Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

약물 타겟 상호 작용 및 항균 저항 검출 Nanomechanics

doi: 10.3791/50719 Published: October 25, 2013

Summary

항생제에 취득한 저항은 중요한 공중 보건 문제이며 현재 인간의 삶에 가장 큰 위협의 하나로서 WHO에 의해 평가된다. 여기에 우리가 내성 박테리아를 약제에 대한 소설과 강력한 대리인의 발견에 중요한 항균 저항을 정량화하는 캔틸레버 기술의 사용을 설명합니다.

Abstract

용액의 표면과 항생제 약물에 고정 모델 세균의 세포벽 기질 사이의 반응의 변환기 역할을하는 캔틸레버 센서는 전례 민감도와 특이도 1-5 생화학 감지 애플리케이션에 상당한 가능성을 보여 주었다. 약물 타겟 상호 작용은 캔틸레버가 구부 원인, 표면 응력을 생성하고,이 레이저에 의해 조명 될 때 신호를 광학적으로 분석 할 수 있습니다. 나노 스케일 정밀도로 측정 표면 응력의 변화는 모델 세균 세포 벽의 생체 역학의 중단 실시간으로 추적 할 대상으로 할 수 있습니다. 상당한 이점을 제공에도 불구하고, 여러 캔틸레버 센서 어레이는 약물 표적 결합 상호 작용을 정량화 적용 적이있다.

여기, 우리는 양적 스투하는 세균 세포 벽 매트릭스를 흉내 낸 알칸 티올 자기 조립 단일 층으로 코팅 된 실리콘 여러 캔틸레버 어레이의 사용에보고DY 항생제 바인딩 상호 작용. 세균의 세포벽 구조 1,6,7의 역학 반코마이신의 영향을 이해합니다. 우리는 굽힘이 캔틸레버는 두 개의 독립적 인 요인에 의해 설명 될 수있다 제안 새로운 모델 1 개발, ⅰ) 즉 고전 랭 뮤어 흡착 등온선에 의해 주어진다 화학적 요인은, 어떤에서 우리는 열역학적 평형 해리 상수를 계산 (K D) 및 ⅱ) 기하학적 요소, 세균성 펩타이드 수용체가 캔틸레버 표면에 분포하는 방법을 근본적으로 측정. 펩타이드 수용체 (P)의 표면 분포 형상과 리간드 로딩 의존성을 조사하는 데 사용됩니다. 그것은 P의 임계 값 ~ 10 % 감지 애플리케이션에 중요하다는 표시됩니다. 이 값보다, 굽힘 신호가 스트레스를 드러내는 거의 선형 적으로 증가하면서 더 감지 굽힘 신호가없는 이하를 로컬 화학 결합 FAC의 제품입니다산 및 기하학적 요소 반응 영역의 기계적 연결에 의해 결합과 슈퍼 벌레 감염을 방지하기 위해 강력한 에이전트의 설계를위한 새로운 패러다임을 제공합니다.

Introduction

생물학 및 의학의 분자 인식 패러다임의 토대 큰 한번 벤 면적. 약리학에서, 예를 들어 목표는 transglycoslyation 또는 세균 세포 벽 펩티드의 가교를 촉진 transpeptidation로 생화학 적 과정의 주요 참가자를 대상으로 병리 경로를 방해하는 것입니다. 약물 설계 따라서 완벽한 적합을 유도하는 특정 박테리아 도킹 사이트를 대상으로 적절한 분자를 정의로 감소된다. 이 방법의 성공을 모방 고전적인 예는 펩티도 글리 세포벽, 세균의 보존 구조적 기능을 대상으로 반코마이신 (반)입니다. 초기 그람 양성 세균에 펩티도 글리 행렬은 순서 D-알라라고 여기 C55 지질 링커 8-10를 통해 닿는 리신-D-알라닌-D-알라닌에 종료 펩티드로 구성되어 있습니다. 펩티도 글리 전구체에서 이러한 노출 펩타이드에 대한 기본적인가혹한 환경 세력에 대한 박테리아 세포의 기계적 보호 및 중요한, 그들 항생제 약물에 이상적 목표 만들기, 인간의 세포에서 발견되지 않습니다. 반은 특히 적당히 강력한 펩티드를 형성하는 세균 세포 벽 펩타이드의 C-말단에 결합 그림 1에서와 같이 복잡한. 노출 된 펩티드 블록, 효과적으로 가교에서 그들을 중지하고 따라서 nanomechanically 파열 1,6하여 사망에 이르는 세균 세포를 약화, 세포 벽 1 가교 촉진 transpeptidases 및 transglycosylases의 행동 사이의 상호 작용 7.

반코마이신 내성 장구균 (VRE)의 출현은 증가 건강 문제 11과 장구균의 세균 저항 아미드 린의 미묘한 변화로 인해 발생하기 때문에에스테르 결합 8, 박테리아 삭제 바인딩 포켓의 후속 변경과 밴의 도킹 사이트에서 하나의 수소 결합의 표면이 현혹 간단한 구조 변화에 그림자. 중요한 것은이 과정에 의해 반-D-락 결합력에있는 뜻 깊은 감소를 산출, 여기에서 D-락 되나, 리신-D-알라닌-D-락 테이트 10,12에 반코마이신 감수성 장구균 (VSE)의 pentapeptide 터미널 알라닌 선물을 바꾼다 Enterococcal 감염 1, 항생제 내성 박테리아의 놀라운 성장에 대한 치료 효과가 크기 렌더링 세 수주 따라서 내성 박테리아를 약제에 대한 항균제의 항균 활동이나 더 강력한 약물의 발견을 가속화하고 복원하는 혁신적인 접근 방식의 개발을 운전 감염.

현장 참조에 사용하고, 시간당 약의. partic에ular 여러 캔틸레버 센서 어레이는 반코마이신 항생제 내성을 연구 유용한 도구입니다 - 반코마이신에 대한 저항은 본질적으로 기계적인 문제 1,6,7 때문이다. 솔루션 모델 세균 세포 벽 목표 및 사이 반응은 약물 표적 결합의 상호 작용에서 유도 된 임상 적 스트레스의 변화를 모니터링하여 검출 할 수있다. 외팔보 굽힘 신호 자체를 명시 표면 반응에서 생성 된 응력은 레이저 빔 조명 센서에 의해 광학적으로 분석됩니다. 또한 캔틸레버 센서의 상단에 세균 표면 표적 분자의 수용 코팅을 조정하여, 분석의 취소 제한된 수의 (반), 특정 생화학 적 상호 작용을 닫고 모델 세균 세포 벽의 행렬 역학을 실시간으로 모니터링합니다. 떨어져 분자 인식 이벤트에서 DEF에 캔틸레버 센서를 일으킬 수있는 몇 가지 요인이 있습니다온도 변화, 불특정 바인딩 또는 용액의 굴절률의 변화를 - 포함 lect. , 비특이적 신호 계정에 측정 및 참조 캔틸레버 모두의 굽힘이 지속적으로 특정 상호 작용을 분석하기 위해 모니터링되는 현장 차동 측정에서 수행됩니다. 또한, 표면 화학 및 형상에 따라 캔틸레버 센서의 검출 감도는 P는 캔틸레버의 전체 표면 영역에 캡처 분자가 차지하는 면적의 비율로 정의되는 표면 밀도 P를 (조정하여 향상시킬 수 있습니다 X-선 광전자 분광법 (XPS) 1에 의해 결정되는 분자의 전체 인구에 의해 덮여.

다음은이 프로토콜의 자세한 방법 완충 용액에서 임상 적 농도에서 세균 세포 벽 전구체 아날로그 (mucopeptides)에 바인딩 반코마이신이나 다른 항생제ND 혈액 혈청 라벨이없는 캔틸레버 기술을 사용하여 검색 할 수 있습니다. 자기 조립 단층이 (SAM을) 쉽게 청소 금 13,14에 안정 층을 형성하는 경향이 있기 때문에 신선한 금 표면이 사용됩니다. 의 SAM은 일반적으로 다른 쪽 끝에서 원하는 캡처 장치가 자유롭게 용액 분석 대상과 상호 작용하도록 허용하는 동안 공유 결합 금 표면에 부착 된 티올 부분 짧은 분자로 구성되어 있습니다. 티올 특히 다른 화학 끝 단체와 많은 티올 화합물은 상업적으로 가능하거나 쉽게 실험실에서 합성 주어진 유연한 시스템을 형성한다. 그러나주의가 티올 부분에 분자가 올바른 최종 그룹이 있어야합니다 확인해야한다, 단백질이나 펩타이드 결합의 예를 들면, 아미노 그룹에 닿는 티올 부분의​​ 카르 복실 그룹과 반응 안쪽을 향해야합니다 발생하는 표면. 여기 티올은 B에서 박테리아 지질 II의 펩티드의 mimetics와 직접 결합했다acterial 세포벽을 사용하여 고체상 방법에 의해 합성 타겟 시판 왕-D-아라와 왕-D-락 수지와 표준 FMOC-보호 그룹 화학 15 탑재. 이 설명은 반코마이신에 초점을 맞추고 있지만, 명확하게 다른 항생제로 확장 될 수 있으며, 실제로 추가 연구는 다른 특히 생화학, 약리학 필드, 쉽게 자신의 실험이 프로토콜을 채택하는 재료 과학에서 연구원으로 초대합니다.

Protocol

1. 캔틸레버의 준비

  1. 테플론 족집게 담그지 캔틸레버 칩 선택한 번호를 사용하여 20 분 동안 갓 준비된 피라 용액 (비율 1:1 H 2 SO 4, H 2 O 2)로 (100 μm의 폭 0.9 μm의 두께 길이 500 μm의 측정, 각 캔틸레버) .
  2. 약 20 분 피라 솔루션에서 캔틸레버 칩을 제거하고 탈 이온수로 철저히 헹군 후 즉시 갓 준비한 피라 솔루션으로 옮긴 후에. 칩 그렇지 않으면 다음 단계로 진행 먼지의 관광 명소가 포함 된 경우 위의 단계 1.1를 반복합니다.
  3. 탈 이온수에 대한 철저한 청소 후, 순수한 에탄올로 세척하고 물을 모든 흔적을 제거하기 위해 75 ° C에서 열판에 캔틸레버 칩을 말린다. 자신의 청결을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여 검사합니다.
  4. 증발 챔버 청소 캔틸레버 칩을 전송하고 아래 펌프, 진공을 달성하기 위해 대상10-7 mbar의 압력.
  5. 두께 20 nm의 금의 추가 계층 전에 접착층 역할을 먼저 2 나노 티타늄 각 캔틸레버에 필요한 진공 압력이 달성되면, 코트 한면. 자신의 두께를 확인하려면, 직접 대상 소스 위에 놓여 석영 크리스탈 모니터를 사용합니다.
  6. 열기 전에 진공 냉각 1-2 시간 동안 챔버에 골드 코팅 된 캔틸레버 센서 칩을 둡니다.
  7. 오염의 형태를 방지하기 위해 아르곤으로 채워진 진공 저장 용기에 갓 증발 칩을 전송합니다.

2. 캔틸레버 칩 기능화

  1. 첫째, 250 ㎛의 캔틸레버 피치 크기에 따라 2 작용 무대에서 마이크로 모세관 튜브를 정렬합니다.
  2. 그런면 표적 분자의 2 mM의 에탄올 싸이 솔루션, 세균 mucopeptides (D-알라와 D-락)을 주입하고, 'inert '알칸 티올은 생명 흡착에 저항하는 것으로 알려져 트리 에틸렌 글리콜 (PEG)에 종료. 16 모세관 호스의 각은 사용자 편견을 피하기 위해 무작위로 결정 모듬 표면 캡처 분자를 포함해야합니다.
  3. microcapillaries에서 20 분 캔틸레버에 대한 다음 부화 표면 캡처 분자를 포함하는 싸이 솔루션으로 가득합니다. 표면 캡처 분자의 솔루션은 교차 오염을 방지하거나 최소화하기 위해 각각의 캔틸레버 센서에 국한되어 있는지 확인합니다. 이 과정이 제대로 고용하는 경우, 그것은 체계적 수용체 골드 코팅 표면에 형성하는 박테리아 mucopeptide 대상의 SAM을 허용하여 형성된 화학적 활성 센서에 갓 준비한 골드 코팅 캔틸레버를 변경해야합니다.

3. 솔루션 준비

  1. 초순수 (MΩ 18.2 cm · 저항)과 혼합 t에서 0.1 M 모노 - 및 디 - 기본 인산 나트륨 염을 용해7.4의 pH 값을 얻을 O를.
  2. 유리에 약물 분자의 비특이적 상호 작용에 의한 응집 효과를 최소화하기 위해 버퍼 솔루션 PS80의 0.002 %를 추가합니다.
  3. K D의 계산을 가능하게 원하는 다른 농도로 갓 버퍼 솔루션으로 약물을 희석.
  4. 0.2 μm의 필터를 사용하여 갓 준비한 약물 솔루션을 필터링하고 아르곤 제거하기 전에 실온에서 5 분간 초음파 처리.
  5. 전체 혈청을 사용하여 버퍼 혈청 약물 절차를 반복합니다. 완벽한 가용성을 보장하기 위해 추가로 5 분에서 15 분 동안 부드럽게 소용돌이.

4. 표면 응력 감지

  1. 액체 흐름 셀 챔버로 기능화 된 캔틸레버 센서 칩을로드합니다.
  2. 각 센서의 자유 단에 레이저 자리를 맞추고 1 ° C.를위한 액체 챔버를 가열하여 정렬을 확인 모두 여덟 골드 코팅 된 캔틸레버 센서 어레이는 직접 성형을 받아야한다ssive 아래 있기 때문에 실리콘과 금의 확장 속도의 차이에 의한 바이메탈 효과의 굽힘.
  3. 약 10 분간 가열 한 후, 캔틸레버 더 10 분 동안 식히십시오.
  4. 굽​​힘 신호의 상대 표준 편차 ≤ 5 % 다음 그렇지 않으면 과정을 반복 바람직한으로 정렬을 받아 들인다이다 각각의 캔틸레버 센서 사이의 경우 최대 굽힘 신호의 휨 변형을 계산합니다.
  5. 다음 여덟 개의 캔틸레버의 공진 주파수가 자신의 스프링 상수를 계산하기 위해 측정합니다. 칩 내의 각 캔틸레버 센서 사이에 스프링 상수의 변화는 ≤ 1 % 다음 일관된 기계적 성질 그렇지 않으면 캔틸레버 칩 센서를 교체 것으로 칩을 수락됩니다.
  6. 다음으로, 데이터 수집을 자동화 LabView를 이렇게 사용하여 얻을 수해야하는 동안 유동 세포 내 액체 교환을 달성하기 위해 6 자 밸브를 통해 유체 시스템 (모델 지니 플러스)를 사용ftware.
  7. 데이터를 구부리는 캔틸레버를 모니터링하려면 다음과 같은 측정 프로토콜을 사용 ⅰ) 기준을 설정 5-30 분 동안 지속적인 제어 측정을위한 약물없이 완충 용액 또는 혈청 중 하나를 주입, II) 30 ~ 60 분 동안 약물 용액을 주입, ⅲ) 바인딩 약물 복합체를 해리하는 10-60 분 동안 10 MM 염산 세척을 주입, IV)가 드디어 표면 펩티드를 생성하고, 기준 신호를 복원하기 위해 다른 5-30 분 완충 용액을 사용하여 추가 세척 단계를 주입. 항상 모든 신호가 30-180 μL / min의 일정한 액체 유량 하에서 온도 제어 캐비닛에서 25 ° C의 온도를 일정에 인수되어 있는지 확인합니다.
  8. 모두 여덟 캔틸레버의 절대 굽힘 신호는 하나의 위치에 민감한 검출기 광 빔 방식을 다중 직렬 시간을 사용하여 모니터링해야합니다.
  9. 약물의 각 농도에서의 굽힘 신호를 분석하려면, 다음 결과로 만들어지는 차등 벤딩은 차동 스트레칭으로 변환됩니다스토니의 방정식을 사용하여 외팔보의 상단과 하단면 사이의.

Representative Results

단일 H-결합 삭제에 전례없는 감도와 나노 스케일 정밀도를 사용하여 측정 응력 변화는 실시간으로 (그림 2A-D)의 모델 세균 세포 벽 역학의 중단을 추적하기 위해 악용하고 있습니다. 반에 대한 약물 검출 감도의 한계는 순차적 ~ -9 평균 ±에 상승을주는 낮은 검출 농도가 10 나노 미터 (~ 15 NG / ML) 공개 1,000 μM에서 ≤ 10 nm의 단계의 농도를 희석하여 조사 하였다 2 차동 굽힘 신호 (그림 2C)으로 멕시코. 생리적 환경에서 항생제를 감지하는 능력은 더욱 3-27 μM (17)의 임상 적 농도 범위에서 혈청 조사 하였다. 동일한 조건 하에서 모든 캔틸레버에 걸쳐 혈청 7 μM ​​(90 % 소 태아 혈청에 10 %의 인산 나트륨 버퍼 산도 7.4)에 대한 차동 신호의 주입시혈청 달라했다 105 ± 4 nm의 DLac 코팅 캔틸레버의 경우, 어떤 구부리는 (그림 3) 관찰하는 동안. 달라 코팅 (반코마이신 감수성) 캔틸레버 관찰 상당한 굴곡 신호는 강한 약물 표적 결합 상호 작용에 의해 발생합니다. 그러나 DLac 코팅 (반코마이신 내성) 캔틸레버, 반코마이신 바인딩 포켓 10,12의 산소 혼자 쌍 감소 NH 결합의 접지 상태 반발의 존재에 대한 이내에 결과 약물 표적 바인딩 상호 작용의 약화에 기여 또는 더 캔틸레버 특히 낮은 반코마이신 농도 (그림 3)의 경우, 굽힘 없습니다. 그러나 높은 반코마이신 농도를 위해, 우리는 DLac에 대한 측정 가능한 구부리는 신호를 관찰한다. 또한, 우리의 실험 설계는 현장 참조에 대한 중요한 경우 모든 CA달라와 DLac 모두 코팅 ntilevers을 동시에 실시간으로 동일한 분석에 노출되어 있습니다.

화학 구조의 정확한 역할을 이해하기 위해, 우리는 용매 상호 작용과 표면 역학 사이의 상관 관계를 설명하는 모델 1을 설계했습니다. 이 표면 응력을 생성합니다 :

식 1 P> PC와 달리 영 (1)에 대한

방정식의 첫 번째 항 (1) 약물 표적 바인딩 이벤트를 차지하고 두 번째 항은 스트레스를 네트워크 형성의 대규모 기계 결과를 설명하는 전원 법 형태로, 랭 뮤어 흡착 등온선이다. 액세스 할 수있는 모든 바인딩 사이트가 점유 할 때 상수의 최대 표면 응력에 해당하며 K D는 표면의 평형 해리 단점입니다캔틸레버에 탄트. 그림 4와 같이 분석 공개 측정 차동 스트레스 신호에 중첩 식의 글로벌 맞는 (1)의 결과입니다 ~ 29.7 ± 1.0 14.1 ± 3.0 mN의 / M 및 K D ~ 1.0 ± 0.3 800 ± 310 표면 응력의 측정에 대응이 액세스 할 수있는 모든 바인딩 사이트가 점유 D-알라 또는 DLac 펩티드에 대한 μM. 캔틸레버의 향상된 감도는 항생제 농도 (그림 5)는 각각 10, 100으로 고정하고, 250 μM 동안 P의 함수로 스트레스 데이터를 모니터링하면서 체계적으로 펩타이드 밀도 P를 변화시켜 조정했다. 펩타이드 밀도는 P로 고정하면서 ~ 100 % 과정은 반 농도의 함수로 스트레스를 반복 하였다.

<IMG 고도 = "그림 1"FO : 콘텐츠 너비 = "5 인치"SRC = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg"/>
그림 1. 항생제 표면에 결합 상호 작용의 캔틸레버 감지. 약물 타겟 상호 작용 nanomechanically 감지하는 캔틸레버 센서 어레이와 모드) 도식 표현. B) 약물 분자 (반) 및 세균성 mucopeptide 아날로그 (D-알라 또는 D-락) 사이의 화학 결합의 상호 작용. C) 변이 반코마이신 감수성 균 (VSE)이 바인딩 주머니에 H-결합 하나를 삭제하여 반코마이신에 내성을 획득하는. 메커니즘은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2 그림 2. 실시간으로 모델 세균 세포 벽 역학의 중단을 추적. ) D-알라, D-락 인산염 버퍼와 250 μM 반코마이신에 PEG 코팅 된 캔틸레버의 절대 굽힘 신호. 차동 PEG 참조 신호는 검은 색 선으로 표시됩니다. B) D-알라 인산염 버퍼와 250 μM의 반코마이신의 D-락 코팅 된 캔틸레버 시간의 함수로 농도 의존적 신호. C) 차동 캔틸레버 편향 차동 굽힘 신호 로 각각 10 nm의 (황색 선), 100 nm의 (빨간색 선)와 1,000 nm의 (진한 빨간색 선)의 순서로 반코마이신 농도의 존재한다. D) 세 가지의 차동 캔틸레버 편향 신호는 D-알라 코팅 된 캔틸레버 센서 10의 존재 시간의 기능나노 반코마이신. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. D-알라와 송아지 태아 혈청에 7 μm의 반코마이신의 존재 D-락 코팅 된 캔틸레버에 대한 실시간 모델 세균 세포 벽 역학의 중단 추적.

그림 4
그림 4. 약물 타겟 상호 작용의 nanomechanics을 조사. D-아라 (검은 색 원)과 D-락 (빨간색 원) 반코마이신의 함수로 코팅 된 캔틸레버의 측정 차동 표면 스트레스 반응을 보여주는 플롯용액의 농도 [반]. 데이터는 식 (1) (실선)에 의해 설명되어 있습니다. 1

그림 5
그림 5. 혼합 단일 층을 통해 수용체 로딩과 기하학의 의존성을 조사하여 수용체 - 리간드 상호 작용의 나노 기계 검출 감도를 최적화.에 고정 반코마이신 농도의 면전에서 D-알라의 기능 표면 범위, P 등의 캔틸레버 센서의 측정 차동 표면 스트레스 반응 10 μM (블랙 라인), 100 μM (빨간색 선), 250 μM (녹색 선)의 솔루션을 제공합니다.

Discussion

이러한 결과는 캔틸레버 센서는 특히 약물의 바인딩 주머니에서 하나의 H-결합의 삭제와 관련된 반코마이신 내성 약물 표적 바인딩 상호 작용의 변화를 감지하고 정량화 할 수있는 감도를 가지고 보여줍니다. 우리는 이전에 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR)의 연구 18,19와 계약 밴의 나노 몰 검출 감도를 표시하고, 정기적으로 임상 연습에 적용되는 캔틸레버 방법은 직접 임상 적 농도로 혈액에서 약물 분자를 감지하고 정량화 할 수있는 공개. 우리의 데이터는 차동 표면 응력은 (I) 특정 약물 표적 바인딩 이벤트 사이의 기계적 연결을 설명 (II) 기하학적 용어를 설명하는 화학 용어는 화학적으로 반응 제품 형태 식 (1)에 의해 설명 될 수 있다고 제안 표면의 사이트 암시하는 글로벌 기계공에서 연결 해제 지역의 화학 작용캔틸레버의 알 상호 작용. 화학 용어는 고전 랭 뮤어 흡착 등온선에 의해 제공되는 동안, 기하학적 용어는 약물 표적에 의한 표면 응력의 변화 percolative 메커니즘을 보여준다. 상대적으로 큰 표면 부분은 항생제 분자에 의해 점유되었을 때 중요한 임계 PC ~ 10 % (그림 5)는 표면 응력을 보여주는 굽힘 차동 캔틸레버를 감지 할 필요가 있었다가 공동으로 형질 있습니다. P에 대한 ≥ PC, 화학적으로 변형 된 표면 사이트 간의 기계적인 연결이 점차적으로 설립, 그리고 나노 기계 네트워크의 노드 사이의 입체 상호 작용으로 단거리 반발 작용은 전체 캔틸레버의 아래 굽힘 증가에 상승을 제공합니다. 그것은 우리의 나노 기계 여​​과 모델은 실제 박테리아 활동의 당 펩타이드 항생제 모드에서 중요한 역할을 할 것으로 추측된다. 이러한 연구 결과는의에 대한 캔틸레버 기술의 높은 감도를 강조행동의 항생제 '모드를 tudying 및 슈퍼 벌레 감염의 문제를 제어 할 수있는 강력한 약물의 발견을 통보하고 활성화하는 나노 스케일에서 항생제의 운영에 대한 이해를 향상시키기 위해 약물을 연구하는 새로운 연구 도구를 나타냅니다. 재현하고 민감한 측정을위한 캔틸레버 시스템을 준비하기 위해, 우리는 특히 미세 세포와 양적 나노 기계 탐지를 허용하는 표준 운영 절차의 샘플 로딩, 프로토콜 대상의 집합을 제시했다.

기존의 방법과 관련하여 외팔보 기술의 중요성

요약 우리는이 기술이 25 년 이상 전에 제안하는 동안, 그것은 때문에 의학적으로 관련 목표에 신중하고 반복적 인 측정의 부족으로 병원에 그것의 방법을 발견하지 않았 음을 지적한다. 여기에서 우리는 기계공을 조사하기 위해 나노 기계 캔틸레버를 사용의 관련성을 확립하는 절차를세균 세포 벽 목표에 항균 저항을 감지하는 항생제의 알 영향을 미친다. 기존의 약물 검사 방법은 종종 경쟁 또는 효소 결합 분석 및 단백질 분석 20과 관련하여 목표에 분석의 결합을 측정하는 기자 분자의 형광 방사성 라벨의 일부 유형을 필요로합니다. 생체 분자의 레이블 것은 단지 시간과 비용이 많이 소모하지만 라벨은 또한 거짓 네거티브로 이어지는, 바인딩 사이트를 방해하여 분자의 상호 작용을 방해 할 수 있습니다. 또한, 형광 화합물은 종종 바인딩 배경과 거짓 반응으로 이어질 수있는 소수성이다. 이러한 제한으로 인해, 거의 모든 분자 복합체 최소한의 분석 개발을 상영 할 수 있도록 새로운 레이블이없는 기술에 대한 관심이 증가가있다. 현재 가장 설립 된 라벨 자유 표면 기술은 SPR 및 석영 크리스탈 마이크로 밸런스 (QCM)입니다. SPR 대조적으로 측정하는 일전자 유전체 상수, 레이블 - 무료 캔틸레버 기술은 직접 표면의 수용체에 리간드 특이 적 결합에 의해 생성 된 나노 기계 힘을 측정 할 수있는 리간드 - 수용체 상호 작용에 의해 생성 된 표면의 변형을 감지합니다. 이러한 센서의 고유성은 기술이 유일하게 공부를 적합하다 자신의 감도 SPR 및 QCM에있는 것이 아니라있는 평면 표면 응력의 정밀한 유도 변화로 결합 분석에 의한 질량 변화에 의한 유전 특성에 의존하지 않는다는 것입니다 임상 적으로 항생제 농도 (3-27 μM) 17시 약물 분자의 nanomechanics. 캔틸레버는 특히 크게 제약 산업의 기초이므로 약물 발견에 보완적인 도구가 될 것입니다 복잡한 환경 등의 생리적 조건 하에서 작은 분자 (예 : DNA 조각과 약물 등) 검출에 적합하다. 캔틸레버 기술을 성공적으로 적용되었습니다게놈 3,5 분야, 가스 감지 21, 프로테오믹스 22, 및 약물 1. 또한, 캔틸레버는 저가의 실리콘 기술과 미세 공정과의 호환성으로 인해를 이용하여 제작되며, 캔틸레버 여러 약물 화합물 심사 및 높은 처리량 정보가 풍부한 심사 분석을위한 센서의 큰 배열로 향상된 감도와 병렬화 소형화 할 수있다. 계측 및 실험 설계의 개선은 상호 작용의 다양한이 내성 감염 약제의 문제를 해결하기 위해 superdrugs의 새로운 세대에 대한 검색을 향상하는 데 도움이 실시간으로 분석 할 수 있습니다.

프로토콜에서 중요한 단계

강력한 측정 프로토콜 개발이 기술의 응용 프로그램의 핵심이다. 만족 정량적 인 약물 표적 측정을 달성하기 위해와 t 항생제의 가장 낮은 농도를 결정하기 위해모자는 프로토콜 내에서 혈청 중요한 단계가 해결 된 버퍼 또는 혈액에서 검출 될 수있다. 첫 번째 작업은 튜닝과 캔틸레버 검출 특이성과 감도를 향상시키기 위해 표면 캡처 화학 최적화를 포함한다. 명백하게, 표면 응력의 전달은 화학적 반응 영역 사이의 연결을 설정하기 위해 적용 할 표면의 비교적 큰 부분을 필요로 집단 현상이다. 우리는 기본 표면 펩티드의 밀도, 임계 값을 변화시켜 ~ P ≥ 10 %, 결정한다는 것을 보여주기위한 펩타이드 농도의 기능과 달리 영 (그림 5)와 같은 표면 응력 규모. 이 실험은 민감한 측정을위한 최대 신호 변형을 보장하기 위해 캔틸레버에 따라 스트레스의 균일 성을 조사하기 위하여 디자인하는 것이 중요합니다. 또한, 효율적인 표면 재생 프로토콜하여 여러 사이클 측정을 허용하는 장소에있을 각 TES 비용을 줄일 필요가마. thiolated 소수성 끝 부분을 사용하여 수용체 표면을 디자인하는 동안, 그들 사이의 수용체 분자 간격의 방향 분자 사이의 반 데르 발스 상호 작용에 의한 조밀 한 포장의 자기 조립은 비특이적 상호 작용을 최소화 할 수 있도록 매우 중요합니다. 또한, 캡처 분자 감지 행렬의 일부가 코팅 금 표면에 직접 반응하는 분석 솔루션에서 분자의 삽입을 방지하기 위해 친수성 ​​할 수 있도록 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커를 포함해야합니다. PEG 링커 분자는 스페이서 입체 제약을 줄이고 따라서 솔루션 분석은 측정 가능한 표면 응력의 변화를 유도하는 표면의 수용체와 구체적으로 상호 작용할 수 있도록하는 역할을합니다. 캔틸레버 센서는 현장 기준 측정에 최소한으로 assayed 실시간으로 표시되는 신호는 차동 편향, s에서 참조 캔틸레버의 절대 편차를 뺀해야합니다캔틸레버를 ensing. 따라서 참조 캔틸레버는 온도 변화, 굴절률 또는 캔틸레버의 nonfunctionalized 아래쪽에있는 상호 작용의 변화 등의 비특이적 상호 작용을 고려하는 것이 필수적입니다. 그것은 액체의 효율적인 교환 및 솔루션 자료의 충분한 꾸준한 대량 수송을 보장하기 때문에 유량 (~ 30-150 μL / 분)의 최적화는 프로토콜 내에서 중요한 단계를 형성한다. 액체 셀의 디자인은 빠른 유속에 대한 최적의 음량 (5-80 μL)은 대량 수송 한계를 극복하기 위해 완벽한 액체 교류를 활성화 할 수 있도록해야합니다. 운동 측정에게 23을 수행하는 동안 유량은 특히 중요합니다. 대량 액체 챔버 불필요 분석의 가격을 증가 큰 샘플 볼륨 요구로 이어지는 통제 할 수없는 높은 유량을 필요로합니다. 이전에 우리는 측정 액체 챔버에 다른 샘플을 주입하는 중력의 흐름을 사용했습니다. 중력 흐름은 장점을 가지고 그것이 미상의는 기계 부품을 필요로하지 않으며 따라서 시스템에 추가 노이즈가 발생하지 않습니다. 그러나, 중요한 단점은 비교적 높은 유속 (~ 200 μL / 분)에서 안정적으로 작동한다는 것입니다. 물론, 낮은 유량 (≤ 1 μL / 분) 단위 시간 당 샘플로 볼륨을 필요로하지만, 다른 한편으로는 반응이 훨씬 느린하게하고 따라서 더 긴 접촉 시간이 필요합니다. 그것은 입구와 샘플 솔루션은 실험 기간 동안 소비로 감소 출구 사이의 높이 차이에 의존하기 때문에 또한, 중력 흐름의 유량에 큰 차이가 있습니다. 중력 흐름 문제를 방지하려면, 주사기 펌프를 사용해야합니다. 주사기 펌프를 사용의 장점은 실험을 좀 더 통제 된 환경에서 실현 될 수 있도록 오랜 기간 동안 일정한 유량을 수 있다는 것입니다.

프로토콜의 한계

재현성을 얻기의 주요 과제캔틸레버 센서를 사용하여 D 특정 생물학적 감지 수용체 층의 속성 화학적으로 "활성화"를 각각 분석에 대한 균일 것을 보장에 자리 잡고 있습니다. 실험 성공의 비밀은 동양의 능동적 형태의 수용체 분자 링커 화학 물질과 표준화 청소 및 고정 프로토콜과 센서 칩의주의 전처리에 있습니다. 우리의 현재 설정에서 우리는 몇 가지 단점 대상이 될 수 있으며, 어떤 경우에는 문제가 될 수있는 작은 유리 모세관을 사용하여 캔틸레버 배열을 기능화. 이 유리 모세관 양쪽에 열려 있고 따라서 시료 용매는 쉽게 증발 할 수 있습니다. 작용 단계의 온도를 정확하게 제어되지 않은 경우 에탄올과 같은 휘발성 용제를 사용하여 특히 예를 들어, 증발 속도는 다른 시간에 상당히 다를 수 있습니다. 하나의 캔틸레버에서 다른 g의 배양 시간에 약간의 변동 가능성도 있습니다감지 액체가 모세관에 연속적으로로드해야하는 iven. 모세관 작용에있는 다른 제한 요인은 캔틸레버는 항상 동일한 방식으로 모세 혈관에 삽입되어 있는지 확인 할 수있는 능력의 부족이다. 또한, 때로는 캔틸레버는 액체 샘플 칩을 몸에 흐를 수있는 교차 오염을 방지하기 위해 모세 혈관에서 약간 당길 수있다. 우리는 코트 캔틸레버에 대한 대안 표면 코팅 프로 시저로 잉크젯 감시인을 고용하여 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 그것은 큰 배열로 확장의 가능성 샘플 코팅의 정확한 제어 할 수있는 것이 있지만, 가장 일반적인 단점은 캔틸레버에 입금 된 작은 방울 초 이내에 증발 할 수 있고 통제 된 습도 환경이 필요합니다. 따라서 배양 시간은 일부 응용 프로그램 바람직 할 수도있는, 쉽게 조정할 수 없습니다. 이러한 샘플 할머니와 같은 요인의 미묘한 상호 작용LUME, 배양 시간 및 증발 속도는 작용 샘플에 캔틸레버의 노출에 직접적인 영향을 가지고 수용체 분자 밀도의 어떤 작은 변화가 캔틸레버에 큰 영향을 미칠 것 같이주의 캔틸레버 분석을위한 최적화 된 표면 화학을 보장하기 위해주의해야 응답.

실험 설계 변경 (즉, 대체 기술 또는 자료)

캔틸레버 기술의 미래 발전을위한 재생 코팅 절차를 얻기에 중요한 도전을 극복하기 위해 서로 다른 전략은 미세 유체 채널에 통합 캔틸레버를 사용하는 것이 필요합니다. 아이디어는 특별한 캔틸레버 칩 채널을 개별적으로 해결하는 현장 작용 절차에서 온라인으로 할 수 있도록 각 캔틸레버는 자신의 채널에 배치되도록 설계해야합니다. 이러한 실험 설계 변경은 코팅 공정을 수행 할 수 있도록 할용매에 노출이 정확하게 배양 시간 및 캔틸레버 칩 캡처 분자의 자동 고정을위한 유량에 의해 모니터링 제어 및 폐쇄 환경에서 에드. 같은 채널은 다음 모든 캔틸레버가 동일한 분석 솔루션에 노출 될 수있는 실제 바인딩 실험에 사용할 수 있습니다. 캔틸레버 작용 과정 외에, 캔틸레버 판독 방식도 개선해야합니다. 광 빔 편향 방식은 매우 민감하고 그것을 몇 년 동안 원자 힘 현미경 (AFM) 기술을 성공적으로 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고, 자유로운 서있는 캔틸레버 센서 애플리케이션을위한 광학 판독 몇 가지 단점이 있습니다, 예를 들어, 그것은 혈액과 같은 불투명 한 액체 측정을​​ 허용하지 않습니다, 레이저의 배열의 정렬 시간이 소요되는 지루한 수 있으며, 현재의 구성을 차별화 할 수 기울이기 및 수직 처짐 사이. 따라서 cantilev의 미래 발전어 기술은 일반적으로 센서 설계 (예 : 외팔보 형상)와 필드와 실험실 환경에서 모두 강력한 측정 프로토콜에 대한 캔틸레버 판독의 측면을 고려해야 할 것이다. Manalis와 동료 (22)는 장치가 높은 품질의 요인 진공 상태에서 작동 할 수 있도록 캔틸레버는 빔 내부에 포함 된 미세 유체 채널이 빈 캔틸레버 센서의 새로운 유형을 개발했다. 이 모드에서, 캔틸레버는 마이크로 저울 22의 역할, 따라서 그것은 따라서 캡처 분자가 물리적으로 흡착 할 수 또는 공유 결합 실리콘에 직접 연결, 일반적으로 SAM을 또는 실란을 사용하여 작용에 대해 양측 사이의 비대칭 성이 더 이상 필요하지 않습니다 24. 캔틸레버는 다음 생화학 감지에 대한 항체 25에 결합되는 얇은 고분자 층으로 수정할 수 있습니다.

문제 해결

일반적인 프로캔틸레버 측정과 관련된 blem은 미세 유체 흐름 셀에 기포의 소개입니다. 주의 칩을 장착하면서 기포가 액체를 세포에 도입되지 않도록주의해야합니다. 신호 감도는 또한 샘플의 온도 차이로 인한 또 다른 일반적인 문제입니다. 캔틸레버는 측정이 수행되기 전에 안정 평형 수 있어야합니다. 캔틸레버 악기의 모든 솔루션은 같은 온도를 가질 수 있도록하는 등 모든 버퍼 분석 및 재생 솔루션은 같은 방에 저장되어야합니다. 주사기 펌프는 매우 정확하고 매우 낮은 유량을 제공 할 수 있지만, 일반적으로 캔틸레버 측정에서 기계 소음과 관련이 있습니다. 그것은 편향 신호에서 불필요한 노이즈를 방지하기 위해 간단하고 효과적인 잡음 감소를 고안하는 것이 중요합니다. 잡음 감소는 주사기 펌프와 T를 흡수 액체 세포 사이에있는 작은 액체 탱크로 구성펌프에서 그는 기계 소음. 때문에 광 검출기의 민감한 성격, 캔틸레버 측정 시스템은 이상적으로 광학 판독 시스템을 방해하는 처진 빛을 차단하는 밀폐 설정에서 작동해야합니다. 세척 단계의 많은 수의 센서 칩의 수명을 제한하는 캔틸레버에서 수행하는 경우 또한, 감지 층의 품질이 현저하게 줄일 수 있습니다.

마스터 후 대체 또는 미래의 응용 프로그램에이 기술

아미노 또는 카르복실기 그룹에 종료 SAM에 코팅 캔틸레버는 pH 센서로 사용할 수 있습니다. 기능의 최종 그룹은 양성자 또는 deprotonate 용액의 pH에 따라 24을 구부리 캔틸레버를 리드 표면 전하를 생성 할 수 있습니다. 캔틸레버 센서는 수명 박테리아 1,6,7의 셀 벽의 불안정과 관련된 약물 타겟 상호 작용을 추적 할 수, 그들은 그러므로에 도움이 될 것입니다 감안할 때검색 및 약물 내성 감염을 방지하기 위해 항생제의 새로운 세대의 개발. microbalances는 질량 및 단일 세포 26의 성장 속도를 측정하는 등 미래의 캔틸레버에 사용됩니다. 캔틸레버 기술은 서로 다른 성장 인자 또는 약물에 세포 반응의 연구에 도움이 증명됩니다. 또한 의료 및 점의 배려 응용 프로그램에서 즉시 관련이 다중 생체의 신속한 검출을위한 새로운 도구를 제공합니다. 다양한 기능, 작은 크기, 그리고 캔틸레버 센서의 안정성을 감안할 때, 그들은 유해 환경 요인의 민감한 모니터를 형성합니다. 그들은 이미 불화 수소산 27 또는 시안화 수소 28와 같은 환경으로 실험실과 산업 생산 단위에서 벗어날 수 독성 및 유해 가스를 감지 자신의 감도를 증명하고있다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다

Acknowledgments

조셉 W. Ndieyira는 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EPRSC), 나노 기술 학제 간 연구 센터 (IRC), 왕립 학회 (RS)와 Biano 컨설팅 (BNC)에 의해 지원되었다. 우리는 알레 Donoso 발레라, Dejian 저우, 마누엘 Vögtli, 마태 복음 배출러, 매튜 A. 쿠퍼, Torsten Strunz, 트레버 Rayment 도움 토론 가브리엘 Aeppli의 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scentris Scentris, Veeco Instruments, Inc Not in production
Six-way valve MVP, Hamilton, Reno, NV Enables multiple concentration injection
EB Evaporator BOC Edwards Auto 500, UK Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel Agar Scientific, UK Keeps gold coated films fresh
Glass capillary King Precision Glass, Claremont, CA, USA For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters 1511940001 Merck Millipore For sample filtering
Cantilever chips London Centre for Nanotechnology (LCN) Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic 10049-21-5 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic 7558-79-4 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80 9005-65-6 Sigma-Aldrich, UK Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water Millipore Co., Billerica, MA, USA Used for making solutions
Whole serum GEM-700-110-H Sera Laboratories International Ltd, UK Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van) 1404-93-9 Sigma-Aldrich, UK Drug used
Sulfuric acid 7664-93-9 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide 7722-84-1 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac London Centre for Nanotechnology (LCN) Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView National Instruments Co., Austin, TX, USA Software used for instrumental interface to allow controlled measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ndieyira, J. W., et al. Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance. Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).
  2. Zhang, J., et al. Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA. Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).
  3. McKendry, R. A., et al. Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).
  4. Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers. Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).
  5. Fritz, J., et al. Translating biomolecular recognition into nanomechanics. Science. 288, 316-318 (2000).
  6. Dwyer, D. J., et al. Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis. Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).
  7. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death. Cell. 135, 679-690 (2008).
  8. Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics. Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).
  9. Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization. Science. 280, 711-714 (1998).
  10. Bugg, T. D. H., et al. Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA. Biochem. 30, 10408-10415 (1991).
  11. Neu, H. C. The crisis in antibiotic resistance. Science. 257, 1064-1073 (1992).
  12. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature. 406, 775-781 (2000).
  13. Xu, J., Li, H. L. The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold. J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).
  14. Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. Self-assembled monolayers for biosensors. Analyst. 122, 43-50 (1997).
  15. Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).
  16. Prime, K. L., Whitesides, G. M. Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces. Science. 252, 1164-1167 (1991).
  17. Rotschafer, J. C., et al. Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations. Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).
  18. Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers. Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).
  19. Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala. J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).
  20. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  21. Baller, M. K., et al. A cantilever array-based artificial nose. Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).
  22. Burg, T. P., et al. Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid. Nature. 446, 1066-1069 (2007).
  23. Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).
  24. Nugaeva, N., et al. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection. Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).
  25. Von Muhlen, M. G., et al. Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators. Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).
  26. Godin, M., M,, et al. Using buoyant mass to measure the growth of single cells. Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).
  27. Mertens, J., et al. Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever. Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).
  28. Porter, T. L., et al. A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas. Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).
약물 타겟 상호 작용 및 항균 저항 검출 Nanomechanics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ndieyira, J. W., Watari, M., McKendry, R. A. Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection. J. Vis. Exp. (80), e50719, doi:10.3791/50719 (2013).More

Ndieyira, J. W., Watari, M., McKendry, R. A. Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection. J. Vis. Exp. (80), e50719, doi:10.3791/50719 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter