Summary
L'imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l'analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l'infezione di neuroni primari.
Abstract
Progressi nelle tecniche di microscopia di fluorescenza di cellule vive, così come la costruzione di ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti hanno permesso visualizzazione in tempo reale di trasporto e diffusione del virus alphaherpes infezione di neuroni. L'utilità di nuove proteine di fusione fluorescenti a membrana virale, in involucri, e capsidi, in collaborazione con l'imaging cellulare dal vivo, identificato assemblee di particelle virali in fase di trasporto all'interno di assoni. Utensili simili sono stati impiegati con successo per analisi di cellula-cellula diffusione di particelle virali per quantificare il numero e la diversità di virioni trasmessi tra le cellule. È importante sottolineare che le tecniche di imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado e la diffusione producono una ricchezza di informazioni tra le velocità delle particelle di trasporto, distribuzioni di particelle, e le analisi temporali della localizzazione delle proteine. Accanto a classici tecniche genetiche virali, queste metodologie hanno fornito spunti criticiin importanti questioni meccanicistici. In questo articolo descriviamo in dettaglio i metodi di imaging che sono stati sviluppati per rispondere alle domande fondamentali della alphaherpes trasporto e diffusione del virus.
Introduction
L'infezione del sistema nervoso periferico (SNP) di alphaherpes virus come il virus herpes simplex (HSV) -1, -2, e virus pseudorabies (PRV) prevede diversi passaggi intricati e altamente regolamentato in tutto il ciclo vitale del virus. Trasporto all'interno neuroni del sistema nervoso periferico è fondamentale durante gli eventi di entrambi infezione virale primaria e la successiva diffusione inter-host. I meccanismi molecolari che modulano due componenti del ciclo di vita virale; trasporto diretto delle assemblee virali di distanza dal corpo cellulare all'interno di assoni (trasporto anterogrado) e la successiva trasmissione dei virioni di cellule sensibili (diffusione anterograda) sono importanti per la comprensione herpesvirus patogenesi.
Il trasporto e l'uscita di particelle virali in neuroni dipende montaggio di un virione maturo infettiva 1,2. Saggi precedentemente fissato, tra l'immunofluorescenza (IF) e la microscopia elettronica (EM), sono stati usati per studiare lo stato di assemblaggio delle particelle e la protinterazioni ein connessi ai trasporti virione e la diffusione 3-6. Tuttavia la natura dinamica del trasporto di virioni e manufatti sperimentali introdotte dalla fissazione chimica confusa l'interpretazione delle immagini fisse 7,8. Recentemente, un certo numero di proteine di fusione virale-fluorescenti sono state descritte per HSV e PRV cui impatti trascurabili sulla funzionalità delle proteine. Proteina fluorescente verde (GFP) e proteine fluorescenti rossi (mCherry o MRFP) fluorofori sono spesso in coppia per consentire l'imaging di due dei tre componenti strutturali di un virione maturo: capside, tegumento, e glicoproteina 9-11. Imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado utilizzando virus dual-etichettati visualizza lo stato di assemblaggio delle particelle virali durante il trasporto. Fluoroforo simili esprimendo ceppi virali vengono utilizzati per visualizzare il numero e la diversità dei genomi virali a seguito diffusione 12,13. Le proprietà delle proteine fluorescenti (recensione in 14,15) di grande impattola capacità di visualizzare assemblee virali o cellulari. Le proprietà intrinseche della proteina fluorescente, tra cui auto-interazione e di stabilità, devono essere considerati durante la progettazione e la sperimentazione di nuovi fusioni proteiche per la conservazione della funzionalità di tipo selvaggio.
In concomitanza con la fusione di proteine fluorescenti, due ben caratterizzati in sistemi di colture cellulari in vitro sono impiegate per l'imaging cellulare dal vivo di infezione da herpes virus: dissociata 16 e 17 compartimenti stagni (Figura 1A) ratto superiori gangli (SCG) neuroni cervicali. In entrambi i sistemi, embrione del SCG sono sezionati, dissociato da corpi cellulari singoli, e cromato per la coltura in vitro 18. Neuroni SCG sono parte del sistema nervoso autonomo e possono essere facilmente coltivate e differenziati per il fattore di crescita neuronale (NGF) in un maturo polarizzato stato ex vivo. Neuroni SCG dissociate formano una rete estesa di assoni che permette fo la visualizzazione di particelle virali in quanto sottoposti trasporto anterogrado 6. Culture SCG compartimenti stagni forniscono isolamento fluidico del corpo cellulare dei neuroni (vano S) e termini assoni distali (vano N) 19. Un certo numero di protocolli dettagliati per la costruzione e l'uso di neuroni compartimenti utilizzando originale 20 o modificati Campenot camere di 17 sono stati pubblicati in precedenza. Isolamento fluidico permette di infezione selettiva dei corpi cellulari neuronali e l'individuazione di virioni progenie dopo il trasporto a isolate Termini assoni. Placcatura cellule epiteliali nei termini prima dell'infezione fornisce cellule riceventi per la diffusione dell'infezione virale.
Ci sono molti elementi essenziali importanti per tutti gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, ma la più rilevante per i nostri protocolli sono: acquisizione automatica immagine, illuminazione fluorescente, velocità di formazione immagine e di controllo ambientale. Per tutti gli esperimenti di imaging, utilizziamorovesciata, automatizzato, microscopio a epifluorescenza illuminazione (Figura 1B). Il microscopio è costruito attorno al Nikon Eclipse Ti base e si avvale di un certo numero di sistemi motorizzati controllati da computer per riconfigurare rapidamente il microscopio durante l'acquisizione dell'immagine automatizzato. Per l'illuminazione a fluorescenza, usiamo un ampio spettro di mercurio lampada ad arco che può essere attenuato con filtri a densità neutra lungo il sentiero dell'illuminazione. Filtri di eccitazione limitano lo spettro di illuminazione fluorescente e quando accoppiato con multi-pass specchi dicroici e filtri di emissione di fluorescenza visualizzare i composti fluorescenti specifici. I filtri di eccitazione e di emissione sono montati, veloce commutazione ruote portafiltri indipendenti per consentire una rapida acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti differenti. La velocità di acquisizione dell'immagine è ulteriormente rafforzata con una telecamera EM-CCD sensibile e veloce, utile per il rilevamento di segnali di bassa intensità e breve immagine tempi di lettura. Controllo ambientale sulla microscope è raggiunto con un alto stadio riscaldato incubatore e un riscaldatore lente obiettivo di mantenere i campioni a temperature elevate, mentre un umidificata e CO 2 atmosfera arricchita viene passato nell'incubatore. Il microscopio è tenuto in una stanza buia con temperatura ambiente mantenuto vicino ai 25 ° C e luce esterna minimizzato con tende oscuranti su tutte le finestre. I seguenti protocolli descrivono l'uso di questo sistema per il trasporto anterogrado e dosaggi diffusione.
Un certo numero di alternative esistono per il controllo per le variabili di imaging cellulare dal vivo. Il controllo delle impostazioni di microscopia può essere eseguita manualmente o tramite sistemi automatizzati dipendenti dal software proprietario. Illuminazione a fluorescenza può essere ottenuto con sorgenti laser alogeno, LED o. La velocità di formazione immagine viene modificata dalla velocità di commutazione filtro e il tempo di visualizzare il segnale con il sistema di rilevamento associato. Controllo ambientale può essere realizzato con hardware specializzato sul mifase croscope, recinto di tutto o parte del microscopio in una scatola riscaldata e umidificata, o elevando la temperatura della stanza in cui verrà eseguita microscopia. Ciascuna di queste alternative presenta vantaggi e svantaggi relativi a costi e prestazioni.
Nel protocollo successivo, abbiamo dettaglio l'uso di cellule vive per studiare rapido trasporto anterogrado e la diffusione di anterograda alphaherpes virus attraverso l'uso di ceppi virali ricombinanti. In tempo reale l'imaging cellulare dal vivo visualizza capside, tegumento, e / o della glicoproteina co-localizzazione su strutture dinamiche in fase di trasporto all'interno assoni 11. Pernottamento timelapse di imaging di colture neuronali compartimenti visualizza assonale uscita virione e l'infezione di cellule suscettibili 12. I protocolli presentati qui sono stati ottimizzati per l'uso con il nostro sistema di imaging particolare, ma sono presentati in termini generali relativi ai quattro elementi di imaging cellulare dal vivo. Nella discussione abbiamovolontà ulteriore dettaglio alcuni ottimizzazione che è necessario per la sperimentazione di successo.
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Protocol
Sezione 1 - Condizioni di controllo ambientale per la microscopia a fluorescenza live-cell
- 30 min prima di ogni esperimento di imaging collegare e iniziare il riscaldamento del microscopio stadio top incubatore.
- Accendere il microscopio, fonti di luce trasmessa e epifluorescente e controlli hardware automatizzati. Aprire il software di controllo del microscopio, NIS Elements, per la connessione al microscopio ed iniziare il raffreddamento della macchina EM-CCD.
- Fissare Lens più caldo per obiettivo appropriato (60X o 100X immersione in olio). Nota: Selezionare lente dell'obiettivo in base a tipo di esperimento. Il contrasto di interferenza differenziale 100X (DIC) è meglio per il monitoraggio di anterogradi assemblee virioni trasportano mentre l'obiettivo di fase 60X è adatto a visualizzare diffusione anterograda. Un ingrandimento inferiore, obiettivi ad immersione non petrolifere non richiedono una lente più caldo in quanto non entrano in contatto diretto con il campione.
- Attaccare stadio superiore incubatore sul palco motorizzato di mi croscope. Assicurare l'inserto appropriato che conterrà il campione è a posto. Collegare la linea di aria umidificata dal controllo incubatrice alla porta di ingresso sul palcoscenico superiore dell'incubatrice.
- Accendere incubatore e lente controlli più caldi e regolare le impostazioni di temperatura alle condizioni precedentemente verificati specifici per l'obiettivo e il campione viene ripreso (vedi discussione).
- Aprire la valvola di controllo del 5% di CO 2 / serbatoio atmosferico del 95% per fornire CO 2 dell'aria integrato per mettere in scena top incubatore. La portata deve essere compresa tra 60 e 80 ml di gas al minuto. Tassi più veloci si tradurrà in una vasta disidratazione del campione, nonostante la camera di umidificazione.
- Aggiungere olio lente per lente dell'obiettivo e collocare immediatamente la cultura che verrà ripreso nella fase top incubatore.
- Raggiungere l'equilibrio di temperatura in coltura per un minimo di 10 min. Un'ora è preferito, in particolare per l'imaging notte descritto nella Sezione 3.
- Da sei a otto ore prima di imaging, infettare un piatto di 35 mm coprioggetto-fondo maturo, dissociate neuroni SCG con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012A 11. Se testare più di un virus, vaccinazioni off-set da 30-60 min per consentire l'imaging di campioni sequenziali a volte simile post infezione.
- Inserire piatto in fase top incubatore per un minimo di 10 minuti prima di eseguire qualsiasi esperimento. Mentre la temperatura si equilibra, il piano focale si sta spostando e avrà un impatto negativo eventuali esperimenti di imaging.
- Utilizzando la luce trasmessa e l'oculare del microscopio, trovare un corpo cellulare neuronale che ha una estensione assonale chiaramente isolato. In alternativa, utilizzare l'appropriata illuminazione a fluorescenza per trovare una cellula che esprime DATECimporti della tabella di proteine fluorescenti. È importante limitare l'esposizione del campione ad illuminazione fluorescente, in questo passaggio e passaggi successivi, a causa della luce danno cellulare indotto e candeggio delle proteine fluorescenti.
- Attenuare illuminazione a fluorescenza per ridurre l'intensità della luce di eccitazione a cui le cellule sono esposte. Impegnarsi luce attenuando densità neutra (ND) i filtri nel percorso luce di illuminazione a fluorescenza. Per i filmati che durano più di 1 min, un minimo di ND4 devono essere utilizzati per prevenire fotometabolismo di proteine fluorescenti e ampia foto-danneggiamento degli assoni. Strutture altamente fluorescenti in genere può essere visualizzato con un ND8 filtro in posizione.
- Utilizzando il software microscopio (Figura 2 e Supplemental Movie 1A), accendere la luce-percorso alla telecamera EM-CCD.
- Determinare i tempi di imaging e le condizioni ottimali per ogni canale fluorescente.
- Avviare una finestra immagine dal vivo utilizzando il pulsante "Play". </ Li>
- Determinare le impostazioni di esposizione della fotocamera ottimali per ogni proteina fluorescente. Non superare i 300 ms per canale come aberrazioni dinamiche di strutture virioni rapido movimento si verificherà. Utilizzare il guadagno EM della fotocamera per un ambiente di 300 (raccomandati dal produttore guadagno massimo), per ridurre al minimo il tempo di esposizione e migliorare il rilevamento dei segnali dim. Tempi di esposizione corretta dovrebbe produrre un'immagine con bassa intensità di fondo e segnali ad alta specifiche.
- Dopo aver impostato esposizioni e trovare una regione ben definita di assone, il software deve essere configurato per eseguire l'acquisizione di immagini automatizzato. Fermare la finestra di imaging dal vivo per evitare campione sbiancamento.
- Nel software NIS Elementi, selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal "Applicazioni" menu a discesa.
- Nella finestra di acquisizione del ND, fare clic sulla scheda Ora che determinerà la frequenza di acquisizione delle immagini. Impostare l'intervallo su "No Delay" e la durata di 5 min. Thsoftware e Viene quindi acquisire fotogrammi dell'immagine alla massima frequenza possibile per la durata di 5 min.
- Selezionare la scheda "Lambda", che permette di selezionare le configurazioni hardware pre-impostati utilizzati per l'acquisizione di immagine multipla fluorescente. Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa per selezionare una configurazione hardware appropriato. Ripetere l'operazione per tutte le proteine fluorescenti per essere ripreso.
- Assicurarsi che le schede per "XY Posizioni", "Z-Series" e "Grande immagine" sono de-selezionati.
- Sopra le schede, selezionare la casella "Save to File" per salvare automaticamente le immagini sul disco rigido durante l'acquisizione. Configurare il percorso e il nome file del file di output esperimento. Come esperimenti vengono eseguiti in sequenza, il software verrà aggiunto un numero sequenziale alla fine del nome file designato.
- Una volta che tutte le schede sono state selezionate. Avviare l'esperimento facendo clic sul pulsante "Run-Now".
- Ottimizzare la velocità di acquisizione delle immagini attraverso le impostazioni di esposizione e imagdimensione e. Usando una piccola regione dell'area dell'immagine-grado spesso accelerare velocità di acquisizione fotogrammi. Definire la regione di interesse con lo strumento ROI nel NIS-Elements, selezionando un'area compresa tra il 25% e il 50% della superficie totale dell'immagine. In alternativa, i tempi di esposizione più brevi potranno aumentare i tassi di acquisizione del telaio, ma diminuisce la qualità del segnale (vedi discussione).
Sezione 3 - Pernottamento Time-lapse imaging di anterograda spread Eventi
- Quattro ore prima di imaging, infettano una cultura neuronale compartimenti costruiti in 35 mm μ-Dish. Seminare corpi cellulari neuronali con 1 x 10 6 unità formanti placca del virus di interesse (Vedi Tabella 1 per esempio i virus) con il metodo descritto in Taylor et al. 2012b 12.
- Posizionare delicatamente piatto cultura nella fase top incubatore. Garantire la posizione dell'obiettivo è impostato sul lato del piatto. Portare lentamente l'obiettivo a fuoco, assicuzione l'obiettivo non spinge fino nel campione. Quando il campo fuoco è stato identificato, spostare lentamente l'obiettivo verso il centro del piatto, vicino alla barriera interna demarking il lato interno del vano assone. Durante il movimento, assicurano la profondità fuoco viene mantenuta ed evitare spingendo nel campione. Flessione della superficie plastica dall'obiettivo danneggiare gli assoni e la plastica.
- Aggiungere circa 2 ml di calda (~ 37 ° C), tampone fosfato salino al piatto cultura esterno dell'anello Teflon. Questo circonda la coltura neuronale con un anello di PBS per minimizzare campione disidratazione e fornire isolamento termico.
- Attendere che la temperatura si stabilizzi per almeno 1 ora prima di iniziare l'acquisizione di immagini automatica (3.8). Passi 3.5 tramite 3.7 possono essere configurati in questo periodo.
- Limitare l'intensità della luce al livello più basso possibile per coinvolgere tutti i filtri a densità neutra. Ciò consentirà l'acquisizione di immagini frequente over lunghi periodi di tempo senza eccessivi foto-danneggiamento. Ridurre l'illuminazione si tradurrà in basso segnale, richiedendo esposizioni più lunghe (vedi discussione).
- Utilizzare le impostazioni di esposizione storici o prima di set-up sperimentale generare un piatto parallelo di cellule epiteliali infettate esprimono le proteine fluorescenti bersaglio per stabilire le impostazioni di esposizione, come descritto nella sezione 2.5.
- Dopo aver impostato fidi ai canali necessari, è tempo di configurare il software per l'acquisizione delle immagini automatizzata. Fermare la finestra di imaging dal vivo per limitare campione sbiancamento.
- Nel software di elementi (Figura 2 e film supplementare 2), selezionare il 6D - Definire / Esegui applicazione Experiment dal "Applicazioni" menu a tendina per visualizzare la finestra di acquisizione del ND.
- Nella finestra di acquisizione ND, fare clic sulla scheda Ora. Impostare l'intervallo di "5 min". Impostare la durata di 20 ore. Il campo loop verrà calcolata automaticamente per il numero di ripetizioni del program si esibirà.
- Selezionare la scheda "Lambda". Fare clic sulla prima casella e nel successivo menu a discesa selezionare la configurazione lambda appropriato per contrasto di fase. Ripetere l'operazione per le posizioni successive, selezionando le impostazioni appropriate per ciascuna proteina fluorescente per essere ripreso.
- Selezionare la scheda "Grande immagine", che determina i parametri di immagini multiple per essere combinati in un unico grande campo di vista. Una zona di buone dimensioni composto da 5 x 2 immagini utilizzando un 7% di sovrapposizione cuciture. Ciò consentirà il massimo numero di celle per posizione per essere ripreso senza influire sulla frequenza di acquisizione delle immagini. Inoltre, deselezionare la casella di controllo per "Shutter Chiudi attivo durante il movimento Stage". Questa opzione aumenta la velocità di acquisizione da parte di non chiudere persiane tra le immagini.
- Selezionare la scheda "XY posizioni", per identificare più posizioni che verranno sequenzialmente imaged in parallelo durante il corso del film durante la notte. Selezionare le posizioni che definiscono il centro Point per ogni grande area dell'immagine. Selezionare 6-8 posizioni immagine del campione. Una buona zona immagine avrà piccoli gruppi di cellule in stretta apposizione di assoni chiaramente definiti. Cellule non dovrebbero essere impilati uno sopra l'altro e assone bundling dovrebbero essere minimizzati. Il punto di messa a fuoco è il nucleo della cellula. Posizionare l'obiettivo tale che un involucro nucleare chiaramente definito è visto per la maggior parte delle cellule.
- Assicurarsi che la scheda "Z-Series" è deselezionata.
- Configurare la funzione di salvataggio automatico, come descritto sopra nella sezione 2.6.5.
- Testare l'esposizione e le impostazioni di posizione con "1 ciclo di tempo". Valutare le immagini risultanti per l'illuminazione a luce trasmessa, messa a fuoco e l'inquadratura. Se il focus si è spostato, reimpostare la messa a fuoco per ogni posizione nella scheda XY. Attendere 10 minuti e ripetere questo passaggio fino a fuoco è stabile.
- Dopo che tutte le impostazioni sono stati verificati e testati, avviare l'esperimento automatica facendo clic sul pulsante "Esegui ora".
Sezione 4 - Elaborazione di immagini e di esportazione
Data Export
- Set di dati ottenuti durante live-cell imaging di eventi di trasporto o di diffusione devono essere esportati dal software NIS Elements in tipi di file comunemente utilizzati per un successivo utilizzo in presentazioni e pubblicazioni (Supplemental Movie 3). Per esportare i filmati aprire l'appropriato cruda ND2 file. Nel NIS Elements e selezionare la visualizzazione "split-componente" per visualizzare i canali desiderati fluorescenti. La riproduzione del file a una velocità adeguata; 5 fotogrammi al secondo è un buon punto di partenza per la visualizzazione di fast-trasporti.
- Includere un timestamp per rappresentare un orologio in tempo reale durante la riproduzione del filmato. Fai clic destro sull'immagine e selezionate, Add-informazione ND. Un contatore digitale apparirà nell'angolo in alto a sinistra.
- Modificare il time-stamp per visualizzare le informazioni. Fare clic destro sul bancone e selezionare Modifica informazioni-ND. Nella successiva finestra di pop-up, modificare il testo in modo da riflettere l'immaginariong parametri che sono importanti. Modifica del carattere, colore e dimensione per chiarezza.
- Vai al menu "Modifica" e trovare "Crea vista istantanea" oppure premere il tasto "x". Questo comando apre la finestra "vista istantanea". Selezionare "Applica a tutti i fotogrammi" per generare un 8-bit, RGB, file di esportazione-ready contenente i canali fluorescenti da tutto il film.
- Salva come file. AVI per la compatibilità cross-platform. Impostare la velocità di riproduzione a 200 msec per fotogramma. I file avi. Generati da NIS elementi possono poi essere ulteriormente compressi con altri software di conversione nel tipo di file desiderato.
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Representative Results
Anterograda Trasporti
L'applicazione di questo protocollo per le infezioni delle dissociate culture SCG con PRV 348, un ceppo ricombinante PRV esprimono GFP-US9 e proteine di fusione della membrana GM-mCherry, ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado di virioni (Figura 3 e Movie supplementare 4). L'incorporazione di queste proteine di fusione in particelle virali risultati nella loro rilevazione sul trasporto puncta, e le condizioni di imaging suddette minimizzare l'offset di ciascun fluoroforo su una particella in movimento durante il cambio filtro. In una finestra di imaging di tre minuti, numerosi puncta trasporto sono comunemente osservati e le dimensioni del campione di grandi dimensioni per le analisi colocalizzazione sono generati rapidamente. Abbiamo precedentemente quantificato la colocalizzazione di GFP-US9, il virus alphaherpes assonale di targeting di proteine, con altre proteine strutturali che utilizzano questo approccio 11. Analisi delle altre due recombinant PRV ceppi sono stati descritti anche 11, e il lavoro recente ha documentato il co-trasporto di proteine PRV con una proteina fluorescente motore ospite taggato in una ulteriore proroga di questo protocollo 21. Utilizzando commutazione rapida ruote portafiltri e appaiati specchi dicroici multi-pass permette una rapida acquisizione sequenziale di due o più canali fluorescenti. Siamo in grado di realizzare al momento di acquisizione sequenziale a due canali, con velocità fino a 0,8 fotogrammi al secondo. Per singolo microscopia video canale, che è limitata solo dalla fluorescenza tempo di esposizione e tempo di lettura della telecamera, possiamo ottenere velocità di acquisizione maggiori di 6 fotogrammi al secondo.
Diffusione anterograda
Per visualizzare gli eventi di diffusione anterograda aree di interesse sono visualizzati ogni 5 a 10 minuti per un periodo di 20 ore, durante le quali virioni di tempo vi trasporterà verso il basso e l'uscita da assoni, infettando le vicine cellule epiteliali. Un fotogramma rappresentante l'immagine di grandi dimensioni sonouna è presentato in Figura 4A e Movie Supplemental 5. Notare la natura spazialmente separato delle cellule esprimenti proteine fluorescenti, indicativo di infezione primaria da assoni. Cellule infettate possono essere monitorati all'indietro durante il film per visualizzare le capsidi fluorescenti che ha avviato l'infezione virale. Queste singole cellule possono essere isolate dalla grande telaio e tracciati senza una significativa perdita di dettaglio. Il telaio rappresentante (Figura 4B) dal film Supplemental 6 raffigura un momento dopo virioni hanno depositato il capside fluorescente nel citoplasma.
Analisi dei dati
Una gamma di diverse analisi può essere eseguita su insiemi di dati live-cell imaging tra cui il monitoraggio delle particelle, studi di colocalizzazione, e la quantificazione degli eventi di diffusione virioni. Spesso svolgiamo le nostre analisi direttamente nel software NIS Elements o utilizza un plug-in estensione disponibile per l'Imapacchetto software che consente GEJ. ND2 sostegno tipo di file. Diverse ipotesi e configurazioni sperimentali richiedono metodi analitici unici. Il nostro gruppo ha descritto i metodi per la valutazione co-localizzazione delle proteine fluorescenti su strutture dinamiche 11,21 e time-lapse quantificazione dei singoli eventi di diffusione di particelle 10,12,22. Le metodologie descritte in questo manoscritto e nostri studi precedenti sono flessibili e possono essere applicate alle infezioni virali differenti così come il trasporto di strutture cellulari, ad esempio mitocondri 23.
Figura 1. Schema di microscopia istituito per l'imaging cellulare dal vivo. A) Tipi di Cultura impiegati per studi di trasporto rispettivamente anterograda (dissociato) e la diffusione anterograda (a camera). Pannello 1 è una fase di contrasto immagine di un maturo, dissociato gangli cervicale superiore (SCG). Pannello 2 è uno schema del sistema di coltura compartimentato, raffigurato nella pannello 3, con i neuroni SCG piastrate nel vano sinistro con proiezioni assonale estendentesi sotto le barriere interne nel vano a destra. B) Il microscopio invertito e epifluorescente stadio configurazione top incubatore utilizzato per esperimenti di microscopia video. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Viene visualizzato NIS-Elements interfaccia software. Uno screenshot di una interfaccia utente standard di NIS-Elements. I pulsanti Play e Stop controllano la finestra live-immagine raffigurante le configurazioni hardware correnti per l'imaging, così come ciò che è in corso di acquisire. Attraverso il pannello superiore sono una serie di configurazioni ottiche che implementano preimpostato hardware SEraccordi per configurare il microscopio per il riconoscimento trans-illuminato o fluorescenza. Il controllo della telecamera e le impostazioni di esposizione consentono la configurazione di rilevamento della fotocamera per ottimizzare la qualità delle immagini e la velocità. Tutti gli esperimenti sono coordinati con i comandi di acquisizione ND. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Imaging cellulare dal vivo di assoni SCG a 8 ore post-infezione con PRV 348. PRV 348 neuroni infetti esprimono la GFP-US9 e GM-mCherry proteine di fusione della membrana. Strutture anterograda-trasportano all'interno assoni distali sono visualizzati in due canali fluorescenti, GFP e mCherry. Una struttura anterograda-trasporto (freccia bianca) progredisce all'interno dell'assone come raffigurato nelle immagini sequenziali tratte da film supplementare 4. Le due proteine fluorescenti sono Spätiallearsi off-set a causa di acquisizione sequenziale dei canali fluorescenti e la rapida circolazione delle strutture virali. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Pernottamento timelapse di imaging di eventi spread anterogradi da assoni infetti a gruppi di cellule epiteliali nel corso di una infezione a più colori. Immagini rappresentative di una posizione unica, grande immagine piastrellata filmato time-lapse di trasmissione virione da PRV 427 assoni infetti nelle cellule epiteliali dei destinatari. A) Una immagine unita delle immagini fluorescenti trasmessa, YFP e RFP in un post infezione tempo in cui cellule riceventi stanno cominciando a esprimere il YFP-CAAX e proteine di fusione VP26-MRFP. Nel secondo pannello, i canali YFP e RFP vengono mostrati insieme. Notate il grande numero di MRFP puncta ASSOri dei singoli tratti di assoni. Questi sono virioni assemblati in fase di trasporto a lunga distanza all'interno degli assoni (Supplemental Movie 2). La scatola bianca rappresenta l'area di interesse evidenziata a parte B. B) immagine rappresentativa delle cellule epiteliali recipiente contenente infettare assemblee del capside (Vedi anche Movie supplementare 3). Pannello 1 è una fusione dei canali trasmessi e RFP. Pannello 2 è il canale RFP solo. Pannello 3 è il canale di richiesta di offerta con una rappresentazione schematica del profilo cellulare (solida linea bianca), nucleo (linea bianca hash), e gli assoni (linee blu). Clicca qui per ingrandire la figura .
Supplemental Movie 1. Impostazioni del software per una rapida, l'acquisizione sequenziale dei virioni assonale. Gli passi associata a determinare le impostazioni di esposizione, come configurare i controlli di acquisizione ND, e l'acquisizione di una struttura rapida acquisizione moVie di virioni fluorescenti sottoposti a trasporto assonale è presentato. La cultura SCG neurone è stato infettato con PRV 427 otto ore prima di imaging. Clicca qui per vedere film .
Supplemental Movie 2. Le impostazioni del software per tutta la notte l'imaging di diffusione assone-cellula. Gli passaggi associati a configurare i controlli di acquisizione ND per una notte l'imaging di assone-cellula eventi spread sono presentati. Clicca qui per vedere film .
Supplemental Movie 3. Conversione di. ND2 file in formati di film presentabile. I passaggi associati con la conversione dei dati grezzi. ND2 file in uno. Avi o. Mov per presentazione con video giocatori comuni. Clicca suoe per visualizzare filmati.
Supplemental Movie 4. Imaging cellulare dal vivo di SCG assoni a 8 ore post-infezione con PRV 348. Clicca qui per vedere film .
Supplemental Movie 5. Ampia area di immagine di una notte di imaging di assone-cellula diffusione. Clicca qui per vedere film .
Supplemental Movie 6. Area ingrandita di una notte Timelapse imaging assone-cellula diffusione. Clicca qui per vedere film .
| Scolare | Genotipo | Utility |
| PRV 341 | GFP-US9 (membrana) / MRFP-Vp26 (capside) Esperimenti di trasporto virioni 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (membrana) / GM-mCherry (membrana) | Esperimenti di trasporto virioni 11 |
| PRV 427 | MRFP-VP26 (capside) / YFP-CAAX (cellulare membrana plasmatica) | Esperimenti di diffusione anterogradi 10 |
Tabella 1. Utili ceppi PRV ricombinanti esprimenti proteine di fusione fluorescenti.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo |
| Piastra da 35 mm cultura fondo di vetro | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 millimetri μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Corpo del microscopio | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorizzata XY microscopio | Scientifica precedente; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Ruote portafiltri motorizzate | Prior Scientific | HF110 10 posizione ruota portafiltri |
| Sorgente di illuminazione fluorescente | Lumen Dynamics, Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-banda filtro di fluorescenza imposta | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| Fotocamera EM-CCD | Andor tecnologia USA, South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide fase top ambientale incubatore | Vivere Strumenti cellulari; Seoul, Corea del Sud | TC-L-10 |
| Riscaldatore lente obiettiva | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Regolatore150819-12-08 Heater |
| Software di analisi | Nikon Instruments Inc., Melville, NY | NIS Elements |
Tabella 2. Reagenti specifici e attrezzature.
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Discussion
L'obiettivo di imaging cellulare dal vivo sta osservando processi biologici che si verificano senza significative alterazioni con l'atto di osservazione. Questo obiettivo è raggiunto attraverso l'ottimizzazione tre variabili: il controllo ambientale, la velocità di formazione immagine, e l'illuminazione a fluorescenza. Queste variabili interdipendenti devono essere bilanciati per ottenere condizioni di imaging vitali. I protocolli presentati utilizzano specifiche condizioni per produrre i risultati rappresentativi. Discuteremo brevemente i controlli ambientali e danni osservazionale prima di descrivere i metodi specifici presentati.
Stabilire e mantenere condizioni biologiche rilevanti sul microscopio è fondamentale per il successo di monitoraggio di eventi cellulari. Raggiungimento di condizioni bersaglio dipende da un certo numero di variabili specifiche per il microscopio e configurazione incubatrice. Tutte le impostazioni di incubazione devono essere convalidati utilizzando una misurazione indipendente della temperatura di un campione finto in incubatrice presoper più posizioni tra cui: il punto di contatto oggettivo, al centro del piatto cultura, e il bordo del piatto cultura. Impostazioni devono essere ottimizzate per minimizzare aree che sono più di 1 ° C più calda di 37 ° C e mantenendo una temperatura prossima a 37 ° C nel punto di contatto oggettivo. Ogni piatto cultura e la configurazione obiettivo utilizzato per l'imaging devono essere testati e convalidati prima della sperimentazione. Idealmente, tutti i campioni dovrebbero essere controllati per la temperatura durante l'imaging, ma questa prova non pratico per un numero di sistemi è complicato quando sono impiegati agenti biologicamente pericolosi. Validazione delle condizioni di incubazione è importante, come incubando campioni a troppo bassa o troppo alta di temperatura può portare a risultati artefatti o rapida degradazione cellulare.
Identificare e ridurre al minimo i risultati derivanti dal danno d'osservazione è importante per lo sviluppo del protocollo. Illuminazione frequente può alterare i processi biologici, irreversibly inattivare molecole fluorescenti, o indurre una serie di percorsi di morte cellulare. Temperatura convalida è importante per riprodurre condizioni biologicamente simili sulla cima palco analoghi a quelli di una coltura tissutale incubatore standard. Controllando gli effetti di frequente illuminazione è più difficile e spesso richiede iterativo prova e pratiche errore. Confrontando campioni paralleli tenuti in incubatori per colture tissutali per differenze morfologiche o alterazioni biologicamente rilevanti in grado di determinare se le condizioni live-cell imaging risultati in significativa tossicità cellulare. Negli esperimenti qui descritti, abbiamo monitorato la produttività di infezione virale mediante titolazione virale e grado di diffusione virale tra cellule.
Raggiungimento di imaging in tempo reale del trasporto veloce all'interno assoni richiede l'ottimizzazione della velocità di acquisizione dell'immagine a fianco l'intensità della luce di fluorescenza. La velocità di acquisizione dell'immagine è determinata dalla camerun impostazioni e l'hardware microscopio, soprattutto quando la raccolta canali fluorescenti multiple in sequenza. Intensità di illuminazione influisce sulla qualità dei segnali fluorescenti e la velocità di acquisizione. Maggiore intensità di illuminazione consente una più facile visualizzazione delle proteine fluorescenti, in particolare per quelli che incorporano in particelle in piccole quantità. Tuttavia, il campione candeggina più veloce e soffrire di danni fototossica migliorata. Riducendo illuminazione attraverso filtri di densità neutri richiede tempi di esposizione più lunghi, riducendo la frequenza di acquisizione delle immagini e causando potenzialmente deformazione spaziale delle strutture fluorescenti a causa del loro movimento durante il rilevamento. Trovare il giusto equilibrio di intensità di illuminazione, con frequenza di acquisizione delle immagini dipende molto dal segnale proteina fluorescente e il tasso di motilità della struttura in fase di studio. È solo necessario acquisire il segnale abbastanza per distinguere le strutture fluorescenti sopra sfondo, anzichéprodurre immagini ad alto contrasto che richiedono tempi di esposizione più lunghi.
L'imaging timelapse Pernottamento utilizza una configurazione hardware simile come live-cell imaging in tempo reale, ma è significativamente influenzato dalla accumulato foto-danno associato a lungo termine, l'illuminazione a fluorescenza frequenti. A differenza di imaging in tempo reale, la necessità di limitare l'intensità di illuminazione a fluorescenza è fondamentale, e di tutte le altre variabili vengono modificati per tenere conto di questa restrizione. Limitare l'intensità di esposizione tiene conto più frequente illuminazione fluorescenti canali multipli senza danneggiare significativamente le cellule creando l'immagine. Eventi spread assone-cellula anterogradi sono temporalmente e spazialmente diversi, tanto che l'imaging di una vasta area è essenziale per catturare il maggior numero di questi eventi non frequenti come possibile.
Diverse pubblicazioni hanno fornito rassegne approfondite e raccomandazioni per pratiche imaging cellulare dal vivo 24-26. I protocolli descritti qui Represent i nostri migliori tentativi di minimizzare l'impatto di imaging di fluorescenza sulla replicazione virale, il trasporto, e la diffusione, preservando le caratteristiche essenziali di infezione virale. La combinazione di questi protocolli con l'attenta allo sviluppo delle proteine di fusione fluorescenti e culture neuronali robuste ha risposto alle mie domande fondamentali di infezioni da herpesvirus e patogenesi.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
LWE e RK sono supportati dal National Institutes of Health sovvenzioni R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03. MPT è stato sostenuto da un Cancer Society Postdoctoral Fellowship americana Research (PF-10-057-01-MPC). La consulenza e la conoscenza del dottor Matteo Lyman e Dr. Oren Kobiler hanno contribuito a progettare la configurazione microscopio e metodi di imaging cellulare dal vivo. Abbiamo anche estendere grazie a Neal Barlow e Brian T. Kain di Nikon Instruments per la loro assistenza tecnica per l'acquisto, l'installazione e la performance del microscopio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
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