Summary
Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.
Abstract
Rezeptortyrosinkinasen sind bei der Entwicklung und Progression von vielen Krebsarten, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren in Verbindung gebracht und sind attraktiv druggable therapeutische Ziele. Hier beschreiben wir eine effiziente Vier-Schritte-Strategie für die präklinische Bewertung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) in der Behandlung der akuten Leukämie. Zunächst wird Western-Blot-Analyse verwendet, um die Ziel Inhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Die funktionelle Aktivität wird dann unter Verwendung klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Kulturen untersucht. Experimentelle Verbindungen, die Aktivität in Zellkulturassays zeigen, werden in vivo mit NOD-SCID-gamma (NSG) orthotop Mäusen mit menschlichen Leukämie-Zelllinien transplantiert ausgewertet. Erste In-vivo-Studien bewerten pharmakodynamische Zielhemmung in leukämischen Blasten aus dem Knochenmark isoliert. Dieser Ansatz wird verwendet, um die Dosis und Verabreichungsschema für eine effektive Zielsperre notwendig festzustellen,ion. Nachfolgende Studien bewerten die Wirksamkeit der TKI in vivo unter Verwendung von Luciferase exprimierenden Leukämiezellen, wodurch eine nicht-invasive Überwachung des Biolumineszenz Leukämie Belastung und Beurteilung der therapeutischen Reaktion unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. Diese Strategie wurde in vitro und in vivo wirksam war zur Bewertung der TKI und kann zur Identifizierung von molekular gezielte Wirkstoffe mit therapeutischem Potential oder zum direkten Vergleich und Priorisierung von mehreren Verbindungen eingesetzt werden.
Introduction
Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern 1,2. Die Gesamtüberlebensrate für Kinder-B-Zelllinien-ALL (B-ALL) ist etwa 85%, aber spezifische biologische Subtypen, darunter T-Zelllinien-ALL (T-ALL), haben immer noch schlechtere Prognose auch mit den aktuellen Therapieprotokolle. Die weitere Behandlung des rezidivierten ALL bleibt eine Herausforderung 3. Obwohl die Mehrheit der erwachsenen Patienten mit akuter Leukämie eine Remission zu erreichen mit Up-Front-Chemotherapie leiden viele Patienten immer noch 4 Rückfall. Strom Chemotherapien bei der Behandlung von akuter Leukämie bekannt, um Toxizität assoziierten kurz-und langfristige Nebenwirkungen verursachen. Daher werden weniger toxische Therapien, die spezifisch auf Krebszellen mit minimaler Wirkung auf normales Gewebe stark benötigt. In den letzten Jahren wurde der Schwerpunkt auf der Entwicklung von neuen, molekular gezielte Wirkstoffe mit Spezifität für Krebszellen oft unter Verwendung von iterativen Chemie platziertmehrere Wirkstoffe, die dann verglichen und priorisiert werden müssen 5 zu erzeugen. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung der TKI für die Behandlung von akuter Leukämie, die für die Bewertung einer einzigen Verbindung oder zur direkten Vergleich mehrerer Verbindungen, um die Medikamentenentwicklung zu erleichtern verwendet werden kann.
Die hier vorgestellten Verfahren besteht aus vier Schritten. Die erste biochemische (1) und Anti-Leukämie-(2)-Aktivitäten der Verbindung (en) sind in der Zellkultur untersucht, dann die Hemmung des Targets in Tiermodellen (3) bestätigt, und schließlich therapeutische Wirksamkeit des TKI (en) (4) in orthotopen Leukämie Xenotransplantatmodellen bestimmt. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, relevante Zelllinien, die Vertreter der häufigsten biologischen Subtypen wählen. Zelllinien gewählt werden, die beide, ausdrücklich das Ziel, Interesse und fehlt das Ziel von Interesse, zu untersuchen, ob biologische Wirkungen med. sinddurch Hemmung der Ziel iated. Dies ist für die Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren, die Nebeneffekte, die für Anti-Tumor-Aktivität können besonders relevant. Es ist auch notwendig, um eine Zelllinie, die von der Ziel-zur funktionellen Wirkungen wie Proliferation oder Überleben zu wählen. Vorläufige Zielvalidierungsstudien (außerhalb des Umfangs dieses Artikels) mittels RNA-Interferenz-oder anderen spezifischen Mittel, um das Ziel zu hemmen, kann verwendet werden, um zielabhängigen Zelllinien zu identifizieren. Es ist auch wünschenswert, um Zelllinien, Maus-Xenotransplantaten, so daß Zellkulturergebnisse können mehr direkt übersetzt in in vivo Experimenten bilden können wählen.
Zur Bewertung der biochemischen Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt wird, kann eine Abnahme der Rezeptor-Phosphorylierung als Indikator der Hemmung Ziel verwendet werden. Western-Blot-Analyse oder ELISA-Assays können verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit und Spezifität von Antikörpern.Wenn Antikörper mit ausreichender Spezifität für das Ziel verfügbar sind, sind ELISA-Assays bevorzugt, da sie mehr quantitative und effizient sind. In Fällen, in denen Antikörper mit ausreichender Spezifität für ELISA nicht verfügbar sind, können Western-Blot-Analyse erforderlich sein. In diesem Fall kann die Immunpräzipitation von einer großen Menge an Lysat nützlich für die Detektion von Zielen, die in geringer Menge sind sein. Dieser Ansatz ist für die Messung von Phospho-Proteine, die eine kurze Halbwertszeit haben können, für schnelle Änderungen in der Signal in Reaktion auf Umweltreize ermöglichen besonders relevant. Einige phosphorylierte Proteine sind extrem labil, wahrscheinlich als Ergebnis der Komplexbildung mit Phosphatasen. Für robuste und konsistente Detektion dieser phosphorylierten Proteine kann es auch möglich sein, Zellen mit Pervanadat eine irreversible Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor 6 behandelt, um das Phospho-Protein vor der Herstellung ganzer Zellysate stabilisieren.
Zubestimmen, ob biochemische Aktivität ergibt Antitumorwirkungen können zielabhängigen biologischen Prozesse in Zell-basierten Experimenten beobachtet werden. Für Leukämie-Zelllinien, kann Anti-Leukämie-Aktivität durch TKI vermittelt mit Koloniebildungstests in Methylcellulose oder Soft-Agar-7 durchgeführt beurteilt werden. Weichagar kann bevorzugt sein, da dies ein festes Medium, das eher für die Manipulation wenn wiederholte Behandlung mit TKI erforderlich ist. Während viele akute myloid Leukämie (AML) Zelllinien Kolonien in Soft-Agar zu bilden, werden die meisten ALLE Zelllinien nur bilden Kolonien in Methylcellulose, die ein halbfestes Medium ist. Obwohl es möglich ist, mittel-und / oder Methylcellulose in TKIs Kulturen zu aktualisieren, kann nur kleine Mengen verwendet und mit begrenzten Frequenz werden. Ebenso ist es schwieriger, in Methylcellulose-Kolonien ohne Unterbrechung färben. Vorläufige Studien sollte die Fähigkeit von geeigneten Zelllinien, Kolonien in Methylcellulose und / oder Soft-Agar-und T-Form zu definierener optimale Dichte von Zellen in Kultur, so dass Kolonien sich nicht überlappen und in ausreichender Anzahl, um statistisch (üblicherweise 50-200 Kolonien pro 35 mm-Platte) erhalten relevanten Daten.
Während in-vitro-Assays sind robust und kostengünstig, und haben weniger ethischen Implikationen als ganze Tierversuche, Weiterentwicklung der therapeutischen Verbindungen erfordert Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen. Für die in vivo-Studien können menschliche akuten Leukämie-Zelllinien in orthotop NOD.Cg-Prkdc SCID transplantiert werden ich l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) Mäuse und TKI kann leicht durch Injektion oder orale Gabe verabreicht werden. Einige Zelllinien kann die Exposition von Mäusen NSG auf eine niedrige Zelllinie abhängige Dosis der Strahlung, um festzustellen, für Heterotransplantate erfordern, und in diesem Fall Mäuse können nicht tolerieren, ohne orale Gabe 5-10 Tage Erholungszeit nach der Bestrahlung. Dieses Manuskript beschreibt Generation der B-ALL und T-ALL-Heterotransplantate mitspezifische Zelllinien (697 und Jurkat) als Beispiele aber Xenotransplantaten in Mäusen NSG Verwendung einer großen Vielzahl von Zelllinien etabliert werden. In dem Fall, dass andere Zelllinien sind falls die Anforderung für die Bestrahlung, die optimale Anzahl von Zellen zu verpflanzen, und den Zeitpunkt der Entstehung und Progression Krankheit sollte experimentell bestimmt werden. Im Idealfall werden diese Modelle vollständiger Penetranz (jedes Tier transplantiert entwickelt Leukämie), konsistente Kinetik (Leukämie schreitet ähnlich bei allen Tieren) und eine angemessene Behandlungsfenster (idealerweise 20 bis 30 Tage zwischen Beginn der Behandlung und Entfernung aus der Studie aufgrund von Krankheit) haben . Die Anzahl der Zellen transplantiert erhöht werden, um kinetische Penetranz und Konsistenz zu verbessern oder verringert, um das Behandlungsfenster bei Bedarf zu verbessern.
Zu bestimmen, ob TKI vermitteln Ziel-Hemmung in vivo werden die Proben von Mäusen mit Leukämie Xenotransplantaten nach der Behandlung mit TKI oder nur Fahrzeug gesammelt. Idealerweise sollte die Dosis eind Zeitplan der Verwaltung für diese Experimente werden von pharmakokinetischen Studien, die oft von kommerziellen Labors durchgeführt und sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels geführt werden kann. Wenn pharmakokinetischen Daten verfügbar sind, kann die Konzentration der Verbindung für eine effektive Ziel Hemmung in der Zellkultur und die maximale Konzentration im Serum nach einer Einzeldosis von TKI erforderlich verwendet, um eine Anfangsdosis für Tierversuche zu definieren. Pharmakokinetischen Studien können auch den Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Behandlung informieren pharmakokinetische Studien und die Art der Verabreichung. Inhibition des Ziels in jeder betroffenen Organs bewertet werden, aber die meisten Gewebe, die leicht erhoben und verarbeitet werden, sind bevorzugt. Die meisten akuten Leukämie-Zelllinien zu etablieren in der Leber, Knochenmark, der Milz, dem peripheren Blut und dem Zentralnervensystem, obwohl die spezifischen Organe betroffen und das Ausmaß der Transplantation dieser Organe variiert zwischen den Modellen. Die hier vorgestellte Protokoll beurteilt phospho-Protein-Hemmung im Knochenmark mittels Western Blot-Analyse, aber soliden Organen kann einfacher sein, konsequent ernten und benötigen nur minimale oder keine Verarbeitung vor dem Einfrieren, so dass weniger Gelegenheit für den Abbau von Phosphor-Proteine während der Probensammlung und-verarbeitung. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um solide Tumoren oder Organe von Leukämie betroffen bewerten.
Schließlich wird die therapeutische Wirksamkeit des TKI (s) in orthotopen Leukämie-Xenograft-Modellen bestimmt. Aus diesen Untersuchungen kann der Zeitpunkt der Einleitung der Behandlung variiert werden, so dass Krankheit mehr oder weniger festgelegt. Die Behandlung kann unmittelbar nach der Transplantation für die ersten Studien beginnen und dann in nachfolgenden Studien verzögert, bis erhebliche Krankheitslast erkannt wird, um eine Diagnosebehandlungsmodell genauer anzunähern. Idealerweise haben diese Tiermodellen auch die Fähigkeit zur nicht-invasiven Messung der Krankheitsbelastung. Wir haben Verfahren für die Einführung der Firefly Lucifer optimiertase-Gen in Leukämie-Zelllinien mit Virus-ähnlichen Partikeln, so dass für nicht-invasive, Längsschnittanalyse der Krankheitsbeginn und Verlauf und Beurteilung der Krankheitslast im Knochenmark und soliden Organen. Entscheidend für diesen Ansatz ist die Verwendung von Luciferase-markierte monoklonale Zelllinien, um die Variabilität in der Entwicklung von Luciferase-exprimierenden Leukämie mit der Verwendung von polyklonalen Zellinien assoziiert zu verhindern, und ist nicht abhängig von der Behandlung mit einem TKI 8.
Zusammengenommen können diese Schritte für die Bewertung eines einzelnen TKI oder zum direkten Vergleich und Einstufung der mehreren TKIs verwendet werden. Während die Protokolle hier vorgestellt werden, zielen auf die Entwicklung von TKI, können diese Methoden, um andere Ziele angepasst werden und Überlegungen für die Assay-Entwicklung beschrieben. Somit kann diese Strategie im weiteren Sinne der präklinischen Bewertung von molekular gezielte Wirkstoffe anwendbar zur Behandlung von akuter Leukämie.
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Protocol
Alle Experimente mit Tieren folgten die von der Universität von Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt regulatorischen Standards. Die nachgewiesene Protokoll wurde von der University of Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Phospho-Protein-Western Blot
- Herstellung von Lysaten
- Kulturzelllinien, die den Rezeptor-Tyrosin-Kinase von Interesse exprimieren. Ernten der Zellen und die Platte 3-5 x 10 6 Zellen / Probe in 400 &mgr; l Wachstumsmedium in einer 48-Well-Gewebekulturschale. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2-3 Stunden.
- 100 l 5x TKI Lösung in Wachstumsmedium und Inkubation für 60 min.
- Vorbereitung Lysepuffer mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) Glycerin, 1% (v / v) Triton X-100 und Protease-Inhibitoren. Wenn Kulturen wird nicht mit Pervanadat vor der Ernte behandelt werden, fügen Phosphatase-Inhibitoren (1 mM Natrium orthovanadate und 0,1 mM Natriummolybdat) mit Lysepuffer.
- Bereiten Pervanadat (PV)-Phosphatase-Inhibitor-Lösung unmittelbar vor Gebrauch. Vorbereitung einer 0,3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (VORSICHT) in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem dunklen Röhrchen auf Eis (1:100 Verdünnung einer 30% Stammlösung). Kochen Sie ein Aliquot von 0,2 M Natriumorthovanadat (OV, VORSICHT) stock-Lösung für 5 min. 1:10 verdünnt in PBS auf 20 mM OV Lösung bei Raumtemperatur (RT) zu machen. Mischungs 0,3% Wasserstoffperoxid und 20 mM OV 1:1 und Inkubieren im Dunkeln bei RT für 20 min.
- Verdünnen PV in Vollmedium (60 ul PV + 940 ul Medium). 100 l verdünnt PV / gut. Bei 37 ° C in 5% CO 2 für 3 min und dann legen Platte auf Eis.
- Ernte der Zellen in kaltem Mikrozentrifugenröhrchen bei 2500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes und resuspendieren Zellen in 120 ul Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 15 min. Klären Sie das Lysat in einem kalten Mikrozentrifuge bei 6.000 rpm für 3 min. Übertragen supernatant zu einem frischen kalten Röhre. Bei -80 ° C
- Immunpräzipitation
- Spin down Protein G Sepharose-Kügelchen in Mikrozentrifuge bei 1.000 rpm für 1 min. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 1 ml kaltem PBS. Hinzufügen eines gleichen Volumens an PBS, um eine 50% ige Aufschlämmung zu machen. In primären Antikörper und 20 ul 50% Protein G-Kügelchen zu jeder Probe. Inkubation für 2 Stunden - O / N bei 4 ° C auf einem Rotator.
- Impuls nach unten Perlen in einem kalten Mikrozentrifuge bei 9.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 150 ul kaltem Lysepuffer. Spin in kalten Mikrozentrifuge bei 1.000 Upm für 1 min. Überstand entfernen und Pellet erneut in 20 ul 2X SDS Probenpuffer mit 2-Mercaptoethanol (VORSICHT). Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C
- Kochen Sie die Proben für 5 min und laufen auf einem SDS-PAGE-Tris-Glycin-Gel. Übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran und erkennen Phospho-Protein durch Western-Blot.
- Spülen Blot mit Wasser und dann inkubieren in 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-Mercaptoethanol (VORSICHT) für 30 min bei 50 ° C. 2x Spülen mit Wasser und dann für 60-90 min waschen in 5-6 Änderungen der TBS-T-Lösung zu entfernen Strippen.
- Erkennen Gesamt-Protein durch Western-Blot.
2. Methylcellulose-Assay
- Aliquot 4 ml Methylcellulose menschlichen Basismedium in 50 ml konische Röhrchen mit einem sterilen große Bohrung stumpfen Ende Nadel. (Hinweis:. Methylcellulose kann aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden Tauwetter bei RT O / N vor der Verwendung)
- Gib 500 ul 10x-TKI oder ein Fahrzeug in einem Wachstumsmedium zu 4 ml Methylcellulose und Wirbelmischung für 10 sek.
- Ernte-und Zählerzellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 10-fach höher als die endgültige Zellkonzentration ist. In 500 ul Zellsuspension auf Methylcellulose-Mischung. Vortex für 10 Sekunden und lassen Sie sich für 10 Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
- Zeichnen bis 4 ml Methylcellulose Mischung mit einer 5-ml-Spritze und sterile größe Bohrung stumpfen Ende Nadel. Vermeiden Sie die Erstellung Blasen. Verzichtet werden 1 ml der Methylcellulose-Gemisch in der Mitte von drei 35 mm-Gewebekulturplatten. Schwenken Sie die Gerichte, bis der Boden vollständig mit Methylcellulose bedeckt.
- Für jede Platte Methylcellulose, bereiten ein 10 cm sterile Gewebekulturplatte mit zwei zusätzlichen 35-mm-Gewebekulturplatten mit sterilem Wasser gefüllt, um eine feuchte Umgebung zu gewährleisten. Ort Kulturen mit Wassermantel bei 37 º C in 5% CO 2 für 10-14 Tage.
- Graf Kolonien nach 1-2 Wochen. Kolonien mehr als 20 Zellen und nicht überlappend sein. Kolonien können mit einem inversen Mikroskop mit einem Mikroskoptisch ausgestattet mit einem Gitter oder mit Hilfe eines automatisierten Kolonie gezählt werden. Änderungen der Kolonie-Morphologie oder in Reaktion auf die Behandlung mit TKI auch ausgewertet werden. Um der Entdeckung durch Koloniezähler, Fleck Kolonien verbessern, indem 60-100 ul (3 - (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-Diphenyl-2H-tetrazoliumbromid Solution (MTT, 5 mg / ml in H 2 O, Lagerung bei -20 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT) tropfenweise über die Oberfläche jeder Platte und Inkubation für 8 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
3. Soft-Agar-Assay
- Bereiten 1% Agar für edle Bodenschicht, 0,7% Agar für edle Deckschicht und 2x Wachstumsmedium. Ins Gleichgewicht 2x Wachstumsmedium in einem 42 ° C Wasserbad. Heat 1% und 0,7% Agar edel in der Mikrowelle (ca. 1 min/100 ml) und ins Gleichgewicht in einem 42 ° C Wasserbad. Mix gleichen Teilen von 1% Agar und 2x mittel-und separat 0,7% Agar und 2x 50 ml Medium in Schrägen. Plan 10 ml Soft-Agar-Mischung / sechs-Well-Platte für jede Schicht.
- Label 6-Well-Gewebekulturplatten. Füllen Sie jedes Well mit 1,5 ml 1% Soft-Agar-Mischung. Vermeiden Sie während der Beschichtung Blasen. Dry Platten mit Deckel weg in sterile Haube für 30 min.
- Zählen von Zellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 500-fache höher als die letzte Zelle ist concentratiauf. In Zellsuspension auf 0,7% Agar-Mischung, gut mischen und dosieren 1,5 ml des Agar Zellgemisch auf der Oberseite der 1%-Agar-Schicht. Lassen Sie die obere Schicht erstarren für 30 min.
- Bereiten 1x Wachstumsmedium TKI-oder Fahrzeugsteuer enthält. 2 ml Medium mit der gewünschten Konzentration von TKI auf dem Top-Agar-Schicht.
- Kulturen für 10 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Entfernen und die Überlagerung Medium ersetzen alle 3 Tage.
- Wenn Kolonien mit bloßem Auge überlagert Medium absaugen und mit 200 ul Nitro-Tetrazolium-Blau-Lösung (1 mg / ml NBT in H 2 O, Lagerung bei 4 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT). Zurück zum Inkubator für 24-48 Std. Bewegen, um 4 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Zählen. Gefärbten Platten können bei 4 º C für einen Monat gelagert werden. Graf Kolonien mit einem Mikroskop oder einem automatisierten Koloniezähler.
4. Auswertung der Phospho-Protein-Hemmung in vivo
- Sammeln cEllen wächst in der log-Phase durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 1500 Upm für 5 min. Waschen der Zellen einmal mit sterilem PBS und Resuspendieren in PBS in einer geeigneten Konzentration (typischerweise 1-5 × 10 7 Zellen / ml). Transplantationszellen in einem Volumen von 100 ul in 6-12 Wochen alte NSG Mäusen durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene unter Verwendung einer 28 G-Insulinspritze. Legen Sie das Tier in einem Restrainer, heizen den Schwanz in einen Becher mit warmem Wasser, um die Venen erweitern sich, und reinigen Sie den Schwanz mit einem Chlorhexidin-Tupfer vor der Injektion. Nach der Injektion Druck auf die Injektionsstelle mit steriler Gaze, bis die Blutung aufhört. Transplant mindestens 3 Tiere / Gruppe. Pflegen Sie die Mäuse auf dem Wasser mit 1 mg / ml Gentamycinsulfat.
- Vierzehn Tage nach der Transplantation zu behandeln Tiere mit TKI oder Fahrzeug nur und Ernteproben für die Analyse von Ziel-Hemmung. Wiegen Tiere und behandeln mit einer angemessenen Dosis (mg / kg Körpergewicht) oder TKI Fahrzeugs. Verabreichen Behandlung in einem Volumen von 5 ml / kg Körpergewicht durch intraperitoneale (ip) Injektion oder 10 ml / kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung. Für ip-Injektion, zurückhalten mit der Maus manuell und injizieren in der rechten unteren Quadranten des Bauches mit einer 29 G-Nadel. Für orale Gabe, beschränken Sie die Maus manuell und halten das Tier aufrecht. Legen Sie die Magensonde Rohr in den Mund über die Zunge und in den hinteren Teil des Mundes. Drücken Sie leicht auf den Schlauch durch die Speiseröhre in den Magen passieren. Drücken Sie den Spritzenkolben, die Behandlung zu verabreichen. Wenn der Kolben nicht leicht drücken die Sondennadel sollte entfernt und neu positioniert werden. Bereiten TKI Formulierungen unmittelbar vor der Verwendung.
- Wenn Pervanadat Behandlung gewünscht, bereiten PV-Lösung 20 min vor der Ernte, wie oben (Schritt 1.1.4) beschrieben und in Medium verdünnt mit 1 uM MgCl 2 und 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul Medium). Hinweis: PV für mindestens 1 h nach der Verdünnung stabil.
- Sacrifice Tiere durch CO 2-Narkose an der apchenden Zeit (en) nach der Behandlung. Dissect Oberschenkelknochen durch Entfernen Fell, Haut und Muskeln aus dem gesamten Bein, so dass die Knochen vollständig ausgesetzt. Entfernen der Oberschenkelknochen von Clipping mit Dissektionsscheren knapp unter dem Hüftgelenk wieder oberhalb des Kniegelenks. Überweisung in eine Petrischale und bündig Knochenmark mit 1 ml kaltem PBS verdünnt oder PV-Lösung mit einer Spritze und einer 27 G-Nadel. Wenn die Behandlung mit PV, Inkubation bei RT im Dunkeln für 10 min.
- Bereiten Lysaten und zu analysieren, Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt wie oben (1.1.6-1.2.5 Schritte) angezeigt.
- Quantifizieren relativ Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt für jede Probe mit Densitometrie. Phospho-protein/total-protein relativ zu berechnen, um den durchschnittlichen Wert für phospho-protein/total-protein Vehikel-behandelten Tieren.
5. Evaluation der Anti-Leukämie-Aktivität von TKI in ALLEN Xenograft Modelle
- Falls notwendig, setzen Mäuse auf 200 cGy von Strahlung in einem RS-2000-Strahler Prio 1 Tagr zu verpflanzen. Transplant-Mäusen mit Leukämie-Zelllinien, wie oben (Schritt 4.1) beschrieben. Transplant mindestens 6 Mäuse pro Gruppe. Identifizieren von Ohrstanzmäuse. Alternativ kann eine schwarze Markierung verwendet, um Mäuse mit Hash-Zeichen auf ihren Schwänzen zu identifizieren. In Bereicherung in Käfige, um das Potenzial für Käfigkollegen Aggression während der Studie zu reduzieren.
- Gönnen Mäuse mit einem TKI oder Fahrzeug nur wie oben (Schritt 4.2) beschrieben. Überwachung des Gesundheitsstatus der Mäuse täglich über körperliche Untersuchung und Gewichtsbestimmung. Erwartete Symptome der Leukämie (reduzierte Aktivität, Gewichtsverlust, Lähmung der hinteren Gliedmaßen und Augeninfektionen). Gewichtsverlust von mehr als 10% -15% wird in der Regel mit dem Tod der Maus innerhalb von zwei Tagen verbunden und ist typischerweise ein Surrogatendpunkt für Tod in Übereinstimmung mit der Norm IACUC Anforderungen.
- Überwachung der Transplantation und die Entwicklung von Leukämie über eine in-vivo-Biolumineszenz-Imaging-System bis zu 2x wöchentlich. Bereiten Sie eine 200x-D-Luciferin-Stammlösung (30 mg / ml) in Sterile Wasser. Vorsichtig mischen durch Umdrehen, bis D-Luciferin vollständig gelöst ist. Verwenden Sie unverzüglich, aliquotieren und bei -20 ° C. Vor der Bilderzeugung unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem, auftauen Aliquots von D-Luciferin bei RT und verdünnt 1:2 PBS auf eine Endkonzentration von durch einen 0,2 &mgr; m-Filter 15 mg / ml und Filter-Sterilisieren.
- Anesthetize die Mäuse vor der Bildgebung mit 1,5% Isofluran in Sauerstoff eingeatmet. Überwachen ausreichende Anästhesie, dadurch gekennzeichnet, Muskelentspannung, Bewegungsverlust und Verlust der Reaktion auf Zehenklemm Stimulation.
- Unmittelbar vor der Bildgebung zu verabreichen 150 mg / kg Körpergewicht D-Luciferin durch ip-Injektion (10 ul 15 mg / ml Luciferin / g Körpergewicht).
- Verwenden Sie eine in-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung System zu 2 Serie von Bildern mit sequentieller 30, 60 und 90 Sekunden Belichtungen und einer abschließenden Bild mit einem 120 Sekunden Belichtung fotografieren. Nach der Bebilderung zurück Mäuse in Käfige und Monitor für Erholung von der Narkose. Je nach derIntensität der Biolumineszenz können Belichtungszeiten variiert werden. Optimale Belichtungszeit sollte für ein bestimmtes Modell vorbestimmt und konsistent gehalten, so dass die Signalintensitäten für einzelne Zeitpunkte sind in der gesamten Studie vergleichbar.
- Bestimmen Sie Biolumineszenz Intensität für jede Maus mit Wohnzimmer Bild 3.2 Erfassung und Analyse-Software. Bestimmen Sie, in Photonen / gemessene Gesamtflusswerte zweiten, indem Regionen von Interesse (ROI) gleicher Größe über jede Maus.
- Opfern Mäuse durch CO 2-Exposition und zervikale Dislokation wenn moribund, aufweist Lähmung, bei mehr als 15% Gewichtsverlust, oder am Ende der Studie. Dissect Mäusen und Rekord Beobachtungen (z. B. Erweiterung der Milz, Leber oder Lymphknoten, blasse Knochenmark). Dissect Oberschenkelknochen und bündig Knochenmark mit kaltem PBS mit einer 27 G-Nadel.
- Sammeln Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 2.500 Upm für 5 min. Die Zellen in PBS, enthaltend 2% FBS und Inkubation für 5 min bei RT.Zellen sammeln und Fleck mit 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid, 1:1000) und FITC-konjugiertem α-hCD45 (1:100) oder Maus-IgG 1-Isotyp-Kontroll-Antikörper (1:100) . Bewerten Leukämie Transplantation mit Durchflusszytometrie. Tor auf der lebensfähige Population (DAPI negativ) und bestimmen Prozentsatz der CD45 +-Zellen (% Blasten im Knochenmark).
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Representative Results
Die hier vorgestellten Untersuchungen bewertet die biochemischen und funktionellen Wirkungen von TKI vermittelt und kann verwendet werden, um neue Verbindungen, basierend auf dem Grad der Ziel Inhibierung in vitro und in vivo werden einstuft, Reduktion der Koloniebildung und Verzögerung Leukämogenese NSG in Mäusen mit Luciferase-transplantierten getaggt Leukämiezellen.
Immunoblot-Analyse wurde verwendet, um die Hemmung der aktiven phosphorylierten Form des Zielproteins in Leukämie-Zellen nach Behandlung mit TKI bestimmen. Behandlung mit TKI führte zu einer dosisabhängigen Abnahme in der Menge des phosphorylierten Proteins. Fig. 1 zeigt die Hemmung der Phosphorylierung von Ziel drei TKI in einer akuten Leukämie-Zelllinie mit TKI C die stärkste TKI B weniger potent und TKI A keine Wirkung. Somit ermöglicht dieser Test Ranking von Verbindungen auf der Basis der Potenz biochemische Aktivität in einem zellbasierten Modellsystem. Bei den in den gezeigten BeispielenFig. 1 Anreicherung von Antigen durch Immunopräzipitation und die Verwendung des Phosphatase-Inhibitors Pervanadat waren notwendig, um interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. Grund dafür könnte sein, dass die Protein-Phosphorylierung des Tyrosin-Kinase ist extrem labil.
Um die Wirkung der TKI auf onkogene Eigenschaften der akuten Leukämie-Zellen zu untersuchen, wurden Koloniebildungstests verwendet. Wir untersuchten die Fähigkeit der zielabhängigen Leukämiezellen, Kolonien in Methylcellulose-Basis (ALL) in Mittel-und Soft-Agar (AML) zu bilden. Bei der in Fig. 2A, eine statistisch signifikante Reduktion der Koloniezahl gezeigten Beispiel wurde in einem ALL-Zelllinie nach Behandlung mit einem TKI beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden bei AML-Zelllinien nach Behandlung mit TKI in Soft-Agar beobachtet. In 2B gibt es einen Trend hin zu verminderter Koloniezahl in Reaktion auf die Behandlung mit TKI und die Abnahme wird dosisabhängig, aber der Unterschied ist nicht statistically Bedeutung als Ergebnis der Variabilität zwischen den Wiederholungen. Beachten Sie die großen Standardfehler in 2B Bezug auf 2A. Genügend Mischen der Zellen in den halbfesten Medium und gleichmäßige Verteilung des halbfesten Medium in die Vertiefungen oder Platten ist für die Kohärenz zwischen den Wiederholungen in klonogenen Assays. Genaue Zählung der lebensfähigen Zellen vor dem Plattieren ist auch wichtig, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten. 2C zeigt eine Platte mit einer ungleichmäßigen Verteilung von Kolonien, Blasen in dem weichen Agar und unvollständige Verteilung des Weichagar in der Platte (rechts) und eine Platte mit ausreichender Beschichtung zum Vergleich (links). Um sicherzustellen, daß die Methylcellulose nicht während der Inkubationszeit trocken ist es auch wichtig, um Platten mit sterilem Wasser in jeder Schale umfassen. Dehydratisierung der Methylcellulose-Medium ändert seine Dichte und verringert dadurch die Fähigkeit der Zellen zur Bildung von Kolonien, potentiellVerhindern der Erzeugung von brauchbaren Ergebnissen.
Um festzustellen, ob TKIs kann das Zielprotein in vivo zu hemmen, wurde Western-Blot-Analyse eingesetzt, um Protein-und Phosphor-Gesamt-Proteinspiegel in Blasten im Knochenmark von Mäusen NSG mit einer akuten Leukämie-Zelllinie transplantiert isoliert zu untersuchen. In der in Fig. 3 gezeigten Beispiel pharmakodynamische Analyse zeigte eine Abnahme der Phospho-Proteinspiegel in Leukämiezellen von Mäusen, die mit TKI relativ zu Mäusen, die mit Vehikel allein behandelt wurden, isoliert. Diese Studien zeigen die Hemmung der Autophosphorylierung in Leukämie-Zellen nach Behandlung mit TKI in vivo, was bestätigt, dass diese Verbindungen auf das Knochenmark und wirksam hemmen vorbei. TKI D war in diesem Test weniger aktiv als E TKI. Das Beispiel zeigt, erforderlich Ausnutzung Pervanadat, um die Ziel Phospho-Protein zu stabilisieren und damit für die Erkennung.
Ein orthotopen Maus Xenograft-Modell der akuten Leukämie im NSG mice injiziert mit einem Luciferase exprimierenden allen Zelllinie wurde verwendet, um die Wirkung der Behandlung mit TKI auf onkogene Potential in vivo zu beurteilen. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, Mäuse mit TKI behandelt wurden, signifikant niedrigere Biolumineszenz, was auf eine reduzierte Leukämielast relativ zu Mäusen, die mit Vehikel allein behandelt. Nach 10 Tagen der Behandlung hatten alle Mäuse einen niedrigen Biolumineszenz, die nicht signifikant unterschiedlich zwischen Tieren und Tieren, die mit Vehikel behandelt wurden, war TKI. Im Gegensatz dazu um 19 Tage nach der Behandlung hatte Vehikel-behandelten Mäusen signifikant höhere Intensität der Biolumineszenz (86,12 ± 19,17 Photonen / sec), während Mäuse, die mit einer hohen Dosis von TKI behandelt wurden, wesentlich geringer Signalintensität (29,64 ± 9,04 Photonen / sec) .
Fig. 1 ist. TKI blockiert die Phosphorylierung des Zielproteins in vitro. Zellkulturen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von TKI A, B TKI oder TKI C für 1 h behandelt. Pervanadat wurde für 3 min auf Zellkulturen zugegeben, um die phosphorylierte Form des Zielproteins stabilisieren. Das Zielprotein wurde aus Zelllysaten immunpräzipitiert und Phospho-Protein-und Protein-Gesamt wurden durch Western-Blot nachgewiesen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. TKI reduziert Koloniebildung in akuter Leukämie-Zellinien in Soft-Agar und Methylcellulose. Alle Zellen wurden in Methylcellulose (A) und AML-Zellen wurden plattiert in s plattiertoft Agar (B) in Gegenwart eines TKI oder DMSO (Vehikel-Kontrolle). Kolonien wurden nach 2 Wochen in Kultur gezählt. Mittelwerte und Standardfehler wurden aus Dreifachplatten abgeleitet. (C) Vertreter Soft-Agar-Platten mit optimalen Verteilung der Kolonien (links) oder ungleiche Verteilung der Kolonien und einer teilweise freistehende Soft-Agar (rechts) gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Die Behandlung mit TKI reduziert Phospho-Protein-Spiegel in vivo. Eine NSG-Mäuse wurden mit einer ALL-Zelllinie transplantiert und mit einer Einzeldosis von TKI D, TKI E, oder das Fahrzeug nur nach der Entwicklung von Leukämie behandelt. Knochen marrow Zellen wurden aus den Oberschenkel gesammelt und mit Pervanadat vor der Herstellung ganzer Zellysate behandelt. Immunpräzipitation von Zielprotein und den Nachweis von Phospho-und Gesamt-Proteine durch Western-Blot durchgeführt. B Signalintensität wurde durch Densitometrie und der Anteil der phosphorylierten Zielprotein in Bezug auf Fahrzeug behandelten Tiere wurde berechnet, quantifiziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. Behandlung mit TKI verzögert Fortschreiten der Krankheit in Mäusen mit einem Luciferase exprimierenden menschlichen allen Zelllinie transplantiert. NSG-Mäuse wurden mit einem monoklonalen Population von Luciferase-transduzierte ALL-Zellen durch Injektion in die Schwanzvene transplantiertVenen. D-Luciferin intraperitoneal injiziert und Biolumineszenz-Bilder wurden zweimal wöchentlich genommen (Bining: Belichtungszeit 120 sec 8, FOV 19,6, f / stop 1,). Falschfarbenbilder zeigen erhöhte Biolumineszenz Intensität über die Zeit in Mäusen mit Leukämie-Zellen transplantiert und eine dosisabhängige Verringerung der Intensität der Biolumineszenz in Tieren mit einem TKI behandelt gezeigt. B Quantifizierung der Durchschnitts Biolumineszenz Intensität und Standardfehler für jede Lerngruppe. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Diese Handschrift beschreibt eine wirksame Strategie zur Evaluierung neuer Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung von akuter Leukämie. Mit diesem Ansatz, biochemischen und Anti-Leukämie-Aktivitäten werden zunächst in zellbasierten Assays in vitro Xenotransplantat-Modelle in vivo ausgewertet und dann. Immunoblot-Analyse wurde erfolgreich verwendet, um die Hemmung der Ziel Tyrosinkinase in Leukämiezellen nach der Behandlung mit TKI demonstrieren und direkt vergleichen die Wirksamkeit von mehreren Verbindungen in Zellen. In dem hier vorgestellten Protokoll wurde verwendet, um die Pervanadat Phospho-Protein zu stabilisieren und das Zielprotein wurde durch Immunpräzipitation engt. Wenn diese Messungen nicht ausreichen, um für die Detektion mittels Western-Blot zu ermöglichen, könnten die Niveaus von Phospho-Protein auch durch die Zugabe des Liganden erhöht werden, entweder mit oder ohne Pervanadat. Ebenso kann die Liganden an das verwendet wird, um das Knochenmark pharmakokinetische Studien Spüllösung zugegeben werden. Ligand kann gereinigt werden, oder in einigen Fällen, kann als eine Komponente von fötalem Rinderserum bereitgestellt werden. In dem Fall, dass diese Methoden nicht zur Detektion von Auto-Tyrosinkinase phosphoryliert zu ermöglichen, können auch stromabwärts Ziele für die Bewertung der Zielhemmung verwendet werden, obwohl es vorzuziehen ist, um die Aktivität des Zielproteins direkt zu beurteilen, wenn möglich. Zu beachten ist, ist Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse von Experimenten mit Pervanadat, die ein nicht-selektiver Phosphatase-Inhibitor, der vielen zellulären Proteinen beeinflusst, ist verwendet werden. Aus diesem Grund sollte Pervanadat nicht zum Nachweis von Veränderungen in nachgeschalteten Signalkomponenten verwendet werden.
Vor der Verwendung in Tiermodellen zu untersuchen, ist es wünschenswert, Anti-Leukämie-Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt bestätigen. Für diese Untersuchungen setzen wir auf klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Medium. Während andere Assays können verwendet werden, um Anti-Tumor-Wirkungen in Kultur zu beurteilen, sind Koloniebildungstests oft predictive der in vivo-Wirksamkeit relativ zu herkömmlichen Assays, die die Proliferation und / oder das Überleben in einer Flüssigkultur zu bewerten. Jedoch können diese Tests zusammen mit Koloniebildungsassays verwendet, um die Mechanismen der Anti-Leukämie-Aktivität von TKI vermittelte bewerten und kann auch nützlich sein, in dem Fall, dass eine Zelllinie von Interesse keine Kolonien bilden. Insbesondere kann es nützlich sein, die Induktion von Apoptose als Reaktion auf Behandlung mit TKI beurteilen mittels Durchflußzytometrie-Assays auf ein Niveau der gespaltenen / aktivierten Caspasen bestimmen, erhöhte Bindung von Annexin V an die Zelloberfläche oder Differenz Aufnahme YOPRO-1-iodid . Ebenso verringerte Proliferation oder Induktion der Differenzierung kann auch Anti-Leukämie-Aktivität beitragen. Als solche können Wachstumskurven in Gegenwart und Abwesenheit von TKI, um die Proliferation und Zellmorphologie und Veränderungen in der Expression von Zelloberflächenmarker untersucht, um zu bestimmen Differenzierungsstadium zu bewerten erzeugt werden. Die Verwendung von klonogenenAssays ist im Bereich der Medikamentenentwicklung gegründet und dient als kostengünstiges Werkzeug für die Bewertung der TKI. Es ist jedoch bekannt, dass systematische Veränderungen der Kulturbedingungen (einschließlich der Zugabe von Wachstumsfaktoren und andere Ergänzungen, Änderungen in Serumzusammensetzung, und Unterschiede in den pH-Wert der Lösung TKI) sowohl Koloniewachstum und Chemosensitivität 9,10 beeinflussen. Daher ist die Konsistenz der Kulturbedingungen entscheidend für die Reproduzierbarkeit in diesem Test. Ungleiche Verteilung von Zellen oder TKI kann auch auf die mischaracterization der Wirksamkeit von experimentellen Therapien (2C) führen. Neben Auswertung von mehr als einem Zeitpunkt für Koloniezählung oder Beschichtung nach der Arzneimittel Kontakt kann helfen, zwischen Drogen, die anti-proliferative Effekte vermitteln, haben aber keine heilende Potenzial 7 unterscheiden.
Die hier beschriebenen in-vivo-Studien stellen eine kritische Schritt auf dem Weg zu clinical Anwendung eines TKI. Pharmakodynamische Studien zur Ziel Hemmung zeigen, sind wichtig, um die entsprechende Dosis und Häufigkeit der Verabreichung für nachfolgende Studien zur Beurteilung der Wirksamkeit zu definieren. In den meisten Fällen ist es bevorzugt, um eine vollständige und kontinuierliche Hemmung des Zielproteins zu erreichen, und dies kann die Behandlung mehr als einmal pro Tag erfordern. Zusätzlich kann die Hemmung der Leukämogenese und erhöhte Überlebensrate in Xenograft-Modelle erfordern eine höhere Dosis von TKI als für eine vollständige und kontinuierliche biochemischen Hemmung im Knochenmark erforderlich. Dies kann auftreten, da Leukämie stellt an mehreren Stellen und der Exposition gegen TKI in unterschiedlichen anatomischen Stellen heterogen sein, einschließlich Gehirn, oder es Einschränkungen beziehen könnte in der Empfindlichkeit des Tests, was zu einem Versagen des begrenzten verbleibenden Mengen der aktiven Zielprotein zu detektieren ( dh unvollständige Zielhemmung). Dennoch, im Gegensatz zu traditionellen zytotoxische Therapien, die bei ihrer maximalen verabreicht werdentolerierte Dosis kann die weitere tumorselektive molekular gezielte Mittel gleich wirksam bei niedrigeren Dosen, die ausreichend zur biochemischen Hemmung des Zielproteins sind, aber nicht mit signifikanten Toxizitäten verbunden sind. So kann dieser Klasse von Mitteln, anfänglichen Studien, um die Wirkungen eines TKI auf Leukämie Progression in Xenograft-Modellen auszuwerten nutzen häufig die erforderlich ist, um vollständige und kontinuierliche Hemmung der Ziel erhalten minimalen Dosis. Wenn keine Auswirkungen auf Leukämie Progression oder Überleben beobachtet werden, kann die Dosis erhöht, bis die Toxizität beobachtet werden. Diese Modelle können auch verwendet werden, um die Auswirkungen eines TKI in Kombination mit Standardtherapien verabreicht Leukämie zu untersuchen, wodurch die Information der Entwicklung nachfolgende klinische Protokolle werden.
Die Einrichtung von Xenograft-Modellen der akuten Leukämie unter Verwendung von Luciferase-exprimierenden Zellen ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber herkömmlichen Xenograft-Modellen und hat das Potenzial, deutlich beschleunigender Prozess der Wirkstoffforschung und Entwicklung 11. Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht eine nicht-invasive Bestimmung der Längs Leukämie Belastung, wodurch die Anzahl der Tiere, für Studien erforderlich abnimmt, und kann auch Informationen über die anatomische Lage der Krankheit. Zusätzlich ist in dem Bemühen, den potenziellen klinischen Dienstprogramme von TKI erweitern, Biolumineszenz-Bildgebung reproduzierbar nach der Transplantation von primären humanen Luciferase-markierte 12 Patientenproben erreicht werden. Allerdings kann Auslegung der Biolumineszenz Bilder Herausforderung durch Positionsunsicherheit der Leuchtzellen und damit in vivo Biolumineszenz-Bildgebung sollte nur als Werkzeug, um die semiquantitative gleichen Tier unter identischen Bedingungen folgen 13 verwendet werden kann.
In der glücklichen Fall, dass mehrere Verbindungen haben signifikante und vergleichbare Aktivität in den hier beschriebenen Tests, zusätzliche Kriterien, die für weitere Rankin verwendet werden könneng-Verbindungen umfassen relative Leichtigkeit der Verbindung Synthese, Löslichkeit, der Grad der orale Bioverfügbarkeit, Pharmakokinetik und Toxikologie-Studien. Zusammengenommen sollten diese Daten für die Identifizierung einer optimalen Verbindung für die Progression der klinischen Untersuchung zu ermöglichen und sind notwendig, um Einreichung einer Investigational New Drug (IND)-Anwendung mit der Food and Drug Administration (FDA) zu klinischen Studien zu ermöglichen unterstützt. Nach der Erzeugung dieser kritischen präklinische Daten für den Aufstieg dieser neuen Substanzen in der Klinik erforderlich, sollte Ausnutzung des National Institute of Health Cancer Therapy Evaluation Program (CTEP) berücksichtigt werden. In diesem Programm klinische Studien werden gefördert, um neue Anti-Krebs-Mittel zu bewerten, mit einem besonderen Schwerpunkt auf die translationale Forschung. Es sollte darauf geachtet werden, um öffentliche Präsentation der präklinischen Daten, einschließlich der Beschreibung der Strukturen und der Synthese von neuen Verbindungen zu koordinieren, mit Einreichung der Patentanmeldungen Schutzt geistigen Eigentumsrechte. In der Regel sollten die Daten nicht öffentlich vorgestellt, bis Patentanmeldungen schützen Zusammensetzung der Materie und Methoden der Nutzung wurden eingereicht werden.
Zusammenfassend haben wir eine effiziente Strategie zur Untersuchung und Bewertung der potentiellen neuartiger TKI als therapeutische Mittel zur Behandlung von akuter Leukämie nachgewiesen. Ziel Hemmung in Leukämiezellen, sowohl in Kultur und aus dem Knochenmark von Mäusen mit menschlichen Leukämie Xenotransplantaten isoliert, durch Immunoblot zu beurteilen. Die funktionelle Bedeutung von Ziel Inhibition können mit klonogenen Assays und orthotopen murinen Xenograft-Modellen mit Biolumineszenz-Bildgebung ausgewertet werden. Zusammen stellen diese Tests liefern wichtige präklinische Daten für die Weiterentwicklung dieser neuartigen Translationsmitteln in der Klinik erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
In-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Shared Resource an der University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30-CA046934 unterstützt). Durchflusszytometrie wurde in der Durchflusszytometrie Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30CA046934 unterstützt) durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (RO1CA137078 DKG) unterstützt. ABLS ist ein Fellow des Pediatric Scientist Entwicklungsprogramm, durch Zuschüsse von der American Academy of Pediatrics, der American Pediatric Society und der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
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