ny generation av antibiotika för att bekämpa resistenta infektioner. I framtida konsoler skulle användas som mikrovågar att mäta massan och ökningstakt enskilda celler ^26. Den fribärande tekniken kommer att vara till nytta för studier av cellulära svar på olika tillväxtfaktorer eller läkemedel. Det kommer också att erbjuda ett nytt verktyg för snabb detektion av multipla biomarkörer, som har omedelbar betydelse i medicinska och point-of-care program. Med tanke på mångsidighet, liten storlek och robusthet cantilever sensorer, kommer de att utgöra en känslig skärm av skadliga miljöfaktorer. De har redan visat sin känslighet vid detektering av giftiga och skadliga gaser som kan läcka ut från laboratoriet och industriella produktionsenheter i miljön, såsom fluorvätesyra ²⁷ eller vätecyanid ^28.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements