Summary
טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה.
Abstract
טירוזין קינאז רצפטור היה מעורב בפיתוח וההתקדמות של סרטן רבים, כולל שני לוקמיה וגידולים מוצקים, והם מטרות טיפוליות druggable אטרקטיביים. כאן אנו מתארים אסטרטגית ארבעת שלבים יעילים להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול בלוקמיה חריפה. בתחילה, ניתוח כתם מערבי משמש כדי לאשר את עיכוב היעד בתאים לוקמיה בתרבית. פעילות פונקציונלית אז הוא הוערך באמצעות מבחני clonogenic בmethylcellulose או תרבויות אגר רכות. תרכובות ניסיוניות המדגימות פעילות במבחני תרבית תאים מוערכות in vivo באמצעות עכברי NOD-SCID-גמא (NSG) המושתלים orthotopically עם שורות תאים לוקמיה. במחקרי vivo pharmacodynamic ראשוניים להעריך עיכוב יעד בתקיעות leukemic מבודדת ממח העצם. גישה זו משמשת כדי לקבוע את המינון ואת לוח זמנים של ממשל נדרש ללעכב יעד אפקטיבייון. מחקרים מאוחרים יותר להעריך את היעילות של TKIs in vivo באמצעות לוציפראז לבטא בתאי סרטן דם, ובכך לאפשר לניטור bioluminescent לא פולשנית של נטל לוקמיה והערכת התגובה לטיפול באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. אסטרטגיה זו הייתה יעילה להערכה של TKIs במבחנה in vivo ויכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של סוכנים ממוקדים מולקולריים עם פוטנציאל טיפולי או להשוואה ולתעדוף ישירים של תרכובות מרובות.
Introduction
לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא המחלה ממארת השכיחה ביותר בקרב ילדי 1,2. שיעור ההישרדות הכללי עבור כל ילדים B-שושלת (B-ALL) הוא כ 85%, אך תת ספציפיים ביולוגיים, כולל T-שושלת ALL (T-ALL), יש לי הפרוגנוזה עדיין עני יותר אפילו עם פרוטוקולים טיפוליים הנוכחיים. טיפול נוסף של ALL הישנות עדיין מהווה אתגר 3. למרות שהרוב המכריע של חולים מבוגרים עם לוקמיה חריפה להשיג הפוגה עם כימותרפיה-up מול, חולים רבים עדיין סובלים הישנות 4. משטרים כימותרפיות הנוכחיים בטיפול בלוקמיה חריפה ידועים כגורמים לתופעות לוואי לטווח קצר וארוך הקשורים ברעילות. לכן, טיפולים פחות רעילים שמתמקדים בתאי סרטן עם השפעה מינימאלית על רקמות נורמליות יש צורך במידה רבה. בשנים האחרונות, הושם דגש על הפיתוח של רומן, סוכנים מולקולריים ממוקדים עם סגוליות לתאי סרטן, לעתים קרובות תוך שימוש בכימיה איטרטיביכדי לייצר חומרים פעילים רבים אשר חייבים לאחר מכן להשוות ועדיף 5. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של TKIs לטיפול בלוקמיה חריפה, שניתן להשתמש בם לצורך ההערכה של תרכובת בודדת או להשוואה ישירה של תרכובות מרובות על מנת להקל על פיתוח תרופה.
השיטה המוצגת כאן מורכבת מארבעה שלבים. ראשון ביוכימי (1) ונגד לוקמיה (2) פעילות של המתחם (ים) מוערכות בתרבית תאים, ולאחר מכן עיכוב של היעד אישר בדגמים (3) בעלי חיים, ויעילות לבסוף טיפולית של TKI (ים) נקבע במודלי xenograft לוקמיה orthotopic (4). למחקרים אלה, חשוב לבחור שורות תאים רלוונטיות, שהם נציגים של תת הביולוגיים הנפוצים ביותר. שורות תאים יש לבחור, ששניהם, מבטאים את היעד של עניין ואין להם את היעד של ריבית, כדי לבדוק האם הם med השפעות ביולוגיותiated על ידי עיכוב של היעד. זה רלוונטי במיוחד לפיתוח של מעכבי מולקולה קטנים, שיש לי מחוץ יעד תופעות שעשויות להיות חשוב לפעילות אנטי סרטניים. כמו כן יש לבחור שורת תאים שתלויה ביעד להשפעות פונקציונליות, כגון ריבוי או הישרדות. מחקרים ראשוניים אימות היעד (מחוץ להיקף של מאמר זה) באמצעות התערבות RNA או באמצעים ספציפיים אחרים כדי לעכב את היעד יכולים לשמש כדי לזהות שורות תאי יעד תלוי. כמו כן, רצוי לבחור שורות תאים שיכולים ליצור xenografts העכברית, כך שתוצאות תרבית תאים יכולות להיות באופן ישיר יותר בתרגום לin vivo ניסויים.
להערכה של פעילות ביוכימית בתיווכו של TKIs בתאי סרטן דם, ירידה בזרחון הקולטן יכולה לשמש כאינדיקציה לעיכוב היעד. יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח כתם מערבי או ELISA, בהתאם לזמינות והספציפיות של נוגדנים.אם נוגדנים עם סגוליות מספיק ליעד זמינים, מבחני ELISA עדיפים כפי שהם יותר כמוני ויעילים. במקרים בהם נוגדנים עם סגוליות מספיק עבור ELISA אינם זמינים, ניתוח כתם מערבי עשוי להיות נחוץ. במקרה זה, immunoprecipitation של כמות גדולה של lysate יכולה להיות שימושית לזיהוי של מטרות שנמצאות בשפע נמוך. גישה זו היא רלוונטית במיוחד למדידת phospho-חלבונים, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים קצרים, כדי לאפשר לשינויים מהירים באיתות בתגובה לגירויים סביבתיים. כמה חלבוני פוספורילציה הם יציבים מאוד, סביר להניח כתוצאה מהיווצרות מורכבת עם phosphatases. לגילוי חזק ועקבי של חלבוני פוספורילציה האלה, זה יכול להיות גם אפשרי לטיפול בתאים עם pervanadate, מעכב החלבון phosphatase-טירוזין בלתי הפיך 6, כדי לייצב את phospho החלבון לפני הכנת lysates תא כולו.
אללקבוע אם פעילות ביוכימית תוצאות בהשפעות אנטי סרטניים, ניתן לנטר תהליכים ביולוגיים היעד תלוי בניסויים מבוססי תאים. לשורות תאי סרטן דם, פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs ניתן להעריך באמצעות מבחני הקמת המושבה בוצעו בmethylcellulose או רך אגר 7. אגר רך עשויים להיות מועדף כמו זה הוא מדיום מוצק כי הוא יותר נוח למניפולציה אם טיפול חוזר ונשנה עם TKI הוא הכרחי. בעוד רבים שורות תאים לוקמיה myloid (AML) חריפות תהווה מושבות באגר רך, רוב כל שורות תאים רק ליצור מושבות בmethylcellulose, שהיא מדיום מוצק למחצה. למרות שניתן לרענן בינוני ו / או TKIs בתרבויות methylcellulose, ניתן להשתמש בם רק בנפחים קטנים ובתדירות מוגבלת. כמו כן, קשה יותר כדי להכתים מושבות מבלי לשבש אותם בmethylcellulose. מחקרים ראשוניים צריכים להגדיר את היכולת של שורות תאים מתאימות כדי ליצור מושבות בmethylcellulose ו / או אגר ולא רכיםהוא צפיפות אופטימלית של תאים בתרבית כך שהמושבות הן שאינן חופפות ובמספר מספיק כדי להשיג סטטיסטי הנתונים רלוונטיים (בדרך כלל 50-200 מושבות בכל צלחת 35 מ"מ).
בעוד שבמבחני חוץ גופית הם חזקים וחסכוניים, ויש פחות השלכות אתיות מאשר ניסויים בבעלי חיים כולו, קידום של תרכובות טיפוליות דורשת הוכחת היעילות ובטיחות במודלים של בעלי חיים. במחקרי vivo, שורות תאים לוקמיה חריפות אנושיות ניתן להשתיל orthotopically לSCID NOD.Cg-Prkdc אני l2rg tm1Wjl / SzJ עכברים (NSG) וTKIs יכולים להינתן בקלות על ידי הזרקה או gavage האוראלי. שורות תאים מסוימות עשויות לדרוש חשיפה של עכברי NSG למנת שורה תלויה נמוכה של קרינה סלולרי על מנת שxenografts להקים, ובמקרה הזה עכברים לא יכולים לסבול gavage האוראלי ללא תקופת ההחלמה 5-10 יום שלאחר הקרנה. כתב יד זה מתאר דור של B-ALL ו-T-ALL xenografts באמצעותקווי תאים ספציפיים (697 וJurkat) כדוגמאות אבל xenografts ניתן להקים בעכברי NSG תוך שימוש במגוון רחב של שורות תאים. במקרה ששורות תאים אחרים הן ישימות יותר, הדרישה להקרנה, מספר אופטימלי של תאים להשתלה, ועיתוי של תחילת מחלה והתקדמות צריכה להיקבע באופן ניסיוני. באופן אידיאלי, דגמים אלה יהיו penetrance מלאה (כל בעל חיים המושתלים מתפתח לוקמיה), קינטיקה העקבית (לוקמיה מתקדמת באופן דומה בכל בעלי החיים), וחלון טיפול סביר (באופן אידיאלי 20-30 ימים שבין תחילת טיפול וההסרה ממחקר בשל מחלה) . מספר התאים המושתלים יכול להיות מוגבר כדי לשפר penetrance ועקביות קינטית או ירד כדי לשפר את חלון הטיפול במידת צורך.
כדי לקבוע אם TKIs לתווך עיכוב יעד in vivo, דגימות שנאספו מעכברים עם xenografts לוקמיה לאחר טיפול עם TKI או כלי רכב בלבד. באופן אידיאלי, במינוןלוח הזמנים של ד של ממשל לניסויים אלה מודרכים על ידי מחקרי פרמקוקינטיקה, אשר לעתים קרובות יכול להיות מבוצעים על ידי מעבדות מסחריות ומחוץ להיקף של מאמר זה. אם הנתונים הפרמקוקינטי זמינים, הריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב יעיל יעד בתרבית תאים והריכוז בסרום המרבי הבאים מנה בודדת של TKI ניתן להשתמש כדי להגדיר את המינון ההתחלתי למחקרים בבעלי חיים. מחקרי פרמקוקינטיקה גם יכולים ליידע את העיתוי של איסוף דגימה לאחר טיפול ללימודי pharmacodynamic והתוואי של ממשל. עיכוב של היעד ניתן להעריך בכל איבר מושפע אך רקמות שנאספות בקלות ומעובד עדיפות. שורות תאים לוקמיה חריפות ביותר להקים בכבד, מח עצם, במערכת העצבים המרכזית הטחול, דם היקפי, ואף האיברים הספציפיים השפיעו ואת מידת קליטתם באיברים אלה משתנה בין דגמים. הפרוטוקול המובא כאן מעריך phosphעיכוב o-חלבון במח עצם באמצעות ניתוח כתם מערבי, אבל איברים מוצקים עשוי להיות קל יותר למסוק באופן עקבי ודורש עיבוד מינימאלי או לא לפני ההקפאה, ומאפשר פחות הזדמנויות לשפלה של phospho-חלבונים במהלך איסוף דגימה ועיבוד. גם אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את גידולים או איברים מושפעים מלוקמיה מוצקים.
לבסוף, היעילות הטיפולית של TKI (ים) נקבעה במודלי xenograft לוקמיה orthotopic. למחקרים אלה, התזמון של תחילת טיפול יכול להיות מגוון, כך שהמחלה היא מבוססת יותר או פחות. טיפול עשוי להתחיל מייד לאחר השתלה למחקרים ראשוניים ולאחר מכן יעוכב במחקרים הבאים עד נטל מחלה משמעותית מזוהה משוער מודל טיפול אבחון באופן הדוק יותר. באופן אידיאלי, יש גם מודלים של בעלי החיים אלה את היכולת למדידה לא פולשנית של נטל מחלה. יש לנו אופטימיזציה שיטות לכניסתה של לוציפר הגחליליתגן ASE לתוך שורות תאים לוקמיה באמצעות חלקיקים כמו וירוס, המאפשר ניתוח לא פולשני, אורך של התפרצות מחלה והתקדמות והערכה של נטל מחלה במח עצם ובאיברים מוצקים. קריטי לגישה זו הוא השימוש בשורות תאים מתויג לוציפראז חד שבטיים למניעת שונות בהתפתחות של לוקמיה-להביע לוציפראז הקשורים לשימוש של שורות תאי polyclonal ואינו קשור לטיפול בTKI 8.
יחדיו, יכולים לשמש את השלבים הבאים להערכת TKI בודד או להשוואה ודירוג ישירים של TKIs מרובה. בעוד הפרוטוקולים שהוצגו כאן מתמקדים בפיתוח של TKIs, ניתן להתאים שיטות אלה למטרות אחרות ושיקולים לפיתוח assay מתוארים. לפיכך, אסטרטגיה זו עשויה להיות רחבה יותר ישים להערכה טרום הקלינית של סוכנים ממוקדים מולקולריים לטיפול בלוקמיה חריפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים מעורבים חיות בעקבות תקני הרגולציה אושרו על ידי האוניברסיטה של ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו. הפרוטוקול הפגין אושר על ידי האוניברסיטה של ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי קולורדו.
1. Phospho חלבון כתם המערבי
- הכנת lysates
- שורות תאים המבטאות את תרבות טירוזין קינאז רצפטור של עניין. קציר תאים וצלחת 3-5 x 10 6 תאים / מדגם ב400 מדיום גידול μl בצלחת תרבית רקמה 48 היטב. לדגור על 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 2-3 שעות.
- הוספה של פתרון 5x TKI 100 μl במדיום גידול ודגירה של 60 דקות.
- הכן מאגר תמוגה עם 50 HEPES מ"מ (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) גליצרול, 1% (v / v) טריטון X-100, ומעכבי פרוטאז. אם תרבויות לא יטופלו עם pervanadate לפני הקציר, להוסיף מעכבי phosphatase (orthova נתרן 1 מ"מmolybdate nadate ו0.1 מ"מ נתרן) למאגר תמוגה.
- הכן pervanadate (PV) פתרון מעכב phosphatase מייד לפני השימוש. הכן פתרון 0.3% של מי חמצן (זהירות) בפוספט שנאגרו מלוח קר (PBS) בצינור כהה על קרח (1:100 דילול של מניות פתרון 30%). מרתיחים aliquot של 0.2 M orthovanadate נתרן פתרון מניות (OV, זהירות) במשך 5 דקות. לדלל 1:10 ב PBS לעשות 20 פתרון מ"מ OV בטמפרטורת חדר (RT). מערבבים 0.3% מי חמצן ו20 מ"מ OV 1:1 ו דגירה בחושך ב RT עבור 20 דקות.
- לדלל PV לבינוני מלא (60 PV μl + 940 בינוני μl). הוספה של PV בדילול מלא / 100 μl כן. לדגור על 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 3 דקות ולאחר מכן למקם את הצלחת על קרח.
- קציר התאים בצינורות microfuge קרים ב2,500 סל"ד במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ותאי resuspend ב 120 μl של חיץ תמוגה. לדגור על קרח במשך 15 דקות. להבהיר את lysate בmicrofuge קרים ב6,000 סל"ד למשך 3 דקות. העבר supernatant לצינור קר טרי. חנות ב -80 ° C.
- Immunoprecipitation
- ספין למטה חרוזים sepharose G חלבון בmicrofuge ב1,000 סל"ד דקות 1. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 1 מיליליטר PBS הקר. הוסף נפח שווה של PBS לעשות slurry 50%. הוספת נוגדן ראשוני ו20 μl חרוזים G חלבון 50% לכל דגימה. דגירה עבור שעה 2 - O / N ב 4 ° C על הכתף.
- דופק את חרוזים בmicrofuge קרים ב9,000 סל"ד. הסר supernatant ולשטוף את חרוזים 2x עם 150 μl מאגר תמוגה הקרה. ספין בmicrofuge הקרים ב1,000 סל"ד דקות 1. הסר supernatant וגלול resuspend ב 20 לדוגמא 2X SDS μl הצפת עם 2-mercaptoethanol (זהירות). השתמש באופן מיידי או בחנות ב -80 ° C.
- דגימות מרתיחים במשך 5 דקות ולרוץ על ג'ל טריס-גליצין-SDS. מעביר את החלבונים לממברנה ניטרוצלולוזה ולזהות phospho-חלבון על ידי כתם מערבי.
- יש לשטוף את הכתם עם מים ולאחר מכן לדגור ב2% SDS, 62.5 מ"מ טריס (pH 6.8), 0.M 1 β-mercaptoethanol (זהירות) ל30 דקות ב50 ° C. יש לשטוף 2x עם מים ולאחר מכן לשטוף ל60-90 דקות ב5-6 שינויים של TBS-T כדי להסיר הפשטת פתרון.
- זיהוי מוחלט של חלבון על ידי כתם מערבי.
2. Assay methylcellulose
- Aliquot 4 מיליליטר של מדיום בסיס האנושי methylcellulose ל50 מיליליטר צינורות חרוטי באמצעות מחט סטרילית סוף גדול נשא בוטה. (הערה:. ניתן aliquoted Methylcellulose ומאוחסן ב -20 ° C. הפשירו ב RT O / N לפני השימוש)
- הוסף 500 μl של 10x TKI או רכב במדיום גידול ל4 מיליליטר של methylcellulose ותערובת מערבולת 10 שניות.
- קציר ותאי ספירה. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 10x ריכוז התא הסופי. הוסף השעיה תא 500 μl לתערובת methylcellulose. ורטקס עבור 10 שניות ולתת לשבת במשך 10 דקות כדי להסיר בועות.
- צייר את 4 מיליליטר של תערובת methylcellulose באמצעות מזרק 5 מיליליטר וlarg סטריליהדואר נשא מחט הסוף בוטה. הימנע מעריכת בועות. לוותר על 1 מיליליטר של תערובת methylcellulose למרכז שלוש צלחות תרבית רקמת 35 מ"מ. לערבל את המנות עד שהתחתית מכוסה לחלוטין עם methylcellulose.
- לכל צלחת methylcellulose, להכין צלחת תרבות 10 סנטימטר סטרילי רקמות עם שתי צלחות נוספות 35 מ"מ רקמת תרבות מלאים במים סטריליים כדי להבטיח סביבה לחה. תרבויות מקום במים במעייל החממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 10-14 יום.
- ספירת מושבות לאחר 1-2 שבועות. מושבות צריכים להיות יותר מ 20 תאים ולא חופפים. ניתן לספור מושבות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בבמה מיקרוסקופ עם רשת או באמצעות דלפק מושבה אוטומטית. שינויים בגודל מושבה או במורפולוגיה בתגובה לטיפול עם TKI גם צריכים להיות מוערכים. כדי לשפר את זיהוי על ידי מונה מושבה, מושבות כתם על ידי הוספת 60-100 μl של (3 - (4,5-דימתיל-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium סול ברומידution (MTT, 5 מ"ג / מיליליטר H 2 O, החנות ב -20 ° C, להגן מפני אור, זהירות) טיפה חכמה על פני כל צלחת ודוגר במשך 8 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2.
3. רך אגר Assay
- הכן 1% אגר אצילי לשכבת תחתונה, 0.7% אגר אצילי לשכבת עליונה ו2x מדיום גידול. לאזן מדיום גידול 2x באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. מחממים 1% ו0.7% אגר אצילי במיקרוגל (כ 1 מיליליטר min/100) ולאזן באמבט מים 42 מעלות צלזיוס. לערבב חלקים שווים של אגר 1% ובינוניים 2x ובנפרד אגר 0.7% ובינוניים 2x ב50 conicals מיליליטר. תכנית 10 מיליליטר של תערובת / צלחת שש היטב אגר רכה לכל שכבה.
- צלחות תרבית רקמת 6 גם לייבל. ממלא כל היטב עם 1.5 מיליליטר 1% תערובת אגר רכה. למנוע בועות בציפוי. צלחות יבשים עם מכסים מעל במכסת מנוע סטרילית ל30 דקות.
- ספירת תאים. הכן את ההשעיה תא במדיום גידול בריכוז, שהוא גבוה יותר מאשר 500x concentrati התא הסופיהלאה. הוסף השעיה תא ל0.7% תערובת אגר, מערבב היטב ולוותר 1.5 מיליליטר של תערובת התאים אגר על החלק העליון של השכבה אגר 1%. בואו לחזק את השכבה העליונה ל30 דקות.
- הכן את מדיום גידול המכיל 1x TKI או שליטה ברכב. הוסף 2 מיליליטר של מדיום עם ריכוז רצוי של TKI על גבי השכבה אגר העליון.
- דגירה תרבויות ל10 ימים ב 37 ° C ב 5% CO 2. להסיר ולהחליף את המדיום שכיסה כל 3 ימים.
- כאשר מושבות הם גלויים לעין בלתי מזוינת, הבינוני לשאוב כיסה ולהוסיף פתרון 200 μl ניטרו-tetrazolium הכחול (1 מ"ג / מיליליטר NBT בH 2 O, לאחסן ב 4 ° C, להגן מפני אור, זהירות). לחזור חממה ל24-48 שעה. מעבר ל4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני הספירה. ניתן לאחסן את הצלחות ויטראז על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. ספירת מושבות באמצעות מיקרוסקופ או דלפק מושבה אוטומטית.
4. הערכה של עיכוב phospho חלבון בvivo
- לאסוף גאמות גוברת בשלב יומן על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה בראש הטבלה ב1,500 סל"ד במשך 5 דקות. לשטוף את התאים פעם עם PBS סטרילי ו resuspend ב PBS בריכוז מתאים (בדרך כלל 1-5 x 10 7 תאים / מיליליטר). תאים להשתלות בהיקף של 100 μl ל6-12 עכברי NSG ישנים שבוע על ידי הזרקה תוך ורידית לזנב וריד באמצעות מזרק אינסולין 28 G. מניחים את החיה בעוצר, מחמם את הזנב בכוס של מים חמים כדי להרחיב את הוורידים, ולנקות את הזנב עם ספוגית כלורהקסידין לפני הזריקה. לאחר הזרקה, יפעיל לחץ על אזור ההזרקה באמצעות גזה סטרילית עד שדימום ייפסק. השתלה לפחות 3 חיות / קבוצה. לשמור על העכברים במים המכילים 1 מ"ג / סולפט gentamycin מיליליטר.
- ארבע עשרה ימים לאחר השתלה, טיפול בבעלים חיים עם TKI או כלי רכב בלבד, ודגימות קציר לניתוח של עיכוב היעד. שוקלים בעלי חיים ולטפל במינון מתאים (מ"ג / ק"ג משקל גוף) של TKI או רכב. לנהל טיפול בנפח של 5 מיליליטר / kמשקל גוף גרם בזריקה (IP) intraperitoneal או 10 מיליליטר / קילוגרם משקל גוף על ידי gavage האוראלי. להזרקת ה-IP, לרסן את העכבר באופן ידני ולהזריק ברבע הימני התחתון של הבטן באמצעות מחט G 29. לgavage האוראלי, לרסן את העכבר באופן ידני ולהחזיק את בעלי החיים זקופים. מניחים את צינור gavage בפה על הלשון ולחלק האחורי של הפה. להפעיל לחץ קל כדי להעביר את הצינור דרך הוושט ולתוך הקיבה. לוחץ על המתג המזרק כדי לנהל טיפול. אם הבוכנה לא לדכא בקלות את מחט gavage יש להסיר ומיקומו. הכן את הניסוחים TKI מייד לפני השימוש.
- אם טיפול pervanadate הוא רצוי, להכין פתרון PV 20 דקות לפני הקציר כפי שתואר לעיל (שלב 1.1.4) ולדלל לבינוני עם 1 מיקרומטר MgCl 2 ו100 U / ml DNase (120 PV μl + 880 בינוני μl). הערה: PV הוא יציב במשך שעה לפחות 1 לאחר דילול.
- להקריב את בעלי חיים על ידי CO 2 הרדמה בapזמן propriate (ים) שלאחר טיפול. לנתח עצמות ירך על ידי הסרת פרווה, עור ושרירים מהרגל כולה, כך שהעצמות חשופות לחלוטין. הסר את עצמות הירך על ידי גזירה עם מספריים לנתח ממש מתחת למפרק הירך ושוב מעל למפרק הברך. מעביר לצלחת פטרי ומח עצם מיושר עם 1 מיליליטר PBS הקר או פתרון PV מדולל באמצעות מזרק ומחט G 27. אם טיפול עם PV, לדגור על RT בחושך במשך 10 דקות.
- הכן lysates ולנתח רמות phospho חלבון וסך הכל החלבון כפי שצוין לעיל (צעדים 1.1.6-1.2.5).
- לכמת phospho חלבון יחסית ורמות כולל של החלבון עבור כל דגימה באמצעות צפיפות. חישוב יחסי phospho-protein/total-protein לערך phospho-protein/total-protein הממוצע לבעלי חיים שטופלו ברכב.
5. הערכה של פעילות נגד לוקמיה של TKIs בכל דגמי xenograft
- במידת צורך, לחשוף את העכברים ל200 cGy של קרינה בirradiator RS-2000 prio יום אחדr להשתלה. עכברי השתלה עם שורות תאים לוקמיה כפי שתואר לעיל (שלב 4.1). השתלת עכברים לפחות 6 לכל קבוצה. זהה את העכברים על ידי ניקוב אוזן. לחלופין, טוש שחור יכול לשמש כדי לזהות עכברים עם סימני חשיש על זנבותיהם. להוסיף העשרה לכלובים כדי להפחית את הפוטנציאל לתוקפנות בן זוג בכלוב במהלך תקופת המחקר.
- טיפול בעכברים עם TKI או רכב רק כפי שתוארו לעיל (שלב 4.2). לנטר את מצב בריאותם של עכברים יומיים באמצעות בדיקה גופנית ונחישות במשקל. סימפטומים צפויים של לוקמיה (הקטין את רמת פעילות, ירידה במשקל, שיתוק גפיים האחורי, ודלקות עיניים). ירידה במשקל יותר מ -10% -15% מזוהים בדרך כלל עם מותו של העכבר בתוך יומיים, והוא בדרך כלל נקודות קצה פונדקאיות למוות בהתאם לדרישות IACUC סטנדרטיות.
- לפקח על קליטתם והתפתחות של לוקמיה באמצעות מערכת vivo בפליטת אור הדמיה עד 2x שבועי. הכן פתרון 200x D-וציפרין המניה (30 מ"ג / מיליליטר) בsteriמים le. מערבבים בעדינות על ידי היפוך עד D-וציפרין הוא נמס לגמרי. השתמש באופן מיידי, או aliquot והקפאה ב -20 ° C. לפני ההדמיה באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב, להפשיר aliquots של D-luciferin ב RT ולדלל 1:02 ב PBS לריכוז סופי של 15 מ"ג / מיליליטר ולסנן לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
- להרדים את העכברים לפני ההדמיה עם 1.5% isoflurane בשאיפה בחמצן. לפקח הרדמה מספיק, מאופיינת בהרפיית שרירים, אובדן התנועה, ואובדן של תגובה לגירוי הבוהן קמצוץ.
- מייד לפני ההדמיה, לנהל 150 מ"ג / D-וציפרין קילוגרם משקל גוף על ידי הזרקת ה-IP (10 μl של 15 מ"ג / מיליליטר וציפרין / גרם של משקל גוף).
- השתמש במערכת הדמיה פליטת אור in vivo ל2 סדרה של תמונות עם חשיפות רציפה 30, 60 ו90 שניות ותמונה סופית עם חשיפת שניות 120 ללכוד. לאחר הדמיה, להחזיר עכברים לכלובים ולפקח על התאוששות מהרדמה. בהתאםעוצמת פליטת אור, יכולים להיות מגוונים זמני חשיפה. זמני חשיפה אופטימליים צריכים להיות קבועים מראש למודל נתון וכל זמן עולה בקנה אחד כזה שעוצמות האות לנקודות זמן בודדות הן השוואה על פני כל המחקר.
- קביעת עוצמת פליטת אור לכל עכבר באמצעות תמונת Living תוכנת רכישה וניתוח 3.2. לקבוע ערכי שטף כולל שנמדדו בפוטונים / שני על ידי ציור אזורים של עניין (ROI) בגודל זהה על כל עכבר.
- להקריב את העכברים על ידי CO 2 חשיפה ונקע בצוואר הרחם אם ננטש, מציג שיתוק, במקרה של יותר מ 15% ירידה במשקל, או בסוף המחקר. לנתח עכברים ותצפיות שיא (למשל הגדלה של בלוטות לטחול, בכבד, או הלימפה; חיוור מח עצם). לנתח עצמות ירך ומח עצם לשטוף עם PBS הקר באמצעות מחט G 27.
- איסוף תאים בmicrofuge ב2,500 סל"ד במשך 5 דקות. Resuspend תאי PBS המכילים 2% FBS ו דגירה במשך 5 דקות ב RT.איסוף תאים ואת כתם עם 20 מ"ג / מיליליטר DAPI (dihydrochloride 4,6-diamidino-2-phenylindole, 1:1,000) וα-hCD45 FITC-מצומדת (1:100) או נוגדן שליטת אלוטיפ 1 העכבר IgG (1:100) . להעריך engraftment לוקמיה באמצעות cytometry זרימה. שער על האוכלוסייה בת קיימא (DAPI שלילי) ולקבוע אחוז CD45 + התאים (תקיעות מח עצם%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחני שהוצגו כאן להעריך את ההשפעות ביוכימיות ופונקציונליות בתיווכו של TKIs וניתן להשתמש בם לדרגת תרכובות רומן המבוססות על המידה של עיכוב היעד במבחנה in vivo, הפחתה של הקמת מושבה, ועיכוב בleukemogenesis בעכברים מושתל עם NSG לוציפראז- מתויג תאים לוקמיה.
ניתוח immunoblot נוצל כדי לקבוע עיכוב של טופס פוספורילציה הפעיל של חלבון המטרה בתאי סרטן דם בעקבות טיפול עם TKIs. טיפול עם TKIs הביא לירידה תלוית מינון בכמות חלבון פוספורילציה. איור 1 מציג עיכוב של זרחון היעד על ידי שלוש TKIs שונה בשורת תאים לוקמיה חריפה עם TKI C להיות החזק ביותר, TKI B להיות פחות חזק, וTKI שאין לו תוקף. לפיכך, assay זה מאפשר דירוג של תרכובות המבוססות על עוצמה של פעילות ביוכימית במערכת מודל מבוסס תאים. בדוגמאות שמוצגים באיור 1, העשרה של אנטיגן על ידי immunoprecipitation והשימוש בpervanadate מעכב phosphatase היה נחוץ כדי להשיג תוצאות לפירוש. סיבה לכך יכולה להיות, שזירחון חלבון טירוזין קינאז זה הוא יציב קיצוני.
כדי לחקור את ההשפעה של TKIs על נכסים בשעור של תאים לוקמיה חריפים, מבחני הקמת המושבה היו בשימוש. חקרנו את היכולת של תאים לוקמיה יעד תלוי ליצור מושבות במדיום מבוסס methylcellulose (ALL) וברך אגר (AML). בדוגמא שמוצגת באיור 2 א ', ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית במספר מושבה נצפה בשורת תאי ALL לאחר טיפול עם TKI. תוצאות דומות נצפו בשורות תאי AML לאחר טיפול עם TKIs באגר רך. באיור 2, קיימת מגמה של מספר מושבה ירידה בתגובה לטיפול עם TKI והירידה נראית תלוי מינון, אבל ההבדל הוא לא רחatistically משמעותי כתוצאה של השתנות בין משכפל. שים לב לשגיאות התקן הגדולים בביחס איור 2 איור 2 א. ערבוב בשפע של התאים לתוך מדיום חצי מוצק וחלוקה שווה של המדיום המוצק למחצה לתוך הבארות או הצלחות הוא קריטי לעקביות בין משכפל במבחני clonogenic. ספירה מדויקת של תאי קיימא לפני ציפוי חשוב גם להבטיח עקביות בין ניסויים. איור 2C מציג צלחת עם חלוקה לא שווה של מושבות, בועות באגר הרך, ולא שלם התפשטות אגר הרך בצלחת (פנל מימין) ו צלחת עם ציפוי הולם להשוואה (משמאל פנל). כדי להבטיח שmethylcellulose לא להתייבש במהלך תקופת הדגירה חשוב גם לכלול צלחות של מים סטריליים בכל מנה. התייבשות של מדיום methylcellulose השינויים בצפיפות ובכך מפחיתה את יכולתם של תאים ליצור מושבות, באופן פוטנציאלימניעת דור של תוצאות שימושיות.
כדי לקבוע אם TKIs יכול לעכב את חלבון מטרת in vivo, ניתוח כתם מערבי הועסק לבחון רמות phospho חלבון וסך הכל חלבון בתקיעות מח עצם מבודדות מעכברי NSG מושתלים עם שורת תאים לוקמיה חריפה. בדוגמא שמוצגת באיור 3, ניתוח pharmacodynamic חשף ירידה ברמות phospho החלבון בתקיעות leukemic מבודדת מעכברים שטופלו ביחס TKI לעכברים שטופלו עם רכב בלבד. מחקרים אלה הראו עיכוב של Auto-זירחון בתאי סרטן דם בעקבות טיפול עם TKIs in vivo, המאשר כי תרכובות אלו הגיעו למח העצם וביעילות לעכב את היעד. TKI D היה פחות פעיל מאשר TKI E בassay זה. הדוגמא מוצגת, ניצול מבוקש לpervanadate לייצב phospho-חלבון המטרה ולאפשר לצורך זיהוי.
מודל orthotopic עכבר xenograft של לוקמיה חריפה בNSG מילce מוזרק עם שורת תאי ALL-להביע לוציפראז שימש כדי להעריך את ההשפעה של טיפול עם TKI על פוטנציאל בשעור in vivo. כפי שניתן לראות בתרשים 4, עכברים שטופלו TKI היו רמה נמוכה משמעותית של פליטת אור, מה שמעיד על מופחת נטל לוקמיה יחסית לעכברים שטופלו ברכב בלבד. לאחר 10 ימים של טיפול, כל העכברים היו רמה נמוכה של פליטת אור שלא הייתה שונה באופן משמעותי בין בעלי החיים שטופלו רכב ובעלי חיים שטופלו TKI. בניגוד לכך, על ידי 19 ימים שלאחר טיפול, עכברים שטופלו ברכב היו עוצמת פליטת אור גבוהה יותר משמעותית (86.12 ± 19.17 פוטונים / sec), ואילו עכברים שטופלו במינון גבוה של TKI היו עוצמת אות נמוכה בהרבה (29.64 ± 9.04 פוטונים / sec) .
איור 1. TKIs מעכב זירחון של חלבון המטרה במבחנה. טופלו בתרביות תאים עם הריכוזים מצויינים של TKI, TKI B, או TKI צלזיוס במשך שעה 1. Pervanadate התווסף לתרביות תאים במשך 3 דקות כדי לייצב את צורת פוספורילציה של חלבון המטרה. חלבון המטרה היה immunoprecipitated מlysates התא וphospho חלבון וסך הכל חלבון התגלו על ידי כתם מערבי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. TKI מפחית הקמת מושבה בשורות תאים לוקמיה חריפות בmethylcellulose ואגר רכים. כל תאים היו מצופים בmethylcellulose () ותאי AML היו מצופה ביםלעתים קרובות אגר (ב ') בנוכחות TKI או DMSO (שליטה ברכב). מושבות נספרו לאחר 2 שבועות בתרבות. ערכים ממוצע וסטיות התקן נגזרו מצלחות בשלושה עותקים. (C) צלחות אגר רכות נציג עם החלוקה אופטימלית של מושבות (פנל משמאל) או חלוקה בלתי צודקת של מושבות ואגרו מנותק חלקית רך (פנל מימין) מוצגות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. טיפול עם TKI מפחית את רמות phospho חלבון in vivo. עכברי NSG הושתלו עם שורת תאי ALL וטופלו במנה אחת של TKI D, TKI E, או רכב רק לאחר פיתוח של לוקמיה. מ 'עצםתאי חץ נאספו עצמות ירך וטופלו בpervanadate לפני הכנת lysates תא כולו. Immunoprecipitation חלבון המטרה, וזיהוי של phospho-וסך חלבונים על ידי כתם המערבי של בוצע. עוצמת אות B ונרשמת ידי צפיפות ואת החלק היחסי של פוספורילציה של חלבון המטרה ביחס לבעלי חיים ברכב שטופל היה מחושבת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. טיפול עם TKI מעכב התקדמות מחלה בעכברים מושתלים עם אדם להביע לוציפראז שורת תאים כולם. עכברי NSG הושתלו עם אוכלוסייה חד שבטי של-transduced לוציפראז כל תאים על ידי הזרקה לתוך הזנבוריד. D-וציפרין שהוזרק intraperitoneally ותמונות פליטת אור נלקחו פעמיים בשבוע (Bining: 8, FOV 19.6, f / להפסיק 1, שניות 120 זמן חשיפה). תמונות Pseudocolor מוצגות להפגין עוצמה מוגברת פליטת אור לאורך זמן בעכברים מושתלים עם תאי סרטן דם והפחתת מינון תלוי בעוצמת פליטת אור בבעלי חיים שטופלו TKI. B Quantitation של עוצמת פליטת אור ממוצע וסטיית התקן עבור כל קבוצת מחקר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה של מעכבי טירוזין קינאז רומן בטיפול בלוקמיה חריפה. שימוש בגישה זו, פעילויות ביוכימיות ונגד לוקמיה מוערכות ראשונה במבחנים מבוססי תאים במבחנה ולאחר מכן במודלי xenograft in vivo. ניתוח immunoblot נוצל בהצלחה כדי להדגים עיכוב של טירוזין קינאז היעד בתאים לוקמיה לאחר טיפול עם TKIs ולהשוות ישירות את העוצמה של תרכובות מרובות בתאים. בפרוטוקול המובא כאן, pervanadate שימש לייצב את phospho החלבון וחלבון המטרה היה מרוכז על ידי immunoprecipitation. אם מדידות אלה לא היו די כדי לאפשר זיהוי על ידי כתם מערבי, הרמות phospho חלבון של יכולה גם להיות מוגברות על ידי התוספת של ליגנד, עם או בלי pervanadate. בדומה לכך, ליגנד ניתן להוסיף לפתרון משמש כדי לשטוף את מוח העצם ללימודי pharmacodynamic. ליGand יכול להיות מטוהר או, במקרים מסוימים, יכול להיות מסופק כמרכיב של סרום שור העובר. במקרה ששיטות אלו אינן מאפשרות זיהוי של טירוזין קינאז-phosphorylated האוטומטי, מטרות במורד יכולות לשמש גם להערכה של עיכוב היעד, אם כי עדיף להעריך את הפעילות של חלבון המטרה באופן ישיר במידת האפשר. ראוי לציין, יש להשתמש בזהירות בעת לפרש את התוצאות של ניסויים באמצעות pervanadate, שהוא מעכב phosphatase לא סלקטיבי שמשפיע רבים חלבונים תאיים. מסיבה זו, pervanadate לא אמור לשמש לצורך זיהוי של שינויים ברכיבי איתות במורד הזרם.
לפני ללמוד במודלים של בעלי חיים, רצוי לאשר פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs בתאים לוקמיה. למחקרים אלה אנו מסתמכים על מבחני clonogenic בmethylcellulose או בינוני אגר רך. גם בזמן שניתן להשתמש בם מבחני אחרים כדי להעריך את ההשפעות אנטי סרטניים בתרבות, מבחני הקמת מושבה הם לעתים קרובות יותר יחסי ציבורedictive של in vivo יעילות יחסי למבחנים מסורתיים יותר שלהעריך הפצה ו / או הישרדות בתרבות נוזלית. עם זאת, מבחני אלה עשויים לשמש יחד עם מבחני הקמת מושבה כדי להעריך את המנגנונים של פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs ויכולים להיות שימושי גם במקרה ששורת תאים של עניין לא ליצור מושבות. באופן ספציפי, זה עשוי להיות שימושי כדי להעריך את האינדוקציה של אפופטוזיס בתגובה לטיפול עם TKIs באמצעות מבחני הזרימה cytometric כדי לקבוע רמות של caspases ביקע / מופעל, עלה מחייב של V Annexin לתא השטח, או ספיגת ההפרש של YOPRO-1-יודיד . כמו כן, ירידה בתפוצה או אינדוקציה של בידול גם עשוי לתרום לפעילות נגד לוקמיה. ככזה, יכולות להיות שנוצרו עקומות גדילה בנוכחות והיעדר TKI להעריך התפשטות ומורפולוגיה תאית ושינויים בביטוי של סמנים פני תא ניתן לבחון כדי לקבוע שלב התמיינות. השימוש בclonogenicמבחני הוא מבוססים היטב בתחום של פיתוח תרופות ומשמש ככלי חסכוני להערכת TKIs. עם זאת, ידוע כי שינויים שיטתיים בתנאי התרבות (כולל תוספת של גורמי גדילה ותוספי מזון אחרים, שינויים בהרכב בסרום, והבדלים בpH של תמיסת TKI) יכולים להשפיע גם צמיחת המושבה וchemosensitivity 9,10. לכן, עקביות בתנאי תרבות היא קריטית לשחזור בassay זה. חלוקה לא שווה של תאים או TKI יכולה גם להוביל לmischaracterization של היעילות של טיפולים ניסיוניים (איור 2 ג). בהערכת תוספת של נקודה יותר מפעם אחת לספירת מושבה או ציפוי לאחר חשיפה לסמים עשויים לסייע להבחין בין תרופות שלתווך השפעות אנטי שגשוג אבל אין לי פוטנציאל מרפא 7.
במחקרי vivo שתוארו כאן מייצגים שלב קריטי בדרך לקליניקהיישום ליטר של TKI. מחקרי pharmacodynamic להפגין עיכוב היעד חשובים כדי להגדיר את המינון ותדירות של ממשל הרלוונטיים למחקרים עוקבים על מנת להעריך את היעילות. ברוב המקרים זה עדיף כדי להשיג עיכוב של חלבון המטרה שלם ורצוף וזה עשוי לדרוש טיפול יותר מפעם אחת ביום. בנוסף, עיכוב של leukemogenesis והישרדות גבוה יותר במודלי xenograft עשוי לדרוש מינון גבוה יותר של TKI יותר מנדרש לעיכוב ביוכימי מלא ורציף במח העצם. זו עלולה להתרחש בגלל לוקמיה קובעת באתרים מרובים וחשיפה לTKIs עשויה להיות הטרוגנית במקומות אנטומיים שונים, כולל המוח, או שזה יכול לשקף את המגבלות ברגישות של assay וכתוצאה מכך אי לזהות כמויות שנותרו מוגבלות חלבון המטרה הפעיל של ( כלומר עיכוב יעד שלם). יחד עם זאת, בניגוד לטיפולים ציטוטוקסיות מסורתיים אשר ניתן במקסימום שלהםמינון נסבל, יותר הסוכנים ממוקדים מולקולרי גידול סלקטיבי עשויים להיות יעילים באותה מידה במינונים נמוכים שמספיקים לעיכוב ביוכימי של חלבון המטרה, אך אינם קשורים לרעילות משמעותית. כך, לסוג כזה של סוכנים, מחקרים ראשוניים כדי להעריך את ההשפעות של TKI על ההתקדמות לוקמיה במודלי xenograft לעתים קרובות לנצל את המינון המינימלי הנדרש כדי להשיג עיכוב של היעד מלא ורציף. אם אין השפעות על התקדמות לוקמיה או הישרדות הם נצפו, ניתן להגדיל את המינון עד לרעילות הוא ציין. גם מודלים אלה יכולים לשמש כדי לחקור את ההשפעות של TKI ניתן בשילוב עם טיפולים לוקמיה סטנדרטיים, ובכך ליידע את הפרוטוקולים קליניים שלאחר מכן פיתוח.
הקמת המודלים xenograft של לוקמיה חריפה באמצעות תאים לבטא-לוציפראז מייצגת התקדמות גדולה על מודלים xenograft מסורתיים יותר ויש לו את הפוטנציאל להאצה משמעותיתהתהליך של גילוי ופיתוח תרופות 11. הדמיה פליטת אור מאפשרת לקביעת אורך לא פולשנית של נטל סרטן דם, ובכך להקטין את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים, וגם יכולה לספק מידע על המיקום האנטומי של מחלה. בנוסף לכך, במאמץ להרחיב על שירות קליני פוטנציאלי של TKIs, הדמיה פליטת אור ניתן להשיג reproducibly לאחר ההשתלה של דגימות ראשוניות אדם מתויג לוציפראז מטופל 12. עם זאת, פרשנות של תמונות פליטת אור יכולה להיות מאתגרת בשל אי וודאות positional של התאים פולטות אור ולכן בהדמיה פליטת אור vivo אמור לשמש רק ככלי semiquantitative לבצע את אותה החיה בתנאים זהים 13.
במקרה בר מזל שיש לי תרכובות מרובות פעילות משמעותית ודומה במבחנים שתוארו כאן, קריטריונים נוספים שעשויות לשמש לרנקין נוסףגרם של תרכובות כולל קלות היחסית של סינתזת מתחם, מסיסות, מידת הזמינות הביולוגית פה, מאפיינים הפרמקוקינטי, ומחקרי רעלים. יחדיו, נתונים אלה צריכים לאפשר זיהוי של מתחם אופטימלי להתקדמות למחקר קליני ובנחוץ כדי לתמוך בהגשת בקשה Investigational New Drug (IND) עם מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) כדי לאפשר מחקרים קליניים. לאחר שהניבו נתונים אלה קריטיים טרום קליניים הכרחיים לקידומם של סוכנים אלה רומן למרפאה, ניצול של המכון הלאומי לטיפול בסרטן התכנית של בריאות הערכה (CTEP) צריך להיחשב. בתכנית זו ניסויים קליניים בחסות להעריך סוכנים אנטי סרטניים חדשים, עם דגש מיוחד על מחקר translational. יש להקפיד לתאם מצגת ציבורית של נתונים טרום קליניים, כוללים תיאור של המבנים והסינתזה של תרכובות רומן, עם הגשת בקשות לפטנטים לפרוטקt זכויות קניין רוחני. באופן כללי, לא צריכים להיות הציגו נתונים פומביים עד יישומי פטנט להגנת הרכב של חומר ושיטות שימוש הוגשו.
לסיכום, יש לנו הפגנו אסטרטגיה יעילה כדי לחקור ולהעריך את הפוטנציאל של TKIs רומן כסוכנים טיפוליים לטיפול בלוקמיה חריפה. עיכוב יעד בתאי סרטן דם, הן בתרבות ומבודדת ממח העצם של עכברים עם xenografts לוקמיה, ניתן להעריך על ידי immunoblot. המשמעות התפקודית של עיכוב היעד ניתן להעריך באמצעות מבחני clonogenic ומודלים עכבריים xenograft orthotopic עם ההדמיה bioluminescent. יחד מבחני אלה מספקים נתונים טרום קליניים קריטיים הכרחיים לקידומם של סוכני translational אלה רומן לתוך המרפאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
בתחום ההדמיה vivo בוצע באמצעות משותפים המשאבים IVIS באוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30-CA046934 מענק). cytometry הזרימה בוצע בcytometry הזרימה משותף המשאבים, אוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30CA046934 מענק). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1CA137078 לDKG). ABLS הוא עמית של תכנית הפיתוח של מדען הילדים, נתמכת על ידי מענקים מהאקדמיה האמריקנית לרפואת הילדים, האגודה האמריקנית לרפואת הילדים, ומכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
