Summary
Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.
Abstract
Receptor tyrosine kinases zijn betrokken bij de ontwikkeling en progressie van vele kankers, waaronder zowel leukemie en vaste tumoren en aantrekkelijk druggable therapeutische doelwitten. Hier beschrijven we een efficiënte vier stappen strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren (TKI) voor de behandeling van acute leukemie. Aanvankelijk wordt western blot analyse gebruikt remming doelwit gekweekte leukemiecellen bevestigen. Functionele activiteit geëvalueerd middels klonogene assays methylcellulose of zachte agar culturen. Experimentele verbindingen die activiteit in celcultuur assays tonen worden geëvalueerd in vivo gebruik van NOD-SCID-gamma (NSG) muizen orthotopically getransplanteerd met menselijke leukemie cellijnen. Initiële in vivo farmacodynamische studies evalueren doel remming in leukemische ontploffing geïsoleerd uit het beenmerg. Deze benadering wordt gebruikt om de dosis en het toedieningsschema nodig zijn voor een effectieve doelwit remmen bepalenion. Latere studies evalueren van de werkzaamheid van de TKI's in vivo middels luciferase expressie leukemiecellen, waardoor voor niet-invasieve monitoring van bioluminescente leukemie last en evaluatie van de therapeutische respons toepassing van een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem. Deze strategie is effectief voor de evaluatie van TKI's in vitro en in vivo en kan worden toegepast voor de identificatie van moleculair gerichte middelen met therapeutisch potentieel of voor directe vergelijking en prioritering van meerdere verbindingen.
Introduction
Acute lymfatische leukemie (ALL) is de meest voorkomende maligniteit bij kinderen 1,2. De totale overleving voor kinderen B-lijn ALL (B-ALL) is ongeveer 85%, maar specifieke biologische subtypen, waaronder T-lineage ALL (T-ALL), hebben nog steeds slechtere prognose, zelfs met de huidige therapeutische protocollen. Verdere behandeling van recidief ALL blijft een uitdaging 3. Hoewel de meerderheid van volwassen patiënten met acute leukemie bereiken van een remissie met up-front chemotherapie, veel patiënten nog steeds last terugval 4. Huidige chemotherapeutische regimes bij de behandeling van acute leukemie is bekend dat-toxiciteit verbonden korte en lange termijn bijwerkingen veroorzaken. Derhalve minder toxische therapieën die specifiek kankercellen met minimale effecten op normale weefsels zeer nodig. De laatste jaren is de nadruk gelegd op de ontwikkeling van nieuwe, moleculair-gerichte middelen met specificiteit voor kankercellen vaak gebruik iteratieve chemie geplaatstmeerdere actieve verbindingen die vervolgens worden vergeleken met prioriteit 5 genereren. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van TKI voor de behandeling van acute leukemie, die kan worden gebruikt voor de evaluatie van een verbinding of een rechtstreekse vergelijking van verschillende verbindingen om de ontwikkeling van geneesmiddelen vergemakkelijken.
De hier gepresenteerde methode bestaat uit vier stappen. Eerst de biochemische (1) en anti-leukemie (2) van de vrije verbinding (en) worden geëvalueerd in celkweek dan remming van de doelstelling wordt bevestigd in diermodellen (3), en tenslotte therapeutische werking van de TKI (s) wordt bepaald leukemie orthotope xenograft modellen (4). Voor deze studies is het belangrijk om relevante cellijnen die vertegenwoordigers van de meest voorkomende biologische subtypes zijn kiezen. Cellijnen moeten worden geselecteerd, die beide, drukken het doelwit van belang en niet de doelgroep van belang zijn, te onderzoeken of biologische effecten worden mediated door remming van het doel. Dit is bijzonder relevant voor de ontwikkeling van kleine molecule inhibitoren die off-doeleffecten die voor antitumoractiviteit bedraagt. Het is ook noodzakelijk om een cellijn die afhankelijk is van het doel van functionele effecten zoals proliferatie of overleving kiezen. Voorlopige doelbevestiging studies (buiten het bestek van dit artikel) met RNA interferentie of andere specifieke wijze aan het doel inhiberen kunnen worden gebruikt om doel-afhankelijke cellijnen te identificeren. Het is ook wenselijk om cellijnen die murine xenotransplantaten, zodat resultaten celkweek directer vertaald in vivo experimenten kan worden kan vormen kiezen.
Voor de evaluatie van de biochemische activiteit gemedieerd door TKI in leukemiecellen, kan een afname in receptor fosforylatie worden gebruikt als een indicator van target inhibitie. Western blot analyse of ELISA assays kunnen worden toegepast, afhankelijk van de beschikbaarheid en de specificiteit van antilichamen.Als antilichamen met voldoende specificiteit voor het doelwit zijn, ELISA assays de voorkeur omdat ze meer kwantitatief en efficiënt. Wanneer antilichamen met voldoende specificiteit voor ELISA beschikbaar zijn, kunnen Western-blot-analyse nodig zijn. In dit geval kan immunoprecipitatie van grote hoeveelheden lysaat nuttig voor de detectie van doelen die in geringe hoeveelheden worden. Dit is bijzonder relevant voor het meten van fosfo-eiwitten, die een korte halfwaardetijd te zorgen voor snelle veranderingen in signalering in respons op omgevingsstimuli. Sommige gefosforyleerde eiwitten zijn zeer labiel, waarschijnlijk als gevolg van complexvorming met fosfatasen. Voor robuuste en consistente detectie van deze gefosforyleerde proteïnen, kan het ook mogelijk om cellen te behandelen met pervanadaat, een irreversibele proteïne-tyrosine fosfatase inhibitor 6, de fosfo-eiwit gestabiliseerd preparaat van gehele cellysaten.
Aanbepalen of biochemische activiteit resulteert in anti-tumor effecten kan doel-afhankelijke biologische processen worden gecontroleerd op cellen gebaseerde experimenten. Voor leukemie cellijnen, kunnen anti-leukemie-activiteit gemedieerd door TKI beoordeeld met behulp kolonievorming assays uitgevoerd in methylcellulose of zachte agar 7. Zachte agar kunnen de voorkeur omdat dit een vast medium dat is meer vatbaar voor manipulatie of herhaalde behandeling met een TKI noodzakelijk. Hoewel veel myloid acute leukemie (AML) cellijnen kolonies in zachte agar zal vormen, de meeste alle cellijnen alleen kolonies te vormen methylcellulose, een half-vast medium. Hoewel het mogelijk is om medium en / of TKI bij te methylcellulose culturen slechts kleine hoeveelheden gebruikt en met beperkte frequentie. Ook is het moeilijker om kolonies te kleuren zonder verstoring hen methylcellulose. Voorlopige studies moet de mogelijkheid van geschikte cellijnen kolonies gevormd in methylcellulose en / of zachte agar en t definiërenhij optimale dichtheid van cellen in cultuur zodanig dat kolonies niet-overlappende en in voldoende aantal om statistisch relevante gegevens te verkrijgen (meestal 50-200 kolonies per 35 mm plaat).
Terwijl in vitro assays robuust en kosteneffectief, en hebben minder ethische implicaties dan geheel dierproeven, vooruitgang van therapeutische verbindingen vereist bewijs van werkzaamheid en veiligheid in diermodellen. Voor in vivo studies, kunnen menselijke acute leukemie cellijnen orthotopically worden getransplanteerd in NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) muizen en TKI's kunnen gemakkelijk worden toegediend door injectie of orale sondevoeding. Sommige cellijnen kunnen blootstelling van NSG muizen een laag cellijn-afhankelijke dosis straling nodig hebben om voor xenografts vast te stellen, en in dit geval muizen orale sondevoeding niet kan verdragen zonder een 5-10 dag herstelperiode na de bestraling. Dit manuscript beschrijft de generatie van B-ALL en T-ALL xenograften gebruikspecifieke cellijnen (697 en Jurkat) als voorbeelden maar xenotransplantaten worden vastgesteld NSG muizen met een groot aantal cellijnen. Indien andere cellijnen zijn van toepassing de vereiste bestraling optimale aantal cellen transplantatie, en de timing van ziektebegin en progressie worden experimenteel bepaald. Idealiter zal deze modellen volledige penetrantie (elk dier getransplanteerd ontwikkelt leukemie), consistente kinetiek (leukemie verloopt op dezelfde wijze in alle dieren), en een redelijke behandeling raam (idealiter 20-30 dagen tussen de start van de behandeling en verwijdering van studie als gevolg van ziekte) . Het aantal cellen getransplanteerd kan worden verhoogd tot penetrantie en kinetische consistentie verbeteren of verlaagd om eventueel de behandelingsvenster verbeteren.
Om te bepalen of TKIs bemiddelen remming doel in vivo, worden monsters verzameld van muizen met leukemie xenograften na behandeling met TKI of enige voertuig. In het ideale geval de dosis eend toedieningsschema voor deze experimenten worden geleid door farmacokinetische studies, die vaak worden uitgevoerd door commerciële laboratoria en vallen buiten het bestek van dit artikel. Als farmacokinetische gegevens beschikbaar, kan de concentratie van de verbinding vereist voor effectieve remming doel in celkweek en de maximale serumconcentratie na een enkele dosis TKI worden gebruikt om een startdosis voor dierproeven definiëren. Farmacokinetische studies kunnen ook de timing van de monstername na de behandeling te informeren voor farmacodynamische studies en de wijze van toediening. Remming van het doel kan worden beoordeeld in welke aangetaste orgaan, maar weefsels die het gemakkelijkst worden verzameld en verwerkt zijn voorkeur. De meeste acute leukemie cellijnen te vestigen in de lever, beenmerg, milt, perifeer bloed en het centrale zenuwstelsel, hoewel het specifieke organen aangetast en de mate van implantatie in deze organen varieert modellen. De hier gepresenteerde protocol beoordeelt phosphinhibitie o-eiwit in het beenmerg met Western blot-analyse, maar solide organen kan makkelijker zijn om consequent te oogsten en vereisen weinig of geen bewerking vóór het invriezen, waardoor minder kans op degradatie van fosfo-eiwitten tijdens monstername en verwerking. Immunohistochemie kan worden gebruikt om vaste tumoren of organen aangetast door leukemie evalueren.
Tenslotte wordt de therapeutische werking van de TKI (s) bepaald leukemie orthotope xenograft modellen. Voor deze studies, kan de timing van de start van de behandeling worden gevarieerd, zodat de ziekte min of meer vaststaat. De behandeling kan na transplantatie onmiddellijk beginnen voor de eerste studies en dan worden uitgesteld in volgende studies tot een significante ziektelast wordt gedetecteerd nauwer benaderen een diagnostische behandeling model. Idealiter zijn diermodellen hebben ook het vermogen om niet-invasieve meting van ziektelast. We hebben methoden voor de invoering van de vuurvlieg lucifer geoptimaliseerdease gen in leukemie cellijnen met behulp van virus-achtige deeltjes, waardoor voor niet-invasieve, longitudinale analyse van de ziekte ontstaan en de progressie en de beoordeling van de ziektelast in het beenmerg en vaste organen. Essentieel voor deze benadering is het gebruik van monoklonale-luciferase gelabeld cellijnen variabiliteit van ontwikkeling van luciferase expressie leukemie geassocieerd met het gebruik van polyklonale cellijnen voorkomen en is niet gerelateerd aan de behandeling met een TKI 8.
Tezamen kunnen deze stappen worden gebruikt voor de evaluatie van een TKI of voor directe vergelijking en ranking van meerdere TKIs. Hoewel de hier gepresenteerde protocollen gericht op de ontwikkeling van TKI, kunnen deze werkwijzen worden aangepast aan andere doelen en overwegingen voor analyseontwikkeling beschreven. Aldus kan deze strategie breder voor de pre-klinische evaluatie van moleculair-gerichte middelen voor behandeling van acute leukemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met dieren volgde de wettelijke normen door de Universiteit van Colorado Institutional Animal Care en gebruik Comite. De aangetoonde protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Colorado Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Fosfo-eiwit Western Blot
- Bereiding van lysaten
- Cultuur cellijnen die de receptor tyrosine kinase van belang. Oogst cellen en plaat 3-5 x 10 6 cellen / monster in 400 ul groeimedium in een 48-well weefselkweek schotel. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2-3 uur.
- Voeg 100 ul 5x TKI oplossing in groeimedium en incubeer gedurende 60 minuten.
- Bereid lysis buffer met 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) glycerol, 1% (v / v) Triton X-100 en protease remmers. Als kweken worden niet behandeld met pervanadaat vóór oogst, toevoegen fosfataseremmers (1 mM natrium orthovanadate en 0,1 mM natriummolybdaat) lysis buffer.
- Bereid pervanadaat (PV) fosfataseremmer oplossing onmiddellijk voor gebruik. Bereid een oplossing van waterstofperoxide (LET) 0.3% in koude met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een donkere buis op ijs (1:100 verdunning van een 30% voorraadoplossing). Kook een hoeveelheid van 0,2 M natriumorthovanadaat (OV, LET) stock oplossing gedurende 5 minuten. Verdun 1:10 in PBS met 20 mM OV oplossing bij kamertemperatuur (KT) maken. Meng 0,3% waterstofperoxide en 20 mM OV 1:1 en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Verdunnen PV in compleet medium (60 ul PV + 940 ul medium). Voeg 100 ul van verdunde PV / goed. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 3 minuten en plaats plaat op ijs.
- Oogst de cellen in koude microfuge buizen bij 2.500 rpm gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 120 ul van lysis buffer. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Verduidelijken het lysaat in een koude microcentrifuge bij 6000 rpm gedurende 3 minuten. Transfer supernatant een nieuwe koude buis. Bewaren bij -80 ° C.
- Immunoprecipitatie
- Spin down Proteïne G Sepharose korrels in microfuge bij 1000 rpm gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant en was kralen 2x met 1 ml koud PBS. Voeg een gelijk volume PBS tot een 50% slurry. Voeg primair antilichaam en 20 ui 50% Proteïne G kralen aan elk monster. Incubeer 2 uur - O / N bij 4 ° C op een rotator.
- Pulse neer parels in een koude microfuge bij 9.000 tpm. Verwijder de supernatant en was beads 2x met 150 ul koude lysisbuffer. Spin koud microcentrifuge bij 1000 rpm gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 20 pl 2X SDS Sample Buffer met 2-mercapto-ethanol (LET). Onmiddellijk of winkel te gebruiken bij -80 ° C.
- Kook monsters gedurende 5 minuten en draaien op een SDS-PAGE Tris-glycine gel. Breng de eiwitten aan een nitrocellulose membraan en detecteren fosfo-eiwit door western blot.
- Spoel vlek met water en vervolgens incubeer in 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoethanol (LET) gedurende 30 min bij 50 ° C. Spoel 2x met water en daarna wassen voor 60-90 min in 5-6 veranderingen van TBS-T te verwijderen stripoplossing.
- Detect totaal-eiwit door western blot.
2. Methylcellulose Assay
- Aliquot 4 ml methylcellulose menselijke base medium in 50 ml conische buizen met een steriele grote boring stomp uiteinde naald. (Noot:. Methylcellulose worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C ontdooien bij kamertemperatuur O / N voor gebruik)
- Voeg 500 ul van 10x TKI of voertuig in groeimedium tot 4 ml methylcellulose en vortex mengsel gedurende 10 sec.
- Oogst en tellen cellen. Bereid een celsuspensie in kweekmedium in een concentratie die 10x hoger is dan de uiteindelijke celconcentratie. Voeg 500 pi celsuspensie methylcellulose mengsel. Vortex gedurende 10 seconden en laat zitten voor 10 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Opstellen 4 ml methylcellulose mengsel met behulp van een 5 ml spuit en steriele large droeg stomp uiteinde naald. Vermijd het opstellen van bubbels. Breng 1 ml methylcellulose mengsel in het midden van drie 35 mm weefselkweekplaten. Zwenk de gerechten tot de bodem volledig is bedekt met methylcellulose.
- Voor elke methylcellulose plaat, bereiden een 10 cm steriele weefselkweek plaat met twee extra 35 mm weefselkweek platen gevuld met steriel water om een vochtige omgeving te verzekeren. Plaats culturen watermantel incubator bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 10-14 dagen.
- Count kolonies na 1-2 weken. Kolonies moet meer dan 20 cellen en niet overlappen. Kolonies worden geteld met behulp van een omgekeerde microscoop met een microscoop podium met een raster of met een geautomatiseerde kolonieteller. Veranderingen in koloniegrootte of morfologie in respons op behandeling met TKI beoordeeld moet worden. Detectie verbeteren door kolonieteller, vlek kolonies door toevoeging 60-100 pl (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium bromide solution (MTT, 5 mg / ml in H2O, bewaar bij -20 ° C, tegen licht, LET) druppelsgewijze over het oppervlak van elke plaat en incuberen 8 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
3. Zachte Agar Assay
- Bereid 1% nobel agar voor onderste laag, 0,7% nobel agar voor toplaag en 2x groeimedium. Equilibreer 2x groeimedium in een 42 ° C waterbad. Verhit 1% en 0,7% nobel agar in een magnetron (ongeveer 1 min/100 ml) en evenwicht in een 42 ° C waterbad. Meng gelijke delen van 1% agar en 2x medium en afzonderlijk 0,7% agar en 2x medium in 50 ml conicals. Plan 10 ml zachte agar mengsel / zes-well plaat voor elke laag.
- Label 6-well weefselkweek platen. Vul elk putje met 1,5 ml 1% zachte agar mengsel. Vermijd bellen tijdens plating. Droge platen met deksels in steriele kap gedurende 30 minuten.
- Tellen cellen. Bereid een celsuspensie in kweekmedium in een concentratie die is 500x hoger dan de uiteindelijke cel concentratiop. Voeg celsuspensie tot 0,7% agar mengsel mengen en doseren van 1,5 ml van het mengsel agar cel bovenop de 1% agar laag. Laat de toplaag stollen gedurende 30 minuten.
- Bereid 1x groeimedium dat TKI of het voertuig. Voeg 2 ml medium met de gewenste concentratie van TKI bovenop de bovenste laag agar.
- Incubeer culturen gedurende 10 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2. Verwijder en vervang het bedekken medium om de 3 dagen.
- Wanneer kolonies zijn zichtbaar voor het blote oog, aspireren overlappen medium en voeg 200 ul nitro-tetrazolium blauw-oplossing (1 mg / ml NBT in H 2 O, bewaren bij 4 ° C, beschermen tegen licht, LET). Terug naar incubator voor 24-48 uur. Ga naar 4 ° C gedurende ten minste 2 uur vóór het tellen. Gekleurd platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende een maand. Count kolonies met behulp van een microscoop of een geautomatiseerde kolonie teller.
4. Evaluatie fosfo-eiwit remming in vivo
- Verzamelen cellen groeien in log-fase door centrifugeren in een tafelblad centrifuge bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Was de cellen eenmaal met steriele PBS en hersuspenderen in PBS bij een geschikte concentratie (gewoonlijk 1-5 x 10 7 cellen / ml). Transplantatie cellen in een volume van 100 ul in 6-12 weken oude muizen NSG door intraveneuze injectie in de staartader met een 28 G insulinespuit. Plaats het dier in een restrainer Verhit de staart in een bekerglas met warm water om de aderen verwijden, en het reinigen van de staart met een chloorhexidine wattenstaafje voorafgaand aan de injectie. Na injectie, druk uit op de injectieplaats met steriel gaas tot bloeden stopt. Transplantatie minstens 3 dieren / groep. Handhaving van de muizen op water dat 1 mg / ml gentamycine sulfaat.
- Veertien dagen na de transplantatie, dieren behandelen met TKI of enige voertuig en de oogst van monsters voor analyse van target remming. Weeg dieren behandelen met een geschikte dosis (mg / kg lichaamsgewicht) van TKI of voertuig. Dien behandeling in een volume van 5 ml / kg lichaamsgewicht door intraperitoneale (ip) injectie of 10 ml / kg lichaamsgewicht oraal gavage. Voor ip injectie, beperken de muis handmatig en injecteren in de rechter kwadrant van de buik met behulp van een 29 G naald. Voor orale sondevoeding, bedwingen de muis handmatig en rechtop te houden van het dier. Plaats de maagsonde buis in de mond over de tong en in de achterkant van de mond. Oefen lichte druk uit op de buis passeren de slokdarm en in de maag. Druk de zuiger van de spuit om de behandeling te beheren. Als de zuiger niet gemakkelijk druk de maagsonde naald moet worden verwijderd en verplaatst. Bereid TKI formuleringen direct voor gebruik.
- Als pervanadaat behandeling gewenst, bereiden PV oplossing 20 min vóór de oogst zoals hierboven (stap 1.1.4) beschreven en verdund in medium met 1 uM MgCl2 en 100 U / ml DNase (120 pl PV + 880 ul medium). Opmerking: PV is stabiel gedurende tenminste 1 uur na verdunning.
- Sacrifice dieren door het CO 2 narcose bij de appropriate tijd (s) na de behandeling. Ontleden dijbenen door het verwijderen van bont, huid en spieren van het hele been, zodat de botten volledig worden blootgesteld. Verwijder de dijbenen door knippen met dissectieschaar net onder het heupgewricht en weer boven het kniegewricht. Transfer naar een petrischaal en spoel beenmerg met 1 ml koud PBS of verdunde PV-oplossing met behulp van een spuit en een 27 G naald. Indien behandeling met PV, incuberen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 10 minuten.
- Bereid lysaten en analyseren fosfo-eiwit en totale eiwitniveaus hierboven (stappen 1.1.6-1.2.5) aangegeven.
- Kwantificeren relatieve fosfo-eiwit en totale eiwitniveaus voor elk monster middels densitometrie. Bereken phospho-protein/total-protein opzichte van de gemiddelde waarde voor phospho-protein/total-protein met hulpmiddel behandelde dieren.
5. Evaluatie van anti-leukemie activiteit van TKI's in ALLE xenograftmodellen
- Eventueel muizen blootstellen aan 200 cGy straling in een RS-2000 bestraler een dag prior te verplanten. Transplantatie muizen met leukemie cellijnen zoals hierboven (stap 4.1) beschreven. Transplantatie minstens 6 muizen per groep. Identificeer muizen op het gehoor punch. Als alternatief kan een zwarte stift worden gebruikt om muizen te identificeren met streepjes op hun staart. Verrijking Naar kooien aan de mogelijke kooi partner agressie tijdens de studie verminderen.
- Behandel muizen met een TKI of voertuig uitsluitend hierboven (stap 4.2) beschreven. De gezondheidstoestand van muizen dagelijks monitoren via lichamelijk onderzoek en gewicht bepalen. Verwachte symptomen van leukemie (verminderde activiteitenniveau, gewichtsverlies, verlamming, en ooginfecties). Gewichtsverlies meer dan 10% -15% wordt meestal geassocieerd met de dood van de muizen binnen twee dagen en is typisch een surrogaat eindpunt dood volgens norm IACUC eisen.
- Monitor innesteling en ontwikkeling van leukemie via een in vivo bioluminescentie imaging systeem tot wekelijks 2x. Bereid een 200x D-luciferine voorraadoplossing (30 mg / ml) in sterile water. Meng voorzichtig door inversie tot D-luciferine volledig is opgelost. Onmiddellijk te gebruiken, of hoeveelheid en invriezen bij -20 ° C. Voorafgaand aan beeldvorming met een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem ontdooien hoeveelheden van D-luciferine bij kamertemperatuur en verdund 1:02 in PBS tot een eindconcentratie van 15 mg / ml en filter gesteriliseerd door een 0,2 um filter.
- Verdoven van de muizen voor de beeldvorming met 1,5% ingeademd isofluraan in zuurstof. Monitor voldoende verdoving, gekenmerkt door ontspanning van de spieren, verlies van beweging, en het verlies van de respons tot teen-snuifje stimulatie.
- Onmiddellijk voor beeldvorming toedienen 150 mg / kg lichaamsgewicht D-luciferine door ip injectie (10 ui 15 mg / ml luciferine / g lichaamsgewicht).
- Gebruik een in vivo bioluminescentie imaging systeem om 2 reeks van beelden met sequentiële 30, 60 en 90 seconden blootstelling en een uiteindelijke afbeelding met een 120 sec belichting vast te leggen. Na beeldvorming, terug muizen kooien en monitor voor herstel van anesthesie. Afhankelijkintensiteit van bioluminescentie, kunnen belichtingstijden worden gevarieerd. Optimale belichting tijden moet vooraf worden bepaald voor een bepaald model en bleef consequent zodanig dat het signaal intensiteiten voor individuele tijdstippen zijn vergelijkbaar over de gehele studie.
- Bepaal bioluminescentie intensiteit voor elke muis met behulp van Leven Beeld 3.2 acquisitie en analyse software. Bepaal totale flux gemeten waarden in fotonen / seconde door het tekenen van gebieden van belang (ROI) van dezelfde grootte meer dan elke muis.
- Offer muizen door CO2 belichting en cervicale dislocatie of stervende, vertonen verlamming, bij meer dan 15% gewichtsverlies of aan het einde van de studie. Ontleden muizen en opnemen waarnemingen (bijvoorbeeld vergroting van milt, lever of lymfeklieren, bleke beenmerg). Ontleden dijbenen en spoel beenmerg met koude PBS met behulp van een 27 G naald.
- Verzamel cellen in een microcentrifuge bij 2500 rpm gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in PBS met 2% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.Verzamel cellen vlek met 20 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride, 1:1000) en FITC-geconjugeerd α-hCD45 (1:100) of muizen IgG1 isotype controle antilichaam (1:100) . Evalueer leukemie innesteling behulp van flowcytometrie. Gate aan de levensvatbare populatie (DAPI negatief) en bepalen percentage van CD45 + cellen (% beenmerg ontploffing).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde assays evalueren biochemische en functionele effecten gemedieerd door TKI en kan worden gebruikt om nieuwe verbindingen op basis van de mate van target inhibitie in vitro en in vivo rang, vermindering van kolonievorming en vertraging van leukemie in NSG muizen getransplanteerd met luciferase- tagged leukemiecellen.
Immunoblot analyse werd gebruikt om de remming van de actieve gefosforyleerde vorm van het doeleiwit bij leukemie cellen te bepalen na behandeling met TKI. Behandeling met TKI resulteerde in een dosis-afhankelijke afname van de hoeveelheid gefosforyleerd eiwit. Figuur 1 toont remming van fosforylering doel drie verschillende TKI per acute leukemie cellijn met TKI C de meest potente, TKI B minder krachtig en TKI Een geen effect. Dus deze test kan rangschikking van verbindingen vanwege de potentie van biochemische activiteit in een celgebaseerde modelsysteem. In de in voorbeeldenFiguur 1, verrijking van het antigeen door immunoprecipitatie en het gebruik van de fosfatase remmer pervanadaat waren noodzakelijk interpreteerbare resultaten. Reden daarvoor kan zijn dat de proteïne fosforylering van deze tyrosine kinase is extreem labiel.
Om het effect van TKI op oncogene eigenschappen van acute leukemie cellen te bestuderen, werden kolonievorming assays gebruikt. We onderzochten de mogelijkheid van target-afhankelijke leukemiecellen om kolonies in-methylcellulose gebaseerde (ALL) medium en in zachte agar (AML) te vormen. In de in figuur 2A, een statistisch significante vermindering van kolonieaantal voorbeeld werd waargenomen in een ALL cellijn na behandeling met een TKI. Soortgelijke resultaten werden waargenomen in AML cellijnen na behandeling met TKI in zachte agar. In figuur 2B, is er een trend naar verminderde aantal kolonies in respons op behandeling met TKI en de daling lijkt dosisafhankelijk, maar het verschil is niet statistically significant als gevolg van variabiliteit tussen de herhalingen. Let op de grote standaardfout in figuur 2B ten opzichte van fig. 2A. Voldoende menging van de cellen in de semi-vast medium en gelijke verdeling van de semi-vast medium in de putjes of platen is van cruciaal belang voor de samenhang tussen de herhalingen in klonogene assays. Nauwkeurige telling van levensvatbare cellen vóór plateren is ook belangrijk om de samenhang tussen experimenten te waarborgen. Figuur 2C toont een plaat met een ongelijke verdeling van kolonies, bellen in de zachte agar en onvolledig verspreiden van de zachte agar in de plaat (rechter paneel) en een plaat met voldoende plating voor vergelijking (linker paneel). Om de methylcellulose niet uitdroogt tijdens de incubatieperiode is het ook belangrijk om platen steriel water omvatten in elk gerecht. Uitdroging van de methylcellulose medium verandert de dichtheid en daardoor vermindert het vermogen van cellen om kolonies te vormen, eventueelwat genereren van bruikbare resultaten.
Om te bepalen of TKI's het doelwit eiwit kan remmen in vivo, werd western blot analyse gebruikt om fosfo-eiwit en totaal-eiwitgehalte in het beenmerg ontploffing geïsoleerd van NSG muizen getransplanteerd met een acute leukemie cellijn te onderzoeken. In het in figuur 3 bijvoorbeeld farmacodynamische analyse toonde een afname van fosfo-eiwitniveaus in leukemische ontploffing geïsoleerd uit muizen behandeld met TKI opzichte van muizen behandeld met alleen vehikel. Deze studies tonen de remming van auto-fosforylatie in leukemiecellen na behandeling met TKI in vivo, bevestigt dat deze verbindingen bereikt het beenmerg en effectief het doelwit remmen. TKI D was minder actief dan TKI E in deze assay. Het voorbeeld getoond, vereist het gebruik van pervanadaat het doelwit fosfo-eiwit te stabiliseren en zorgen voor detectie.
Een orthotopische muis xenograftmodel van acute leukemie in NSG mice geïnjecteerd met een luciferase-expressie op alle cellijn werd gebruikt om het effect van behandeling met een TKI op oncogene potentiaal in vivo te evalueren. Zoals getoond in figuur 4, muizen behandeld met TKI een significant lager niveau van bioluminescentie, wat wijst op een verminderde leukemie last ten opzichte van muizen behandeld met alleen vehikel. Na 10 dagen behandeling, alle muizen een geringe bioluminescentie die niet significant verschillend tussen dieren behandeld met vehiculum en dieren die met TKI was. Daarentegen, met 19 dagen na de behandeling, met drager behandelde muizen hadden significant hogere bioluminescentie intensiteit (86,12 ± 19,17 fotonen / seconde), terwijl muizen behandeld met een hoge dosis TKI had veel lagere signaalintensiteit (29.64 ± 9.04 fotonen / seconde) .
Figuur 1. TKI remmen fosforylering van het doeleiwit in vitro. Celkweken werden behandeld met de aangegeven concentraties van TKI A, B TKI of TKI C gedurende 1 uur. Pervanadaat is celkweken toegevoegd gedurende 3 minuten om het gefosforyleerde vorm van het doeleiwit te stabiliseren. Het doelwit eiwit werd geïmmunoprecipiteerd van cellysaten en fosfo-eiwit en totaal-eiwit werden gedetecteerd door western blot. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. TKI vermindert kolonievorming bij acute leukemie cellijnen methylcellulose en zachte agar. ALL cellen werden uitgeplaat in methylcellulose (A) en AML cellen werden uitgeplaat in soft agar (B) in aanwezigheid van een TKI of DMSO (controle voertuig). Kolonies werden geteld na 2 weken in de cultuur. Gemiddelde waarden en standaardfouten werden afgeleid uit drievoud platen. (C) Vertegenwoordiger zachte agar platen met een optimale verdeling van de kolonies (linker paneel) of ongelijke verdeling van de koloniën en een deels vrijstaande zachte agar (rechter paneel) worden getoond. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Behandeling met TKI vermindert fosfo-eiwit niveaus in vivo. Een NSG muizen werden getransplanteerd met alle cellijn behandeld met een enkele dosis van TKI D, E TKI, of alleen drager na de ontwikkeling van leukemie. Bone marrow cellen werden verzameld van dijbenen en behandeld met pervanadaat voorafgaand aan de voorbereiding van de hele cellysaten. Immunoprecipitatie van target eiwitten, en detectie van fosfo-en totaal-eiwitten door western blot werden uitgevoerd. B Signal intensiteit werd gekwantificeerd door densitometrie en de fractie van gefosforyleerd doelproteïne opzichte van het voertuig behandelde dieren werd berekend. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. De behandeling met TKI vertraagt progressie van de ziekte in muizen getransplanteerd met een luciferase die menselijke ALLE cellijn. NSG muizen werden getransplanteerd met een monoklonaal bevolking van luciferase getransduceerde ALL cellen via een injectie in de staartader. D-luciferine werd intraperitoneaal geïnjecteerd en bioluminescentie beelden werden tweemaal per week genomen (Bining: 8, FOV 19,6, f / stop 1, belichtingstijd 120 sec). Een pseudocolor afbeeldingen worden demonstreren verhoogde bioluminescentie intensiteit tijd bij muizen getransplanteerd met leukemiecellen en een dosis-afhankelijke verlaging van bioluminescentie intensiteit bij dieren behandeld met een TKI. B Kwantificering van de gemiddelde bioluminescentie intensiteit en standaardafwijking voor elke onderzoeksgroep. Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een effectieve strategie voor de evaluatie van nieuwe tyrosine kinase inhibitoren bij de behandeling van acute leukemie. Met deze benadering worden biochemische en anti-leukemie activiteiten eerst geëvalueerd in celgebaseerde proeven in vitro en in vivo xenograft modellen. Immunoblotanalyse is succesvol toegepast om remming van het doel tyrosine kinase in leukemiecellen na behandeling met TKI tonen en direct vergelijken van de potentie van meerdere verbindingen in cellen. In het protocol hier gepresenteerde pervanadaat werd gebruikt om het fosfo-eiwit te stabiliseren en het doeleiwit werd geconcentreerd door immunoprecipitatie. Als deze metingen was onvoldoende om detectie door Western blot was, zou het niveau van fosfo-eiwit ook worden verhoogd door de toevoeging van ligand, met of zonder pervanadaat. Evenzo kan het ligand worden toegevoegd aan de oplossing die het beenmerg farmacodynamische studies spoelen. Ligand kunnen worden gezuiverd of, in sommige gevallen, kunnen als onderdeel van foetaal runderserum. Indien deze methoden niet mogelijk voor de detectie van auto-gefosforyleerd tyrosine kinase, kan stroomafwaartse doelwitten worden gebruikt voor de beoordeling van target inhibitie, hoewel het de voorkeur om de activiteit van het doeleiwit direct beoordelen wanneer mogelijk. Van de nota, is voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van de resultaten van experimenten met pervanadaat, dat is een niet-selectieve fosfataseremmer dat vele cellulaire eiwitten beïnvloedt. Daarom dient pervanadaat niet worden gebruikt voor de detectie van veranderingen in stroomafwaartse signalering componenten.
Vóór bestuderen in diermodellen, is het wenselijk om anti-leukemie-activiteit gemedieerd door TKI in leukemiecellen bevestigen. Voor deze studies hebben we vertrouwen op klonogene assays methylcellulose of zachte agar medium. Terwijl andere testen kunnen worden gebruikt om anti-tumor effecten in kweek evalueren kolonievorming tests zijn vaak predictive van in vivo werkzaamheid ten opzichte van meer traditionele assays die proliferatie en / of overleving in vloeibare kweek te beoordelen. Echter kunnen deze assays worden gebruikt samen met kolonievorming assays om de mechanismen van anti-leukemie-activiteit gemedieerd door TKI evalueren en kan ook nuttig zijn indien een cellijn van belang geen kolonies vormen. Specifiek kan het nuttig zijn om inductie van apoptose beoordelen respons met TKIs met flowcytometrische assays om het niveau van de gesplitste / actieve caspasen bepalen, verhoogde binding van Annexine V aan het celoppervlak, of differentiële opname van YOPRO-1-jodide . Ook verminderde proliferatie of inductie van differentiatie kan ook bijdragen aan anti-leukemie activiteit. Als zodanig kan groeicurven worden gegenereerd in de aanwezigheid en afwezigheid van TKI proliferatie en cellulaire morfologie en veranderingen in expressie van celoppervlak markers kunnen worden onderzocht om te bepalen differentiatiestadium beoordelen. Het gebruik van klonogeneassays goed is ingeburgerd in het gebied van de ontwikkeling van geneesmiddelen en dient als een kosteneffectief instrument voor de evaluatie van TKI's. Het is echter bekend dat systematische veranderingen in de kweekomstandigheden (inclusief groeifactoren en andere supplementen, variaties in serum samenstelling, en verschillen in de pH van de oplossing TKI) zowel kolonie groei chemogevoeligheid 9,10 beïnvloeden. Daarom consistentie kweekomstandigheden is essentieel voor reproduceerbaarheid in deze test. Ongelijkmatige verdeling van cellen of TKI kan ook leiden tot de mischaracterization van de werkzaamheid van experimentele behandelingen (figuur 2C). Bovendien evaluatie van meer dan een tijdstip voor kolonie tellen of plateren na blootstelling geneesmiddel kan bijdragen aan het onderscheiden tussen geneesmiddelen die anti-proliferatieve effecten mediëren maar geen curatief vermogen 7.
De in vivo studies beschreven vormen een belangrijke stap op de weg naar clinical toepassing van een TKI. Farmacodynamische studies om de beoogde remming tonen zijn belangrijk voor de desbetreffende dosis en frequentie van toediening voor verdere studies naar de werkzaamheid evalueren definiëren. In de meeste gevallen verdient het de voorkeur om volledige en continue remming van het doeleiwit te verwezenlijken en kan behandeling meer dan eenmaal per dag nodig. Bovendien kan remming van leukemie en verhoogde overleving in xenograft modellen een hogere dosis TKI dan nodig is voor volledige en continue biochemische remming in het beenmerg vereisen. Dit kan optreden omdat leukemie stelt op meerdere sites en blootstelling aan TKIs kan heterogeen in verschillende anatomische locaties, inclusief de hersenen, of het kan beperkingen geven in de gevoeligheid van de test resulteert in een niet-beperkte resterende hoeveelheden actieve doeleiwit detecteren ( dwz onvolledige doel inhibitie). Niettemin, in tegenstelling tot traditionele cytotoxische therapieën die worden toegediend op hun maximalegetolereerde dosis, des te meer tumor-selectieve moleculair-gerichte middelen even effectief bij lagere doseringen voldoende voor biochemische inhibitie van het doeleiwit, maar worden niet geassocieerd met significante toxiciteit is. Zo kan deze klasse van middelen, eerste studies naar de effecten van een TKI op leukemische progressie bij xenograftmodellen evalueren vaak gebruik maken van de minimale dosis die nodig is om volledige en continue remming van het doelwit te verkrijgen. Als er geen effecten op leukemie progressie of overleving worden waargenomen, kan de dosis worden verhoogd tot toxiciteit wordt waargenomen. Deze modellen kunnen ook worden gebruikt om de effecten van een TKI toegediend in combinatie met standaard therapieën leukemie onderzoeken die de totstandkoming daaropvolgende klinische protocollen informeren.
De oprichting van xenograftmodellen van acute leukemie met behulp van luciferase-expressie cellen betekent een grote vooruitgang ten opzichte van meer traditionele xenotransplantaatmodellen en heeft het potentieel om aanzienlijk versnellenhet proces van drug discovery en ontwikkeling 11. Bioluminescentie zorgt voor niet-invasieve bepaling van leukemie longitudinale belasting, waardoor het aantal dieren nodig voor studies verminderen en kan ook informatie over de anatomische locatie van ziekte. Bovendien, in een poging om uit te breiden op potentiële klinische nut van TKI's, bioluminescentie beeldvorming kan worden reproduceerbaar bereikt na transplantatie van primaire humane-luciferase tag patiënten monsters 12. Echter, de interpretatie van bioluminescentie beelden uitdagend door positionele onzekerheid van de lichtemitterende cellen en dus in vivo bioluminescentie mag alleen worden gebruikt als een semikwantitatieve instrument om hetzelfde dier onder identieke omstandigheden 13 volgen.
In de gelukkige Indien meerdere verbindingen significante en vergelijkbare activiteit in de hier beschreven assays, aanvullende criteria die kunnen worden gebruikt voor verdere Ranking verbindingen omvatten relatieve gemak van samengestelde synthese, oplosbaarheid, de mate van orale biologische beschikbaarheid, farmacokinetische eigenschappen en toxicologische studies. Tezamen moeten deze gegevens mogelijk te maken voor de identificatie van een optimale verbinding voor de progressie naar klinisch onderzoek en zijn noodzakelijk om het indienen van een Investigational New Drug (IND) aanvraag bij de Food and Drug Administration (FDA) de klinische studies mogelijk te maken te ondersteunen. Na het genereren van deze kritische pre-klinische gegevens die nodig zijn voor de vooruitgang van deze nieuwe agenten in de kliniek, moet het gebruik van de National Institute of Health's Cancer Therapy Evaluation Program (CTEP) worden overwogen. In dit programma klinische proeven worden gesponsord om nieuwe anti-kanker middelen te evalueren, met bijzondere nadruk op translationeel onderzoek. Zorg moeten worden genomen om de publieke presentatie van pre-klinische gegevens, inclusief beschrijving van de structuren en de synthese van nieuwe verbindingen te coördineren, met het indienen van octrooiaanvragen te beschert intellectuele eigendomsrechten. In het algemeen moeten de gegevens niet openbaar worden gepresenteerd tot octrooiaanvragen beschermen samenstelling van de materie en wijze van gebruik zijn ingediend.
Concluderend, hebben wij een efficiënte strategie te onderzoeken en evalueren van het potentieel van nieuwe TKI als therapeutische middelen voor de behandeling van acute leukemie aangetoond. Remming Target in leukemiecellen, zowel in kweek en geïsoleerd van het beenmerg van muizen met menselijke leukemie xenotransplantaten, kan worden beoordeeld door immunoblot. De functionele betekenis van target remming kan worden geëvalueerd met behulp van klonogene assays en orthotopic muizen xenograftmodellen met bioluminescentie beeldvorming. Samen zijn deze testen leveren kritische pre-klinische gegevens die nodig zijn voor de vooruitgang van deze nieuwe translationele agenten in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
In vivo beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de IVIS Shared Resource aan de Universiteit van Colorado Cancer Center (ondersteund door subsidie P30-CA046934). Flowcytometrie werd uitgevoerd bij de flowcytometrie Shared Resource, Universiteit van Colorado Cancer Center (ondersteund door subsidie P30CA046934). Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health (RO1CA137078 naar DKG). ABLS is een Fellow van de Pediatric Scientist Development Program, ondersteund door subsidies van de Amerikaanse Academie voor Kindergeneeskunde, de American Pediatric Society, en het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
