Abstract
Receptortyrosinkinaser har implicerats i utvecklingen och progressionen av många cancerformer, inklusive både leukemi och solida tumörer, och är attraktiva druggable terapeutiska mål. Här beskriver vi en effektiv fyra steg strategi för pre-klinisk utvärdering av tyrosinkinashämmare (TKIs) vid behandling av akut leukemi. Inledningsvis är western blot-analys som används för att bekräfta målet inhibition i odlade leukemiceller. Funktionell aktivitet utvärderas sedan med hjälp av klonogena analyser i metylcellulosa eller mjuka agarodlingar. Experimentella föreningar som visar aktivitet i cellkulturanalyser utvärderas in vivo med hjälp av NOD-SCID-gamma (NSG) möss transplanteras orthotopically med leukemicellinjer. Initiala in vivo farmakodynamiska studier utvärdera mål inhibering i leukemiska blaster isolerade från benmärgen. Denna metod används för att bestämma dos och schema för administration som krävs för en effektiv mål spärrjon. Efterföljande studier utvärdera effekten av TKI in vivo med hjälp av luciferas uttrycka leukemiceller, vilket gör det möjligt för icke-invasiv självlysande övervakning av leukemi börda och bedömning av terapeutiskt svar med hjälp av en in vivo mareld imaging system. Denna strategi har varit effektiv för utvärdering av TKI in vitro och in vivo och kan användas för identifiering av molekylärt inriktade agenter med terapeutisk potential eller för direkt jämförelse och prioritering av flera föreningar.
Introduction
Akut lymfoblastisk leukemi (ALL) är den vanligaste maligniteten hos barn 1,2. Den totala överlevnaden för pediatrisk B-härstamning ALL (B-ALL) är ca 85%, men specifika biologiska undertyper, inklusive T-härstamning ALL (T-ALL), har fortfarande sämre prognos även med nuvarande behandlingsprotokoll. Ytterligare behandling av återfall ALLT är fortfarande en utmaning 3. Trots att majoriteten av vuxna patienter med akut leukemi uppnå en eftergift med up-front kemoterapi, många patienter fortfarande lider återfall 4. Aktuella kemoterapeutiska behandlingar vid behandling av akut leukemi är kända för att orsaka toxicitet associerad kort och långsiktiga biverkningar. Därför finns ett stort behov mindre giftiga behandlingar som specifikt till cancerceller med minimal påverkan på normal vävnad. Under senare år har tonvikten lagts på utveckling av nya, molekylärt riktade medel med specificitet för cancerceller, ofta använder iterativ kemiatt generera flera aktiva föreningar, vilka sedan skall jämföras och prioriterade 5. Detta manuskript beskriver en effektiv strategi för pre-klinisk utvärdering av TKI för behandling av akut leukemi, vilket kan användas för utvärdering av en enda förening eller för direkt jämförelse av flera föreningar för att underlätta utveckling av läkemedel.
Den metod som presenteras här består av fyra steg. Först den biokemiska (1) och anti-leukemi (2) verksamhet förening (ar) utvärderas i cellkultur, då hämning av målet bekräftas i djurmodeller (3), och slutligen terapeutisk effekt av TKI (er) bestämmes i orthotopic leukemi xenograft-modeller (4). För dessa studier är det viktigt att välja relevanta cellinjer, som är representanter för de vanligaste biologiska subtyper. Cellinjer bör väljas, som båda uttrycker målet av intresse och saknar målet av intresse, för att undersöka om biologiska effekter Mediated genom inhibering av målet. Detta är särskilt relevant för utveckling av småmolekylära hämmare, som har ej åsyftade effekter som kan vara viktiga för antitumöraktivitet. Det är även nödvändigt att välja en cellinje som är beroende av målet för funktionella effekter såsom proliferation eller överlevnad. Preliminära validerings mål studier (utanför ramen för denna artikel) med hjälp av RNA-interferens eller andra särskilda medel för att hämma målet kan användas för att identifiera mål beroende cellinjer. Det är också önskvärt att välja cellinjer som kan bilda murina xenografter, så att cellkulturresultat kan vara mer direkt översättas till in vivo-experiment.
För utvärdering av biokemisk aktivitet förmedlad av TKI i leukemiceller, kan en minskning av receptor-fosforylering används som en indikator på mål-hämning. Western blot-analys eller ELISA-analyser kan användas, beroende på tillgänglighet och specificitet av antikroppar.Om antikroppar med tillräcklig specificitet för målet är tillgängliga, ELISA-analyser är att föredra eftersom de är mer kvantitativ och effektiv. I de fall där antikroppar med tillräcklig specificitet för ELISA inte är tillgängliga, kan Western blöt-analys vara nödvändig. I detta fall kan immunoutfällning av en stor mängd av lysat vara användbara för detektering av mål som är i begränsad omfattning. Detta tillvägagångssätt är särskilt relevant för mätning av fosfonotio-proteiner, som kan ha en kort halveringstid för att möjliggöra snabba förändringar i signalering som svar på stimuli från omgivningen. Vissa fosforylerade proteiner är extremt labila, troligen till följd av komplexbildning med fosfataser. För robust och konsekvent detektering av dessa fosforylerade proteiner, kan det också vara möjligt att behandla cellerna med pervanadat, en irreversibel protein-tyrosin-fosfatas-inhibitor 6, för att stabilisera den fosfo-protein före preparation av helcellslysat.
Tillbestämma huruvida biokemisk aktivitet resulterar i anti-tumöreffekter, kan riktberoende biologiska processer övervakas i cellbaserade försök. För leukemicellinjer, kan anti-leukemia aktivitet förmedlas av TKI bedömas med hjälp av kolonibildningsanalyser utförda i metylcellulosa eller mjuk agar 7. Mjuk agar kan vara att föredra eftersom detta är ett fast medium som är mer mottaglig för manipulation, om upprepad behandling med en TKI är nödvändig. Medan många akuta myloid leukemi (AML)-cellinjer kommer att bilda kolonier i mjuk agar, kommer de flesta ALLA cellinjer endast bilda kolonier i metylcellulosa, som är ett halvfast medium. Fastän det är möjligt att uppdatera medellång och / eller TKI i metylcellulosa kulturer, kan endast små volymer att användas och med begränsad frekvens. På samma sätt är det svårare att färga kolonier utan att störa dem i metylcellulosa. Preliminära studier bör definiera förmågan hos lämpliga cellinjer för att bilda kolonier i metylcellulosa och / eller mjuk agar och tHan optimal täthet av celler i odling så att kolonier är icke-överlappande och i tillräckligt antal för att få statistiskt relevanta uppgifter (vanligen 50 till 200 kolonier per 35 mm platta).
Även om in vitro analyser är robusta och kostnadseffektiva, och har färre etiska implikationer än hela djurförsök, utveckling av terapeutiska föreningar kräver bevis på effekt och säkerhet i djurmodeller. För in vivo-studier kan akuta leukemicellinjer skall ortotopiskt transplanteras in NOD.Cg-Prkdc scid jag l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) möss och TKI lätt kan administreras genom injektion eller oral sondmatning. Vissa cellinjer kan kräva exponering av NSG möss till en låg cellinje-beroende dos av strålning för att xenotransplantat att fastställa, och i detta fall möss kan inte tolerera oral sondmatning utan en 5-10 dagars återhämtningsperiod efter bestrålning. Detta manuskript beskriver generering av B-ALL och T-ALL xenografts använderspecifika cellinjer (697 och Jurkat) som exempel men xenografter kan fastställas i NSG möss med hjälp av en mängd olika cellinjer. I händelse av att andra cellinjer är mer tillämpliga, kravet för bestrålning, optimala antalet celler för transplantation, och tidpunkten för sjukdomens uppkomst och progression bör bestämmas experimentellt. Helst ska dessa modeller har fullständig penetrans (varje djur transplanteras utvecklar leukemi), konsekventa kinetik (leukemi fortskrider på samma sätt i alla djur), och en rimlig fönster behandling (helst 20-30 dagar mellan påbörjad behandling och avlägsnande från studien på grund av sjukdom) . Antalet celler transplanterade kan ökas för att förbättra penetrans och kinetisk konsistens eller minskas för att förbättra behandlingsfönstret vid behov.
För att avgöra om TKI medla mål hämning in vivo, tas blodprov från möss med leukemi xenografter efter behandling med TKI eller bara fordon. Helst dosen end administreringsschema för dessa experiment styrs av farmakokinetiska studier, som ofta kan utföras av kommersiella laboratorier och ligger utanför ramen för denna artikel. Om farmakokinetiska data finns tillgängliga, kan koncentrationen av föreningen som krävs för en effektiv mål-hämning i cellkultur och den maximala koncentrationen i serum efter en engångsdos av TKI användas för att definiera en startdos för djurstudier. Farmakokinetiska studier kan också informera tidpunkten för provinsamling efterbehandling för farmakodynamiska studier och administrationsvägen. Hämning av målet kan bedömas i alla drabbade organ men vävnader som är lättast att samlas in och behandlas är att föredra. Mest akut leukemi cellinjer etablera i lever, benmärg, mjälte, perifert blod, och det centrala nervsystemet, även om de särskilda organ som påverkas och omfattningen av engraftment i dessa organ varierar mellan modellerna. Protokollet presenteras här bedömer fosfo-protein inhibition i benmärg med hjälp av Western blot-analys, men fasta organ kan vara lättare att konsekvent skörda och kräver minimal eller ingen behandling före frysning, vilket gör att mindre möjlighet till nedbrytning av fosfonotio-proteiner under insamling och bearbetning prov. Immunohistokemi kan också användas för att utvärdera solida tumörer eller organ som drabbats av leukemi.
Slutligen är den terapeutiska effektiviteten av TKI (er) bestämmas i orthotopic leukemi xenograft-modeller. För dessa studier, kan tidpunkten för behandlingsstart varieras, så att sjukdomen är mer eller mindre etablerade. Behandlingen kan påbörjas omedelbart efter transplantation för inledande studier och därefter fördröjas i senare studier tills börda betydande sjukdomen upptäcks att närmare approximera ett diagnostiskt behandlingsmodell. Helst dessa djurmodeller har också kapacitet för icke-invasiv mätning av sjukdomsbördan. Vi har optimerat metoder för införande av eldfluga luciferase gen i leukemicellinjer använder virusliknande partiklar, vilket möjliggör icke-invasiv, longitudinell analys av sjukdoms uppkomsten och utvecklingen och bedömning av sjukdomsbördan i benmärgen och fasta organ. Kritiskt för detta tillvägagångssätt är användningen av monoklonala luciferas-taggade cellinjer för att förhindra variationer i utvecklingen av luciferas-uttryckande leukemi i samband med användning av polyklonala cellinjer och har inget samband med behandling med en TKI 8.
Sammantaget kan dessa steg kan användas för utvärdering av en enda TKI eller för direkt jämförelse och rangordning av flera TKI. Medan de protokoll som presenteras här fokuserar på utveckling av TKI, kan dessa metoder anpassas till andra mål och överväganden för analysutveckling beskrivs. Således kan denna strategi vara mer allmänt tillämpas på preklinisk utvärdering av molekylärt inriktade medel för behandling av akut leukemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
