Summary
يتم التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز ectopically في العديد من أنواع السرطان وتم تحديدها كأهداف العلاجية في سرطان الدم الحاد. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من مثبطات كيناز التيروزين لعلاج سرطان الدم الحاد.
Abstract
قد تورطت مستقبلات التيروزين كيناز في تطور وتقدم العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الدم والأورام الصلبة، وتكون الأهداف العلاجية druggable جذابة. نحن هنا تصف استراتيجية من أربع خطوات فعالة لتقييم ما قبل السريرية مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) في علاج سرطان الدم الحاد. في البداية، تم استخدام تحليل لطخة غربية لتأكيد تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم مثقف. ثم يتم تقييم النشاط الوظيفي باستخدام المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو الثقافات أجار لينة. يتم تقييم المركبات التجريبية التي تثبت النشاط في المقايسات الثقافة خلية في الجسم الحي باستخدام NOD SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران زرع orthotopically مع خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم. الأولي في الدراسات المجراة الدوائية تقييم تثبيط الهدف في انفجارات معزولة عن اللوكيميا في نخاع العظام. ويستخدم هذا النهج لتحديد الجرعة والجدول الزمني اللازم لإدارة فعالة تمنع الهدفأيون. دراسات لاحقة تقييم فعالية TKIs في الجسم الحي باستخدام luciferase المراسل معربا عن خلايا سرطان الدم، مما يسمح للإضاءة الحيوية للرصد غير الغازية من عبء اللوكيميا وتقييم استجابة علاجية باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير. وكانت هذه الاستراتيجية فعالة لتقييم TKIs في المختبر والمجراة ويمكن تطبيقها لتحديد وكلاء جزيئيا المستهدفة مع الإمكانات العلاجية أو للمقارنة المباشرة وإعطاء الأولوية للمركبات متعددة.
Introduction
سرطان الدم الليمفاوي الحاد (ALL) هو الورم الخبيث الأكثر شيوعا عند الأطفال 1،2. معدل البقاء على قيد الحياة عموما للأطفال ALL-B النسب (B-ALL) هو ما يقرب من 85٪، ولكن الأنواع الفرعية بيولوجية معينة، بما في ذلك النسب T-ALL (T-ALL)، يكون لا يزال الأكثر فقرا التكهن حتى مع البروتوكولات العلاجية الحالية. لا يزال مزيد من العلاج من انتكس ALL تحديا 3. على الرغم من أن الغالبية العظمى من المرضى البالغين المصابين بسرطان الدم الحاد تحقيق مغفرة مع العلاج الكيميائي في خط الهجوم، العديد من المرضى لا تزال تعاني من الانتكاس 4. ومن المعروف نظم العلاج الكيميائي الحالي في علاج سرطان الدم الحاد لتتسبب في آثار جانبية طويلة المدى القصير والمرتبطة سمية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علاجات أقل سمية التي تستهدف على وجه التحديد خلايا السرطان مع تأثير ضئيل على الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، وقد تم التركيز على تطوير الرواية، وكلاء المستهدفة جزيئيا مع خصوصية لخلايا السرطان، وغالبا ما تستخدم الكيمياء التكراريةلتوليد المركبات النشطة المتعددة التي يجب عندئذ مقارنة وتحديد أولوياتها 5. يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم ما قبل السريرية من TKIs لعلاج سرطان الدم الحاد، والتي يمكن استخدامها لتقييم مركب واحد أو لمقارنة مباشرة من المركبات متعددة من أجل تسهيل تطوير العقاقير.
طريقة المقدمة هنا يتكون من أربع خطوات. أولا البيوكيميائية (1) ومكافحة سرطان الدم (2) يتم تقييم أنشطة المجمع (ق) في خلية ثقافة، ثم يتم تأكيد تثبيط الهدف في النماذج الحيوانية (3)، وأخيرا الكفاءة العلاجية للTKI (ق) يتم تحديد سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي مثلي (4). لهذه الدراسات، فمن المهم اختيار خطوط الخلايا ذات الصلة، والتي هي ممثلين عن الأنواع الفرعية البيولوجية الأكثر شيوعا. وينبغي اختيار خطوط الخلايا، والتي على حد سواء، والتعبير عن الهدف من الفائدة وتفتقر إلى الهدف من الفائدة، للتحقيق في ما إذا كانت الآثار البيولوجية ميدiated عن طريق تثبيط الهدف. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما لتطوير مثبطات جزيء صغير، والتي لها آثار خارج الهدف التي قد تكون مهمة للنشاط المضادة للورم. من الضروري أيضا اختيار خط الخلية التي تعتمد على الهدف للآثار وظيفية مثل الانتشار أو البقاء على قيد الحياة. ويمكن استخدام دراسات التحقق من صحة الهدف الأولي (خارج نطاق هذه المقالة) باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو وسائل أخرى محددة لمنع الهدف لتحديد خطوط الخلايا التي تعتمد على الهدف. ومن المستحسن أيضا لاختيار خطوط الخلايا التي يمكن أن تشكل xenografts الفئران، مثل أن نتائج زراعة الخلايا يمكن أن يكون ترجمة لفي التجارب المجراة على نحو أكثر مباشرة.
لتقييم النشاط البيوكيميائية بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم، انخفاض في مستقبلات الفسفرة يمكن استخدامها كمؤشر على تثبيط الهدف. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية أو ELISA المقايسات، وهذا يتوقف على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة.إذا كانت الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لهدف المتاحة، فحوصات ELISA هي الأفضل لأنها أكثر كمية وكفاءة. في الحالات التي تكون فيها الأجسام المضادة مع خصوصية كافية لELISA ليست متاحة، قد يكون من الضروري تحليل لطخة غربية. في هذه الحالة، يمكن مناعي من كمية كبيرة من المحللة تكون مفيدة للكشف عن الأهداف التي هي في وفرة منخفضة. هذا النهج هو ذات الصلة ولا سيما لقياس الفوسفات، والبروتينات، والتي قد يكون لها نصف حياة قصيرة للسماح للتغيرات السريعة في إشارة استجابة للمؤثرات البيئية. بعض البروتينات فسفرته هي عطوب للغاية، وعلى الأرجح نتيجة لتشكيل معقدة مع phosphatases. للكشف قوية وثابتة من هذه البروتينات فسفرته، قد يكون من الممكن أيضا لعلاج الخلايا مع pervanadate، وهو لا رجعة فيه بروتين تيروزين الفوسفاتيز المانع 6، لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين قبل إعداد لست] خلية كاملة.
إلىتحديد ما إذا كان النشاط البيوكيميائية النتائج في تأثيرات مضادة للورم، والعمليات البيولوجية التي تعتمد على الهدف يمكن رصدها في التجارب القائمة على الخلية. لخطوط خلية سرطان الدم، النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs يمكن تقييمها باستخدام فحوصات أجريت في تشكيل مستعمرة ميثيل أو أجار لينة 7. أجار لينة قد يكون من المفضل لأن هذا هو وسيلة الصلبة التي هي أكثر قابلية للتلاعب إذا كان العلاج تتكرر مع TKI ضروري. في حين أن العديد اللوكيميا myloid (AML) خطوط الخلايا الحادة وشكل مستعمرات في أجار لينة، فإن معظم خطوط الخلايا ALL تشكل فقط المستعمرات في ميثيل، والذي هو وسيلة شبه صلبة. على الرغم من أنه من الممكن لتحديث المتوسطة و / أو TKIs في الثقافات ميثيل، فقط كميات صغيرة يمكن استخدامها مع وتيرة محدودة. وبالمثل، فإنه من الصعب صمة عار المستعمرات دون تعطيل لهم في ميثيل. ينبغي أن تحدد الدراسات الأولية قدرة خطوط الخلايا المناسبة لشكل مستعمرات في ميثيل و / أو أجار لينة ورانه الكثافة المثلى من الخلايا في الثقافة بحيث المستعمرات غير قابلة للتداخل وعدد كاف إحصائيا للحصول على البيانات ذات الصلة (عادة 50-200 المستعمرات في لوحة 35 ملم).
بينما في فحوصات المختبر هي قوية وفعالة من حيث التكلفة، ولها آثار أخلاقية أقل من التجارب على الحيوانات كلها، والنهوض من المركبات العلاجية يتطلب دليلا على فعالية وسلامة في النماذج الحيوانية. لفي الدراسات المجراة، خطوط الخلايا البشرية سرطان الدم الحاد يمكن زرعها في orthotopically NOD.Cg-Prkdc SCID أنا l2rg tm1Wjl / SzJ (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران وTKIs عن طريق الحقن أو عن طريق الفم بالتزقيم يمكن أن تدار بسهولة. بعض خطوط الخلايا قد تتطلب تعرض الفئران مجموعة موردي المواد النووية إلى خلية المنخفضة التي تعتمد على خط جرعة من الإشعاع من أجل xenografts أن ينشئ، والفئران في هذه الحالة قد لا تتسامح مع أنبوب تغذية عن طريق الفم دون فترة نقاهة 5-10 يوم آخر التشعيع. يصف هذا المخطوط جيل من B-ALL وT-ALL xenografts استخداميمكن إنشاء خطوط خلية معينة (697 وJurkat) كأمثلة ولكن xenografts في الفئران مجموعة موردي المواد النووية باستخدام مجموعة واسعة من خطوط الخلايا. في حال أن خطوط الخلايا الأخرى هي أكثر قابلية للتطبيق، شرط التشعيع، ينبغي تحديد العدد الأمثل من الخلايا لزرع، وتوقيت ظهور المرض وتطور تجريبيا. من الناحية المثالية، فإن هذه النماذج وانتفاذ كاملة (كل حيوان زرع يتطور سرطان الدم)، حركية متناسقة (اللوكيميا تقدم مماثل في جميع الحيوانات)، ونافذة معالجة معقولة (مثالي بين 20-30 يوما من بدء العلاج وإزالة من الدراسة بسبب المرض) . ويمكن زيادة عدد الخلايا المزروعة لتحسين انتفاذ والاتساق الحركية أو انخفضت إلى تحسين إطار العلاج إذا لزم الأمر.
لتحديد ما إذا TKIs تتدخل لإعاقة الهدف في الجسم الحي، يتم جمع عينات من الفئران مع xenografts سرطان الدم بعد العلاج مع TKI أو مركبة فقط. من الناحية المثالية، فإن جرعةوتسترشد جدول د الإدارة لهذه التجارب من خلال الدراسات الدوائية، والتي يمكن في كثير من الأحيان أن يقوم بها المختبرات التجارية وخارج نطاق هذا المقال. إذا كانت البيانات الدوائية المتاحة، وتركيز مركب المطلوبة لتثبيط فعالية المستهدفة في خلية ثقافة والحد الأقصى للتركيز مصل الدم بعد جرعة واحدة من TKI يمكن استخدامها لتحديد جرعة البداية لدراسات على الحيوانات. يمكن أن الدراسات الدوائية أيضا بإبلاغ توقيت جمع العينة بعد العلاج للدراسات الدوائية وطريقة التعاطي. تثبيط الهدف يمكن تقييمها في أي جهاز المتضررة ولكن الأنسجة التي يتم جمع معظم بسهولة ومعالجتها هي الأفضل. خطوط الخلايا سرطان الدم الحاد الأكثر إقامة في الكبد ونخاع العظم والطحال والدم المحيطي، والجهاز العصبي المركزي، على الرغم من أن أجهزة معينة المتضررة ومدى engraftment في هذه الأجهزة تختلف بين النماذج. بروتوكول المعروضة هنا يقيم phosphس البروتين تثبيط نخاع العظام في استخدام تحليل لطخة غربية، ولكن الأجهزة الصلبة قد يكون من الأسهل لجني باستمرار وتتطلب معالجة الحد الأدنى أو أي قبل التجميد، مما يتيح فرصة أقل للتدهور الفوسفات البروتينات أثناء جمع العينات وتجهيزها. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لتقييم أورام أو الأجهزة المتضررة من سرطان الدم الصلبة.
أخيرا، يتم تحديد الكفاءة العلاجية للTKI (ق) في نماذج طعم أجنبي مثلي سرطان الدم. لهذه الدراسات، توقيت بدء العلاج يمكن أن تختلف، بحيث يتم إنشاء أكثر أو أقل المرض. العلاج قد تبدأ على الفور بعد زرع لإجراء الدراسات الأولية ومن ثم يتأخر في دراسات لاحقة حتى يتم الكشف عن عبء المرض كبيرة لتقريب أكثر عن كثب نموذج العلاج التشخيص. من الناحية المثالية، وهذه النماذج الحيوانية أيضا القدرة على القياس غير الغازية من عبء المرض. قمنا الأمثل للأساليب إدخال إبليس اليراعبورصة عمان الجين في خطوط الخلايا سرطان الدم باستخدام جزيئات الفيروسات مثل، والسماح لغير الغازية، وتحليل طولية من بداية ظهور أعراض المرض والتقدم وتقييم عبء المرض في نخاع العظام والأعضاء الصلبة. الحرجة لهذا النهج هو استخدام خطوط الخلايا وحيدة النسيلة الموسومة luciferase المراسل لمنع التقلبات في تطوير سرطان الدم، معربا عن luciferase المراسل المرتبطة باستخدام خطوط الخلايا بولكلونل والعلاج ليست لها علاقة مع TKI 8.
أخذت معا، وهذه الخطوات يمكن استخدامها لتقييم لTKI واحدة أو للمقارنة المباشرة وترتيب TKIs متعددة. بينما البروتوكولات المعروضة هنا التركيز على تطوير TKIs، وهذه الأساليب يمكن تكييفها لأهداف أخرى وموصوفة اعتبارات للتنمية الفحص. وبالتالي، قد يكون هذا أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية لتقييم ما قبل السريرية وكلاء جزيئيا المستهدفة للعلاج من سرطان الدم الحاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت كل التجارب التي تنطوي على الحيوانات والمعايير التنظيمية التي وافقت عليها لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية كولورادو. تمت الموافقة على بروتوكول يتبين من جامعة جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية كولورادو.
1. الفوسفات من البروتين البقعة الغربية
- إعداد لست]
- خطوط الخلايا ثقافة التعبير عن مستقبلات التيروزين كيناز من الفائدة. خلايا الحصاد وصفيحة 3-5 × 10 6 خلية / عينة في 400 ميكرولتر المتوسطة النمو في 48 طبق جيدا زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 2-3 ساعة.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل 5X TKI في النمو المتوسطة واحتضان لمدة 60 دقيقة.
- إعداد العازلة تحلل مع 50 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 10 ملي EDTA، 10٪ (V / V) الجلسرين، 1٪ (V / V) تريتون X-100، ومثبطات الأنزيم البروتيني. إذا لن يتم التعامل مع الثقافات pervanadate قبل الحصاد، إضافة مثبطات إنزيم الفوسفاتيز (orthova 1 ملم الصوديومnadate و 0.1 ملي كربونات الصوديوم) إلى تحلل العازلة.
- إعداد pervanadate (PV) حل المانع الفوسفاتيز فورا قبل الاستخدام. إعداد محلول 0.3٪ من بيروكسيد الهيدروجين (تنبيه) في البرد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب الظلام على الجليد (1:100 تمييع الحل الأسهم 30٪). تغلي قسامة من 0.2 M الصوديوم orthovanadate (OV، تنبيه) محلول المخزون لمدة 5 دقائق. تمييع 1:10 في برنامج تلفزيوني لجعل 20 ملي OV الحل في درجة حرارة الغرفة (RT). خلط 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين و 20 ملي OV 1:1 و احتضان في الظلام في RT لمدة 20 دقيقة.
- تمييع الكهروضوئية في المتوسطة كاملة (60 ميكرولتر PV + 940 ميكرولتر المتوسطة). إضافة 100 ميكرولتر من المخفف PV / جيد. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 3 دقائق ثم وضع لوحة على الجليد.
- حصاد الخلايا في أنابيب microfuge الباردة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. طاف نضح والخلايا resuspend في 120 ميكرولتر من العازلة تحلل. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. توضيح المحللة في microfuge الباردة في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. نقل سوبrnatant إلى أنبوب الباردة الطازجة. المحل في -80 درجة مئوية.
- مناعي
- تدور باستمرار بروتين G حبات sepharose و في microfuge في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف وتغسل حبات 2X مع 1 مل PBS الباردة. إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني لجعل الطين 50٪. إضافة الأجسام المضادة الأولية و 20 ميكرولتر 50٪ بروتين G حبات لكل عينة. احتضان لمدة 2 ساعة - O / N عند 4 درجات مئوية على محور دوار.
- نبض أسفل حبات البرد في microfuge في 9،000 دورة في الدقيقة. إزالة طاف وتغسل حبات 2X مع 150 ميكرولتر العازلة تحلل الباردة. تدور في microfuge الباردة في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر العازلة عينة SDS 2X مع 2 المركابتويثانول (تنبيه). استخدام فورا أو تخزينها في -80 درجة مئوية.
- عينات يغلي لمدة 5 دقائق وعلى المدى SDS-PAGE-تريس جليكاين هلام. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز الفوسفات وكشف البروتين بواسطة لطخة غربية.
- شطف وصمة عار مع الماء ثم احتضان في 2٪ SDS، 62.5 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 0.1 M β-المركابتويثانول (تنبيه) لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. شطف 2X مع الماء ثم يغسل لمدة 60-90 دقيقة في 5-6 التغيرات في TBS-T لإزالة تجريد الحل.
- الكشف عن البروتين الكلي من قبل لطخة غربية.
2. ميثيل الفحص
- قسامة 4 مل من ميثيل المتوسطة قاعدة الإنسان في أنابيب مخروطية 50 مل باستخدام العقيمة تتحمل كبيرة حادة نهاية الإبرة. (ملاحظة: ميثيل يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في RT O / N قبل استخدامها)
- إضافة 500 ميكرولتر من 10X TKI أو مركبة في النمو المتوسط إلى 4 مل من ميثيل وخليط دوامة لمدة 10 ثانية.
- الحصاد وخلايا العد. إعداد تعليق خلية في النمو المتوسطة في التركيز، وهو 10X أعلى من تركيز الخلية النهائي. إضافة 500 ميكرولتر الخلية تعليق لخليط ميثيل. دوامة لمدة 10 ثانية وترك الجلوس لمدة 10 دقيقة لإزالة الفقاعات.
- وضع 4 مل من خليط ميثيل باستخدام حقنة 5 مل العقيمة وتأه حمل نهاية إبرة حادة. تجنب وضع الفقاعات. الاستغناء 1 مل من الخليط ميثيل في وسط الثلاث 35 ملم الأنسجة لوحات الثقافة. دوامة الأطباق حتى يتم تغطية الجزء السفلي تماما مع ميثيل.
- لكل لوحة ميثيل، وإعداد 10 سم معقمة لوحة زراعة الأنسجة مع اثنين إضافية 35 ملم لوحات زراعة الأنسجة مملوءة بالماء المعقم لضمان بيئة رطبة. مكان الثقافات في الماء تغلف حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 10-14 يوما.
- عد المستعمرات بعد 1-2 أسابيع. يجب أن تكون المستعمرات أكثر من 20 خلايا وليس متداخلة. المستعمرات يمكن عدها باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مرحلة المجهر مع شبكة أو باستخدام عداد مستعمرة الآلي. وينبغي أيضا تقييم التغييرات في حجم مستعمرة أو التشكل في الاستجابة للعلاج مع TKI. لتحسين الكشف عن طريق مكافحة مستعمرة، المستعمرات وصمة عار وذلك بإضافة 60-100 ميكرولتر من (3 - (4،5-ثنائي ميثيل-2-thiazolyl) -2،5-ثنائي الفينيل-2H-نتروبلو بروميد سولution (الإنتقالي العسكري، 5 ملغ / مل في H 2 O، تخزينها في -20 درجة مئوية، بعيدا عن الضوء، تنبيه) غلبه الحكمة على سطح كل لوحة واحتضان لمدة 8 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
3. لينة آجار الفحص
- إعداد 1٪ أجار النبيلة للطبقة القاع، 0.7٪ أجار النبيلة للطبقة العليا والمتوسطة 2X النمو. تتوازن 2X المتوسطة النمو في 42 ° C حمام الماء. الحرارة 1٪ و 0.7٪ أجار النبيلة في الميكروويف (حوالي 1 min/100 مل)، وتتوازن في حمام مائي 42 ° C. خلط أجزاء متساوية من 1٪ أجار و 2x والمتوسطة بشكل منفصل 0.7٪ أجار و 2x المتوسطة في 50 مل conicals. خطة 10 مل من أجار لينة خليط / لوحة ستة جيدا لكل طبقة.
- تسمية 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة. ملء كل جيدا مع 1.5 مل 1٪ خليط أجار لينة. تجنب فقاعات أثناء الطلاء. لوحات الجافة مع الأغطية قبالة في هود عقيمة لمدة 30 دقيقة.
- عد الخلايا. إعداد تعليق خلية في النمو المتوسطة في التركيز، وهو 500X أعلى من concentrati الخلية النهائيعلى. إضافة تعليق خلية إلى 0.7٪ خليط أجار، تخلط جيدا والاستغناء 1.5 مل من الخليط خلية أجار على الجزء العلوي من طبقة أجار 1٪. دعونا الطبقة العليا يصلب لمدة 30 دقيقة.
- إعداد 1X المتوسطة النمو تحتوي على TKI أو السيطرة على السيارة. إضافة 2 مل من المتوسط مع التركيز المطلوب من TKI على رأس الطبقة العليا أجار.
- احتضان الثقافات لمدة 10 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. إزالة واستبدال المتوسطة تتراكب كل 3 أيام.
- عندما المستعمرات مرئية للعين المجردة، تتراكب نضح المتوسطة وإضافة 200 ميكرولتر نيترو نتروبلو الحل الأزرق (1 ملغ / مل NBT في H 2 O، تخزينها في 4 درجة مئوية، بعيدا عن الضوء، تنبيه). العودة إلى الحاضنة لمدة 24-48 ساعة. الانتقال إلى 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل العد. ويمكن تخزين لوحات الملون في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. عد المستعمرات باستخدام مجهر أو عداد مستعمرة الآلي.
4. تقييم الفوسفات تثبيط البروتين في الجسم الحي
- جمع جأذرع نموا في مرحلة سجل بواسطة الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي في أعلى الجدول 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة و resuspend في برنامج تلفزيوني في تركيز المناسب (عادة 1-5 × 10 7 خلية / مل). خلايا الزرع في حجم 100 ميكرولتر في الأسبوع 6-12 الفئران مجموعة موردي المواد النووية القديمة عن طريق الحقن في الوريد في الوريد الذيل باستخدام حقنة الانسولين 28 G. وضع الحيوان في كابح، تسخين الذيل في كوب من الماء الدافئ لتمدد الأوردة، وتنظيف الذيل مع مسحة الكلورهيكسيدين قبل الحقن. بعد الحقن، وممارسة الضغط على موقع الحقن باستخدام شاش معقم حتى يتوقف النزيف. زرع ما لا يقل عن 3 حيوانات / المجموعة. الحفاظ على الفئران على المياه التي تحتوي على 1 ملغ / مل سلفات الجنتاميسين.
- أربعة عشر يوما بعد الزرع، وعلاج الحيوانات مع TKI أو مركبة فقط، وعينات الحصاد لتحليل تثبيط الهدف. وزن الحيوانات وعلاج مع الجرعة المناسبة (ملغم / كغم من وزن الجسم) من TKI أو مركبة. إدارة العلاج في حجم 5 مل / كغرام من وزن الجسم عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن أو 10 مل / كجم من وزن الجسم عن طريق التغذية الأنبوبية عن طريق الفم. للحقن الملكية الفكرية، وكبح جماح الماوس يدويا وحقن في الربع السفلي الأيمن من البطن باستخدام إبرة G 29. لأنبوب تغذية عن طريق الفم، وكبح جماح الماوس يدويا مع الاستمرار على الحيوان في وضع مستقيم. وضع أنبوب التغذية الأنبوبية في الفم على اللسان وداخل الجزء الخلفي من الفم. تطبيق ضغط طفيف لتمرير أنبوب عبر المريء الى المعدة و. كساد الغطاس حقنة لإدارة العلاج. إذا لم المكبس خفض بسهولة يجب إزالة إبرة التغذية الأنبوبية وأعادت. إعداد الصياغات TKI فورا قبل الاستخدام.
- إذا كان المطلوب معالجة pervanadate، وإعداد حل PV 20 دقيقة قبل الحصاد كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4) وتمييع في المتوسطة مع 1 ميكرومتر MgCl 2 و 100 U / مل الدناز (120 ميكرولتر PV + 880 متوسطة ميكرولتر). ملاحظة: PV مستقرة لا يقل عن 1 ساعة بعد التخفيف.
- تضحية الحيوانات CO 2 الخدر في أبالوقت تكبده (ق) بعد العلاج. تشريح عظام الفخذ عن طريق إزالة الفراء والجلد والعضلات من الساق بأكملها بحيث تتعرض العظام تماما. إزالة عظام الفخذ بواسطة قطة مع تشريح مقص أقل بقليل من مفصل الورك، ومرة أخرى فوق مفصل الركبة. نقل إلى طبق بتري ونخاع العظام مطاردة مع 1 مل PBS الباردة أو حل PV المخفف باستخدام حقنة و27 G الإبرة. إذا علاج مع PV، في احتضان RT في الظلام لمدة 10 دقيقة.
- إعداد لست] وتحليل مستويات الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي، كما هو مبين أعلاه (الخطوات 1.1.6-1.2.5).
- Quantitate النسبية الفوسفات من البروتين ومستويات البروتين الكلي للكل عينة باستخدام كثافة. حساب النسبية phospho-protein/total-protein إلى متوسط قيمة phospho-protein/total-protein للحيوانات المعالجة السيارة.
5. تقييم نشاط مكافحة سرطان الدم من TKIs في جميع النماذج طعم أجنبي
- إذا لزم الأمر، وتعريض الفئران ل200 CGY الإشعاع في irradiator-RS 2000 PRIO يوم واحدr لزرع. الفئران زرع مع خطوط الخلايا سرطان الدم كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.1). زرع ما لا يقل عن 6 الفئران في كل مجموعة. تحديد الفئران عن طريق الأذن لكمة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام علامة سوداء لتحديد الفئران مع علامات التجزئة على ذيولها. إضافة تخصيب اليورانيوم لأقفاص للحد من احتمالات العدوان قفص زميله أثناء الدراسة.
- علاج الفئران مع TKI أو مركبة فقط كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.2). رصد الوضع الصحي من الفئران يوميا عبر الفحص البدني والعزم الوزن. الأعراض المتوقع سرطان الدم (انخفاض مستوى النشاط، وفقدان الوزن، والشلل أطرافه الخلفية، والتهابات العين). عادة ما يرتبط فقدان الوزن أكثر من 10٪ -15٪ مع وفاة الماوس في غضون يومين وعادة ما يكون نقطة نهاية بديلة للموت وفقا لمتطلبات IACUC القياسية.
- رصد engraftment وتطوير سرطان الدم عبر الجسم الحي تلألؤ بيولوجي في نظام التصوير يصل إلى 2x الأسبوعية. إعداد 200X-D وسيفيرين محلول المخزون (30 ملغ / مل) في STERIلو المياه. المزيج بلطف بواسطة انقلاب حتى يذوب D-وسيفيرين تماما. استخدامها على الفور، أو قسامة والتجميد في -20 درجة مئوية. قبل التصوير باستخدام في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي نظام التصوير، وذوبان الجليد مأخوذة من D-RT في وسيفيرين وتمييع 01:02 في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 15 ملغ / مل وتصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون التصفية.
- تخدير الفئران قبل التصوير مع 1.5٪ isoflurane واستنشاق الأكسجين في. رصد تخدير كافية، وتتميز استرخاء العضلات، وفقدان الحركة، وفقدان الاستجابة لتحفيز أخمص القدمين قرصة.
- مباشرة قبل التصوير، وإدارة 150 ملغ / كغ من وزن الجسم D-وسيفيرين عن طريق الحقن الملكية الفكرية (10 ميكرولتر من 15 ملغ / مل وسيفيرين / غرام من وزن الجسم).
- استخدام نظام التصوير تلألؤ بيولوجي في الجسم الحي لالتقاط سلسلة من الصور 2 مع متتابعة 30 و 60 و 90 ثانية والتعرض الصورة النهائية مع التعرض ثانية 120. بعد التصوير، والعودة إلى أقفاص الفئران ورصد للتعافي من التخدير. تبعا لشدة تلألؤ بيولوجي، يمكن أن تختلف مرات التعرض. وينبغي سلفا مرات التعرض الأمثل لنموذج معين وأبقى متناسقة بحيث شدة إشارة لنقطة زمنية قابلة للمقارنة عبر الفردية الدراسة بأكملها.
- تحديد شدة تلألؤ بيولوجي لكل فأر باستخدام المعيشة صورة 3.2 اقتناء وتحليل البرمجيات. تحديد مجموع القيم في قياس تدفق الفوتونات / ثانية صنف من الفائدة (ROI) من حجم متطابقة على كل الماوس الرسم.
- التضحية الفئران عن طريق CO 2 التعرض وخلع عنق الرحم إذا المحتضرة، واظهار الشلل، في حالة أكبر من 15٪ وفقدان الوزن، أو في نهاية الدراسة. تشريح الفئران والملاحظات سجل (مثل تضخم الغدد الطحال والكبد، أو الليمفاوية؛ شاحب نخاع العظام). تشريح عظام الفخذ ونخاع العظام مطاردة مع PBS الباردة باستخدام إبرة G 27.
- جمع الخلايا في microfuge في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.جمع الخلايا وصمة عار مع 20 ملغ / مل دابي (4،6-Diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد، 1:1،000) وFITC مترافق α-hCD45 (1:100) أو الماوس مفتش الرقابة 1 الضد isotype (1:100) . تقييم سرطان الدم engraftment باستخدام التدفق الخلوي. البوابة على السكان قابلة للحياة (دابي سلبية) وتحديد النسبة المئوية للخلايا CD45 + (انفجارات نخاع العظام٪).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المقايسات المقدمة هنا تقييم آثار البيوكيميائية والوظيفية بوساطة TKIs، ويمكن استخدامها لتصنيف المركبات رواية تقوم على درجة تثبيط الهدف في المختبر والمجراة، والحد من تشكيل مستعمرة، والتأخير في حدوث الاييضاض في الفئران مجموعة موردي المواد النووية المزروعة مع luciferase المراسل- الموسومة خلايا سرطان الدم.
تم استخدام تحليل طخة مناعية لتحديد تثبيط شكل فسفرته النشطة من البروتين الهدف في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs. أدت المعاملة مع TKIs في الانخفاض تعتمد على الجرعة في كمية البروتين فسفرته. الشكل 1 يبين تثبيط الفسفرة المستهدفة من قبل ثلاثة TKIs مختلفة في خط خلية سرطان الدم الحاد مع TKI C كونها أقوى، TKI B كونها أقل قوة، وTKI وجود أي تأثير. وبالتالي، هذا الاختبار يسمح الترتيب من المركبات على أساس قوة النشاط البيوكيميائية في النظام النموذجي القائم على الخلية. في الأمثلة هو مبين فيكان الرقم 1، والإثراء من المستضد بواسطة مناعي واستخدام مثبط إنزيم الفوسفاتيز pervanadate اللازمة لتحقيق نتائج التأويل. السبب في ذلك قد يكون، أن الفسفرة بروتين كيناز التيروزين هذا هو عطوب المدقع.
لدراسة تأثير TKIs على خصائص أنكجنيك من خلايا سرطان الدم الحاد، واستخدمت المقايسات تشكيل مستعمرة. نحن التحقيق في قدرة خلايا سرطان الدم تعتمد على الهدف لتشكيل مستعمرات في القائم ميثيل (ALL) والمتوسطة في أجار لينة (AML). في المثال هو موضح في الشكل 2A، انخفاضا كبيرا إحصائيا في عدد مستعمرة لوحظ في خط الخلية ALL بعد العلاج مع TKI. وقد لوحظت نتائج مماثلة في خطوط الخلايا AML بعد العلاج مع TKIs في أجار لينة. في الشكل 2B، هناك اتجاه نحو انخفاض عدد مستعمرة في الاستجابة للعلاج مع TKI ويظهر انخفاض تعتمد على الجرعة، ولكن الفرق ليس شارعatistically كبيرة نتيجة لتقلب بين مكررات. لاحظ الأخطاء المعيارية كبيرة في الشكل 2B نسبة إلى الشكل 2A. خلط وافرة من الخلايا في المتوسط شبه صلبة والتوزيع المتساوي للوسط شبه صلبة في الآبار أو لوحات أمر بالغ الأهمية من أجل التناسق بين مكررات في المقايسات مولد الرمع. العد الدقيق للخلايا قابلة للحياة قبل الطلاء المهم لضمان الاتساق بين التجارب أيضا. يبين الشكل 2C لوحة مع التوزيع غير المتكافئ للمستعمرات، فقاعات في أجار لينة، وانتشار غير مكتملة من أجار لينة في لوحة (اللوحة اليمنى) و لوحة مع طلاء كافية للمقارنة (اللوحة اليسرى). لضمان أن ميثيل لا تجف أثناء فترة الحضانة من المهم أيضا لتشمل لوحات من الماء المعقم في كل طبق. جفاف المتوسطة ميثيل يغير كثافته ويقلل من قدرة الخلايا على شكل مستعمرات، مما يحتملمنع توليد نتائج مفيدة.
لتحديد ما إذا TKIs يمكن أن تمنع بروتين المستهدف في الجسم الحي، كان يعمل تحليل لطخة غربية لفحص مستويات الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي في انفجارات نخاع العظام المعزولة من الفئران مجموعة موردي المواد النووية المزروعة مع خط خلية سرطان الدم الحاد. في المثال هو موضح في الشكل 3، وكشف تحليل الدوائية انخفاضا في مستويات الفوسفات من البروتين في تفجيرات اللوكيميا المعزولة من الفئران التي عولجت مع TKI بالنسبة إلى الفئران التي عولجت مع السيارة فقط. وتبين هذه الدراسات تثبيط لصناعة السيارات في الفسفرة في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs في الجسم الحي، مؤكدا أن هذه المركبات تصل إلى نخاع العظام وتمنع بشكل فعال الهدف. كان TKI D أقل نشاطا من TKI E في هذا الاختبار. المثال المعروض، والاستفادة المطلوبة من pervanadate لتحقيق الاستقرار في الهدف الفوسفات من البروتين وتسمح للكشف.
ماوس نموذج طعم أجنبي مثلي من سرطان الدم الحاد في مجموعة موردي المواد النووية ميلم مع حقن استخدمت كل خط الخلية، معربا عن luciferase المراسل لتقييم تأثير العلاج مع TKI على إمكانات أنكجنيك في الجسم الحي. كما هو مبين في الشكل (4)، وكان الفئران التي عولجت مع TKI مستوى أدنى من تلألؤ بيولوجي كبير، مما يدل على انخفاض العبء النسبي لسرطان الدم الفئران التي عولجت مع السيارة فقط. بعد 10 يوما من العلاج، وكان كل الفئران مستوى منخفض من تلألؤ بيولوجي لم يكن يختلف كثيرا بين الحيوانات تعامل مع السيارة والحيوانات تعامل مع TKI. في المقابل، من خلال 19 أيام بعد العلاج، وكان الفئران المعالجة سيلة هامة أعلى كثافة تلألؤ بيولوجي (86.12 ± 19.17 الفوتونات / ثانية)، في حين كان الفئران التي عولجت بجرعة عالية من TKI أقل بكثير كثافة إشارة (29.64 ± 9.04 الفوتونات / ثانية) .
الشكل 1. TKIs تمنع الفسفرة من البروتين المستهدف في المختبر، وعولجوا الثقافات الخليوي مع تركيزات مبين من TKI A، B TKI، أو TKI مئوية لمدة 1 ساعة. وأضاف Pervanadate لمزارع الخلايا لمدة 3 دقائق لتحقيق الاستقرار في شكل فسفرته من البروتين الهدف. تم immunoprecipitated البروتين الهدف من الخلية لست وتم الكشف عن الفوسفات من البروتين والبروتين الكلي من قبل لطخة غربية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. TKI يقلل تشكيل مستعمرة في خطوط الخلايا في سرطان الدم الحاد ميثيل وأجار لينة. ALL كانت مطلية الخلايا في ميثيل (A) وخلايا مكافحة غسل الأموال وكانت مطلية في لياليكثيرا أجار (B) في وجود TKI أو DMSO (السيطرة على السيارة). احصي المستعمرات بعد 2 أسابيع في الثقافة. وقد استمدت متوسط القيم والأخطاء القياسية من لوحات ثلاث نسخ. (C) يتم عرض لوحات أجار لينة مع الممثل التوزيع الأمثل للمستعمرات (اللوحة اليسرى) أو عدم المساواة في توزيع المستعمرات وأجار لينة منفصلة جزئيا (اللوحة اليمنى). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. المعاملة مع TKI يقلل من مستويات الفوسفات من البروتين في الجسم الحي. تم زرع مجموعة موردي المواد النووية والفئران مع خط الخلية ALL وتعامل مع جرعة واحدة من TKI D، E TKI، أو مركبة إلا بعد تطور سرطان الدم. عظم مجمعت سهم الخلايا من عظام الفخذ وتعامل مع pervanadate قبل إعداد لست] خلية كاملة. أجريت مناعي للبروتين الهدف، والكشف عن الفوسفات والبروتينات الكلية من قبل لطخة غربية. كان quantitated شدة B الإشارة بواسطة قياس كثافة وجزء من البروتين فسفرته الهدف بالنسبة إلى السيارة معاملة الحيوانات تم حساب. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. المعاملة مع TKI يؤخر تطور المرض في الفئران زرعها مع كل خط الخلية البشرية، معربا عن luciferase المراسل. تم زرع الفئران مجموعة موردي المواد النووية التي يبلغ عدد سكانها حيدة النسيلة من transduced luciferase المراسل-ALL الخلايا عن طريق الحقن في الذيلالوريد. تم حقن D-وسيفيرين الغشاء البريتونى، وأخذت الصور تلألؤ بيولوجي مرتين أسبوعيا (Bining: 8، فوف 19.6، و / وقف 1، زمن التعرض 120 ثانية). وأظهرت الصور Pseudocolor يدل على زيادة كثافة تلألؤ بيولوجي مع مرور الوقت في الفئران زرعها مع خلايا سرطان الدم وانخفاض تعتمد على الجرعة في شدة تلألؤ بيولوجي في الحيوانات تعامل مع TKI. B الكميات من متوسط كثافة تلألؤ بيولوجي والخطأ المعياري لكل مجموعة الدراسة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا المخطوط استراتيجية فعالة لتقييم مثبطات التيروزين كيناز الرواية في علاج سرطان الدم الحاد. باستخدام هذا النهج، يتم تقييم الأنشطة البيوكيميائية ومكافحة سرطان الدم الأول في المقايسات خلية مقرها في المختبر ثم في نماذج طعم أجنبي في الجسم الحي. تم استخدام تحليل طخة مناعية بنجاح لإثبات تثبيط كيناز التيروزين الهدف في خلايا سرطان الدم بعد العلاج مع TKIs وللمقارنة بشكل مباشر على قوة من مركبات متعددة في الخلايا. في بروتوكول المعروضة هنا، تم استخدام pervanadate لتحقيق الاستقرار في الفوسفات من البروتين وتركزت البروتين الهدف عن طريق مناعي. إذا كانت هذه القياسات كافية للسماح للكشف من قبل لطخة غربية، ويمكن أيضا أن تكون زيادة مستويات الفوسفات من البروتين عن طريق إضافة يجند، إما مع أو بدون pervanadate. وبالمثل، يمكن إضافة يجند في حل تستخدم لطرد نخاع العظام للدراسات الدوائية. لىجنت يمكن تنقيته أو، في بعض الحالات، يمكن أن تقدم بوصفها مكونا من مكونات مصل بقري جنيني. في حال أن هذه الأساليب لا تسمح للكشف عن السيارات-فسفرته التيروزين كيناز والأهداف المصب يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم تثبيط الهدف، على الرغم من أنه من الأفضل لتقييم النشاط من البروتين الهدف مباشرة عندما يكون ذلك ممكنا. من المذكرة، ينبغي توخي الحذر عند تفسير نتائج التجارب باستخدام pervanadate، وهو مثبط غير انتقائي الفوسفاتيز الذي يؤثر على العديد من البروتينات الخلوية. لهذا السبب، pervanadate لا ينبغي أن تستخدم للكشف عن تغيرات في مكونات الإشارات المصب.
قبل للدراسة في النماذج الحيوانية، فمن المستحسن لتأكيد النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs في خلايا سرطان الدم. لهذه الدراسات ونحن نعتمد على المقايسات مولد الرمع في ميثيل أو لينة المتوسطة أجار. بينما فحوصات أخرى يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم تأثيرات مضادة للورم في الثقافة، مستعمرة المقايسات تشكيل غالبا ما تكون أكثر العلاقات العامةedictive في الجسم الحي من الكفاءة النسبية لفحوصات أكثر تقليدية التي تقيم انتشار و / أو البقاء على قيد الحياة في الثقافة السائل. ومع ذلك، قد يتم استخدام هذه المقايسات جنبا إلى جنب مع المقايسات تشكيل مستعمرة لتقييم آليات النشاط المضاد للسرطان الدم بوساطة TKIs ويمكن أيضا أن تكون مفيدة في حالة عدم وجود خط الخلية من الفائدة لا تشكل المستعمرات. على وجه التحديد، قد يكون من المفيد لتقييم استحثاث موت الخلايا المبرمج في الاستجابة للعلاج مع TKIs باستخدام فحوصات تدفق cytometric لتحديد مستويات المشقوق caspases / تنشيط، وزيادة ربط Annexin V إلى سطح الخلية، أو امتصاص الفرق من YOPRO-1-يوديد . وبالمثل، انخفض انتشار أو تحريض تمايز قد تسهم أيضا في النشاط المضاد للسرطان الدم. على هذا النحو، يمكن أن تتولد منحنيات النمو في وجود وغياب TKI لتقييم انتشار ومورفولوجيا الخلوية والتغيرات في التعبير عن علامات سطح الخلية يمكن فحص لتحديد مرحلة التمايز. استخدام مولد الرمعيتم تأسيس المقايسات بشكل جيد في مجال تطوير الأدوية وبمثابة أداة فعالة من حيث التكلفة لتقييم TKIs. ومع ذلك، فمن المعروف أن التغيرات المنتظمة في ظروف الثقافة (بما في ذلك إضافة عوامل النمو وغيرها من الملاحق، والاختلافات في تكوين الدم، والاختلاف في الرقم الهيدروجيني من الحل TKI) يمكن أن تؤثر على كل من النمو ومستعمرة chemosensitivity 9،10. وبالتالي، والاتساق في ظروف الثقافة هو أمر حاسم لاستنساخ في هذا الاختبار. التوزيع غير المتكافئ للخلايا أو TKI يمكن أن يؤدي أيضا إلى mischaracterization من فعالية العلاجات التجريبية (الشكل 2C). في التقييم إضافة نقطة أكثر من مرة واحدة لعد مستعمرة أو الطلاء بعد التعرض المخدرات قد تساعد على التمييز بين الأدوية التي تتوسط تأثيرات مضادة للالتكاثري ولكن ليس لديهم إمكانات علاجية 7.
في الجسم الحي الدراسات الموضحة هنا تمثل خطوة حاسمة على الطريق نحو السريريل تطبيق TKI. الدراسات الدوائية لإثبات تثبيط الهدف مهمة لتحديد الجرعة وتردد الإدارة ذات الصلة لدراسات لاحقة لتقييم فعالية. في معظم الحالات فمن الأفضل لتحقيق تثبيط كاملة ومستمرة من البروتين وهذا الهدف قد يتطلب معالجة أكثر من مرة في اليوم. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط حدوث الاييضاض وزيادة البقاء على قيد الحياة في نماذج طعم أجنبي قد تتطلب جرعة أعلى من TKI مما هو مطلوب لاستكمال والمستمر تثبيط البيوكيميائية في نخاع العظام. قد يحدث هذا بسبب سرطان الدم أثبت في مواقع متعددة والتعرض لTKIs قد تكون غير متجانسة في مواقع تشريحية مختلفة، بما في ذلك الدماغ، أو أنها يمكن أن تعكس القيود في حساسية مقايسة مما أدى إلى عدم اكتشاف كميات محدودة المتبقية من البروتين الهدف نشط ( أي تثبيط الهدف غير مكتملة). مع ذلك، على عكس العلاجات السامة للخلايا التقليدية التي تدار في أقصى بهمجرعة التسامح، قد تكون أكثر وكلاء جزيئيا المستهدفة للورم انتقائية نفس القدر من الفعالية في الجرعات المنخفضة التي هي كافية لتثبيط البيوكيميائية للبروتين الهدف، ولكن لا ترتبط مع السميات كبيرة. وبالتالي، لهذه الفئة من العملاء، والدراسات الأولية لتقييم الآثار المترتبة على TKI على تطور سرطان الدم في نماذج طعم أجنبي غالبا ما تستخدم الجرعة الحد الأدنى اللازم للحصول على تثبيط الكامل والمستمر من الهدف. إذا لم يلاحظ أي آثار على تطور سرطان الدم أو البقاء على قيد الحياة، ويمكن زيادة الجرعة حتى لوحظ سمية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه النماذج للتحقيق في الآثار المترتبة على TKI تديرها بالاشتراك مع علاجات سرطان الدم القياسية، وبالتالي إبلاغ تطوير البروتوكولات السريرية اللاحقة.
إنشاء نماذج طعم أجنبي من سرطان الدم الحاد باستخدام الخلايا، معربا عن luciferase المراسل يمثل تقدما كبيرا على مدى أكثر النماذج التقليدية وطعم أجنبي لديه القدرة على تسريع كبيرعملية اكتشاف المخدرات والتنمية 11. التصوير تلألؤ بيولوجي يسمح لتحديد طولية غير الغازية من عبء سرطان الدم، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة للدراسات، ويمكن أيضا تقديم معلومات حول موقع التشريحية للمرض. بالإضافة إلى ذلك، في محاولة لتوسيع بناء المرافق السريرية المحتملة للTKIs، والتصوير تلألؤ بيولوجي يمكن أن يتحقق بتكاثر بعد زرع العينات البشرية الأولية الموسومة luciferase المراسل المريض 12. ومع ذلك، يمكن تفسير الصور تلألؤ بيولوجي تكون صعبة نظرا لعدم اليقين الموضعية من الخلايا التي ينبعث منها ضوء وبالتالي في الجسم الحي التصوير تلألؤ بيولوجي ينبغي أن تستخدم فقط كأداة نصف كمي لمتابعة نفس الحيوان في ظل ظروف مماثلة 13.
في حالة حسن الحظ أن مركبات متعددة لها نشاط كبير وقابلة للمقارنة في المقايسات وصفها هنا، معايير إضافية التي يمكن استخدامها لمزيد من رانكينغرام من المركبات تشمل السهولة النسبية لتوليف مركب، والذوبان، ودرجة التوافر الحيوي عن طريق الفم، والخصائص الدوائية، ودراسات علم السموم. أخذت معا، وينبغي أن تسمح هذه البيانات لتحديد مركب الأمثل للتقدم إلى التحقيق السريرية والتي تكون ضرورية لدعم ايداع الفحص دواء جديد (IND) التطبيق مع إدارة الغذاء والدواء (FDA) لتمكين الدراسات السريرية. بعد توليد هذه البيانات ما قبل السريرية الحرجة اللازمة للنهوض من هذه العوامل الرواية في العيادة، وينبغي النظر في الاستفادة من المعهد الوطني للبرنامج التقييم علاج السرطان الصحة (CTEP). في هذا البرنامج وترعى التجارب السريرية لتقييم الأدوية المضادة للسرطان جديدة، مع التركيز بشكل خاص على البحوث متعدية. ينبغي الحرص على تنسيق العرض العام للبيانات ما قبل السريرية، بما في ذلك وصف لهياكل والتوليف من المركبات الرواية، مع تقديم طلبات براءات الاختراع لحمايهر حقوق الملكية الفكرية. بشكل عام، لا ينبغي أن تعرض البيانات علنا حتى يتم إيداع طلبات البراءات حماية تكوين المادة وطرق استخدامها.
في الختام، لقد أثبتنا استراتيجية فعالة للتحقيق وتقييم إمكانات TKIs رواية كعوامل علاجية لعلاج سرطان الدم الحاد. تثبيط الهدف في خلايا سرطان الدم، سواء في الثقافة والمعزولة من نخاع العظام من الفئران مع xenografts سرطان الدم البشرية، يمكن تقييمها من قبل طخة مناعية. أهمية وظيفية من تثبيط الهدف يمكن تقييمها باستخدام المقايسات مولد الرمع ومثلي نماذج طعم أجنبي الفئران مع التصوير للإضاءة الحيوية. معا هذه المقايسات توفير بيانات ما قبل السريرية الحرجة اللازمة للنهوض من هذه العوامل متعدية الرواية في العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
في الجسم الحي التصوير تم تنفيذها باستخدام IVIS الموارد المشتركة في جامعة كولورادو مركز السرطان (بدعم من منحة P30-CA046934). تم تنفيذ التدفق الخلوي في التدفق الخلوي الموارد المشتركة، مركز جامعة كولورادو للسرطان (بدعم من منحة P30CA046934). وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (RO1CA137078 إلى DKG). ABLS هو زميل في برنامج التنمية للأطفال عالم، بدعم من المنح المقدمة من الأكاديمية الأميركية لطب الأطفال، وجمعية طب الأطفال الأمريكية، وكينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
