Summary
Live-cell imaging av alphaherpes virusinfeksjoner gjør analyse av dynamiske hendelser rettet transport og intercellulært spredning. Her presenterer vi metoder som benytter rekombinant virusstammer uttrykker fluorescerende fusjonsproteinene å lette visualisering av virale forsamlinger under infeksjon av primære nevroner.
Abstract
Fremskritt i live celle fluorescens mikroskopi teknikker, samt bygging av rekombinant virusstammer som uttrykker fluorescerende fusjon proteiner har aktivert sanntids visualisering av transport og spredning av alphaherpes virus infeksjon av nerveceller. Nytten av nye fluorescerende fusjon proteiner til viral membran, tegument, og capsids, sammen med levende celle bildebehandling, identifisert viral partikkel forsamlinger gjennomgår transport innen axoner. Lignende verktøy har blitt ansatt for analyser av celle-celle spredning av viruspartikler å kvantifisere antall og mangfold av virions overføres mellom cellene. Viktigere, teknikker for live-cell imaging av anterograd transport og spredning produsere et vell av informasjon, inkludert partikkel transport hastigheter, utdeling av partikler, og timelige analyser av protein lokalisering. Ved siden av klassiske viral genetiske teknikker, har disse metodene gitt kritisk innsikti viktige mekanistiske spørsmål. I denne artikkelen beskriver vi i detalj imaging metoder som ble utviklet for å svare på grunnleggende spørsmål om alphaherpes virus transport og spredning.
Introduction
Infeksjon i det perifere nervesystemet (PNS) ved alphaherpes virus som herpes simplex virus (HSV) -1, -2, og pseudorabies virus (PRV) involverer flere intrikate og svært regulert skritt hele viral livssyklus. Transport i nevroner av PNS er kritisk under hendelsene i både primær viral infeksjon og påfølgende inter-host spredning. De molekylære mekanismene som modulerer to komponentene i den virale livssyklus, rettet transport av virale forsamlinger unna celle organer innenfor axoner (anterograd transport) og påfølgende overføring av virions til mottakelige celler (anterograd spread) er viktig for å forstå herpesvirus patogenesen.
Transport-og avstigning av virale partikler i nevroner er avhengig av montering av en moden infeksiøs virion 1,2. Tidligere faste analyser, inkludert immunfluorescens (IF) og elektronmikroskopi (EM), ble brukt til å studere partikkel forsamlingen staten og protein interaksjoner forbundet med virion transport og spredning 3-6. Men de dynamiske egenskapene til transport av viruspartikler og eksperimentelle gjenstander introdusert av kjemisk fiksering forvirret tolkning av faste bilder 7,8. Nylig har en rekke viral-fluorescerende fusjonsproteinene blitt beskrevet for HSV og PRV som har ubetydelig effekt på protein funksjon. Grønt fluorescerende protein (GFP) og røde fluorescerende proteiner (mCherry eller mRFP) fluoroforer blir ofte koblet sammen for å tillate avbildning av to av de tre strukturelle komponenter i en moden virion: kapsid, tegument, og glykoprotein 9-11. Levende celle avbildning av anterograd transport ved hjelp av dual-merket virus visualiserer forsamlingen staten viruspartikler under transport. Lignende fluorofor uttrykke virusstammer brukes til å visualisere antallet og mangfoldet av virale genomer etter spredning 12,13. Egenskapene til de fluorescerende proteiner (gjennomgått i 14,15) i stor grad påvirkeevnen til å visualisere virale eller cellulære sammenstillinger. De iboende egenskapene til den fluorescerende protein, inkludert selv-interaksjoner og stabilitet, bør vurderes ved utforming og testing romanen protein fusjoner for bevaring av vill-type funksjonalitet.
I forbindelse med fluorescerende protein fusjoner, to godt karakterisert in vitro cellekultur-systemer er ansatt for live cell imaging av herpes virus infeksjon: dissociated 16 og compartmentalized 17 (figur 1A) rotte overlegne cervical ganglia (SCG) nerveceller. I begge systemer, er embryonale SCG er dissekert, dissosiert til én celle organer, og belagt for in vitro dyrkning 18. SCG nevroner er en del av det autonome nervesystemet og kan lett dyrkes og differensiert av neuronal vekstfaktor (NGF) til en moden polarisert tilstand ex vivo. Dissosiert SCG nevroner danner et utvidet nettverk av axoner som gjør at feller visualisering av virale partikler etter hvert som de gjennomgår anterograde transport 6.. Compartmentalized SCG kulturer gi fluidic isolering av neuronal celle kroppen (S-rom) og distale axon termini (N kupé) 19. En rekke detaljerte protokoller for bygging og bruk av compartmentalized nevroner bruker originale 20 eller modifisert Campenot kamre 17 har blitt publisert tidligere. Fluidic isolasjon tillater selektiv infeksjon av nevrale celle organer og påvisning av avkom virions etter transport til isolerte axon Termini. Plettering epitelceller i de termini før infeksjon gir mottakercellene for spredningen av virusinfeksjon.
Det er mange viktige elementer viktig for alle levende celle bildebehandling eksperimentering, men det mest relevante for våre protokoller er: automatisert image oppkjøpet, fluorescerende belysning, hastighet på bildebehandling, og miljøkontroll. For alle bildebehandling eksperimenter, bruker vien invertert, automatisert, epifluorescence belysning mikroskop (figur 1B). Mikroskopet er bygget rundt Nikon Eclipse Ti base og sysselsetter en rekke datastyrte motoriserte systemer for å raskt konfigurere mikroskop under automatisert image oppkjøpet. For fluorescens belysning, bruker vi et bredspektret kvikksølv arc lampe som kan dempes med nøytral tetthet filter langs belysning banen. Eksitasjon filtre begrense spekteret av fluorescerende belysning og da sammen med multi-pass dichroic speil og fluorescens emisjonsfiltre visualisere spesifikke fluorescerende forbindelser. De eksitasjon og emisjon er montert filtre i uavhengige, rask veksling filter hjul å muliggjøre rask sekvensiell oppkjøp av ulike fluorescerende kanaler. Hastigheten på bildet oppkjøpet er ytterligere forbedret med en sensitiv og rask EM-CCD-kamera, nyttig for påvisning av lav intensitet signaler og korte bilde lesehastigheten. Miljøkontroll på microscope oppnås med en scene topp oppvarmet inkubator, og en objektivlinse ovn for å holde prøvene på forhøyet temperatur mens en fuktet og CO2 anrikede atmosfære føres inn i inkubatoren. Mikroskopet er holdt i et mørkt rom med omgivelsestemperatur holdt tett til 25 ° C og utelys minimert med blendingsgardiner på alle vinduer. De følgende protokoller beskriver bruken av dette system for anterograde transport og spredning analyser.
En rekke alternativer finnes for å kontrollere for variabler av levende celle bildebehandling. Kontrollen av mikroskopi innstillinger kan utføres manuelt eller ved hjelp av automatiserte systemer avhengig av proprietær programvare. Fluorescens belysning kan oppnås med halogen, LED eller laser kilder. Hastigheten på avbildning er modifisert ved hastigheten på filteret svitsjing og tiden for å visualisere signalet med den parede deteksjonssystem. Miljøkontroll kan oppnås med spesialisert maskinvare på microscope stadium, innelukking av hele eller deler av mikroskopet i en oppvarmet og fuktet boks, eller ved å heve temperaturen i rommet hvor mikroskopi vil bli utført. Hver av disse alternativer har fordeler og ulemper knyttet til kostnad og ytelse.
I den etterfølgende protokollen, detalj vi bruken av levende celle bildebehandling for å studere hurtig anterograde transport og spredning av anterograde alphaherpes virus gjennom bruk av rekombinante virusstammer. Real-time live-cell imaging visualiserer capsid, tegument, og / eller glykoprotein samlokalisering på dynamiske strukturer som gjennomgår transport innen axoner 11. Overnatter timelapse avbildning av compartmentalized nevrale kulturer visualiserer axonal virion utgang og infeksjon av mottakelige celler 12. Protokollene som presenteres her er optimalisert for bruk med vår spesielle imaging system, men er presentert i grove trekk i forhold til de fire elementene av levende celle bildebehandling. I diskusjonen vivil ytterligere detalj noen optimalisering av den som er nødvendig for vellykket eksperimentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
§ 1 - miljøkontroll betingelser for Live-cell fluorescensmikroskopi
- 30 min før enhver tenkelig eksperiment koble til og begynne oppvarmingen mikroskopet scenen toppen kuvøse.
- Slå på mikroskop, overføres og epifluorescent lyskilder, og automatiserte hardware kontroller. Åpne mikroskop kontroll programvare, NIS Elements, for å koble til mikroskopet og begynne kjøling av EM-CCD-kamera.
- Fest Lens varmere til riktig mål (enten 60X eller 100X oljeimmersjon). Merk: Velg objektiv basert på eksperiment type. Den 100X differensial interferens kontrast (DIC) er best for sporing av anterograd transport virion forsamlinger mens 60X fase målet er egnet til å visualisere anterograde spredning. Lavere forstørrelse, gjør ikke-Oljeneddypping målene ikke krever en objektiv varmere som de ikke ta direkte kontakt med prøven.
- Fest scenen toppen inkubator på motoriserte stadium av mi croscope. Sikre riktig innsats som vil holde prøven er på plass. Fest luftfuktighet linje fra inkubatoren kontrollen til inngangen på scenen toppen kuvøse.
- Slå på inkubator og linsen varmere kontroller og justere temperatur innstillinger til tidligere bekreftet forhold som er spesifikke for objektiv og prøven blir fotografert (se diskusjon).
- Åpne ventilen på 5% CO 2/95% atmosfærisk tank for å gi CO 2 supplert luft å iscenesette toppen kuvøse. Strømningshastigheten bør være mellom 60 og 80 ml gass pr minutt. Raskere priser vil føre til omfattende prøve dehydrering til tross for luftfuktingsanlegg kammeret.
- Legg linse olje til objektiv og umiddelbart plassere den kulturen som skal avbildes inn scenen toppen kuvøse.
- Tillat ekvilibrering av temperaturen i kulturen i minst 10 min. En time er å foretrekke, spesielt for natten bildebehandling nevnt i § 3.
- Seks til åtte timer før avbildning, infisere en 35 mm dekkglass-bunn skål av modne, dissosiert SCG neuroner med 1 x 10 6 plaque forming units av viruset av interesse (Se tabell 1 for eksempel virus) ved hjelp av metoden beskrevet i Taylor et al. 2012a 11. Ved testing mer enn ett virus, off-set inokulasjoner med 30-60 min for å muliggjøre avbildning av sekvensielle prøvestykker ved tilsvarende tider etter infeksjon.
- Sett fatet i scenen toppen inkubator for minst 10 min før du kjører noe eksperiment. Mens temperaturen equilibrates, er brennplanet skiftende og vil negativt påvirke eventuelle bildebehandling eksperimenter.
- Ved hjelp overført lys og okularet av mikroskopet, finne en neuronal celle kroppen som har en tydelig isolert aksonal forlengelse. Alternativt kan du bruke riktig fluorescens belysning for å finne en celle uttrykke deteksjontabell mengder selvlysende proteiner. Det er viktig å begrense eksponering av prøven til fluorescerende belysning, på dette trinn og etterfølgende trinn, på grunn av lys indusert celleskade og bleking av fluorescerende proteiner.
- Attenuere fluorescens-belysning for å redusere intensiteten av eksiteringslys til hvilken cellene blir utsatt for. Engasjere lys demping Neutral Density (ND) filtre i fluorescens belysning lysbanen. For filmer som varer lengre enn 1 min, et minimum av ND4 må brukes for å hindre at foto-bleking av fluorescerende proteiner og omfattende foto-skade av aksoner. Sterkt fluorescerende strukturer kan typisk være visualisert med en ND8 filter på plass.
- Ved hjelp av mikroskop programvare (figur 2 og Supplemental Movie 1A), slå på lyset-banen til EM-CCD-kamera.
- Bestem optimal bildebehandling og-forhold for hver fluorescerende kanal.
- Initiere et levende bilde vinduet ved hjelp av "Play"-knappen. </ Li>
- Bestemme optimale kameraeksponeringsinnstillinger for hver fluorescerende protein. Ikke overstig 300 ms per kanal som motional avvik i rask bevegelse virion strukturer vil oppstå. Utnytte EM gevinst på kameraet til en innstilling på 300 (produsent foreslått maksimal gevinst), for å minimere eksponering tid og forbedre deteksjon av dim signaler. Riktig eksponeringstider skal produsere et bilde med lav bakgrunn intensitet og høy konkrete signaler.
- Etter innstilling eksponeringer og finne en veldefinert regionen axon, må programvaren være konfigurert til å utføre automatiserte image oppkjøpet. Stopp direkte avbildning vinduet for å hindre prøve bleking.
- I NIS Elements programvare, velger 6D - Definer / Kjør Experiment programmet fra "Programmer"-rullegardinmenyen.
- I ND oppkjøpet vinduet klikker du på kategorien Tid som avgjør hyppigheten av bildet oppkjøpet. Setter intervallet til "No Delay" og varigheten til 5 min. The-programvaren vil da få bilde rammer på høyeste frekvens mulig for varigheten av 5 min.
- Velg "Lambda"-kategorien, noe som gjør at utvalget av de forhåndsinnstilte maskinvarekonfigurasjoner brukes til flere fluorescerende image oppkjøpet. Klikk den første boksen, og i den påfølgende drop down menyen for å velge en passende hardware konfigurasjon. Gjenta for alle fluoriserende proteiner for å bli fotografert.
- Sikre fanene for "XY Posisjoner", "Z-serien" og "stort bilde" er de-merket.
- Over fanene, velger du boksen merket "Lagre til fil" for å automatisk lagre bildene på harddisken under oppkjøpet. Konfigurer plasseringen og filnavnet forsøket filen. Som etterfølgende eksperimenter utføres, vil program-met en sekvensielt nummer ved slutten av det angitte filnavn.
- Når alle kategoriene er valgt. Initiere eksperimentet ved å klikke på "Run-nå"-knappen.
- Optimalisere bildet oppkjøpet hastighet gjennom eksponering innstillinger og forestillee størrelsen. Ved hjelp av et lite område av bildet-stand område vil ofte raskere bildefrekvens oppkjøpet priser. Definere aktuelle området ved hjelp av ROI verktøy i NIS-Elements, velger et område mellom 25% og 50% av det totale bildet området. Alternativt vil kortere eksponeringstider øke rammen oppkjøpet priser, men reduserer kvaliteten på signalet (se diskusjon).
§ 3 - Overnatting Time-lapse Imaging av anterograd Spread Hendelser
- Fire timer før bildebehandling, infisere en oppdelt neuronal kultur bygget på et 35 mm μ-Dish. Inokuler neuronal celle-legemer med en 6 x 10 plaque forming units av viruset av interesse (Se tabell 1 for eksempel virus) ved hjelp av metoden beskrevet i Taylor et al. 2012b 12..
- Forsiktig plassere kultur fatet i scenen toppen kuvøse. Sikre posisjonen til målet er satt til side av retten. Sakte bringe målet i fokus, ensuring målet ikke skyve opp i prøven. Når fokus feltet har blitt identifisert, beveg av målet til midten av tallerken, nær den indre barrieren demarking indre side av axon met. Under bevegelse, sikre fokus dybde er vedlikeholdt og unngå å skyve opp i prøven. Nedbøyning av plastoverflaten av målet vil skade axoner og plasten.
- Tilsettes ca 2 ml varm (~ 37 ° C) fosfatbufret saltvann til kultur tallerken utsiden av Teflon ringen. Dette omgir den neuronale kulturen med en ring av PBS for å minimalisere prøven dehydrering og gi termisk isolasjon.
- Tillat temperaturen skal stabilisere seg i minst 1 time før start av automatisert bildeopptak (3.8). Trinn 3,5 gjennom 3.7 kan konfigureres i løpet av denne tiden.
- Begrense intensiteten av belysning til et lavest mulig nivå ved å engasjere alle nøytral tetthet filter. Dette vil tillate hyppige image oppkjøpet over lange tidsperioder uten overdreven foto-skade. Reduksjon belysning vil resultere i lav-signal, som krever lengre eksponering (se diskusjon).
- Bruk historiske eksponering eller tidligere til eksperimentelle oppsett generere en parallell rett av infiserte epitelceller uttrykker målet fluorescerende proteiner for å etablere eksponeringsinnstillinger som beskrevet i punkt 2.5.
- Etter innstilling eksponeringer for de nødvendige kanalene, er det på tide å konfigurere programvaren for automatisert image oppkjøpet. Stopp direkte avbildning vinduet for å begrense utvalget bleking.
- I Elements programvare (figur 2 og supplerende film 2), velg 6D - Definer / Kjør Experiment programmet fra "Programmer" drop down menyen for å få opp ND Acquisition vinduet.
- I ND Acquisition vinduet klikker du på kategorien Klokkeslett. Setter intervallet til "5 min". Sett Varighet til 20 timer. Den looper feltet beregnes automatisk for antall repetisjoner på program skal utføre.
- Velg "Lambda"-kategorien. Klikk den første boksen, og i den påfølgende nedtrekksmenyen velger du riktig lambda konfigurasjon for fase kontrast. Gjenta for etterfølgende posisjoner, velge de riktige konfigurasjoner for hver fluorescerende protein for å bli fotografert.
- Velg "stort bilde"-kategorien, som bestemmer parametrene av flere bilder som skal kombineres til ett større synsfelt. En god størrelse området består av 5 x 2 bilder ved hjelp av en 7% søm overlapping. Dette vil gi rom for maksimalt antall celler per posisjon til å bli fotografert uten at det påvirker hyppigheten av bildet oppkjøpet. Også oppheve valget av "Close Active Shutter under Stage bevegelse". Dette alternativet øker hastigheten på kjøpet ved å ikke lukke skodder mellom bilder.
- Velg "XY posisjoner"-kategorien, for å identifisere flere posisjoner som vil bli sekvensielt avbildes i parallell i løpet av natten over filmen. Velg posisjoner som definerer senteret point for hvert stort bilde området. Velg 6-8 bildeposisjonene i utvalget. Et godt bilde, vil små klynger av celler i nært apposition klart definerte axoner. Cellene bør ikke være stablet på toppen av hverandre og axon bunting bør minimaliseres. Poenget med fokus er kjernen i cellen. Plasser målet slik at en klart definert kjernefysiske konvolutten er sett for de fleste av cellene.
- Sørg for at "Z-serien" fanen er valgt.
- Konfigurere auto-save funksjonen som beskrevet ovenfor i avsnitt 2.6.5.
- Test eksponering og posisjon ved å klikke "en gang loop". Evaluere de resulterende bildene for overførte lys belysning, fokus og innramming. Hvis man har mistet, endre fokuseringen for hver posisjon under XY-kategorien. Vent 10 min og gjenta dette trinnet til fokus er stabil.
- Etter at alle innstillingene har blitt verifisert og testet, initiere den automatiserte eksperiment ved å klikke på "Kjør nå"-knappen.
§ 4 - Bildebehandling og eksport
Data Export
- Datasett innhentet under live-cell imaging av transport eller spredning hendelser skal eksporteres fra NIS Elements programvare til vanlige filtyper for senere bruk i presentasjoner og publikasjoner (Supplemental Movie 3). Å eksportere filmer åpne riktig rå. ND2 fil i NIS Elements og velg "split-komponent" sikte på å visualisere de ønskede fluorescerende kanaler. Spille filen på et passende hastighet, 5 bilder per sekund er et godt utgangspunkt for visualisering av rask transport.
- Inkluder et tidsstempel å representere en real-time clock under filmavspilling. Høyreklikk på bildet og velg Legg ND-informasjon. En digital teller vises i øvre venstre hjørne.
- Rediger klokkeslett-stempel for å vise informasjon. Høyreklikk på disken og velg Rediger ND-informasjon. I den påfølgende pop-up vindu, redigere teksten å reflektere imaging parametere som er viktige. Edit skrift, farge og størrelse for klarhet.
- Gå til "Edit"-menyen og finn "Lag utsikt snapshot" eller trykk på "x"-tasten. Denne kommandoen åpner "view snapshot"-vinduet. Velg "gjelder for alle rammer" for å generere en 8-bit, RGB, eksport-klar fil som inneholder fluorescerende kanaler fra hele filmen.
- Lagre som. Avi fil for kryssplattform kompatibilitet. Sett avspilling hastigheten 200 ms per ramme. De. Avi-filer generert av NIS Elements kan da bli ytterligere komprimert med andre konvertering programvare til ønsket filtype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograd Transport
Anvendelse av denne protokollen til infeksjoner i dissosiert SCG kulturer med PRV 348, har en rekombinant PRV belastning uttrykker GFP-US9 og GM-mCherry membran fusjon proteiner, til rette for visualisering av anterograd transport av virions (figur 3 og Supplemental Movie 4). Innlemmelse av disse fusjon proteiner i viruspartikler resultater i sin oppdagelse på transport puncta, og de nevnte bildebehandling betingelser minimere oppveid av hver fluorophore på et bevegelig partikkel i løpet filter veksling. I en tre-minutters bildebehandling vinduet, er mange transport puncta ofte observert og store utvalgsstørrelser for colocalization analyser er raskt genereres. Vi har tidligere kvantifisert colocalization av GFP-US9, den alphaherpes virus axonal målretting protein, med andre strukturelle proteiner ved hjelp av denne tilnærmingen 11. Tilsvarende analyser av andre dual recombinant PRV stammer har også blitt beskrevet 11, og nyere arbeider har dokumentert co-transport av PRV proteiner med en fluorescently merket host motor protein i en ytterligere forlengelse av denne protokollen 21. Utnytte rask veksling filter hjul og sammenkoblede multi-pass dichroic speil tillater rask sekvensiell kjøp av to eller flere fluorescerende kanaler. Vi kan i dag oppnå to-kanals sekvensiell oppkjøp i hastigheter på opptil 0,8 bilder per sekund. For enkelt kanal video mikroskopi, som er begrenset bare av fluorescens eksponeringstid og lese-tid på kameraet, kan vi oppnå oppkjøp frekvenser høyere enn seks bilder per sekund.
Anterograd Spread
For å visualisere Anterograd spredning hendelser, er områder av interesse visualisert hvert 5 til 10 min for en 20 timers periode, der tiden virions skal transportere ned og vandrer ut fra axoner, infiserer de nærliggende epitelceller. En representant ramme fra det store bildet eren er presentert i figur 4A og Supplemental Movie 5. Legg merke til romlig separert natur fluorescerende protein uttrykker cellene, noe som indikerer primær infeksjon fra axoner. Infiserte celler kan spores bakover under filmen å visualisere de fluorescerende capsids som innledet virusinfeksjon. Disse individuelle celler kan bli isolert fra stor ramme og spores uten et betydelig tap av detaljer. Representanten ramme (Figur 4B) fra Supplemental Movie 6 skildrer en tid etter virions har deponert den fluorescerende capsid til cytoplasma.
Data Analysis
En rekke ulike analyser kan utføres på live-cell imaging datasett inkludert partikkel sporing, colocalization studier, og kvantifisering av virion spredning hendelser. Vi utfører ofte våre analyser direkte i NIS Elements programvare eller benytte en plug-in forlengelse tilgjengelig for ImageJ programvarepakke som gjør. ND2 filtypestøtte. Ulike hypoteser og eksperimentelle oppsett nødvendiggjøre unike analysemetoder. Vår gruppe har beskrevet metoder for å vurdere colocalization av fluorescerende proteiner på dynamiske strukturer 11,21 og time-lapse kvantifisering av enkelte partikkel spredning hendelser 10,12,22. Metoder beskriver i dette manuskriptet og våre tidligere studier er fleksible og kan brukes på ulike virusinfeksjoner samt transport av cellulære strukturer, f.eks mitokondrier 23.
Figur 1. Skjematisk av mikroskopi satt opp for live cell imaging. A) Kultur typer ansatt for studier av anterograd transport (dissosiert) og anterograd spread (kammer) hhv. Panel 1 er en fase kontrast bilde av en moden, dissociated Superior Cervical Ganglia (SCG). Panel 2 er et skjematisk av Compartmentalized kultursystem, avbildet i panel 3, med SCG nevroner pletteres i det venstre kammer med aksonale projeksjoner som strekker seg under de interne barrierer helt til høyre kammer. B) Den inverterte mikroskop og epifluorescent trinns topp inkubator form benyttet for video mikroskopi eksperimenter. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. NIS-Elements programvare grensesnitt. Et skjermbilde av et standard brukergrensesnitt i NIS-Elements vises. The Play og Stopp styre live-bildevinduet viser dagens maskinvare for bildebehandling, samt hva som er i ferd med å bli fotografert. Øverst panel er en serie med optiske konfigurasjoner som implementerer forhåndsinnstilt hardware settings å konfigurere mikroskop for trans-belyste eller fluorescens deteksjon. Kamera-kontroll og eksponering tillate konfigurasjon av kamera gjenkjenning for å optimalisere bildekvaliteten og hastighet. Alle forsøkene er koordinert med ND Acquisition kontroller. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Levende celle avbildning av SCG axoner på 8 timers post-infeksjon med PRV 348. PRV 348 infiserte nevroner uttrykker GFP-US9 og GM-mCherry membran fusjon proteiner. Anterograd-transport strukturer innenfor distale axoner er visualisert i to fluorescerende kanaler, GFP og mCherry. En anterograd-transport struktur (hvit pil) utvikler seg innenfor axon som avbildet i sekvensielle bilder tatt fra Supplemental Movie 4. De to fluoriserende proteiner er spatialliere off-set på grunn av sekvensiell oppkjøpet av fluorescerende kanaler og rask bevegelse av virale strukturer. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Overnatter timelapse avbildning av Anterograd spredning hendelser fra infiserte axoner til epiteliale celle klynger i løpet av en multi-farge infeksjon. Representative bilder fra en enkelt stilling, stort bilde flislagt time-lapse film av virion overføring fra PRV 427 infiserte axoner til mottaker epitelceller. A) Et sammenslått bilde av de overførte, YFP og RFP fluorescerende bilder samtidig etter infeksjon der mottaker cellene begynner å uttrykke YFP-CAAX og VP26-mRFP fusjon proteiner. I det andre panelet, blir YFP og RFP kanaler vist sammen. Legg merke til det store antallet mRFP puncta assobindelse med axon traktater. Disse er montert virions gjennomgår langdistanse transport innen axoner (Supplemental Movie 2). Den hvite boksen representerer det området av interesse uthevet i del B. B) Representant bilde av mottaker epitelceller inneholder infiserer kapsid forsamlinger (Se også Supplemental Movie 3). Panel 1 er en sammenslåing av de overførte og RFP-kanaler. Panel 2 er RFP kanal alene. Panel 3 er RFP-kanal med en skjematisk fremstilling av cellen disposisjon (heldekkende hvit linje), nucleus (hashet hvit linje), og axoner (blå linjer). Klikk her for å se større figur .
Supplemental Movie en. Programvare innstillinger for rask, sekvensiell oppkjøp av aksonale virions. Trinnene forbundet med å bestemme eksponering innstillinger, konfigurere ND oppkjøp kontroller, og anskaffe en rask ramme oppkjøpet movie av fluorescerende virions gjennomgår aksonal transport er presentert. SCG neuron kultur var infisert med PRV 427 åtte timer før bildebehandling. Klikk her for å se film .
Supplemental Movie 2. Programvare innstillinger for natten avbildning av axon-til-celle spredning. Trinnene i forbindelse med konfigurering ND oppkjøpet kontroller for overnatting avbildning av axon-til-celle spredning hendelser blir presentert. Klikk her for å se film .
Supplemental Movie 3. Konvertering av. ND2 filer i presentabel filmformater. Trinnene i forbindelse med konvertering av rådata. ND2 filer i enten. Avi eller. Mov til presentasjon etter vanlige videospillere. Trykk here for å se film.
Supplemental Movie 4. Levende celle avbildning av SCG axoner på 8 timers post-infeksjon med PRV 348. Klikk her for å se film .
Supplemental Movie 5. Stort bilde areal på over natten avbildning av axon-til-celle spredning. Klikk her for å se film .
Supplemental Movie seks. Forstørret område av natten timelapse avbildning av axon-til-celle spredning. Klikk her for å se film .
| Sil | Genotype | Utility |
| PRV 341 | GFP-US9 (membran) / mRFP-Vp26 (capsid) Virion transport eksperimenter 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (membran) / GM-mCherry (membran) | Virion transport eksperimenter 11 |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (capsid) / YFP-CAAX (mobil plasma membran) | Anterograd spredning eksperimenter 10 |
Tabell 1. Nyttige rekombinant PRV stammer som uttrykker fluorescerende fusjon proteiner.
| Navn | Selskapet | Katalognummer |
| 35 mm glassbunn kultur fatet | Mattek Corporation; Ashland, MA | P35G-1,5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Mikroskop kroppen | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorisert mikroskop XY scenen | Prior Scientific, Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motoriserte filter hjul | Før Scientific | HF110 10 plassering filter hjul |
| Fluorescerende belysning kilde | Lumen Dynamics, Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescens filter setter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-CCD-kamera | Andor Technology USA, South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide scenen toppen miljømessige inkubator | Leve Cell Instruments, Seoul, Sør-Korea | TC-L-10 |
| Objektiv varmeapparat | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller150819-12-08 Heater |
| Analyse programvare | Nikon Instruments Inc., Melville, NY | NIS Elements |
Tabell 2. Spesifikke reagenser og utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med levende celle bildebehandling er å observere biologiske prosesser som de oppstår uten vesentlig endring av loven av observasjon. Dette målet oppnås ved å optimalisere tre variabler: miljøkontroll, hastighet på bildebehandling, og fluorescens belysning. Disse inter-avhengige variabler må balanseres for å oppnå levedyktige bildebehandling forhold. Protokollene som presenteres utnytte spesifikke forhold for å produsere de representative resultater. Vi vil kort diskutere miljø-kontroller og observerende skade før detaljering spesifikke metoder som presenteres.
Etablere og vedlikeholde relevante biologiske forhold på mikroskopet er avgjørende for vellykket overvåking av cellulære hendelser. Å oppnå mål-forhold er avhengig av en rekke variable som er spesifikke for mikroskop og inkubator konfigurasjon. Alle inkubator innstillinger bør validert ved hjelp av en uavhengig temperaturmåling av en mock prøven i kuvøse tattved flere posisjoner, inkludert; punktet for objektiv kontakt, midt i kultur tallerken, og kanten av den kultur tallerken. Innstillinger bør optimaliseres for å minimalisere områder som er mer enn 1 ° C varmere enn 37 ° C, så vel som å opprettholde en temperatur nær 37 ° C ved det punkt av målet kontakt. Hver kultur tallerken og objektiv konfigurasjon brukes til bildebehandling må testes og valideres før eksperimentering. Ideelt sett vil alle prøvene overvåkes for temperatur under avbildning, men dette viser seg upraktisk for en rekke systemer, og er komplisert når biologisk farlige midler anvendes. Validering av inkuberingsbetingelser er viktig, som ruger prøver ved for lav eller for høy for en temperatur kan resultere i kunstig resultater eller raske mobilnettet degradering.
Identifisere og minimere resultater som oppstår fra observasjonsstudier skaden er viktig for protokoll utvikling. Hyppig belysning kan endre biologiske prosesser, IRReversibly inaktivere fluorescerende molekyler, eller indusere en rekke cellulære dødsveier. Validering av temperaturen er viktig for å reprodusere biologisk lignende forhold på scenen toppen analogt med en standard vevkultur inkubatoren. Kontrollere for effekten av hyppig belysning er mer vanskelig og krever ofte iterativ prøving og feiling praksis. Sammenligning parallelle prøver oppbevares i vevskulturstudier inkubatorer for morfologiske forskjeller eller biologisk relevante endringer kan avgjøre om live-cell imaging-forhold fører til betydelig cellulær toksisitet. I forsøkene som er beskrevet her, har vi overvåket produktiviteten av virusinfeksjon gjennom viral titer i tillegg til omfanget av viral spredning mellom cellene.
Oppnå sanntids avbildning av rask transport innen axoner krever optimalisering av bildet oppkjøpet hastighet sammen med intensiteten av fluorescens belysning. Hastigheten på bildet oppkjøpet bestemmes av cameren innstillinger og mikroskopet maskinvare, spesielt når samle flere fluorescerende kanaler sekvensielt. Lysintensiteten påvirker kvaliteten på fluorescerende signaler og frekvensen av oppkjøpet. Større belysning intensitet muliggjør lettere visualisering av fluorescerende proteiner, spesielt for de som innlemme i partikler i små mengder. Men prøven vil blekemiddel raskere og lider av økt fototoksisk skader. Redusere belysning gjennom nøytral tetthet filter krever lengre eksponeringstider, noe som reduserer hyppigheten av bildeopptak og potensielt forårsake romlig deformasjon av fluorescerende strukturer på grunn av deres bevegelse i løpet av gjenkjenning. Finne riktig balanse mellom lysintensiteten med bilde oppkjøpet frekvensen avhenger i stor grad på den fluorescerende protein signal og hastighet på motilitet av strukturen som studeres. Det er bare nødvendig å skaffe tilstrekkelig signal for å skjelne de fluorescerende strukturer over bakgrunnen, i stedetprodusere bilder med høy kontrast som krever lengre eksponeringstider.
Overnatter timelapse bildebehandling benytter en lignende hardware konfigurasjon som sanntid live-cell bildebehandling, men er betydelig påvirket av akkumulert foto-skader forbundet med langsiktige, hyppig fluorescens belysning. I motsetning til sanntids avbildning, er behovet for å begrense fluorescens lysintensiteten av vesentlig betydning, og alle andre variabler er modifisert for å ta hensyn til denne begrensning. Begrense intensiteten av eksponeringen gir mulighet for hyppigere belysning av flere fluorescerende kanaler uten vesentlig skade fotografert celler. Anterograd axon-til-celle spredning hendelser er tid og rom uensartet, så avbildning et stort område er viktig å fange opp så mange av disse sjeldne hendelser som mulig.
En rekke publikasjoner har gitt grundige oversikter og anbefalinger for live cell imaging praksis 24-26. Protokollene beskrevet her Represent våre beste forsøk på å minimere virkningen av fluorescens bildebehandling på viral replikasjon, transport og spredning samtidig bevare de grunnleggende funksjonene i virusinfeksjon. Ved å kombinere disse protokollene med forsiktig utbygging av fluorescerende fusjon proteiner og robuste nevrale kulturer har besvart mine grunnleggende spørsmål om herpesvirus-infeksjon og patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
LWE og RK støttes av det amerikanske National Institutes of Health tilskudd R37 NS033506-16 og R01 NS060699-03. MPT ble støttet av en American Cancer Society Postdoktor Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). Råd og kunnskap om Dr. Matthew Lyman og Dr. Oren Kobiler var instrumental i å utforme mikroskopet konfigurasjon og live celle imaging metoder. Vi utvider også takket være Neal Barlow og Brian T. Kain av Nikon Instruments for sin teknisk bistand i anskaffelse, installasjon og performance av mikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
