Summary
Levende cell imaging af alphaherpes virusinfektioner muliggør analyse af dynamiske begivenheder rettet transport og intercellulære spredning. Her præsenteres metoder, der udnytter rekombinante virale stammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner at lette visualisering af virale samlinger under infektion af primære neuroner.
Abstract
Fremskridt i levende celler fluorescens mikroskopi teknikker, samt opførelse af rekombinante virale stammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner har aktiveret real-time visualisering af transport og spredning af alphaherpes virusinfektion af neuroner. Nytten af nye fluorescerende fusionsproteiner til viral membran, avner, og capsider, sammenholdt med levende celler, identificerede virale partikel forsamlinger gennemgår transport inden axoner. Lignende værktøjer er med held blevet anvendt til analyser af celle-celle spredning af virale partikler at kvantificere antallet og mangfoldigheden af virioner overføres mellem cellerne. Vigtigere er det, de teknikker levende celler af anterograd transport og spredning producere et væld af oplysninger, herunder partikel transport hastigheder, fordelinger af partikler, og tidsmæssige analyser af protein lokalisering. Sideløbende klassiske virale genetiske teknikker, har disse metoder, forudsat kritiske indsigteri vigtige mekanistiske spørgsmål. I denne artikel beskriver vi i detaljer billeddiagnostiske metoder, der blev udviklet til at besvare grundlæggende spørgsmål om alphaherpes virus transport og spredning.
Introduction
Infektion af det perifere nervesystem (PNS) efter alphaherpes vira, såsom herpes simplex virus (HSV) -1, -2 og pseudorabies virus (PRV) involverer flere indviklede og stærkt reguleret trin hele den virale livscyklus. Transport indenfor neuroner i PNS er kritisk under begivenhederne i både primær virusinfektion og efterfølgende inter-host spredes. De molekylære mekanismer, der modulerer to komponenter af den virale livscyklus, instrueret transport af virale forsamlinger væk fra celle organer inden axoner (anterograd transport) og efterfølgende overførsel af virioner til modtagelige celler (anterograd spread) er vigtige for forståelsen herpesvirus patogenese.
Transporten og påstigning af virale partikler i neuroner er afhængig af montering af en moden infektiøs virion 1,2. Forud fastsatte assays, herunder immunofluorescens (IF) og elektronmikroskopi (EM), blev anvendt til at undersøge partikel forsamling tilstand og protein interaktioner forbundet med virion transport og spredning 3-6. Men den dynamiske karakter af transport virioner og eksperimentelle artefakter indført ved kemisk fiksering forvirret fortolkningen af faste billeder 7,8. For nylig har en række viral-fluorescerende fusionsproteiner er beskrevet for HSV og PRV der har ubetydelige konsekvenser for protein-funktion. Grønt fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende proteiner (mCherry eller mRFP) fluoroforer er ofte parret til at tillade billeddannelse af to af de tre strukturelle komponenter af en moden virion: capsid, avner, og glycoprotein 9-11. Levende cell imaging af anterograd transport ved hjælp dual-mærkede virus visualiserer samling tilstand af virale partikler under transport. Lignende fluorofor udtrykker virale stammer anvendes til at visualisere antallet og mangfoldigheden af virale genomer efter spredning 12,13. Egenskaberne af de fluorescerende proteiner (gennemgået i 14,15) i høj grad indflydelseevnen til at visualisere virale eller cellulære enheder. De iboende egenskaber fluorescerende protein, herunder selvstændige-interaktioner og stabilitet, bør overvejes, når designe og teste nye proteinfusioner for bevarelsen af vildtype funktionalitet.
I forbindelse med fluorescerende proteinfusioner, to velkarakteriserede in vitro-cellekultur-systemer anvendes til levende celler af herpes virus infektion: dissocieret 16 og opdelte 17 (figur 1A) rotte overlegen cervikale ganglier (SCG) neuroner. I begge systemer er embryonale SCG s dissekeret, dissocieret til enkelte celle organer og forgyldt til in vitro dyrkning 18.. SCG neuroner er en del af det autonome nervesystem og kan let dyrkes og differentieret ved neuronal vækstfaktor (NGF) i en moden polariserede tilstand ex vivo. Dissocierede SCG neuroner danner et omfattende netværk af axoner, der tillader feller visualisering af viruspartikler, som de gennemgår anterograd transport 6.. Opdelte SCG kulturer giver fluidisk isolation af nervecelle kroppen (S-rum) og distale Axon Termini (N rum) 19. En række detaljerede protokoller for konstruktion og brug af opdelte neuroner anvender originale 20 eller modificeret Campenot kamre 17 er blevet offentliggjort tidligere. Fluidic isolation giver mulighed for selektiv infektion af neuronale celle organer og påvisning af afkom virioner efter transport til isolerede Axon Termini. Plating epitelceller over terminalerne før infektion giver recipientceller til spredning af virusinfektion.
Der er mange væsentlige elementer er vigtige for alle levende cell imaging eksperimenter, men den mest relevante for vores protokoller er: automatiseret billede erhvervelse, fluorescerende belysning, hastighed billedbehandling og miljøkontrol. For alle billeddiagnostiske eksperimenter, bruger vien omvendt, automatiseret, epifluorescens belysning mikroskop (figur 1B). Mikroskopet er bygget op omkring Nikon Eclipse Ti base og beskæftiger en række computer kontrollerede motoriserede systemer til hurtigt at omkonfigurere mikroskopet under automatiseret billede erhvervelse. For fluorescensbelysning, bruger vi et bredspektret kviksølv buelampe der kan dæmpes med neutralfiltre langs belysningen sti. Excitationsfiltre begrænser spektret af fluorescerende belysning og når parret med multi-pass dikroiske spejle og fluorescensemission filtre visualisere specifikke fluorescerende forbindelser. Excitation og emission filtre er monteret i selvstændige, hurtige skift filter hjul til at muliggøre en hurtig sekventiel køb af forskellige fluorescerende kanaler. Hastigheden af billedet erhvervelse er yderligere forbedret med en følsom og hurtig EM-CCD-kamera, nyttig til påvisning af lav intensitet signaler og kort image Læs tider. Miljøkontrol på MicroscOPE opnås med en scene top opvarmet inkubator og en objektivlinse varmelegeme at opretholde prøver ved forhøjede temperaturer, mens en befugtet og CO 2-beriget atmosfære ledes ind i inkubatoren. Mikroskopet er holdt i et mørkt rum med omgivelsestemperatur vedligeholdt tæt ved 25 ° C og uden lys minimeres med mørklægningsgardiner på alle vinduer. Følgende protokoller beskriver anvendelsen af dette system til anterograd transport og spredning assays.
En række alternativer til kontrol for variablerne i levende celler. Styringen af mikroskopi indstillinger kan udføres manuelt eller via automatiserede systemer er afhængige af proprietær software. Fluorescensbelysning kan opnås med halogen, LED eller laser kilder. Hastigheden af billeddannelse er modificeret ved hastigheden af filteret kobling og tid til at visualisere signalet med den parrede detektionssystemet. Miljøkontrol kan opnås med specialiseret hardware på mistativet fase, indkapsling af hele eller en del af mikroskopet i en opvarmet og befugtet kasse, eller ved at hæve temperaturen i det rum, hvor mikroskopi vil blive udført. Hver af disse alternativer har fordele og ulemper i forbindelse med pris og ydelse.
I den efterfølgende protokol, detalje vi brug af levende celler for at studere hurtig anterograd transport og anterograd spredning af alphaherpes virus gennem brug af rekombinante virusstammer. Realtid levende celler visualiserer capsid, avner, og / eller glycoprotein co-lokalisering af dynamiske strukturer undergår transport inden axoner 11.. Overnight timelapse billeddannelse af opdelte neuronkulturer visualiserer axonal virion udgang og infektion modtagelige celler 12. Protokollerne præsenteres her, er blevet optimeret til brug med vores særlige imaging system, men præsenteres i brede vendinger i forhold til de fire elementer i levende celler. I den diskussion, vivil nærmere nogle af optimeringen, der er nødvendig for en vellykket forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Afsnit 1 - miljøkontrol Betingelser for live-cell fluorescensmikroskopi
- 30 min forud for enhver imaging eksperiment tilslutte og begynde at varme mikroskopbordet top inkubator.
- Tænd mikroskop sendes og epifluorescerende lyskilder, og automatiserede hardware kontrol. Åbn mikroskop kontrol software, NIS Elements, til at forbinde til mikroskopet og begynde køling EM-CCD-kameraet.
- Vedhæft Lens varmere til passende mål (enten 60X eller 100X olieimmersion) Bemærk:. Vælg objektiv baseret på eksperiment type. Den 100X differential interferens kontrast (DIC) er bedst til sporing af anterograd transport virionpartikler forsamlinger, mens 60X fase målet er velegnet til at visualisere anterograd spredning. Lavere forstørrelse, behøver ikke oliebestandighed mål ikke kræver en linse varmere, da de ikke komme i direkte kontakt med prøven.
- Vedhæft etape top inkubator på den motoriserede etape af mi stativet. Sikre en passende indsats, der vil holde prøven er på plads. Fastgør befugtet luft linje fra inkubatoren kontrol til indgangsporten på scenen øverst kuvøse.
- Tænd kuvøse og objektivet varmere kontrol og justere temperatur indstillinger til tidligere verificerede særlige betingelser til målet og prøve, der afbildes (se diskussionen).
- Åben styreventilen på 5% CO 2/95% atmosfærisk beholder til at levere CO 2 suppleret luft til bordets øverste inkubator. Strømningshastigheden skal være mellem 60 og 80 ml gas pr minut. Hurtigere satser vil resultere i en omfattende stikprøve dehydrering trods befugtning kammer.
- Tilføj linse olie til objektiv og straks placere den kultur, der vil blive afbildet i den fase top kuvøse.
- Tillad aekvilibreret temperaturen i kulturen i mindst 10 min. En time foretrækkes, især for overnight billeddannelse beskrevet i punkt 3..
- Seks til otte timer før billeddannelse, inficere en 35 mm dækglas-bund fad af modne, dissocierede SCG neuroner med 1 x 10 6 plakdannende enheder af viruset af interesse (Se tabel 1 for eksempel virus) ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i Taylor et al. 2012a 11.. Hvis testning mere end én virus, off-set vaccinationer med 30-60 min for at tillade billeddannelse af sekventielle prøver på lignende tidspunkter efter infektion.
- Sæt fadet i scenen top inkubator i mindst 10 min før du kører nogen eksperiment. Mens temperaturen ækvilibrerer er brændplanet skiftende og vil have en negativ indvirkning eventuelle billeddiagnostiske eksperimenter.
- Brug transmitteret lys og okularet af mikroskopet, en neuronal celle krop, der har en klart isoleret axonal forlængelse finde. Alternativt kan du bruge den relevante fluorescensbelysning at finde en celle udtrykker detektiontable mængder af fluorescerende proteiner. Det er vigtigt at begrænse eksponeringen af prøven fluorescerende belysning, på dette trin og de efterfølgende trin, på grund af lys induceret celleskade og blegning af fluorescerende proteiner.
- Dæmpe fluorescensbelysning at reducere intensiteten af excitationslyset, som cellerne udsættes for. Engager lyssvækkende Neutral Density (ND) filtre i fluorescensbelysning strålegangen. Til film varede længere end 1 min, et minimum af ND4 skal bruges til at forhindre fotoblegende af fluorescerende proteiner og omfattende foto-skader på axoner. Stærkt fluorescerende strukturer kan typisk være visualiseres med en ND8 filter på plads.
- Brug af mikroskop software (figur 2 og supplerende Movie 1A), tænder lyset-stien til EM-CCD-kamera.
- Bestem optimale billeddiagnostiske og betingelser for hver fluorescerende kanal.
- Starte et live-billede vindue ved hjælp af "Play"-knappen. </ Li>
- Bestem de optimale kameraets eksponering indstillinger for hver fluorescerende protein. Må ikke overstige 300 msek per kanal som bevægelsens aberrationer hurtigt bevægende virionpartikler strukturer vil forekomme. Udnyt EM gevinst af kameraet til en indstilling på 300 (fabrikant anbefalede maksimum gevinst), for at minimere eksponeringen tid og øge detektering af dim signaler. Korrekt eksponeringstider skal producere et billede med lav baggrund intensitet og høj specifikke signaler.
- Efter indstilling eksponeringer og finde en veldefineret region Axon, skal softwaren konfigureres til at udføre automatiseret billede erhvervelse. Stop direkte billedvisning vinduet for at forhindre prøve blegning.
- I NIS Elements software, skal du vælge 6D - Definer / Run Experiment program fra "Programmer" drop down menu.
- I ND købet vinduet, klik på fanen Tid, som vil afgøre hyppigheden af billedet erhvervelsen. Indstil Interval til "Ingen forsinkelse" og varighed til 5 min. The Softwaren vil derefter erhverve billedrammer på højeste frekvens muligt for varighed af 5 min.
- Vælg "Lambda" fanen, som giver valg af forudindstillede hardwarekonfigurationer bruges til flere fluorescerende billede erhvervelse. Klik på det første felt, og i den efterfølgende drop down menu til at vælge en passende hardwarekonfiguration. Gentag for alle fluorescerende proteiner, der skal afbildes.
- Sørg for faner for "XY positioner", "Z-serien" og "stort billede" er fravalgt.
- Over fanerne, skal du vælge rubrikken "Gem til fil" for automatisk at gemme billeder til harddisken i forbindelse med købet. Konfigurere placering og filnavnet af forsøget output fil. Som sekventielle eksperimenter udføres, vil softwaren tilføje et fortløbende nummer i slutningen af den udpegede filnavn.
- Når alle faner er blevet valgt. Indled eksperimentet ved at klikke på "Kør-nu"-knappen.
- Optimere billedet købet sats gennem eksponering indstillinger og image størrelse. Ved hjælp af en lille region af image-stand område vil ofte fremskynde frame erhvervelsesprocent. Definer interesseområdet ved hjælp af ROI værktøj i NIS-Elements, vælge et område mellem 25% og 50% af det samlede billedområde. Alternativt vil kortere eksponeringstider øge frame erhvervelsesprocent, men nedsætter kvaliteten af signalet (se diskussionen).
Afsnit 3 - Overnight Time-lapse Imaging af anterograd Spread Arrangementer
- Fire timer før billedbehandling, inficere en rumopdelt neuronal kultur bygget på en 35 mm μ-parabol. Indpodes neuronale cellelegemer med 1 x 10 6 plakdannende enheder af viruset af interesse (Se tabel 1 for eksempel virus) ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i Taylor et al. 2012b 12..
- Anbring forsigtigt dyrkningsskål ind på scenen top kuvøse. Sikre positionen af målet er sat til side af skålen. Langsomt bringe målsætningen i fokus, sikING målet ikke skubbe op i prøven. Når fokuseringen feltet er blevet identificeret, langsomt flytte målet i midten af skålen, nær den indre barriere demarking indersiden af Axon rum. Under bevægelse, sikrer fokus dybde bevares, og undgå at skubbe op i prøven. Afbøjning af plastic overflade ved målet vil ødelægge axoner og plast.
- Tilsæt ca 2 ml varm (~ 37 ° C) phosphatpufret saltopløsning til dyrkningsskålen uden for Teflon ringen. Dette omgiver neuronale kultur med en ring af PBS for at minimere prøve dehydrering og giver varmeisolering.
- Tillad temperatur i ligevægt i mindst 1 time før initiering automatiseret billede erhvervelse (3.8). Trin 3.5 gennem 3,7 kan konfigureres i løbet af denne tid.
- Begræns intensiteten af belysningen til det lavest mulige niveau ved at inddrage alle neutralfiltre. Dette vil give mulighed for hyppig billede erhvervelse over lange perioder uden overdreven foto-skader. Reduktion belysning vil resultere i lavt signal, der kræver længere eksponering (se diskussionen).
- Brug historiske eksponering indstillinger eller før eksperimentelle set-up generere en parallel fad af inficerede epitelceller udtrykker målet fluorescerende proteiner til at etablere eksponering indstillinger som beskrevet i afsnit 2.5.
- Efter indstilling eksponeringer for de nødvendige kanaler, er det tid til at konfigurere softwaren til automatiseret billede erhvervelse. Stop levende scanningsvindue at begrænse prøve blegning.
- I Elements software (figur 2 og supplerende film 2), skal du vælge 6D - Definer / Run Experiment program fra "Programmer" drop down menu til at opdrage den ND Acquisition vinduet.
- I ND Acquisition vinduet, klik på Time fanen. Indstil intervallet til "5 min." Indstil Varighed til 20 timer. Løkkerne område vil automatisk blive beregnet for antallet af gentagelser af program vil udføre.
- Vælg "Lambda" fanen. Klik på det første felt, og i den efterfølgende drop down menu til at vælge passende lambda-konfiguration til fase kontrast. Gentag for efterfølgende positioner, vælge de relevante konfigurationer for hver fluorescerende protein, der skal afbildes.
- Vælg "stort billede" fanen, som bestemmer parametrene for flere billeder, der skal kombineres i en enkelt større synsfelt. En god størrelse Området består af 5 x 2 billeder ved hjælp af en 7% syning overlap. Dette vil give mulighed for det maksimale antal celler pr position skal afbildes uden at påvirke frekvensen af billedet erhvervelse. Også fravælge afkrydsningsfeltet "Close Active Shutter under Stage bevægelse". Denne indstilling øger hastigheden af overtagelse af ikke at lukke skodder mellem billederne.
- Vælg "XY positioner" fanen, for at identificere flere positioner, der vil blive sekventielt afbildes sideløbende i løbet af natten filmen. Vælg positioner, der angiver centrum point for hvert stort billede område. Vælg 6-8 billedfiler positioner i prøven. Et godt image område vil have små klynger af celler i tæt apposition til klart definerede axoner. Celler bør ikke være stablet oven på hinanden og Axon bundling bør minimeres. Fokuspunktet er cellekernen. Placer målet, således at en klart defineret nuklear kappe ses for størstedelen af cellerne.
- Sørg for "Z-serien" fanen er fravalgt.
- Konfigurere auto-save funktion, som beskrevet ovenfor i afsnit 2.6.5.
- Test eksponering og position indstillinger ved at klikke på "1 gang loop". Vurdere de resulterende billeder til transmitteret lys belysning, fokus og indramning. Hvis fokus er flyttet, skal du nulstille fokus for hver position under XY fanen. Vent 10 min og gentag dette trin, indtil fokus er stabil.
- Når alle indstillinger er kontrolleret og testet, indleder den automatiserede eksperiment ved at klikke på "Kør nu"-knappen.
Afsnit 4 - Image Processing og Export
Data Export
- Datasæt opnået under live-cell imaging af transport eller spredning begivenheder burde eksporteres fra NIS Elements software i almindeligt anvendte filtyper til senere brug i præsentationer og publikationer (supplerende Movie 3). For at eksportere film åbne den relevante rå. ND2 fil i NIS Elements og vælg "split-komponent" for at visualisere de ønskede fluorescerende kanaler. Afspilning filen på et passende hastighed, 5 billeder per sekund er et godt udgangspunkt for visualisering af hurtigt transport.
- Medtag et tidsstempel til at repræsentere en real-time clock under filmafspilning. Højreklik på billedet og vælg Tilføj ND-information. En digital tæller vises i øverste venstre hjørne.
- Rediger tidsstempel til at vise oplysninger. Højreklik på disken og vælg Rediger ND-information. I den efterfølgende pop-up vindue, redigere teksten for at afspejle den fantasing parametre, der er vigtige. Edit skrifttype, farve og størrelse for klarhed.
- Gå til menuen "Rediger" og find "Opret visning snapshot" eller tryk på "x"-tasten. Denne kommando åbner "view snapshot" vinduet. Vælg "gælder for alle rammer" til at generere et 8-bit, RGB, eksport-klar fil, der indeholder fluorescerende kanaler fra hele filmen.
- Gem som en. Avi fil til cross-platform kompatibilitet. Sæt afspilning hastighed 200 msek per ramme. De. Avi filer genereret af NIS Elements kan derefter yderligere komprimeret med andre konvertering software til den ønskede filtype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograd Transport
Anvendelsen af denne protokol til infektioner af dissocierede SCG kulturer med PRV 348 har en rekombinant PRV-stammen udtrykker GFP-US9 og GM-mCherry membranfusionsteknikker proteiner lettet visualisering af anterograd transport af virioner (figur 3 og supplerende Movie 4). Indarbejdelsen af disse fusionsproteiner i viruspartikler resultater i deres opdagelse på at transportere puncta og de førnævnte imaging betingelserne minimere forskydning af hvert fluorfor på en partikel i bevægelse under filter skift. I en tre-minutters scanningsvindue, er der utallige transporterer puncta almindeligt observerede og de store prøvestørrelser til colokalisering analyser hurtigt genereres. Vi har tidligere kvantificeret colokalisering af GFP-US9 den alphaherpes virus axonal målretning protein, med andre strukturelle proteiner ved hjælp af denne metode 11.. Lignende analyser af andre dobbelt recombinant PRV stammer er også blevet beskrevet 11, og seneste arbejde har dokumenteret co-transport af PRV-proteiner med en fluorescens-mærkede vært motor protein i en yderligere forlængelse af denne protokol 21.. Udnytte hurtige skift filter hjul og parrede multi-pass dichroic spejle tillader hurtig sekventiel køb af to eller flere fluorescerende kanaler. Vi kan i øjeblikket opnå to-kanals sekventiel erhvervelse med hastigheder på op til 0,8 billeder per sekund. For enkelt kanal video mikroskopi, som kun er begrænset af den fluorescens eksponeringstid og read-tid på kameraet, kan vi opnå erhvervelsesprocent større end 6 frames per sekund.
Anterograd Spread
At visualisere anterograd spredning begivenheder, indregnes interesseområder visualiseret hver 5 til 10 min for en 20 hr periode, i hvilket tidsrum virioner vil transportere ned og udgang fra axoner, inficerer de nærliggende epitelceller. En repræsentativ ramme fra den store image eren er præsenteret i figur 4A og supplerende Movie 5.. Bemærk rumligt adskilt arten af de fluorescerende protein udtrykkende celler, hvilket indikerer primær infektion fra axoner. Inficerede celler kan spores bagud under filmen at visualisere de fluorescerende capsider, der igangsatte den virusinfektion. Disse individuelle celler kan isoleres fra den store ramme og sporet uden et betydeligt tab af detaljer. Den repræsentative ramme (figur 4B) fra Supplemental Movie 6 afbilder en tid efter virioner har deponeret den fluorescerende capsid i cytoplasmaet.
Dataanalyse
En række forskellige analyser kan udføres på live-cell imaging datasæt, herunder partikel tracking, colokalisering studier og kvantificering af virion spredt begivenheder. Vi udfører ofte vores analyser direkte i NIS Elements software eller bruger en plug-in forlængelse rådighed for ImaGEJ softwarepakke, der gør det muligt. ND2 filtype støtte. Forskellige hypoteser og forsøgsopstillinger nødvendiggøre unikke analysemetoder. Vores gruppe har beskrevet metoder til vurdering colokalisering af fluorescerende proteiner på dynamiske strukturer 11,21 og time-lapse kvantificering af de enkelte partikel spredt begivenheder 10,12,22. Metoderne beskrives i dette manuskript og vores tidligere undersøgelser er fleksible og kan anvendes på forskellige virusinfektioner samt transport af cellulære strukturer, fx mitokondrier 23..
Figur 1. Skematisk af mikroskopi oprettet for levende celler. A) Kultur typer ansat til studier af anterograd transport (dissocieret) og anterograd spread (kammer) hhv. Panel 1 er en fase kontrast billede af en moden, dissocieret Superior Cervikal Ganglier (SCG). Panel 2 er en skematisk afbildning af den opdelte dyrkningssystem, afbilledet i panel 3, med SCG neuroner udpladet i det venstre rum med aksonal fremspring strækker sig under de interne barrierer i den yderste højre kammer. B) Den omvendte epifluorescerende mikroskop og bordets øverste inkubator brugte konfiguration for video mikroskopi eksperimenter. Klik her for at se større figur .
Figur 2. NIS-Elements software interface. Et screenshot af en standard brugergrænseflade i NIS-Elements vises. The Play og Stop knapper styrer live-image vinduet viser de aktuelle hardwarekonfigurationer til billeddannelse samt hvad der i øjeblikket bliver afbildet. På tværs af toppanelet er en serie af optiske konfigurationer, gennemfører forudindstillet hardware SEtilling e r at konfigurere mikroskopet for trans-belyst eller fluorescensdetektion. Kamera kontrol og eksponering indstillinger tillader konfigurationen af kameraets detektering for at optimere billedkvaliteten og hastighed. Alle forsøg er koordineret hjælp ND Acquisition kontrol. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Levende cell imaging af SCG axoner ved 8 timer efter infektion med PRV 348. PRV 348 inficerede neuroner udtrykker GFP-US9 og GM-mCherry membranfusionsteknikker proteiner. Anterograd-transport strukturer i distale axoner er visualiseret i to fluorescerende kanaler, GFP og mCherry. En anterograd-transport struktur (hvid pil) skrider inden Axon som afbildet i de sekventielle billeder taget fra Supplemental Movie 4. De to fluorescerende proteiner er spatialliere modregne grund sekventiel køb af fluorescerende kanaler og den hurtige bevægelse af virale strukturer. Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Overnight timelapse billeddannelse af anterograd spread begivenheder fra inficerede axoner til epitelcelletyper klynger i løbet af en multi-color infektion. Repræsentative billeder fra en enkelt position, stort billede flisebelagt time-lapse film af virion transmission fra PRV 427 inficerede axoner i modtagerlandene epitelceller. A) En flettede billede af den overførte, YFP og RFP fluorescerende billeder ad gangen efter infektion, hvor recipientceller er begyndt at udtrykke YFP-CAAX og VP26-mRFP fusionsproteiner. I det andet panel, er YFP og RFP kanaler vist sammen. Bemærk det store antal mRFP puncta dertildelse med de Axon skrifter. Disse er samlet virioner gennemgår fjerntransport inden axoner (Supplemental Movie 2). Den hvide boks repræsenterer området af interesse fremhævet i del B. B) Repræsentant billede af modtagerens epitelceller indeholdende inficerer capsid forsamlinger (Se også Supplerende Movie 3). Panel 1 er en sammenfletning af de fremsendte og RFP-kanaler. Panel 2 er RFP-kanalen alene. Panel 3 er den RFP-kanalen med en skematisk fremstilling af cellen omrids (solid hvid linje), nucleus (hashet hvid linje) og axoner (blå linjer). Klik her for at se større figur .
Supplerende Movie 1. Software-indstillinger til hurtig, sekventiel erhvervelse af axonale virioner. Trinene er forbundet med at bestemme eksponering indstillinger, konfiguration ND erhvervelse kontrol, og erhverve en hurtig frame erhvervelse movie af fluorescerende virioner undergår axonal transport præsenteres. SCG neuron kultur blev inficeret med PRV 427 otte timer før billeddannelse. Klik her for at se filmen .
Supplerende Movie 2. Software indstillinger for natten billeddannelse af axon-til-celle spredning. De trin, der er forbundet med at konfigurere ND erhvervelse styringer til overnight billeddannelse af axon-til-celle spredning begivenheder præsenteres. Klik her for at se filmen .
Supplerende Movie 3.. Konvertering af. ND2 filer til præsentable film formater. Trinene er forbundet med at konvertere de rå data. ND2 filer i enten. Avi eller. Mov filformater til præsentation ved hjælp af fælles video-afspillere. Klik hendee for at se filmen.
Supplerende Movie 4. Levende cell imaging af SCG axoner ved 8 timer efter infektion med PRV 348. Klik her for at se filmen .
Supplerende Movie 5.. Stort billede område natten billeddannelse af axon-til-celle spredning. Klik her for at se filmen .
Supplerende Movie 6.. Udvidet område med overnight timelapse billeddannelse af axon-til-celle spredning. Klik her for at se filmen .
| Strain | Genotype | Utility |
| PRV 341 | GFP-US9 (membran) / mRFP-Vp26 (capsid) Virion transport eksperimenter 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (membran) / gM-mCherry (membran) | Virion transport eksperimenter 11 |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (capsid) / YFP-CAAX (cellulære plasmamembranen) | Anterograd spredning eksperimenter 10 |
Tabel 1. Nyttige rekombinante PRV stammer, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner.
| Navn | Company | Katalognummer |
| 35 mm glas bunden dyrkningsskål | Mattek Corporation, Ashland, MA | P35G-1,5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81.156 |
| Mikroskop krop | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motoriseret mikroskop XY-scene | Prior Scientific, Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motoriseret filter hjul | Prior Scientific | HF110 10 position filterhjul |
| Fluorescerende lyskilde | Lumen Dynamics, Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescens filter sæt | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-CCD-kamera | Andor Technology USA, South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide etape top miljømæssige inkubator | Levende Cell Instrumenter, Seoul, Sydkorea | TC-L-10 |
| Objektiv varmelegeme | Bioptecs, Butler, PA | 150.803 Controller150819-12-08 Heater |
| Analyse software | Nikon Instruments Inc., Melville, NY | NIS Elements |
Tabel 2. Specifikke reagenser og udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med levende celler er at observere biologiske processer, som de opstår, uden signifikant ændring af loven for observation. Dette mål opnås ved at optimere tre variabler: miljøkontrol, hastighed billedbehandling og fluorescens belysning. Disse indbyrdes afhængige variable skal afbalanceres for at opnå levedygtige billeddannelse forhold. De præsenterede protokoller udnytte særlige betingelser til at producere de repræsentative resultater. Vi vil kort diskutere miljøkontrol og observationelle skader, før angivelse af de specifikke præsenterede metoder.
Etablering og opretholdelse af relevante biologiske forhold på mikroskopet er afgørende for en vellykket overvågning af cellulære begivenheder. Opnåelse målbetingelserne er afhængig af en række variabler, som er specifikke for mikroskopet og inkubator konfiguration. Alle inkubator indstillinger skal valideres ved hjælp af en uafhængig temperatur måling af en mock prøve i inkubatoren tagetved flere positioner, herunder, punktet af objektive kontakt midten af dyrkningsskålen, og kanten af dyrkningsskålen. Indstillinger skal optimeres for at minimere områder, der er mere end 1 ° C varmere end 37 ° C, samt at opretholde en temperatur nær 37 ° C ved punktet for objektiv kontakt. Hver kultur skål og objektiv konfiguration, der anvendes til billeddannelse skal testes og valideres før eksperimenteren. Ideelt set ville alle prøver overvåges for temperatur under billeddannelse, men dette viser sig upraktisk for en række systemer og kompliceres når biologisk farlige midler anvendes. Validering af inkubationsbetingelser er vigtig, da inkubere prøverne ved for lav eller for høj en temperatur kan resultere i kunstig resultater eller hurtig cellulær nedbrydning.
Identifikation og minimering resultater fra de observationelle skader er vigtig for protokol udvikling. Hyppig belysning kan ændre biologiske processer, IRReversibly inaktivere fluorescerende molekyler, eller fremkalde en række cellulære død veje. Validering temperatur er vigtigt at gengive biologisk lignende betingelser på scenen toppen analog til en standard vævskultur inkubator. Controlling for virkningen af hyppig belysning er mere vanskelig og ofte kræver iterativ trial and error praksis. Sammenligning parallelle prøver holdes i vævskultur kuvøser for morfologiske forskelle eller biologisk relevante ændringer kan afgøre, om levende cell imaging forhold medfører betydelig cellulær toksicitet. I eksperimenterne beskrevet her, har vi overvåget produktivitet virusinfektion gennem virustiter samt omfanget af viral spredning mellem celler.
Opnåelse real-time scanning af hurtig transport i axoner kræver optimering af billedet erhvervelse hastighed langs fluorescensintensitet belysning. Hastigheden af billedet erhvervelse bestemmes af camera indstillinger og mikroskop hardware, især når indsamler flere fluorescerende kanaler sekventielt. Belysningsintensiteten påvirker kvaliteten af fluorescerende signaler og satsen på overtagelsestidspunktet. Større belysningsintensiteten letter visualisering af fluorescerende proteiner, især for dem, der inkorporere partikler i små mængder. Men prøven vil blege hurtigere og lider af øget fototoksisk skader. Reduktion belysning gennem neutralfiltre kræver længere eksponeringstider, reducere hyppigheden af billedet erhvervelse og potentielt forårsage rumlige deformation af fluorescerende strukturer på grund af deres bevægelse under afsløring. At finde den rette balance i belysningsintensiteten med billede erhvervelse frekvens høj grad afhænger af fluorescerende protein signal og hastigheden af motilitet af strukturen blive undersøgt. Det er kun nødvendigt at erhverve nok signal til at skelne de fluorescerende strukturer over baggrunden, snarere endproducere billeder med høj kontrast, der kræver længere eksponeringstider.
Overnight timelapse billeddannelse udnytter en lignende hardwarekonfiguration som real-time live-cell imaging, men er væsentligt påvirket af akkumulerede foto-skader i forbindelse med en langsigtet, hyppige fluorescensbelysning. I modsætning til real-time scanning, er behovet for at begrænse fluorescensbelysning intensitet altafgørende, og alle andre variable er modificeret til at redegøre for denne begrænsning. Begrænsning intensiteten af eksponeringen tillader hyppigere belysning af multiple fluorescerende kanaler uden signifikant at beskadige de afbildede celler. Anterograd axon-til-celle-spredning begivenheder er tidsmæssigt og rumligt forskellige, så billeddannelse et stort område er afgørende for at fange så mange af disse sjældne hændelser som muligt.
En række publikationer har givet grundige oversigter og anbefalinger til levende celler praksis 24-26. Protokollerne beskrevet her repræsenent vores bedste forsøg på at minimere virkningen af fluorescensimagografi på viral replikation, transport og spredning og samtidig bevare de væsentlige kendetegn ved virusinfektion. Ved at kombinere disse protokoller med omhyggelig udvikling af fluorescerende fusionsproteiner og robuste neuronale kulturer har besvaret mine grundlæggende spørgsmål om herpesvirus infektion og patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
LWE og RK understøttes af det amerikanske National Institutes of Health tilskud R37 NS033506-16 og R01 NS060699-03. MPT blev støttet af et American Cancer Society postdoc Fellowship (PF-10-057-01-MPC). De råd og viden om Dr. Matthew Lyman og Dr. Oren Kobiler var medvirkende til at designe mikroskopet konfiguration og levende celle billeddiagnostiske metoder. Vi har også udvide tak til Neal Barlow og Brian T. Kain for Nikon Instruments for deres tekniske assistance ved køb, installation og performance af mikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
