Nanomekanik af narkotikarelaterede target Interaktioner og bakterieresistensmønstre Detection

Summary

Erhvervet resistens over for antibiotika er et stort offentligt sundhedsvæsen problem, og er i øjeblikket rangeret af WHO som en af ​​de største trusler mod menneskers liv. Her beskrives anvendelsen af ​​udkragede teknologi at kvantificere antibakteriel resistens, kritisk til opdagelsen af ​​hidtil ukendte og kraftige midler mod multiresistent bakterier.

Abstract

Cantilever sensor, der fungerer som en transducer reaktioner mellem model bakterielle cellevæg matrix immobiliseret på dens overflade og antibiotika i opløsning, har vist et betydeligt potentiale i biokemiske sensing applikationer med hidtil uset følsomhed og specificitet ^1-5. De drug-target interaktioner genererer overfladen stress, forårsager cantilever til at bøje, og signalet kan analyseres optisk, når det er belyst af en laser. Ændringen i overfladen stress målt med nano-skala præcision giver forstyrrelser i biomekanik model bakteriel cellevæg mål at blive sporet i realtid. Trods tilbyde betydelige fordele, har flere cantilever sensor arrays aldrig blevet anvendt kvantificere drug-target bindende interaktioner.

Her rapporterer vi på brugen af ​​silicium flere cantilever arrays belagt med alkanthiol selv-samlet monolag efterligner bakteriens cellevæg matrix til kvantitativ study antibiotika bindende interaktioner. For at forstå konsekvenserne af vancomycin på mekanikken i bakterielle cellevæg strukturer ^1,6,7. Vi har udviklet en ny model ^1, der foreslår, at cantilever bøjning kan beskrives af to uafhængige faktorer i), nemlig en kemisk faktor, som er givet ved en klassisk Langmuir adsorptionsisotermens, hvorfra vi beregner termodynamisk ligevægt dissociationskonstant (K _d), og ii) en geometrisk faktor, hovedsagelig et mål for, hvor bakterielle peptid-receptorer er fordelt på cantilever overflade. Overfladen fordeling af peptid-receptorer (p) anvendes til at undersøge afhængighed af geometri og ligand belastning. Det vises, at en tærskelværdi på p ~ 10% er afgørende for sensing applikationer. Hvorunder der er nogen påviselig bøjning signal, mens over denne værdi, bøjning signalet stiger næsten lineært, afslører, at stress er et produkt af en lokal kemisk binding FACtor og geometrisk faktor kombineres ved den mekaniske tilslutning af omsatte regioner og giver et nyt paradigme for konstruktion af effektive agenter til at bekæmpe superbakterie infektioner.

Introduction

Den molekylære anerkendelse paradigme understøtter store dele af biologi og medicin. I farmakologi, målet for eksempel er at forstyrre en patologisk vej ved at målrette en vigtig deltager i en biokemisk proces som transglycoslyation eller transpeptidering der katalyserer tværbindingen af ​​bakterielle cellevæg peptider. Det stof design reduceres derfor til at definere en passende molekyle at målrette en bestemt bakterie docking site til at fremkalde en perfekt pasform. Et klassisk eksempel efterligne succesen af denne tilgang er vancomycin (Van), som er rettet mod peptidoglycan cellevæg, et konserveret strukturelt træk af en bakterie. I en spirende Gram-positiv bakterie, består peptidoglycan matrix af peptider slutter i sekvensen Lysin-D-alanin-D-alanin, tøjret via en C55 lipid linker ^8-10 betegnes her D-Ala. Disse udsatte peptider på peptidoglycan prækursorer er afgørende formekanisk beskyttelse af de bakterielle celler mod barske miljømæssige kræfter, og vigtigst, er ikke fundet i humane celler, hvilket gør dem ideelle mål for antibiotika. Van specifikt binder til C-terminalen af de bakterielle cellevægge peptider danner en moderat stærk Van-peptid kompleks som vist i figur 1.. Denne interaktion mellem Van de udsatte peptider blokerer handlinger transpeptidaser og transglycosylaser, som katalyserer krydsbinding af cellevæggene ^1, effektivt stoppe dem fra at krydsbinding, og derfor nanomechanically svækker bakteriecellen fører til sin død ved brud ^{1,6, 7..}

Fremkomsten af vancomycin-resistente Enterococcus (VRE) er et stigende sundhedsproblem ¹¹ og fordi bakteriel resistens hos enterokokker opstår på grund af den subtile ændring af et amid linKage til en esterbinding ^8, denne bedragerisk enkle strukturændring på overfladen af bakterien sletter en enkelt hydrogenbinding fra Van 's docking site med efterfølgende ændring af den bindende lomme. Vigtigst denne proces ændrer pentapeptidet terminal alanin stede i vancomycin modtagelige Enterococcus (VSE) til en lysin-D-alanin-D-lactat ^10,12, her benævnes D-Lac, hvilket gav en signifikant reduktion i Van-D-Lac bindingsaffiniteten tre størrelsesordener rendering Van terapeutisk ineffektive mod enterococcale infektioner ^1, Den alarmerende vækst i antibiotikaresistente bakterier derfor drivkraft for udviklingen af innovative tilgange til at fremskynde og genoprette den antibakterielle aktivitet af antibiotika eller opdagelsen af mere kraftfulde medicin mod multiresistent bakterie infektioner.

in situ henvisninger til differentielle målinger tillader dem at specifikt at påvise narkotika target interaktioner, og i kraft af deres fabrikation via standard halvleder forarbejdningsmetoder, er de modtagelig for masseproduktion og parallelisering til high-throughput screening af tusinder af narkotika i timen. I particgelmæssige flere cantilever sensor arrays er nyttige værktøjer til at studere antibiotikaresistens for vancomycin - fordi modstanden over for vancomycin er hovedsageligt en mekanisk problem ^1,6,7. Reaktionerne mellem en model bakteriens cellevæg målet og Van i opløsning kan påvises ved at overvåge ændringer i klinisk relevant stress induceret fra drug-target bindende interaktioner. Den genererede stress fra overflade reaktioner, som manifesterer sig i en udhængende bøjning signal analyseres optisk ved at belyse sensorer med en laserstråle. Desuden ved at skræddersy den modtagende coating af bakterielle overflade målmolekyler oven på cantilever sensor tæt på en un-begrænset antal analytter (Van), de specifikke biokemiske interaktioner og biomekanik model bakterielle cellevæg matrix overvåges i realtid. Bortset fra molekylær genkendelse begivenhed, er der flere faktorer, der kan forårsage cantileversensorer til deflect, som omfatter - temperaturvariationer, uspecifikke binding eller ændringer i brydningsindeks af løsningen. Redegøre for uspecifik signaler, in situ differentielle målinger udføres, når bøjning af både måle-og reference-køreledningsophæng overvåges løbende at analysere specifikke interaktioner. Endvidere kan påvisning følsomhedsgrader cantileversensorer der afhænger af overfladen kemier og geometri forøges ved tuning overfladedensiteten p (hvor p er defineret som forholdet mellem overfladearealet optaget af at fange molekyler til hele overfladeareal cantilever omfattet af den samlede population af molekyler som bestemt ved røntgen fotoelektronspektroskopi (XPS) ^1..

Her Denne protokol detaljer, hvordan vancomycin eller anden antibiotika binding til bakterielle cellevæg precursor analoger (mucopeptides) i klinisk relevante koncentrationer i bufferopløsning, etnd blodserum kan påvises ved hjælp af etiket-fri cantilever teknologi. Friske guld overflader bliver brugt, fordi selv-samlet monolag (SAM) har tendens til nemt at danne stabile lag på ren guld ^13,14. SAM er typisk består af korte molekyler med en thiol kovalent bundet til guld overflade, mens den ønskede opfange enhed på den anden ende får lov til frit at interagere med analytten mål i opløsning. Thioler danner et fleksibelt system, især i betragtning af, at mange thiolforbindelser med forskellige kemiske endegrupper er kommercielt tilgængelige eller kan let syntetiseres i et laboratorium. Dog bør der sørges for at sikre, at molekyler med en thioldel skal have de korrekte endegrupper, for eksempel i et protein eller peptid konjugation, bør aminogruppen vende indad for reaktionen med carboxylgruppen af ​​thiolandelen tøjret på overfladen for at forekomme. Her er de thioler var direkte konjugeret med tripeptid mimetikaene bakteriel lipid II fra bacterial cellevæg mål syntetiseres ved fastfasemetodologi ved anvendelse af kommercielt tilgængelige forspændt Wang-D-Ala og Wang-D-Lac-harpikser og standard Fmoc-beskyttende gruppe kemi ^15.. Selvom denne beskrivelse er fokuseret på at vancomycin, er det helt klart kan udvides til andre antibiotika og faktisk yderligere undersøgelser er inviteret af forskere fra forskellige områder især i biokemi, farmakologi og materielle videnskab til nemt at vedtage denne protokol for deres egne eksperimenter.

Protocol

1.. Fremstilling af Cantilevers

1. Brug Teflon pincet immerse udvalgt antal cantilever chips (hver cantilever måler 500 um lange, 100 um brede og 0,9 um tyk) i en frisklavet Piranha-løsning (ved 1:1 H ₂ SO ₄ og H ₂ O ₂₎ i 20 min .
2. Efter ca 20 min fjerne cantilever chips fra Piranha løsning, og skyl dem grundigt med deioniseret vand og straks overføre til en frisklavet Piranha løsning. Gentag trin 1.1 ovenfor, hvis chips indeholder pletter af snavs ellers fortsæt til næste trin.
3. Efter en grundig rensning i deioniseret vand, skylles med ren ethanol og tørres cantilever chips på en varmeplade ved 75 ° C for at fjerne ethvert spor af vand. Efterse dem ved hjælp af et optisk mikroskop til at bekræfte deres renlighed.
4. Overfør rensede cantilever chips til en fordampningskammer og pumpe ned, rettet på at opnå et vakuumtryk på 10 ^-7 mbar.
5. Når det krævede vakuum er nået, belægge den ene side af hver cantilever array med en 2 nm titanium første fungerer som en vedhæftning lag før et ekstra lag af 20 nm guld tyk. For at bekræfte deres tykkelse, brug kvartskrystal monitor placeret direkte over målet kilde.
6. Efterlad guld belagt cantilever sensor chips i kammeret for 1-2 timer til afkøling under vakuum før åbning.
7. Overfør frisk fordampede chips til et vakuum opbevaringsbeholder fyldt med argon for at forhindre enhver form for forurening.

2.. Cantilever Chip Funktionalisering

1. Først arrangere mikro-kapillarrør på en funktionalisering trin ² ifølge cantilever tonehøjde størrelse på 250 um.
2. Derefter injiceres 2 mM ethanoliske thiol opløsninger af overfladen målmolekyler, dvs bakterielle mucopeptides (D-Ala og D-Lac), og en 'inert 'alkanthiol ender i triethylenglycol (PEG), som vides at modstå biomolekylære adsorption. ^16. Hver af de kapillære slangerne bør indeholde en udvalgte overflade fangmolekyler bestemmes tilfældigt for at undgå brugeren bias.
3. Næste inkuberes i 20 minutter de køreledningsophæng i microcapillaries fyldt med thiolgrupper opløsninger indeholdende overflade fanger molekyler. Sikre, at løsninger af overfladen fangmolekyler er begrænset på hver enkelt cantilever sensor til at undgå eller minimere krydskontaminationer. Hvis denne proces ansat korrekt, bør det systematisk ændre de frisklavede guld belagte udkragninger i kemisk aktive sensorer dannet ved at lade SAM bakterielle mucopeptid mål at danne på guld belagte overflader som receptorer.

3.. Løsning Forberedelser

1. Opløs 0,1 M mono-og di-basiske natrium phosphatsalte i ultrarent vand (18,2 MOhm · cm resistivitet) og bland to give en pH-værdi på 7,4.
2. Tilføj 0,002% af PS80 til buffertablet løsninger til at minimere sammenlægning virkninger forårsaget af uspecifikke interaktioner mellem narkotika molekyler til glas.
3. Fortynd lægemidler med frisk buffer løsninger på de ønskede forskellige koncentrationer, som vil sætte beregning af _Kd.
4. Filter frisklavet drug løsninger ved hjælp af 0,2 um filtre og soniker i 5 min ved stuetemperatur, før skylning med argon.
5. Gentag proceduren med stof i bufferet serum hjælp hele serum. Forsigtigt vortex i 15 min med yderligere 5 minutter for at sikre fuldstændig opløselighed.

4.. Surface Stress Detection

1. Indlæse en funktionaliseret cantilever sensor chip i en flydende flow-celle kammer.
2. Juster laserpletten på den frie ende af hver sensor og bekræft tilpasningen ved opvarmning op væskekammeret til 1 ° C. Alle otte guld belagt cantilever sensor arrays bør gennemgå omfattendessive nedadgående bøjning på grund af den bimetalliske virkning skyldes forskelle i ekspansion satser af silicium og guld.
3. Efter opvarmning i ca 10 minutter, tillade udkragninger til afkøling i yderligere 10 min.
4. Beregn bøjning variation ved de maksimale bøjning signaler mellem de enkelte cantileversensorer og hvis relative standardafvigelse bøjning signaler er ≤ 5% derefter acceptere tilpasningen som ønskeligt ellers gentage processen.
5. Dernæst måle resonansfrekvenser for alle otte udkragninger at beregne deres forår konstanter. Hvis variationen af ​​fjederkonstanten mellem hver cantilever sensor inden en chip er ≤ 1% derefter acceptere chippen som havende konsistente mekaniske egenskaber ellers erstatte cantilever chip sensor.
6. Dernæst bruge en strømningsteknisk ordning (model Genie Plus) via en seks-vejs ventil for at opnå den flydende udveksling inden flowcellen mens dataopsamling bør opnås ved hjælp af en automatiseret LabView såftware.
7. At overvåge udkragningsbøjningsværdi data, skal du bruge følgende måling protokoller: i) enten injicere bufferopløsning eller serum uden stof til kontrolmåling varig for 5-30 min at etablere en baseline, ii) injicere medicin løsning til 30-60 min iii) injicere 10 mM HCl vask for 10-60 min at dissociere bundet lægemiddelkompleks iv) Endelig tilføre et yderligere vasketrin hjælp bufferopløsning for en anden 5-30 min at regenerere overfladen peptider og genoprette den hidtidige signal. Altid sikre, at alle signaler er erhvervet under konstant væskestrømningshastighed på 30-180 ul / min og ved fast temperatur på 25 ° C i en temperatur-kontrolleret kabinet.
8. De absolutte bøjning signaler for alle otte støtteben skal overvåges ved hjælp af seriel tidsmultipleksede optisk stråle metode med en enkelt position følsom detektor.
9. At analysere de bøjende signaler fra hver koncentration af lægemiddel, er de resulterende differentierede ombøjningsstederne omdannet til et differentiale stress mellem de øvre og nedre sider af cantilever hjælp Stoney ligning.

Representative Results

Stress ændring målt ved hjælp nanoskala præcision med en hidtil uset følsomhed over for en enkelt H-bond sletning, udnyttes til at spore afbrydelser af model bakteriecellevægskomponenter biomekanik i realtid (2a-d). Grænsen af lægemiddel følsomhed for Van blev undersøgt ved seriel fortynding koncentrationer heraf i trin fra 1.000 um til ≤ 10 nM, afslører 10 nM (~ 15 ng / ml) som den laveste påviselige koncentration giver anledning til et gennemsnit på ~ -9 ± 2 nm som forskel bøjning signaler (fig. 2c). Evnen til at påvise antibiotika under fysiologisk miljø blev yderligere undersøgt i serum på en klinisk relevant koncentrationsområde på 3-27 uM ^17. Efter injektion af 7 uM Van i serum (90% føtalt kalveserum plus 10% natriumphosphatbuffer, pH 7,4) på tværs af alle støtteben under identiske betingelser, differenssignalet forDAla i serum var 105 ± 4 nm mens DLac overtrukne udkragninger blev ingen bøjning observeret (figur 3). De betydelige bøjning signaler observeret for DAla coated (vancomycin følsomme) køreledningsophæng er forårsaget af de stærke drug-target bindende interaktioner. Men for DLac coated (vancomycin resistente) køreledningsophæng, tilstedeværelsen af jord-state frastødning af den ilt lone pair og reducerede NH obligation i vancomycin bindingslommen ^10,12 bidrager til svækkelsen af drug-target bindende interaktioner, som resulterer i mindre eller ingen udkragningsbøjningsværdi, især for lavere vancomycin koncentrationer (figur 3). Men for høj vancomycin koncentration, observere vi målbare bøjning signaler for DLac. Desuden er vores eksperimentelle design er vigtigt for in situ henvisninger hvor alle cantilevers overtrukket med både DAla og DLac samtidigt udsat for samme analyt i realtid.

For at forstå den præcise rolle for kemi og geometri, vi har designet en model ¹ beskriver sammenhængen mellem solvente interaktioner og overflade mekanik. Dette frembringer overfladen stress:

for p> pc og nul ellers (1)

Det første ord i ligning (1) er Langmuir adsorptionsisotermen, tegner sig for drug-target bindende begivenheder, og den anden valgperiode er magt loven form, som beskriver de store mekaniske konsekvenser af stresset netværksdannelse. Den konstante a svarer til maksimal overflade stress, når alle de tilgængelige bindingssteder er besat, og K _d er overfladen ligevægt dissociation consTant på cantilever. Analysen som vist i figur 4 er resultatet af den globale anfald af ligning (1) overlejret på målte differentielle stresssignaler afslører, en ~ 29,7 ± 1,0 eller 14,1 ± 3,0 mN / m og _Kd ~ 1,0 ± 0,3 eller 800 ± 310 uM til D-Ala eller DLac peptider, hvor A svarer til et mål for overfladen stress, når alle de tilgængelige bindingssteder er besat. Den forbedrede følsomhed cantilever blev indstillet ved systematisk at variere peptidet densiteter p under overvågning stress data som en funktion af p mens antibiotiske koncentrationer sættes til 10, 100 og 250 uM, henholdsvis (figur 5). Processen blev gentaget med stress som en funktion af Van koncentrationer mens peptid tætheder fastsat til p ~ 100%.

<img alt = "Figur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
Figur 1. Cantilever detektering af antibiotiske overflade bindingsinteraktioner. a) Skematisk fremstilling af en fritbærende føleropstilling, og den tilstand, som de drug-target interaktioner detekteres nanomechanically. b) Kemisk bindende vekselvirkning mellem et lægemiddel molekyle (Van) og bakterielle mucopeptid analog (D-Ala eller D-Lac). c) Den mekanisme, hvorved en muteret vancomycin følsomme bakterier (VSE) erhverver resistens over for vancomycin ved at slette en enkelt H-binding i bindingslommen. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Sporing af forstyrrelser af den model bakteriecellevægskomponenter biomekanik i realtid. a) Absolutte bøjning signaler af D-Ala, D-Lac og PEG overtrukne udkragninger i phosphatbuffer og 250 uM vancomycin. De differentielle PEG referencesignaler er vist i sorte linier. B) Differential bøjning signaler af D-Ala og D-Lac overtrukne udkragninger i phosphatbuffer og 250 uM vancomycin. C) differentieret cantilever afvigelse på en dosisafhængig signal som en funktion af tid i overværelse af vancomycin koncentrationer i størrelsesordenen 10 nM (gul linje), 100 Nm (rød linje) og 1.000 Nm (mørk rød linje) hhv. d) De differentierede cantilever afbøjning signalering til tre D-Ala coatede cantileversensorer som en funktion af tiden i nærvær af 10nM vancomycin. Klik her for at se større figur .

Figur 3. Sporing af forstyrrelser af den model bakteriecellevægskomponenter biomekanik i realtid for en D-Ala og D-Lac coatede udkragninger i nærværelse af 7 uM vancomycin i læggen føtal serum.

Figur 4.. Undersøge nanomekanik af narkotikarelaterede target interaktioner. Plot viser den målte forskellen overflade stress respons for D-Ala (sorte cirkler) og D-Lac (røde cirkler) coatede udkragninger som en funktion af vancomycinkoncentration i opløsning [Van]. Dataene er beskrevet ved ligning (1) (fuldt optrukne linier). ^1.

Figur 5. Optimering af nanomechanical detekteringsfølsomhed af receptor-ligand-interaktioner ved at undersøge afhængighed af receptoren lastning og geometri via blandede monolag. Målte forskelligartet overflade stress reaktioner cantileversensorer som funktion af D-Ala overflade dækning, s. i nærværelse af faste vancomycin koncentrationer i opløsning ved 10 uM (sort linje), 100 m (rød linje), og 250 um (grøn linje).

Discussion

Disse resultater viser, at cantilever array-sensorer har følsomheden til at påvise og kvantificere ændringer i narkotika-target bindingsinteraktioner særligt i vancomycinresistens forbundet med sletningen af ​​et enkelt H-obligation fra lægemidlets bindende lomme. Vi viser en nanomolær detekteringsfølsomhed Van efter aftale med tidligere Surface (SPR) undersøgelser ^18,19 og afsløre, at cantilever metoden direkte kan detektere og kvantificere medikamentmolekyler i blod ved klinisk relevante koncentrationer, som rutinemæssigt anvendes i klinisk praksis. Vores data tyder på, at forskellen overflade stress kan beskrives ved et produkt formular ligning (1), dvs (i) en kemisk udtryk, der beskriver de specifikke lægemiddel-target-bindende begivenheder, og (ii) et geometrisk sigt beskriver den mekaniske forbindelse mellem omsættes kemisk overfladepositioner, hvilket indebærer, at de lokale kemiske vekselvirkninger afkoble fra det globale mekanikeral vekselvirkninger mellem cantilever. Mens kemiske udtryk er givet ved den klassiske Langmuir adsorptionsisotermens, den geometriske udtryk afslører en percolative mekanisme af lægemiddel-target inducerede overflade stress ændringer. Den kritiske tærskel pc ~ 10% (figur 5) var nødvendig for at påvise forskellen udkragningsbøjningsværdi, der viser, at overfladen stress transduceres kollektivt når en relativt stor overflade fraktion er besat af antibiotiske molekyler. For p ≥ pc, den mekaniske forbindelse mellem omdannes kemisk overflade sites er efterhånden etableret, samt de kortrækkende frastødende interaktioner såsom steriske interaktioner mellem knudepunkter i nanomechanical nettet giver anledning til stigende nedadgående bøjning af hele cantilever. Det er spekuleret at vores nanomechanical nedsivning model kan spille en vigtig rolle i den glycopeptidantibiotikum virkningsmekanisme i reelle bakterier. Disse resultater understreger den høje følsomhed cantilever teknologi til studying antibiotika 'virkningsmekanisme og repræsenterer en ny forsknings-værktøj til at studere medicin for at forbedre forståelsen af ​​transaktionerne antibiotika på nanoskala at informere og aktivere opdagelsen af ​​magtfulde medicin til at kontrollere problemer med superbakterie infektioner. For at forberede cantilever system for reproducerbare og følsomme målinger, vi har behandlet en række mål i protokollen, især for prøveindføringen i mikrofluid celle og standard operationelle procedurer for at give kvantitative nanomekaniske påvisninger.

Betydningen af ​​cantilever teknologi med hensyn til eksisterende metoder

Sammenfattende vi påpege, at mens denne teknologi blev foreslået mere end 25 år siden, har det ikke fundet vej ind på klinikken på grund af manglende omhyggelige og gentagne målinger på medicinsk relevante mål. Her viser vi de procedurer, der etablerer relevansen af ​​at bruge nanomekaniske udkragninger at undersøge mekanikerenal indflydelse af antibiotika på de bakterielle cellevægge mål og påvise antibakteriel resistens. Konventionelle medikamentscreeningsanalyse metoder kræver en vis form for fluorescerende eller radioaktiv mærkning af et reportermolekyle til at måle bindingen af en analysand til sit mål, ofte i forbindelse med en konkurrencedygtig eller enzymatisk bindingsassay og proteinanalyser ^20. Mærkning af biomolekyler er ikke kun tidskrævende og dyrt men mærket kan også interferere med den molekylære interaktion ved at obstruere bindingsstedet, hvilket fører til falske negative resultater. Desuden er fluorescerende forbindelser ofte hydrofob som kan føre til baggrunden bindende og falske positiver. På grund af disse begrænsninger, er der en stigende interesse i nye etiket-frie teknikker, der tillader næsten enhver molekylært kompleks, der skal screenes med minimal assay udvikling. De mest etablerede label-fri overflade teknologier på nuværende tidspunkt er SPR og kvartskrystalmikrovægt (QCM). I modsætning til SPR denne foranstaltning the dielektricitetskonstant, en etiket - fri cantilever teknologi detekterer overfladen stamme genereret af en ligand-receptor-interaktion, som direkte kan måle nanomekaniske kræfter, der genereres af den specifikke binding af ligander til overflade-receptorer. Det unikke ved disse sensorer er, at deres følsomhed ikke er afhængig af dielektriske egenskaber forårsaget af masse-ændring som følge af analytbinding som i SPR og QCM men snarere på en minutiøs induceret ændring i in-plane overflade stress, hvilket gør teknologien unikt egnet til at studere de nanomekanik af lægemiddelmolekylerne i klinisk relevante koncentrationer af antibiotikum (3-27 uM) ^17. Udkragninger er også særdeles velegnet til lille molekyle (såsom DNA-fragmenter og narkotika) påvisning under fysiologiske betingelser, herunder komplekse miljøer, der stort set er grundlaget for den farmaceutiske industri og vil derfor fungere som et supplerende redskab i lægemiddelforskning. Cantilever-teknologien har med held været anvendt iinden for genomforskning ^3,5, gas sensing ^21, proteomics ^22, og narkotika ^1.. Desuden er køreledningsophæng fremstillet ved hjælp af lave omkostninger silicium-teknologi og på grund af deres kompatibilitet med microfabrication processer kan køreledningsophæng blive miniaturiseret for forbedret følsomhed og parallelisering i store arrays af sensorer til blandingsmisbrug sammensatte screening og højere gennemløb information-rige screeningassays. Forbedringer af instrumentering og eksperimentelle design vil give en bred vifte af interaktioner, der skal analyseres i realtid for at hjælpe med at fremme søgningen efter en ny generation af superdrugs at tackle problemerne med multiresistent infektioner.

Kritiske skridt i protokollen

Udviklingen af ​​robuste måling protokoller er central på de anvendelser af denne teknologi. For at opnå tilfredsstillende kvantitative narkotika target målinger, og at bestemme den laveste koncentration af antibiotika that kunne detekteres i buffer eller blod serum, kritiske skridt i protokollen blev behandlet. Den første opgave involverer tuning og optimering overflade capture kemier at forbedre cantilever afsløring specificitet og sensitivitet. Unægtelig, overflade stress transduktion er en kollektivt fænomen, der kræver en forholdsvis stor del af overfladen, der skal dækkes for at etablere forbindelse mellem kemisk reaktive regioner. Vi viser, at ved at variere tætheden af den underliggende overflade peptider, en kritisk tærskel ~ p ≥ 10%, bestemmes hvor overfladen stress skala som en funktion af peptid tæthed og ellers nul (figur 5). Det er vigtigt, at eksperimenter er designet til at undersøge ensartetheden af ​​stress langs udkragninger at sikre maksimal signal omlægninger for følsomme målinger. Desuden skal effektive landbaserede regenerering protokoller til at være på plads, således at flere cyklus målinger og reducere omkostningerne for hver TESt.. Mens designe en receptor overflade ved hjælp thiolerede hydrofob ende, orientering af receptormolekylet og afstanden mellem dem er af afgørende betydning at tillade selvsamling af tætte pakning følge Van-der-Waals-interaktioner mellem molekyler for at minimere ikke-specifikke interaktioner. Endvidere bør fangmolekyler indeholde en polyethylenglycol (PEG)-linker for at tillade en del af sensing matrix at være hydrofil til at forhindre indføring af molekyler i analytopløsningen at reagere direkte med den ikke-coatede guld overflade. PEG linkermolekyler skal handle som afstandsstykker til at reducere steriske begrænsninger, og derfor lader opløsningen analytter at interagere specifikt med overfladen receptorer fremkalde målbare overflade stress forandring. Cantilever arraysensor skal analyseres med mindst en in situ referencemåling og signalet vises i realtid er en differential deformation, opnået ved at subtrahere den absolutte udbøjning af henvisningen cantilever fra sEnsing støtteben. Således vil en henvisning cantilever er afgørende at tage højde for uspecifikke interaktioner såsom temperaturændringer, ændringer i brydningsindeks eller interaktioner på funktionaliserede undersiden af ​​cantilever. Optimering af flow (~ 30-150 ul / min) danner et afgørende skridt i den protokol, fordi det sikrer en effektiv udveksling af væsker og en tilstrækkelig stabil massetransport af løsningsforslag materialer. Udformningen af ​​en flydende celle skal give optimale volumen (5-80 ul) til hurtige strømningshastigheder at muliggøre perfekt væske udveksling at overvinde massetransport begrænsninger. Flowet er især kritisk, mens de udfører kinetiske målinger ^23.. Store mængder væske kamre kræver ukontrollerbare høje strømningshastigheder, der fører til store prøvevolumen krav, som unødigt øger prisen af ​​assayet. Tidligere har vi brugt tyngdestrømning at injicere forskellige prøver i målingen væskekammer. Tyngdestrømning har den fordel, at det Does ikke kræver nogen mekaniske dele og derfor ikke indføre yderligere støj i systemet. Men dens væsentlig ulempe er, at det fungerer kun ordentligt ved relativt høje strømningshastigheder (~ 200 ul / min). Naturligvis ville en lavere strømningshastighed (≤ 1 gl / min) kræver begrænsede prøvevolumener per tidsenhed, men på den anden side gør reaktionerne meget langsommere og dermed kræver længere kontakttider. Desuden tyngdestrømning har en stor varians i sin strømningshastighed da det afhænger af højdeforskellen mellem indløbet og udløbet, hvilket nedsætter som prøveopløsningerne forbruges under eksperimentet. At undgå tyngdekraft flow-problemer, bør en sprøjtepumpe anvendes. Fordelen ved at benytte en sprøjtepumpe er at det giver en konstant strømningshastighed over en lang periode tillader eksperimenter at blive realiseret i et mere kontrolleret miljø.

Begrænsninger i protokollen

Den største udfordring i at opnå en reproducerbar end specifik biologisk påvisning ved cantileversensorer ligger i at sikre, at egenskaberne af receptoren lag er biokemisk "aktiv" og ensartet for hver assay. Hemmeligheden til eksperimentel succes er i en omhyggelig forbehandling af sensoren chip med en standardiseret rengøring og immobilisering protokol med linker kemier at orientere receptor molekyler i deres aktive konformation. I vores nuværende setup, functionalize vi cantilever arrays hjælp lille glas kapillærer, som kunne være genstand for nogle ulemper, og kan være problematisk i nogle tilfælde. Disse glas kapillærer er åbne i begge ender, og derfor prøven opløsningsmidler fordamper let. For eksempel, hvis temperaturen af ​​funktionalisering stadium ikke styres præcist kan fordampningshastigheden varierer betydeligt på forskellige tidspunkter, især når der anvendes flygtige opløsningsmidler som ethanol. Der er også en mulighed for lille variation i inkubationstiden fra en cantilever til anden given at sensing væsker skal lastes fortløbende i kapillærer. Den anden begrænsende faktor i kapillar funktionalisering er manglen på evnen til at sikre, at udkragninger altid indsættes i kapillærerne på nøjagtig samme måde. Desuden køreledningsophæng undertiden skal trækkes lidt ud fra kapillærer for at undgå krydskontaminering som væskeprøver kan flyde på chippen krop. Vi kan løse disse problemer ved at anvende inkjet observatører som et alternativ overfladebelægning procedure at overtrække støtteben. Mens det tillader præcis styring af prøve overtræk med mulighed for at opskalere til store arrays, den mest almindelige ulempe er, at de små dråber, der afsættes på støtteben kan fordampe inden for få sekunder og kræver en kontrolleret luftfugtighed. Derfor kan inkubationstiden ikke let justeres, hvilket kan være ønskeligt til nogle anvendelser. Den subtile samspil af faktorer såsom prøve voLume, inkubationstid og fordampning sats har direkte indvirkning på eksponering af udkragninger til funktionalisering prøven og pleje skal tages for at sikre optimerede overflade kemi for cantilever analyser som enhver lille variation i receptoren molekylære tæthed vil have en stor effekt på cantilever respons.

Eksperimentelle design ændringer (dvs. alternative teknikker eller materialer)

For at overvinde den store udfordring i at opnå reproducerbar belægning procedure for den fremtidige udvikling af cantilever-teknologi, der er forskellige strategier, som ville bruge køreledningsophæng integreret i mikrofluidkanaler. Ideen er, at særlige cantilever chips bør udformes således, at hver fremspring er placeret i sin egen kanal til at tillade online in situ funktionalisering procedurer, hvor kanalerne er rettet individuelt. Disse eksperimentelle design ændringer vil tillade coating proces at udføreed i et kontrolleret og lukket miljø, hvor eksponeringen for opløsningsmidlet netop overvåges af inkubationstiden og strømningshastighed til automatiseret immobilisering af fangmolekyler på cantilever chips. De samme kanaler kan derefter anvendes til den egentlige bindende eksperimenter, hvor alle støtteben kunne blive eksponeret for den samme analyt løsning. Udover cantilever funktionalisering procedure, ville cantilever udlæsning mekanismen også skal forbedres. Den optiske stråle deformation metode er meget følsom, og det har været anvendt med succes i Atomic Force Microscopy (AFM) teknologi i mange år. Men for de fritstående cantilever sensor applikationer den optiske udlæsning har nogle ulemper, for eksempel er det ikke muligt målinger i uigennemsigtige væsker såsom blod, kan tilpasningen af ​​en vifte af lasere være tidskrævende og trættende, og den aktuelle konfiguration kan ikke skelne mellem vippe og lodrette nedbøjninger. Således fremtidige udvikling af cantilevis-teknologien bliver nødt til at overveje aspekter af den generelle sensor design (f.eks cantilever geometrier) og cantilever udlæsning for robuste måling protokoller både inden og laboratorium miljøer. Manalis og kolleger ²² har udviklet nye typer af hule cantileversensorer hvor køreledningsophæng har en indlejret mikrofluid kanal inde i strålen, så enheden kan betjenes i et vakuum med høj kvalitet faktorer. I denne tilstand, fungerer støtteben som mikrovægt ^22, og det er derfor ikke længere nødvendigt at have en asymmetri mellem de to parter med hensyn til funktionalisering, dermed fangmolekyler kan fysisorberet eller kovalent bundet direkte på silicium, typisk under anvendelse af SAM eller silaner ^24.. Køreledningsophæng kan også være modificeret med et tyndt polymerlag, som derefter konjugeres til antistoffer ²⁵ til biokemiske sensing.

Fejlfinding

En fælles problem forbundet med cantilever målinger er indføring af luftbobler i mikrofluid strømningscelle. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at ingen luftbobler er indført i flydende celle, mens montering af chippen. Signal drifting er også et andet fælles problem forårsaget af forskelle i temperatur af prøver. Køreledningsophæng skal være ækvilibreres at stabilisere før målingerne foretages. Alle buffere, analytter og regeneration løsninger skal opbevares i samme rum som cantilever instrument til at give alle de løsninger til at have den samme temperatur. Selv sprøjtepumpen kan give meget præcise og ekstremt lave strømningshastigheder, er det generelt forbundet med mekanisk støj i cantilever målinger. Det er derfor vigtigt at udtænke en enkel og effektiv støj reducer for at undgå unødig støj i afbøjning signaler. Støj reducering består af små flydende reservoir placeret mellem sprøjtepumpen og det flydende celle, der absorberer than mekanisk støj fra pumpen. På grund af den følsomme karakter af optisk detektor, skal cantilever målesystemet ideelt betjenes i et lukket setup til at blokere enhver omstrejfende lys fra at blande sig med det optiske udlæsning system. Desuden kan kvaliteten af ​​sensing lag falde betydeligt, hvis et stort antal vasketrin udføres på støtteben begrænser levetiden af ​​sensorchippen.

Alternative eller fremtidige ansøgninger efter mastering denne teknik

Støtteben overtrukket med SAM ender i en amino-eller carboxylgruppe-gruppe kan bruges som pH-sensorer. De funktionelle endegrupper protonere eller deprotonere afhængig af pH i opløsningen og kan generere en overfladeladning, der fører cantilever at bøje ^24.. Da de cantileversensorer kan spore narkotika for målgruppen interaktioner forbundet med destabilisering af cellevæggen af livets bakterier ^1,6,7, vil de derfor bidrage isøgningen og til udvikling af en ny generation af antibiotika til bekæmpelse af resistente infektioner. I fremtidige udkragninger ville blive brugt som mikrovægte at måle massen og vækstrater enkeltceller ^26. Cantilever teknologi vil vise sig gavnlig for studiet af cellulære responser til forskellige vækstfaktorer eller narkotika. Det vil også tilbyde en roman værktøj til hurtig påvisning af flere biomarkører, der har umiddelbar relevans i medicinske og point-of-care-applikationer. Da den alsidighed, lille størrelse, og robusthed cantileversensorer, vil de danne en følsom skærm af skadelige miljøfaktorer. De har allerede vist deres følsomhed i afsløring giftige og skadelige gasser, der kan slippe fra laboratoriet og industrielle produktionsenheder i miljøet, såsom flussyre ²⁷ eller hydrogencyanid ^28..

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements