Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nanomechanics من المخدرات التفاعلات المستهدفة وكشف المقاومة للجراثيم

doi: 10.3791/50719 Published: October 25, 2013

Summary

المقاومة المكتسبة للمضادات الحيوية هي مشكلة رئيسية الرعاية الصحية العامة وحاليا تحتل من قبل منظمة الصحة العالمية باعتبارها واحدة من أكبر الأخطار التي تهدد حياة الإنسان. نحن هنا وصف استخدام التكنولوجيا ناتئ لتحديد المقاومة للجراثيم، وهو أمر حاسم لاكتشاف عوامل جديدة وقوية ضد البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة.

Abstract

وقد أظهرت أجهزة الاستشعار ناتئ، الذي يعمل بمثابة محول من التفاعلات بين نموذج البكتيرية جدار الخلية المصفوفة يجمد على سطحه وعقاقير المضادات الحيوية في الحل، وإمكانات كبيرة في تطبيقات الاستشعار البيوكيميائية مع حساسية وخصوصية لم يسبق لها مثيل 1-5. التفاعلات المستهدفة المخدرات توليد التوتر السطحي، مما تسبب في ناتئ على الانحناء، وإشارة يمكن تحليلها بصريا عندما يضيء عليه بواسطة الليزر. التغير في الضغط سطح قياس بدقة نانو النطاق يسمح للاضطرابات الميكانيكا الحيوية من نموذج البكتيرية جدار الخلية يستهدف لتعقبها في الوقت الحقيقي. وعلى الرغم من تقدم مزايا كبيرة، لم تم تطبيق عدة صفائف استشعار ناتئ في قياس التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزمة.

هنا، ونحن التقرير على استخدام السيليكون صفائف ناتئ متعددة المغلفة مع alkanethiol المجمعة monolayers النفس محاكاة الخلية البكتيرية مصفوفة الجدار لستو كمياالتفاعلات ملزم المضادات الحيوية دى. لفهم تأثير فانكومايسين على اليات البكتيرية الهياكل جدار الخلية 1،6،7. قمنا بتطوير نموذج جديد (1) الذي يقترح أن ناتئ الانحناء يمكن وصفها من قبل اثنين من العوامل المستقلة، وأنا) وهي أحد العوامل الكيميائية، والتي تعطى من قبل انجميور الكلاسيكية امتصاص حرارة ثابتة، من الذي نقوم بحساب الحرارية التوازن التفكك المستمر (K د) و II) عامل الهندسية، أساسا مقياس لكيفية توزيع مستقبلات الببتيد البكتيرية على سطح ناتئ. يستخدم توزيع سطح مستقبلات الببتيد (ع) للتحقيق في الاعتماد للهندسة وتحميل يجند. يتبين أن قيمة عتبة P ~ 10٪ أمر بالغ الأهمية لتطبيقات الاستشعار عن بعد. أدناه والتي لا يوجد أي إشارة يمكن كشفها في حين الانحناء فوق هذه القيمة، في إشارة الانحناء يزيد خطيا تقريبا، وكشف عن أن الإجهاد هو نتاج مادة كيميائية ملزم القوات المسلحة الكونغولية المحليةتور وعامل الهندسية يجمعهما الربط الميكانيكية من المناطق كان رد فعل ويقدم نموذجا جديدا للتصميم وكلاء قوية لمكافحة العدوى بكتيريا.

Introduction

نموذج التعرف الجزيئي يدعم مساحات واسعة من الأحياء والطب. في الصيدلة، على سبيل المثال كان الهدف هو تتداخل مع مسار المرضية من خلال استهداف أحد المشاركين الرئيسيين في عملية البيوكيميائية مثل transglycoslyation أو transpeptidation أن يحفز يشابك من الببتيدات جدار الخلية البكتيرية. وبالتالي يتم تقليل تصميم الأدوية لتحديد جزيء مناسبة لاستهداف موقع معين لرسو السفن البكتيرية للحث على مثاليا. والمثال الكلاسيكي محاكاة نجاح هذا النهج هو فانكومايسين (فان)، الذي يستهدف جدار الخلية ببتيدوغليكان، وهو سمة هيكلية الحفظ من جرثومة. في نوع من البكتيريا إيجابية الجرام الوليدة، المصفوفة ببتيدوغليكان يتكون من الببتيدات تنتهي في تسلسل يسين-D-ألانين-D-ألانين، المربوطة عبر C55 الدهون 8-10 رابط هنا تسمى D-علاء. هذه الببتيدات كشفها على السلائف ببتيدوغليكان أساسية للالحماية الميكانيكية للخلايا البكتيرية ضد القوات البيئية القاسية، والأهم من ذلك، لا توجد في الخلايا البشرية، مما يجعلها أهدافا مثالية للعقاقير المضادات الحيوية. يربط فان على وجه التحديد إلى C-محطة للبكتيريا الخلية الببتيدات بالحائط لتشكيل قوي باعتدال فان الببتيد معقدة كما هو مبين في الشكل 1. هذا التفاعل بين فان والببتيدات كتل يتعرض تصرفات transpeptidases وtransglycosylases، التي تحفز عبر ربط للجدران الخلايا وقف على نحو فعال لهم من يشابك وبالتالي يضعف nanomechanically الخلية البكتيرية التي تؤدي إلى الوفاة عن طريق تمزق 1،6، 7.

ظهور المقاومة للفانكومايسين المعوية (VRE) هو زيادة مشكلة الرعاية الصحية (11) ولأن المقاومة البكتيرية المعوية في ينشأ بسبب التغيير خفية من أميد لين كاجي لاستر الربط وهذا التغيير الهيكلي مخادعة بسيطة على سطح حذف بكتيريا السندات الهيدروجين واحد من موقع فان 'ق الالتحام مع التعديلات اللاحقة من جيب ملزمة. الأهم يغير هذه العملية ألانين محطة خماسي الببتيد موجودة في فانكومايسين عرضة المعوية (VSE) ليسين-D-ألانين-D-اللاكتات 10،12، وهنا يسمى D-لاك، مما أسفر عن انخفاض كبير في Van-D-لاك تقارب ملزم من قبل ولذلك ثلاثة أوامر من حجم التقديم فان غير فعالة علاجيا ضد الالتهابات Enterococcal ونمو مثيرة للقلق من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية الدافعة لتطوير نهج مبتكرة لتسريع واستعادة النشاط المضاد للبكتيريا من وكلاء المضادة للبكتيريا أو اكتشاف أدوية أقوى ضد أدوية متعددة البكتيرية مقاومة الالتهابات.

الطبقة = "jove_content"> تجاربنا باستخدام الكابولي قائمة بذاتها مستوحاة من النظم مثل الخلايا التي تسخير الطاقة الكيميائية إلى حركة. قدرة أجهزة الاستشعار ناتئ لترجمة الطاقة الكيميائية إلى الحركة الميكانيكية يجعلها تحقيقات فريدة من نوعها مع مزايا كبيرة لرصد الاضطرابات الميكانيكية للأهداف جدار الخلية البكتيرية في الوقت الحقيقي. أجهزة الاستشعار ناتئ تتطلب 'به' أي مراسل ويتم الكشف عن الجزيئات الحيوية بسرعة في رد فعل خطوة واحدة. يمكن أن فحص المخدرات متعددة في نفس الوقت في ظل بيئات الفسيولوجية مثل حلول مخزنة والمصل كله. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تكنولوجيا ناتئ المرجعية الموقعية لقياس الفرق السماح لهم للكشف على وجه التحديد التفاعلات المستهدفة المخدرات و، بحكم تلفيق لهم عبر طرق معالجة أشباه الموصلات القياسية، فهي قابلة لانتاج كميات كبيرة والموازاة لالفرز الفائق الإنتاجية الآلاف الأدوية للساعة الواحدة. في particجزيئية متعددة صفائف استشعار ناتئ هي أدوات مفيدة لدراسة مقاومة المضادات الحيوية للفانكومايسين - لأن المقاومة للفانكومايسين هي في جوهرها مشكلة ميكانيكية 1،6،7. ويمكن الكشف عن التفاعلات بين نموذج البكتيرية جدار الخلية الهدف وفان في حل عن طريق رصد التغيرات في الضغط ذات الصلة سريريا الناجمة عن التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزمة. ويتم تحليل الضغط المتولدة من تفاعلات السطح الذي يتجلى في إشارة الانحناء ناتئ بصريا بواسطة أجهزة استشعار المضيئة مع شعاع الليزر. وعلاوة على ذلك من خلال تخصيص طلاء تقبلا من البكتيريا الجزيئات المستهدفة على رأس السطح من أجهزة الاستشعار ناتئ، على مقربة من عدد غير محدود من التحاليل (فان)، والتفاعلات البيوكيميائية محددة ويتم رصد الميكانيكا الحيوية من نموذج البكتيرية جدار الخلية المصفوفة في الوقت الحقيقي. وبصرف النظر عن هذا الحدث التعرف الجزيئي، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب أجهزة الاستشعار ناتئ إلى مواطنهlect الأول، والتي تشمل - تغيرات درجة الحرارة، ملزم غير محددة أو تغييرات في معامل الانكسار من الحل. لحساب إشارات غير محددة، وقياسات الفرق في الموقع حيث يتم تنفيذ الانحناء للكل من القياس والكابولي إشارة تتم مراقبتها بشكل مستمر لتحليل التفاعلات المحددة. وعلاوة على ذلك، فإن الحساسيات كشف من أجهزة الاستشعار ناتئ التي تعتمد على كيمياء المياه السطحية والهندسة يمكن أن تتعزز ضبط كثافة P السطحية (حيث يتم تعريف P كنسبة من المساحة السطحية بواسطة جزيئات التقاط المحتلة إلى منطقة السطح العلوي بأكمله للناتئ من مجموع السكان من الجزيئات كما هو محدد بواسطة الأشعة السينية الضوئية الطيفي (XPS) 1 تغطيتها.

هنا تفاصيل هذا البروتوكول كيفية فانكومايسين أو أي مضاد حيوي الأخرى ملزمة لجدار الخلية البكتيرية النظير السلائف (mucopeptides) عند تركيزات ذات الصلة سريريا في حل مخزنة علىويمكن الكشف عن مصل الدم الثانية باستخدام التسمية خالية من التكنولوجيا ناتئ. وتستخدم أسطح الذهب الطازجة لأن المجمعة monolayers النفس (صواريخ سام) تميل إلى تشكيل بسهولة طبقات مستقرة على الذهب نظيفة 13،14. يتكون عادة من صواريخ سام جزيئات قصيرة مع شاردة ثيول المرفقة تساهميا على سطح الذهب، ولا يسمح وحدة التقاط المطلوب على الطرف الآخر للتفاعل بحرية مع أهداف الحليلة في الحل. ثيول تشكيل نظام مرن خاصة وأن العديد من المركبات ثيول مع مختلف الفئات نهاية الكيميائية متاحة تجاريا أو يتم تصنيعه بسهولة في المختبر. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر لضمان أن الجزيئات مع شاردة ثيول يجب أن يكون الجماعات نهاية الصحيحة، على سبيل المثال في البروتين أو الاقتران الببتيد، ينبغي للفريق الأمينية مواجهة الداخل للتفاعل مع المجموعة الكربوكسيلية من شاردة ثيول المربوطة على السطح ليحدث. هنا، كانت ثيول مترافق مباشرة مع mimetics ثلاثي الببتيد من الدهون البكتيرية الثاني من بجدار الخلية acterial أهداف توليفها من قبل منهجية المرحلة الصلبة باستخدام المتاحة تجاريا مسبقة انغ-D-علاء وانغ-D-لاك راتنجات ومستوى FMOC-حماية مجموعة الكيمياء 15. على الرغم من تركيز هذا الوصف للفانكومايسين، من الواضح أنها يمكن أن تمتد إلى المضادات الحيوية الأخرى، بل يتم إجراء المزيد من الدراسات دعا من قبل الباحثين من مختلف المجالات وخاصة في الكيمياء الحيوية، علم الصيدلة، والعلوم المادية لاعتماد هذا البروتوكول بسهولة لإجراء التجارب الخاصة بهم.

Protocol

1. إعداد الكابولي

  1. باستخدام تفلون ملاقط تزج عدد مختار من رقائق ناتئ (كل ناتئ قياس 500 ميكرون طويل، 100 ميكرون واسعة و 0.9 ميكرومتر سميكة) في حل سمكة البيرانا الطازجة (في نسبة 1:1 H 2 SO 4 و H 2 O 2) لمدة 20 دقيقة .
  2. بعد ما يقرب من 20 دقيقة إزالة رقائق ناتئ من حل سمكة البيرانا وشطف لهم جيدا بالماء منزوع الأيونات ونقل على الفور الى حل سمكة البيرانا الطازجة. كرر الخطوة 1.1 أعلاه إذا رقائق تحتوي على بقع من الأوساخ وإلا المضي قدما إلى الخطوة التالية.
  3. بعد تنظيف شامل في الماء منزوع الأيونات، وشطف مع الإيثانول النقي وتجفيف رقائق ناتئ على موقد في 75 درجة مئوية لإزالة أي آثار للماء. تفتيشها باستخدام المجهر الضوئي للتأكد من نظافتها.
  4. نقل رقائق ناتئ تنظيفها إلى غرفة التبخير وضخ أسفل، واستهداف لتحقيق الفراغالضغط من 10 -7 م بار.
  5. مرة واحدة ويتحقق الضغط فراغ المطلوبة، ومعطف جانب واحد من كل مجموعة ناتئ مع التيتانيوم 2 نانومتر أول من يقوم بدور طبقة التصاق قبل طبقة إضافية من 20 نانومتر الذهب سميكة. للتأكد من سماكتها، واستخدام شاشة الكريستال الكوارتز وضعها مباشرة فوق مصدر الهدف.
  6. ترك الذهب المطلي رقائق استشعار ناتئ في غرفة لمدة 1-2 ساعة لتبرد تحت فراغ قبل الافتتاح.
  7. نقل رقائق تبخرت حديثا إلى وعاء تخزين فراغ مليئة الأرجون لمنع أي شكل من أشكال التلوث.

2. ناتئ Functionalization رقاقة

  1. أولا، ترتيب أنابيب-الشعرية الدقيقة في مرحلة functionalization 2 وفقا لحجم الملعب ناتئ من 250 ميكرون.
  2. ثم حقن 2 مم حلول ثيول الايثانول من الجزيئات المستهدفة سطح، أي mucopeptides البكتيرية (D-علاء وD-لاك)، و 'INERيجب ر 'alkanethiol تنتهي في غليكول triethylene (PEG) المعروف لمقاومة الجزيئية البيولوجية الامتزاز. 16 كل من الأنابيب الشعرية تحتوي على جزيئات متنوعة التقاط سطح تحدد بشكل عشوائي لتجنب التحيز المستخدم.
  3. احتضان المقبل لمدة 20 دقيقة في الكابولي في microcapillaries مليئة حلول ثيول التي تحتوي على جزيئات التقاط السطح. ضمان أن تقتصر الحلول من الجزيئات القبض على كل سطح ناتئ استشعار الفرد لتجنب أو تقليل عبر التلوث. إذا تم توظيف هذه العملية بشكل صحيح، ينبغي أن يغير بشكل منهجي الطازجة الكابولي المغلفة الذهب إلى أجهزة استشعار نشط كيميائيا شكلت من خلال السماح صواريخ سام من أهداف mucopeptide البكتيرية لتشكيل على الأسطح المطلية بالذهب باسم المستقبلات.

3. التحضيرات الحل

  1. حل 0.1 M أملاح فوسفات الصوديوم أحادية ودى الأساسية في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ · سم المقاومية) ومزيج رس تسفر عن قيمة الرقم الهيدروجيني من 7.4.
  2. إضافة 0.002٪ من PS80 إلى حلول مخزنة لتقليل الآثار الناجمة عن تجميع التفاعلات غير محددة من جزيئات الدواء إلى الأواني الزجاجية.
  3. تمييع المخدرات مع حلول مخزنة حديثا إلى تركيزات مختلفة المطلوب الذي سيمكن حساب K د.
  4. تحديد الحلول المخدرات الطازجة باستخدام 0.2 ميكرون مرشحات ويصوتن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل تطهير مع الأرجون.
  5. كرر الإجراء مع المخدرات في المصل مخزنة باستخدام المصل كله. دوامة بلطف لمدة 15 دقيقة مع 5 دقائق إضافية لضمان الذوبان الكامل.

4. كشف سطح الإجهاد

  1. تحميل جهاز استشعار ناتئ functionalized رقاقة إلى غرفة خلية تدفق السائل.
  2. محاذاة بقعة الليزر على نهاية خالية من كل أجهزة الاستشعار وتأكيد المواءمة بواسطة تسخين السائل لغرفة 1 ° C. وينبغي لجميع ثمانية الذهب المطلي صفائف استشعار الخضوع ناتئ التحليل الشاملssive الانحناء نحو الانخفاض بسبب تأثير متعلق بنظام المعدنين الناجمة عن الاختلافات في معدلات التوسع من السليكون والذهب.
  3. بعد التسخين لحوالي 10 دقيقة، والسماح للالكابولي لتبرد لمدة 10 دقيقة أخرى.
  4. حساب التباين الانحناء في أقصى إشارات الانحناء بين أجهزة الاستشعار ناتئ الفردية وإذا كان الانحراف المعياري النسبي للإشارات الانحناء ≤ 5٪ ثم قبول المحاذاة على النحو المرغوب فيه وإلا تكرار هذه العملية.
  5. المقبل، وقياس الترددات الرنانة من كل ثمانية الكابولي لحساب الثوابت الربيع بهم. إذا كان الاختلاف من ربيع مستمر بين كل جهاز استشعار ناتئ داخل رقاقة هو ≤ 1٪ ثم قبول رقاقة وجود الخواص الميكانيكية متسقة استبدال وإلا فإن رقاقة الاستشعار ناتئ.
  6. بعد ذلك، استخدم نظام فلويديك (نموذج جيني زائد) عن طريق صمام السداسية لتحقيق تبادل السائل داخل الخلية التدفق بينما ينبغي أن يتحقق الحصول على البيانات باستخدام ابفيف الآلي بحيثftware.
  7. لرصد ناتئ الانحناء البيانات، واستخدام البروتوكولات القياس التالية: أ) حقن إما حل العازلة أو المصل دون المخدرات لقياس التحكم دائم للدقيقة 5-30 لإنشاء خط الأساس؛ الثاني) حقن محلول المخدرات لمدة 30-60 دقيقة، الثالث) حقن 10 ملم حمض الهيدروكلوريك غسل ل10-60 دقيقة لفصل ملزمة معقدة المخدرات؛ الرابع) حقن أخيرا خطوة الغسيل باستخدام مزيد من حل العازلة للدقيقة 5-30 آخر لتجديد الببتيدات السطحية وإلى استعادة إشارة خط الأساس. تأكد دائما من أن جميع الإشارات يتم الحصول على معدل ثابت تحت تدفق السائل من 30-180 ميكرولتر / دقيقة في درجة حرارة ثابتة و25 ° C في خزانة التحكم في درجة حرارته.
  8. وينبغي رصد الإشارات الانحناء المطلق من كل ثمانية الكابولي استخدام الوقت المسلسل المضاعفة طريقة شعاع بصري مع جهاز الكشف عن موقف واحد الحساسة.
  9. لتحليل إشارات الانحناء من كل تركيز من المخدرات، يتم تحويل bendings التفاضلية الناتجة إلى stres الفرقق بين الطرفين العلوي والسفلي من ناتئ باستخدام معادلة ستوني لل.

Representative Results

يتم استغلال التغيير الإجهاد قياسها باستخدام الدقة مقياس النانو مع حساسية غير مسبوقة لحذف H-السندات واحد، لتعقب الاضطرابات من نموذج الميكانيكا الحيوية البكتيرية جدار الخلية في الوقت الحقيقي (أرقام 2A-D). وكان التحقيق الحد من حساسية للكشف عن المخدرات لفان عن طريق تمييع متسلسل تركيزات في الخطوات من 1،000 ميكرومتر إلى ≤ 10 نانومتر، وكشف عن 10 نيوتن متر (~ 15 نانوغرام / مل) كما تحتوي على نسبة أقل كشفها مما أدى إلى ما متوسطه ~ -9 ± 2 نانومتر كما الإشارات الانحناء الفرق (الشكل 2C). القدرة على اكتشاف المضادات الحيوية تحت بيئة الفسيولوجية ومزيد من التحقيق في المصل في مجموعة تركيز ذات الصلة سريريا من 3-27 ميكرومتر 17. عند حقن من 7 ميكرومتر فان في مصل الدم (90٪ مصل العجل الجنين بالإضافة إلى 10٪ من الصوديوم العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4) في جميع الكابولي في ظل ظروف مماثلة، في إشارة التفاضلية للDALA في مصل الدم كان 105 ± 4 نانومتر بينما لالكابولي المغلفة DLac، لم يلاحظ أي الانحناء (الشكل 3). هي سبب الإشارات الانحناء كبيرا لوحظ DALA المغلفة (فانكومايسين عرضة) الكابولي من تفاعلات قوية ملزمة المستهدفة المخدرات. ولكن لDLac المغلفة (مقاومة فانكومايسين) الكابولي، وجود تنافر للدولة أرض الواقع من الزوج الوحيد الأوكسجين وانخفاض السندات NH في جيب ملزمة فانكومايسين 10،12 يسهم في إضعاف التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزم والذي ينتج في أقل أو لا ناتئ الانحناء، ولا سيما بالنسبة للتركيزات فانكومايسين السفلى (الشكل 3). ومع ذلك، لتركيز فانكومايسين عالية، نلاحظ إشارات الانحناء قابلة للقياس لDLac. وعلاوة على ذلك، لدينا تصميم تجريبي مهم لمراجع في الموقع حيث كل CAويتعرض ntilevers المغلفة مع كل دلع وDLac في وقت واحد لنفس الحليلة في الوقت الحقيقي.

لفهم الدور المحدد الكيمياء والهندسة، قمنا بتصميم نموذج (أ) 1 اصفا العلاقة بين التفاعلات المذيبات والميكانيكا السطح. وهذا ينتج الضغط السطحية:

المعادلة 1 لP> الكمبيوتر وصفر خلاف ذلك (1)

الفصل الدراسي الأول في المعادلة (1) هو انجميور امتزاز متساوي الحرارة، وهو ما يمثل الأحداث المستهدفة المخدرات ملزمة والفترة الثانية هي شكل قانون السلطة تصف عواقب الميكانيكية على نطاق واسع من تشكيل شبكة شدد. ثابت ليتوافق مع التوتر القصوى السطح عندما تكون جميع مواقع الربط التي يمكن الوصول إليها المحتلة وK d هو سطح التوازن سلبيات التفككتانت على ناتئ. التحليل كما هو مبين في الشكل (4) هو نتيجة لنوبة العالمية من المعادلة (1) فرضه على الفرق قياس إشارات الإجهاد يكشف؛ A ~ 29.7 ± 1.0 أو 14.1 ± 3.0 مليون / م وK د ~ 1.0 ± 0.3 أو 800 ± 310 ميكرومتر لD-علاء أو الببتيدات DLac، حيث يتوافق مع مقياس التوتر السطحي عندما تشغل جميع المواقع ملزم الوصول إليها. كان ضبطها حساسية تعزيز ناتئ من خلال تغيير منهجي كثافة الببتيد P في حين رصد البيانات الإجهاد بوصفها وظيفة من P بينما تركيزات المضادات الحيوية ثابتة عند 10، 100، و 250 ميكرومتر، على التوالي (الشكل 5). وتكرر هذه العملية مع الضغط كدالة للتركيزات فان في حين أن كثافة الببتيد ثابتة في P ~ 100٪.

<IMG بديل = "الشكل 1" FO: محتوى العرض = "5IN" SRC = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
الشكل 1. كشف ناتئ من المضادات الحيوية التفاعلات سطح ملزمة. أ) تمثيل تخطيطي من مجموعة أجهزة الاستشعار ناتئ وطريقة التي يتم من خلالها الكشف عن التفاعلات المستهدفة المخدرات nanomechanically. ب) التفاعل الكيميائي بين ملزمة جزيء المخدرات (فان) والتناظرية mucopeptide البكتيرية (D-علاء أو D-لاك). ج) الآلية التي يتم من خلالها تحور البكتيريا المكورة عرضة (VSE) يكتسب مقاومة للعقار عن طريق حذف H-السندات واحد في جيب ملزمة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2 الشكل 2. تتبع الاضطرابات من طراز البكتيرية الميكانيكا الحيوية جدار الخلية في الوقت الحقيقي. أ) إشارات الانحناء المطلق من D-علاء، D-لاك وPEG الكابولي المغلفة في العازلة الفوسفات و 250 ميكرومتر فانكومايسين. وترد إشارات مرجعية PEG الفرق في خطوط سوداء. ب) إشارات الانحناء التفاضلية من D-علاء وD-لاك الكابولي المغلفة في العازلة الفوسفات و 250 ميكرومتر فانكومايسين. ج) ناتئ انحراف الفرق من إشارة تعتمد على الجرعة بوصفها وظيفة من الوقت في وجود تركيزات فانكومايسين في الترتيب من 10 نانومتر (الخط الأصفر)، و 100 نيوتن متر (خط أحمر) و 1،000 نيوتن متر (خط أحمر الداكن) على التوالي. د) ناتئ إشارات انحراف الفرق لمدة ثلاثة D-علاء أجهزة الاستشعار ناتئ المغلفة باعتباره وظيفة من الوقت في ظل وجود 10فانكومايسين نانومتر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل (3). تتبع من الاضطرابات من طراز البكتيرية الميكانيكا الحيوية جدار الخلية في الوقت الحقيقي لD-علاء وD-لاك الكابولي المغلفة في وجود 7 فانكومايسين ميكرومتر في مصل العجل الجنين.

الشكل 4
الشكل 4. التحقيق في nanomechanics من التفاعلات المستهدفة المخدرات. القطعة يظهر سطح الفرق قياس الاستجابة للتوتر لD-علاء (الدوائر السوداء) وD-لاك (الدوائر الحمراء) الكابولي المغلفة بوصفها وظيفة من فانكومايسينالتركيز في حل [فان]. يتم وصف البيانات بواسطة المعادلة (1) (خطوط الصلبة). 1

الرقم 5
الشكل 5. تعظيم الاستفادة من حساسية الكشف ميكانيكية نانوية من التفاعلات مستقبلات يجند من خلال التحقيق في الاعتماد التحميل مستقبلات والهندسة عبر الطبقات الوحيدة المختلطة. المقاسة الفرق سطح استجابات التوتر من أجهزة الاستشعار ناتئ بوصفها وظيفة من D-علاء التغطية السطحية، p في وجود تركيزات فانكومايسين الثابتة في حل في 10 ميكرومتر (الخط الأسود)، و 100 ميكرومتر (خط أحمر)، و 250 ميكرومتر (الخط الأخضر).

Discussion

هذه النتائج تثبت أن أجهزة الاستشعار مجموعة ناتئ لديهم حساسية لكشف وتحديد التغييرات في التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزمة خصوصا في مقاومة فانكومايسين المرتبطة مع حذف واحد H-السندات من جيب الدواء ملزم. وتبين لنا وجود حساسية الكشف nanomolar فان بالاتفاق مع مأكل سطح الرنين (SPR) دراسات سابقة 18،19، وتكشف عن أن الأسلوب ناتئ يمكن الكشف عن مباشرة وقياس جزيئات الدواء في الدم بتركيزات ذات الصلة سريريا كما تطبق بشكل روتيني في الممارسة السريرية. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الإجهاد سطح الفرق يمكن وصفها من قبل المعادلة شكل المنتج (1)، أي (أنا) وهو مصطلح الكيميائية واصفا الأحداث المستهدفة المخدرات محددة ملزمة، و (الثاني) وهو مصطلح هندسي واصفا الربط الميكانيكي بين رد فعل كيميائيا مواقع السطح، مما يعني أن التفاعلات الكيميائية المحلية لفك الارتباط ميكانيكي العالميةالتفاعلات آل من ناتئ. في حين يتم إعطاء مصطلح الكيميائية من قبل انجميور الكلاسيكية امتصاص حرارة ثابتة، فإن مصطلح هندسي يكشف عن آلية percolative من الإجهاد الناجم عن التغيرات سطح المستهدفة المخدرات. الكمبيوتر عتبة حرجة ~ كان 10٪ (الشكل 5) اللازمة للكشف عن ناتئ الفرق الانحناء، وتبين أن الإجهاد السطح ترانسدوسيد بشكل جماعي عندما تحتل جزء سطح كبيرة نسبيا من قبل جزيئات المضادات الحيوية. لP ≥ الكمبيوتر، والربط الميكانيكي بين المواقع السطح يتحول كيميائيا يتم تأسيس تدريجيا، والتفاعلات طاردة قصيرة المدى مثل التفاعلات الفراغية بين العقد في الشبكة ميكانيكية نانوية يؤدي إلى زيادة الانحناء الهابط للناتئ بأكمله. وتكهن بأن لدينا نموذج الترشيح ميكانيكية نانوية قد تلعب دورا هاما في وضع المضادات الحيوية ببتيد سكري العمل في البكتيريا الحقيقية. هذه النتائج تسلط الضوء على حساسية عالية من التكنولوجيا ناتئ لياليtudying وضع المضادات الحيوية 'العمل وتمثل أداة بحث جديدة لدراسة الأدوية لتحسين فهم العمليات من المضادات الحيوية في مقياس النانو لتوعية وتمكين اكتشاف أدوية قوية للسيطرة على مشاكل الإصابات بكتيريا. لإعداد نظام ناتئ لقياسات متكررة وحساسة، ونحن قد تناول مجموعة من الأهداف في البروتوكول، لا سيما لتحميل عينة في الخلية ميكروفلويديك وإجراءات التشغيل الموحدة للسماح المكتشفة ميكانيكية نانوية الكمي.

أهمية التكنولوجيا ناتئ فيما يتعلق بأساليب القائمة

في ملخص نشير إلى أنه في حين تم اقتراح هذه التكنولوجيا منذ أكثر من 25 عاما، إلا أنها لم تجد طريقها إلى العيادة بسبب عدم وجود قياسات دقيقة ومتكررة على الأهداف ذات الصلة طبيا. نحن هنا لشرح الإجراءات التي تثبت أهمية استخدام الكابولي ميكانيكية نانوية للتحقيق في ميكانيكيآل تأثير المضادات الحيوية على الأهداف جدار الخلية البكتيرية وللكشف عن مقاومة مضادة للجراثيم. طرق فحص المخدرات التقليدية تتطلب بعض نوع من العلامات الفلورية المشعة أو من جزيء مراسل لقياس ملزم من الحليلة إلى هدفه، وغالبا في اتصال مع مقايسة ملزمة تنافسية أو الأنزيمية والمقايسات بروتين 20. وضع العلامات من الجزيئات الحيوية ليس فقط مضيعة للوقت ومكلفة ولكن يمكن أن التسمية أيضا تتداخل مع التفاعل الجزيئية عن طريق عرقلة الموقع ملزم، مما يؤدي إلى السلبيات كاذبة. وبالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون مركبات الفلورسنت مسعور التي يمكن أن تؤدي إلى خلفية ايجابيات ملزمة وكاذبة. ونظرا لهذه القيود، هناك اهتمام متزايد في تقنيات خالية من تسمية الرواية التي تسمح لأي معقدة الجزيئية تقريبا ليتم عرضه مع تطوير مقايسة الحد الأدنى. التقنيات سطح خالية من التسمية الأكثر رسوخا في الوقت الحاضر هي SPR وكوارتز كريستال توازن دقيق (QCM). وعلى النقيض من ذلك التدبير SPR الالثابت e عازلة، تسمية - تكنولوجيا ناتئ مجانا بالكشف عن سلالة سطح الناتجة عن تفاعل مستقبلات يجند، والتي يمكن قياس مباشرة قوات ميكانيكية نانوية التي تم إنشاؤها بواسطة ملزمة محددة من يغاندس لمستقبلات السطح. تفرد هذه المجسات هو أن حساسيتها لا تعتمد على خصائص عازلة الناجمة عن كتلة التغيير نظرا لالحليلة ملزمة كما هو الحال في SPR وQCM بل على أدق التغيير الناجم عن الإجهاد في السطح في الطائرة، مما يجعل من تكنولوجيا مناسبة فريدة لدراسة وnanomechanics من جزيئات الدواء في تركيزات المضادات الحيوية ذات الصلة سريريا (3-27 ميكرون) 17. وأيضا مناسبة الكابولي بشكل خاص إلى جزيء صغير (مثل شظايا الحمض النووي والمخدرات) كشف في ظل الظروف الفسيولوجية بما في ذلك بيئات معقدة والتي هي إلى حد كبير أساس صناعة المستحضرات الصيدلانية، وبالتالي سيكون بمثابة أداة تكميلية في اكتشاف المخدرات. وقد تم بنجاح تطبيق تكنولوجيا ناتئ فيمجالات علم الجينوم 3،5، الغاز الاستشعار 21، 22 البروتينات، والمخدرات 1. وعلاوة على ذلك، هي ملفقة الكابولي باستخدام منخفضة التكلفة تكنولوجيا السيليكون، ونظرا لتوافقها مع عمليات التصنيع الدقيق، يمكن المنمنمة الكابولي لتحسين حساسية والموازاة في صفائف كبيرة من أجهزة استشعار متعددة لفحص المخدرات ومجمع العالي المعلومات الغنية الإنتاجية المقايسات الفرز. وإدخال تحسينات على الأجهزة والتصميم التجريبي تسمح مجموعة متنوعة واسعة من التفاعلات التي سيتم تحليلها في الوقت الحقيقي للمساعدة في دفع عملية البحث عن جيل جديد من superdrugs لمعالجة المشاكل المتعددة من الالتهابات المقاومة.

الخطوات الحاسمة في إطار بروتوكول

وضع بروتوكولات القياس قوي أمر أساسي لتطبيقات هذه التكنولوجيا. لتحقيق مرضية الكمي القياسات المستهدفة المخدرات وتحديد أقل تركيز من المضادات الحيوية ريمكن أن يتم الكشف عن قبعة في المخزن أو الدم عولجت، الخطوات الحاسمة المصل ضمن البروتوكول. المهمة الأولى ينطوي على ضبط وتحسين كيمياء التقاط سطح لتعزيز ناتئ خصوصية الكشف وحساسية. لا يمكن إنكاره، تنبيغ التوتر السطحي هو ظاهرة جماعية، تتطلب نسبة كبيرة نسبيا من السطح المراد تغطيتها لتأسيس اتصال بين مناطق رد الفعل كيميائيا. وتبين لنا أن من خلال تغيير كثافة من الببتيدات سطح الكامنة، عتبة حرجة ~ P ≥ 10٪، حيث يتم تحديد مقياس التوتر السطحي بوصفها وظيفة من كثافة الببتيد وصفر خلاف ذلك (الشكل 5). فمن المهم أن التجارب التي تهدف إلى تحقيق التوحيد من التوتر على طول الكابولي لضمان الانحرافات إشارة الحد الأقصى للمقاييس حساسة. وبالإضافة إلى ذلك، كفاءة بروتوكولات تجديد سطح يجب أن تكون في المكان، مما يسمح القياسات دورة متعددة وتخفيض التكاليف لكل TESر. في حين أن تصميم سطح مستقبلات باستخدام thiolated نهاية مسعور، والتوجه للجزيء مستقبلات وتباعد بينهما هو أمر حيوي للسماح التجميع الذاتي من التعبئة الكثيفة بسبب التفاعلات فان در فال-بين جزيئات لتقليل التفاعلات غير محددة. وعلاوة على ذلك، يجب أن يحتوي على جزيئات القبض على البولي ايثيلين جلايكول (PEG) رابط للسماح لبعض جزء من مصفوفة الاستشعار لتكون ماء لمنع الإدراج من الجزيئات في حل الحليلة من التفاعل مباشرة مع سطح الذهب غير المصقول. يجب على جزيئات رابط PEG بمثابة الفواصل للحد من القيود الفراغية وبالتالي تسمح للالتحاليل حل للتفاعل تحديدا مع مستقبلات سطح للحث على التغيير قابلة للقياس التوتر السطحي. يجب أن يعاير جهاز استشعار مجموعة ناتئ مع ما لا يقل عن مرجع القياس في الموقع وإشارة عرض في الوقت الحقيقي هو انحراف الفرق، التي تم الحصول عليها عن طريق طرح انحراف المطلقة للناتئ إشارة من لياليensing الكابولي. وهكذا ناتئ إشارة أمر ضروري لمراعاة التفاعلات غير محددة مثل التغيرات في درجات الحرارة، والتغيرات في معامل الانكسار أو التفاعلات على الجانب السفلي nonfunctionalized من ناتئ. تعظيم الاستفادة من معدل تدفق (~ 30-150 ميكرولتر / دقيقة) يشكل خطوة حاسمة في إطار بروتوكول لأنه يضمن تبادل كفاءة من السوائل والنقل الجماعي ثابت كافية من المواد حل. تصميم خلية السائل يجب أن تسمح حجم الأمثل (5-80 ميكرولتر) لمعدلات تدفق سريع لتمكين تبادل السائل مثالية للتغلب على القيود النقل الجماعي. معدل التدفق أمر بالغ الأهمية خصوصا أثناء أداء القياسات الحركية 23. غرف السائل حجم كبير لا يمكن السيطرة عليها تتطلب معدلات تدفق عالية مما يؤدي إلى متطلبات حجم عينة كبيرة، مما يزيد بلا داع سعر الفحص. سابقا وقد استخدمنا تدفق الجاذبية لحقن عينات مختلفة الى غرفة سائل القياس. تدفق الجاذبية لديه ميزة أنه ظبيةو لا يتطلب أي أجزاء ميكانيكية، وبالتالي لا يدخل الضوضاء إضافية في النظام. ومع ذلك، مؤات لها أهمية هو أنه يعمل فقط موثوق في معدلات تدفق عالية نسبيا (~ 200 ميكرولتر / دقيقة). ومن الواضح أن انخفاض معدل التدفق (≤ 1 ميكرولتر / دقيقة) تتطلب كميات عينة محدودة في وحدة الزمن ولكن من ناحية أخرى فإنه يجعل ردود الفعل أبطأ بكثير، وبالتالي يتطلب أوقات أطول للإتصال به. وعلاوة على ذلك، تدفق الجاذبية لديه تباين كبير في معدل تدفقها كما أنها تعتمد على الفرق بين ارتفاع مدخل ومخرج، مما يقلل حيث يتم استهلاك الحلول عينة خلال التجربة. لتجنب المشاكل تدفق الجاذبية، ينبغي أن تستخدم مضخة الحقنة. وميزة استخدام مضخة محقنة هو أنه يتيح لمعدل تدفق ثابت على مدى فترة طويلة من الزمن مما يسمح للتجارب أن تتحقق في بيئة أكثر الخاضعة للرقابة.

قيود البروتوكول

ويتمثل التحدي الرئيسي في الحصول على استنساخه علىد الكشف البيولوجي محددة باستخدام أجهزة استشعار ناتئ يكمن في التأكد من أن خصائص طبقة مستقبلات هي كيميائيا "النشط" وموحدة لكل ومقايسة. سر النجاح هو التجريبية في المعالجة متأنية للرقاقة الاستشعار مع تنظيف موحدة وبروتوكول الشلل مع كيمياء رابط لتوجيه جزيئات المستقبلات في التشكل بصورة نشطة. في الإعداد الحالية لدينا، ونحن functionalize صفائف ناتئ باستخدام الزجاج الصغيرة الشعيرات الدموية، التي يمكن أن تخضع لبعض السلبيات ويمكن أن يكون مشكلة في بعض الحالات. هذه الزجاج الشعيرات الدموية مفتوحة عند كلا الطرفين، وبالتالي فإن المذيبات عينة يمكن أن يتبخر بسهولة. على سبيل المثال، إذا لم يتم التحكم بدقة في درجة الحرارة للمرحلة functionalization، يمكن أن معدل التبخر تتفاوت تفاوتا كبيرا في أوقات مختلفة وخاصة عند استخدام المذيبات المتطايرة مثل الايثانول. وهناك أيضا إمكانية اختلاف طفيف في فترة حضانة من ناتئ واحد إلى آخر زاللاعب Iven أن السوائل الاستشعار عن بعد يجب أن تكون محملة على التوالي في الشعيرات الدموية. العامل المحدد أخرى في functionalization الشعرية هو عدم وجود القدرة على التأكد من أن الكابولي تندس دائما إلى الشعيرات الدموية في بنفس الطريقة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، في بعض الأحيان الكابولي يجب أن انسحبت قليلا من الشعيرات الدموية من أجل منع انتقال التلوث مثل عينات السائل يمكن أن تتدفق على هيئة رقاقة. لا يمكننا حل هذه المشاكل عن طريق استخدام راصدي النافثة للحبر كإجراء بديل لطلاء السطح الكابولي معطف. في حين انها ستسمح سيطرة الدقيق للطلاء عينة مع إمكانية توسيع النطاق لصفائف كبيرة، ولكن العائق الأكثر شيوعا هو أن قطرات الصغيرة التي تترسب على الكابولي يمكن أن تتبخر في غضون ثوان ويتطلب وجود بيئة الرطوبة التي تسيطر عليها. لذلك، لا يمكن تعديل فترة حضانة بسهولة، والتي قد يكون من المرغوب فيه لبعض التطبيقات. التفاعل خفية من العوامل مثل عينة VOلوم، فترة حضانة ومعدل التبخر يكون لها تأثير مباشر على التعرض للالكابولي لعينة functionalization ويجب توخي الحذر لضمان كيمياء السطح الأمثل لفحوصات ناتئ عن أي اختلاف صغير في الكثافة الجزيئية مستقبلات سوف يكون لها تأثير كبير على ناتئ استجابة.

تعديلات التصميم التجريبي (أي تقنيات أو مواد بديلة)

للتغلب على التحديات الرئيسية في الحصول على الإجراء طلاء استنساخه للتنمية المستقبلية لهذه التكنولوجيا ناتئ، يطلب من الاستراتيجيات المختلفة التي من شأنها أن استخدام الكابولي متكاملة في القنوات ميكروفلويديك. والفكرة هي أنه ينبغي تصميم رقائق ناتئ خاص بحيث أن كل ناتئ يتم وضعها في قناة خاصة بها على شبكة الإنترنت للسماح الإجراءات functionalization الموقع حيث تتم معالجتها بشكل فردي في القنوات. ومن شأن هذه التعديلات التصميم التجريبي تسمح عملية الطلاء إلى أن أداءإد في بيئة تسيطر عليها والمنجزة حيث التعرض للمذيب يتم رصد بدقة قبل فترة حضانة ومعدل تدفق لتجميد الآلي من جزيئات القبض على رقائق ناتئ. ويمكن بعد ذلك استخدام قنوات نفسه بالنسبة للتجارب الربط الفعلي حيث يمكن أن يتعرض كل الكابولي في حل الحليلة نفسه. إلى جانب إجراء functionalization ناتئ، فإن آلية قراءات ناتئ أيضا تحتاج إلى تحسين. الأسلوب انحراف شعاع بصري حساس للغاية وكان قد تم استخدامها بنجاح في المجهر القوة الذرية (AFM) التكنولوجيا لسنوات عديدة. ومع ذلك، مجانا مكانة تطبيقات الاستشعار ناتئ قراءات البصرية لديه بعض السلبيات، وعلى سبيل المثال فإنه لا يسمح القياسات في السوائل مبهمة مثل الدم، يمكن محاذاة مجموعة من أشعة الليزر وقتا طويلا ومملا والتكوين الحالي لا يمكن التفريق بين الانحرافات إمالة والرأسي. وبالتالي فإن مستقبل التنمية في cantilevسوف التكنولوجيا إيه ديك للنظر في جوانب التصميم الاستشعار العامة (على سبيل المثال هندستها ناتئ) وقراءات ناتئ لبروتوكولات القياس قوية سواء في المجالات والبيئات المختبر. وقد وضعت Manalis وزملاء العمل 22 أنواع من أجهزة الاستشعار رواية ناتئ أجوف حيث لديها الكابولي قناة ميكروفلويديك جزءا لا يتجزأ من داخل شعاع، والسماح للجهاز ليتم تشغيلها في فراغ مع العوامل ذات جودة عالية. في هذا الوضع، الكابولي بمثابة توازن دقيق 22، وبالتالي لم يعد من الضروري أن يكون هناك عدم تناسق بين الجانبين فيما يتعلق functionalization، وبالتالي فإن الجزيئات يمكن التقاط physisorbed أو تعلق تساهمي مباشرة على السيليكون، وعادة ما تستخدم صواريخ سام أو silanes 24. ويمكن أيضا أن الكابولي يمكن تعديلها مع طبقة رقيقة من البوليمر الذي هو ثم يضاف إلى الأجسام المضادة 25 للاستشعار عن البيوكيميائية.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

A برو المشتركةblem المرتبطة القياسات ناتئ هو إدخال فقاعات الهواء في الخلية تدفق ميكروفلويديك. يجب توخي الحذر لضمان أن يتم تقديم أية فقاعات الهواء في الخلية السائلة في حين تركيب رقاقة. إشارة الانجراف هو أيضا مشكلة مشتركة أخرى بسبب الاختلافات في درجة حرارة العينات. يجب أن يكون الكابولي معايرتها لتحقيق الاستقرار قبل أن يتم إجراء القياسات. يجب أن يتم تخزين جميع المخازن المؤقتة، التحاليل وحلول التجديد في نفس الغرفة مع والصك ناتئ للسماح لجميع الحلول لديهم نفس درجة الحرارة. على الرغم من أن ضخ حقنة يمكن أن توفر معدلات تدفق دقيقة للغاية ومنخفضة للغاية، ويرتبط عموما مع الضوضاء الميكانيكية في قياسات ناتئ. ولذا فمن المهم أن تضع بسيطة وفعالة المخفض الضوضاء لتجنب الضوضاء غير الضرورية في إشارات انحراف. يتكون المخفض الضوضاء من خزان السائل صغيرة تقع بين ضخ حقنة والخلية السائلة، التي تمتص روقال انه من الضوضاء الميكانيكية من المضخة. بسبب الطبيعة الحساسة للكشف عن بصري، ينبغي من الناحية المثالية أن تعمل نظام القياس ناتئ في الإعداد المغلقة لمنع أي أضواء الضالة من التدخل في نظام قراءات البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن للجودة من طبقات الاستشعار عن انخفاض ملحوظ إذا يتم تنفيذ عدد كبير من غسل الخطوات على الكابولي يحد من العمر الافتراضي للرقاقة الاستشعار.

تطبيقات بديلة أو المستقبل بعد اتقان هذه التقنية

الكابولي المغلفة مع صواريخ سام تنتهي في الأمينية أو الكربوكسيل المجموعة يمكن أن تستخدم أجهزة استشعار درجة الحموضة. الجماعات الوظيفية نهاية protonate أو deprotonate اعتمادا على درجة الحموضة من الحل ويمكن أن تولد تهمة السطحية التي تقود ناتئ لثني 24. وبالنظر إلى أن أجهزة الاستشعار ناتئ يمكن أن تتبع التفاعلات المستهدفة المخدرات المرتبطة زعزعة استقرار جدار الخلية من البكتيريا الحياة 1،6،7، فإنها بالتالي تساعد فيالبحث وتطوير جيل جديد من المضادات الحيوية لمكافحة الالتهابات المقاومة للأدوية. في الكابولي المستقبل سوف تستخدم لقياس microbalances معدلات نمو الخلايا واحد 26 كتلة و. فإن التكنولوجيا ناتئ تكون مفيدة لدراسة الاستجابات الخلوية لعوامل النمو المختلفة أو المخدرات. وسوف توفر أيضا أداة رواية للكشف السريع عن المؤشرات الحيوية متعددة، والتي لديها صلة مباشرة في التطبيقات الطبية ونقطة من الرعاية. ونظرا لبراعة، وصغر حجمها، ومتانة من أجهزة الاستشعار ناتئ، فإنها ستشكل رصد الحساسة من العوامل البيئية الضارة. وقد أثبتت أنها بالفعل حساسيتها في الكشف عن الغازات السامة والضارة التي يمكن الهروب من وحدات الإنتاج الصناعي والمختبر في البيئة، مثل حمض الهيدروفلوريك 27 أو سيانيد الهيدروجين 28.

Disclosures

يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح

Acknowledgments

وأيد جوزيف دبليو Ndieyira من قبل مجلس الهندسة والعلوم الفيزيائية البحوث (EPRSC)، مركز البحوث متعددة التخصصات في تقنية النانو (IRC)، الجمعية الملكية (RS) وبيانو الاستشارات (BNC). نشكر، أليخاندرا دونوسو باريرا، Dejian تشو، مانويل Vögtli، ماثيو باتشيلور، ماثيو كوبر A.، تورستن Strunz، تريفور رايمنت وغابرييل Aeppli لإجراء مناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scentris Scentris, Veeco Instruments, Inc Not in production
Six-way valve MVP, Hamilton, Reno, NV Enables multiple concentration injection
EB Evaporator BOC Edwards Auto 500, UK Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel Agar Scientific, UK Keeps gold coated films fresh
Glass capillary King Precision Glass, Claremont, CA, USA For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters 1511940001 Merck Millipore For sample filtering
Cantilever chips London Centre for Nanotechnology (LCN) Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic 10049-21-5 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic 7558-79-4 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80 9005-65-6 Sigma-Aldrich, UK Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water Millipore Co., Billerica, MA, USA Used for making solutions
Whole serum GEM-700-110-H Sera Laboratories International Ltd, UK Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van) 1404-93-9 Sigma-Aldrich, UK Drug used
Sulfuric acid 7664-93-9 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide 7722-84-1 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac London Centre for Nanotechnology (LCN) Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView National Instruments Co., Austin, TX, USA Software used for instrumental interface to allow controlled measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ndieyira, J. W., et al. Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance. Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).
  2. Zhang, J., et al. Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA. Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).
  3. McKendry, R. A., et al. Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).
  4. Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers. Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).
  5. Fritz, J., et al. Translating biomolecular recognition into nanomechanics. Science. 288, 316-318 (2000).
  6. Dwyer, D. J., et al. Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis. Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).
  7. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death. Cell. 135, 679-690 (2008).
  8. Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics. Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).
  9. Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization. Science. 280, 711-714 (1998).
  10. Bugg, T. D. H., et al. Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA. Biochem. 30, 10408-10415 (1991).
  11. Neu, H. C. The crisis in antibiotic resistance. Science. 257, 1064-1073 (1992).
  12. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature. 406, 775-781 (2000).
  13. Xu, J., Li, H. L. The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold. J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).
  14. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43-50 (1997).
  15. Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).
  16. Prime, K. L., Whitesides, G. M. Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces. Science. 252, 1164-1167 (1991).
  17. Rotschafer, J. C., et al. Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations. Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).
  18. Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers. Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).
  19. Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala. J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).
  20. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  21. Baller, M. K., et al. A cantilever array-based artificial nose. Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).
  22. Burg, T. P., et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature. 446, 1066-1069 (2007).
  23. Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).
  24. Nugaeva, N., et al. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection. Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).
  25. Von Muhlen, M. G., et al. Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators. Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).
  26. Godin, M., M,, et al. Using buoyant mass to measure the growth of single cells. Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).
  27. Mertens, J., et al. Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever. Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).
  28. Porter, T. L., et al. A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas. Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).
Nanomechanics من المخدرات التفاعلات المستهدفة وكشف المقاومة للجراثيم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ndieyira, J. W., Watari, M., McKendry, R. A. Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection. J. Vis. Exp. (80), e50719, doi:10.3791/50719 (2013).More

Ndieyira, J. W., Watari, M., McKendry, R. A. Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection. J. Vis. Exp. (80), e50719, doi:10.3791/50719 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter