Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levande cell imaging av Alphaherpes Virus Anterograd Transport och Spread

Published: August 16, 2013 doi: 10.3791/50723

Summary

Levande cell imaging av alphaherpes virusinfektioner möjliggör analys av dynamiska händelser riktad transport och intercellulär spridning. Här presenterar vi metoder som utnyttjar rekombinanta virusstammar som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner att underlätta visualisering av virala församlingar under infektion av primära neuroner.

Abstract

Framsteg i levande celler fluorescens mikroskopi tekniker, liksom byggandet av rekombinanta virusstammar som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner har aktiverat realtid visualisering av transport och spridning av alphaherpes virusinfektion av nervceller. Nyttan av nya fluorescerande fusionsproteiner till virusmembranet, inneragnen och capsids, tillsammans med levande cell imaging, identifierade virus partikel församlingar genomgår transporter inom axoner. Liknande verktyg har framgångsrikt använts för analyser av cell-cell spridning av viruspartiklar för att kvantifiera antalet och mångfalden av virioner överförs mellan celler. Huvudsakligen de metoder för levande cell imaging av anterograd transport och spridning ger en mängd information, inklusive hastigheter partikel transport, fördelningar av partiklar, och temporala analyser av protein lokalisering. Vid sidan av klassiska virala genetiska tekniker har dessa metoder förutsatt kritiska insiktertill viktiga mekanistiska frågor. I den här artikeln beskriver vi i detalj imaging metoder som utvecklats för att svara på grundläggande frågor om alphaherpes virus transport och spridning.

Introduction

Infektion av det perifera nervsystemet (PNS) genom alphaherpes virus, såsom herpes simplex-virus (HSV) -1, -2 och pseudorabiesvirus (PRV) involverar flera invecklade och starkt reglerat steg under hela virusets livscykel. Transport inom nervceller i PNS är kritiskt under händelserna av både primär virusinfektion och efterföljande inter-host spridning. De molekylära mekanismerna som modulerar två komponenter i virusets livscykel, riktad transport av virala församlingar bort från cell organ inom axoner (anterograd transporter) och därpå följande överföring av virioner till mottagliga celler (anterograd spread) är viktiga för förståelsen herpesvirus patogenes.

Transporten och avstigning av viruspartiklar i nervceller är beroende av montering av en mogen infektiös virion 1,2. Tidigare fasta analyser, inklusive immunofluorescens (IF) och elektronmikroskopi (EM), användes för att studera den statliga partikel montering och protein interaktioner förknippade med virion transport och spridning 3-6. Men den dynamiska karaktären av transport virioner och experimentella artefakter införts av kemisk fixering försvårade tolkningen av fasta bilder 7,8. Nyligen har ett antal virus-fluorescerande fusionsproteiner beskrivits för HSV och PRV som har försumbara effekter på proteiners funktion. Grönt fluorescerande protein (GFP) och rött fluorescerande proteiner (mCherry eller mRFP) fluoroforer är ofta ihopkopplade för att tillåta avbildning av två av de tre strukturella delarna av en mogen virion: kapsid, inneragnen, och glykoprotein 9-11. Levande cell imaging av anterograd transporter med dual-märkta virus visualiserar församling tillstånd av viruspartiklar under transport. Liknande fluorofor uttrycker virusstammar används för att visualisera antalet och mångfalden av virala genom följande uppslag 12,13. Egenskaperna hos fluorescerande proteiner (översikt i 14,15) har stor inverkanförmågan att visualisera virala eller cellulära aggregat. De inneboende egenskaper fluorescerande proteinet, inklusive sluten interaktioner och stabilitet, bör beaktas när man utformar och testar fusioner nya proteinet för bevarandet av vild-typ funktionalitet.

I samband med fluorescerande proteinfusioner, två välkarakteriserade in vitro cellkultursystem används för levande cell imaging av herpes virus infektion: dissocierade 16 och fack 17 (Figur 1A) Superior Cervikal ganglierna (SCG) neuroner. I båda systemen är embryonala SCG: s dissekeras, dissocierade till encelliga organ, och ströks för in vitro-odling 18. SCG neurons är en del av det autonoma nervsystemet och kan lätt odlas och differentieras genom neuronal tillväxtfaktor (NGF) till en mogen polariserade tillstånd ex vivo. Dissocierade SCG nervceller bildar ett omfattande nätverk av axoner som tillåter feller visualisering av viruspartiklar som de genomgår anterograd transporter 6. Compartmentalized SCG kulturer ger fluidisk isolering av neuronal cell organ (S fack) och distala Termini axon (N fack) 19. Ett antal detaljerade protokoll för konstruktion och användning av compartmentalized nervceller som använder original 20 eller modifierad Campenot kamrarna 17 har publicerats tidigare. Fluidic isolering möjliggör selektiv infektion av neuronala cellkroppar och detektering av avkomma virioner efter transport till isolerade axon terminaler. Plätering epitelceller över terminalerna före infektion ger recipientceller för spridning av virusinfektion.

Det finns många viktiga faktorer viktiga för alla levande cell imaging experiment, men den mest relevanta för våra protokoll är: automatisk bildtagning, fluorescerande belysning, hastighet avbildning, och miljökontroll. För alla imaging experiment, använder vien inverterad, automatiserat, epifluorescens belysning mikroskop (Figur 1B). Mikroskopet är uppbyggd kring Nikon Eclipse Ti bas och sysselsätter ett antal dator motoriserade styrda system för att snabbt konfigurera om mikroskopet under automatisk bildtagning. För fluorescensbelysning, använder vi ett brett spektrum kvicksilverbåglampa som kan dämpas med neutral densitet filter längs belysning vägen. Excitationsfilter begränsa det spektrum av fluorescerande belysning och när det paras ihop med flera pass dikroiskt speglar och fluorescens filter utsläpp visualisera specifika fluorescerande föreningar. Excitation och emission filter är monterade i fristående, snabbt byte filter hjul för att möjliggöra snabb sekventiell förvärv av olika fluorescerande kanaler. Hastigheten på bilden förvärvet förstärks ytterligare med en känslig och snabb EM-CCD-kamera, användbar för detektering av låg intensitet signaler och korta image Läs gånger. Miljö kontroll på Microscopa uppnås med en scen topp uppvärmd inkubator och en objektivlins värmare för att bibehålla prov vid förhöjda temperaturer medan en fuktad och CO 2 anrikad atmosfär passerar in i inkubatorn. Mikroskopet förvaras i ett mörkt rum med rumstemperatur konstant nära 25 ° C och utanför ljus minimeras med mörkläggningsgardiner på alla fönster. Följande protokoll beskriver användningen av detta system för anterograd transport och analyser spridning.

Ett antal alternativ finns för att kontrollera för de variabler för levande cell imaging. Styrningen av mikroskopi inställningar kan utföras manuellt eller med hjälp av automatiserade system är beroende av proprietär programvara. Fluorescensbelysning kan uppnås med halogen, LED eller laser källor. Hastigheten på avbildning modifieras av hastigheten filtret omkoppling och tiden för att visualisera signalen med den parade detektionssystem. Miljökontroll kan uppnås med specialiserad hårdvara på mimikroskop skede, inneslutning av hela eller en del av mikroskopet i ett uppvärmt och befuktad låda, eller genom att höja temperaturen i det rum där mikroskopi kommer att utföras. Vart och ett av dessa alternativ har fördelar och nackdelar relaterade till kostnad och prestanda.

I det påföljande protokoll, detalj vi användning av levande cell imaging att studera snabba anterograd transport och anterograd spridning av alphaherpes virus genom användning av rekombinanta virala stammar. Realtids levande cell imaging visualiserar kapsid, inneragnen, och / eller glykoprotein samlokalisering på dynamiska strukturer genomgår transporter inom axoner 11. Övernattning Timelapse avbildning av compartmentalized neuronala kulturer visualiserar axonal virion avstigning och infektion av mottagliga celler 12. De protokoll som presenteras här har optimerats för användning med våra särskilt imaging system, men presenteras i stora drag i förhållande till de fyra elementen i levande cell imaging. I den diskussion som vikommer att ytterligare detalj några av optimeringen som är nödvändig för en framgångsrik experimentering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Avsnitt 1 - Omgivningskontroll Villkor för Live-cell Fluorescensmikroskopi

  1. 30 min före varje avbildning experiment ansluta och börja värma mikroskop inkubator scenen toppen.
    1. Slå på mikroskop, överförs och epifluorescent ljuskällor, och automatiserade kontroller hårdvara. Öppna mjukvaran mikroskop kontroll, NIS Elements, för att ansluta till mikroskopet och börja kyla EM-CCD-kamera.
    2. Bifoga Lens varmare till lämpligt mål (antingen 60X eller 100X oljeimmersion) Anmärkning:. Välj objektiv baserad på experiment typ. Den 100X differential interferens kontrast (DIC) är bäst för spårning av anterograd transporterar virion församlingar medan 60X fasen målet är lämpad att visualisera anterograd spridning. Lägre förstoring, behöver icke-oljeimmersion mål inte en lins varmare eftersom de inte ta direkt kontakt med provet.
    3. Bifoga scenen top inkubator på den motoriserade stadium av mi mikroskop. Säkerställa lämplig insats som kommer att hålla provet är på plats. Fäst fuktad luft linje från inkubatorn kontrollen till ingången på scenen top inkubator.
    4. Slå på inkubatorn och linsen varmare reglage och justera temperaturinställningen till tidigare kontrollerade förhållanden specifika för mål och prov som avbildas (se diskussion).
    5. Öppna reglerventilen på 5% CO 2/95% atmosfärisk tank för att ge CO 2 kompletterad luft att iscensätta topp inkubator. Flödeshastigheten bör vara mellan 60 och 80 ml gas per minut. Snabbare priserna kommer att resultera i omfattande prov uttorkning trots befuktning kammaren.
  2. Lägg lins olja till objektiv och omedelbart placera kulturen som kommer att avbildas i scenen top inkubator.
  3. Tillåt utjämning av temperaturen i kulturen i minst 10 minuter. En timme är att föredra, särskilt för övernattning avbildning beskrivs i avsnitt 3.
ve_title "> Avsnitt 2 - realtid avbildning av Anterograd Virion Transport Evenemang Protocol

  1. Sex till åtta timmar före avbildning, infektera en 35 mm täckglas-bottom maträtt av mogna, dissocierade SCG nervceller med 1 x 10 6 plackbildande enheter av viruset av intresse (se tabell 1 för exempel virus) med den metod som beskrivs i Taylor et al. 2012a 11. Om att testa mer än en virus, off-set vaccinationer med 30-60 min för att möjliggöra avbildning av sekventiella prover vid liknande tider efter infektion.
  2. Sätt skålen i scenen top inkubator i minst 10 minuter innan du kör något experiment. Medan temperaturen i jämvikt, är det fokalplan växling och kommer att negativt påverka några imaging experiment.
  3. Använda genomlysning och okularet i mikroskopet, hitta en neuronal cell organ som har ett tydligt isolerad axonal förlängning. Alternativt, använd lämplig fluorescensbelysning att hitta en cell som uttrycker upptäckttable mängder av fluorescerande proteiner. Det är viktigt att begränsa exponeringen av prov till fluorescerande belysning, i detta steg och efterföljande steg, på grund av ljus framkallad cellskada och blekning av fluorescerande proteiner.
  4. Dämpa fluorescensbelysning att minska intensiteten av excitationsljus för vilka cellerna utsätts för. Engagera Ijusdämpande Neutral Density (ND) filter i fluorescensbelysning strålgången. För filmer som varar längre än 1 minut, minst ND4 måste användas för att förhindra foto-blekning av fluorescerande proteiner och omfattande foto-skador av axoner. Mycket fluorescerande strukturer kan typiskt vara visualiseras med ett ND8 filter på plats.
  5. Använda mikroskop mjukvaran (figur 2 och Supplemental Movie 1A), växla lätta vägen till EM-CCD-kamera.
  6. Bestäm optimala avbildning tider och villkor för varje fluorescerande kanal.
    1. Initiera en levande bild fönster med "Play"-knappen. </ Li>
    2. Bestäm de optimala kamerainställningar exponering för varje fluorescerande protein. Överskrid inte 300 ms per kanal som rörelsers aberrationer snabbrörliga virionens strukturer kommer att inträffa. Utnyttja EM förstärkningen av kameran till en inställning på 300 (tillverkare föreslog maximal vinst), för att minimera exponeringstiden och förbättra upptäckten av dunkla signaler. Korrekt exponering tider bör producera en bild med låg bakgrund intensitet och höga specifika signaler.
  7. Efter inställning exponeringar och hitta en väl definierad region av axon, måste programvaran konfigureras för att utföra automatisk bildtagning. Stoppa levande avbildning fönstret för att förhindra prov blekning.
    1. I NIS Elements väljer 6D - Definiera / Kör Experiment ansökan från "Applications" rullgardinsmenyn.
    2. I ND förvärvet fönstret, klicka på fliken Tid som kommer att bestämma frekvensen av bilden förvärvet. Ställer in intervallet på "Ingen fördröjning" och varaktigheten till 5 min. The mjukvaran kommer då få bildramar på högsta frekvensen möjligt löptid för 5 min.
    3. Välj "Lambda" fliken, som tillåter val av förinställda maskinvarukonfigurationer användas för flera fluorescerande bildtagning. Klicka på den första rutan och i den efterföljande rullgardinsmenyn för att välja en lämplig maskinvarukonfiguration. Upprepa för alla fluorescerande proteiner som skall avbildas.
    4. Se till flikarna för "XY positioner", "Z-serien" och "stor bild" är avmarkerade.
    5. Ovanför flikarna markerar rutan "Spara till fil" för att automatiskt spara bilder till hårddisken under förvärvet. Konfigurera plats och filnamn för experimentet utfil. Som sekventiella experiment utförs, kommer programmet lägga ett löpnummer i slutet av den angivna filnamnet.
    6. När alla flikar har valts. Initiera experimentet genom att klicka på "Run-nu"-knappen.
    7. Optimera hastigheten bilden förvärvet genom exponering inställningar och image storleken. Med hjälp av en liten region av bilden-stånd, kommer ofta snabbare frame rates förvärv. Definiera regionen av intresse med hjälp av ROI verktyg i NIS-Elements, välja ett område mellan 25% och 50% av den totala bildytan. Alternativt kommer kortare exponeringstider öka frame rates förvärv, men minskar kvaliteten på signalen (se diskussion).

Avsnitt 3 - Övernattning Time-lapse avbildning av anterograd Spread Evenemang

  1. Fyra timmar före avbildning, infektera en compartmentalized neuronal kultur byggd på en 35 mm μ-Dish. Inokulera neuronala cellkroppar med 1 x 10 6 plackbildande enheter av viruset av intresse (se tabell 1 för exempel virus) med användning av den metod som beskrivs i Taylor et al. 2012b 12.
  2. Placera försiktigt odlingsskålen in scenen top inkubator. Se till positionen för målet är satt till sidan av skålen. Sakta föra målet i fokus, att säkerning av mål innebär Tryck inte upp i provet. När skärpan fältet har identifierats, sakta målet i mitten av skålen, nära den inre barriären demarking inre sidan av axonet facket. Under rörelse, säkerställa fokus djup bibehålls och undvika att driva upp i provet. Avböjning av plast ytan av målet kommer att skada axoner och plast.
  3. Tillsätt cirka 2 ml varmt (~ 37 ° C) fosfatbuffrad saltlösning till odlingsskålen utanför teflonring. Detta omger den neuronala kultur med en ring av PBS för att minimera prov uttorkning och tillhandahålla värmeisolering.
  4. Låt temperaturen i jämvikt i minst 1 timme före start automatisk bildtagning (3,8). Steg 3.5 genom 3.7 kan konfigureras under denna tid.
  5. Begränsa intensiteten av belysningen till den lägsta möjliga nivå genom att engagera alla neutrala densitet filter. Detta kommer att medge frekventa bildtagning over långa tidsperioder utan överdriven foto-skador. Minska belysningen kommer att resultera i lågt signal, som kräver längre exponeringar (se diskussion).
  6. Använd historiska exponeringsinställningar eller före experimentell installation genererar en parallell maträtt av infekterade epitelceller som uttrycker målet fluorescerande proteiner för att etablera exponeringsinställningar som beskrivs i avsnitt 2.5.
  7. Efter inställning exponeringar för de nödvändiga kanalerna, är det dags att konfigurera programvaran för automatisk bildtagning. Stoppa levande avbildning fönstret för att begränsa urvalet blekning.
    1. I Elements (Figur 2 och kompletterande film 2), välj 6D - Definiera / Kör Experiment ansökan från "Applications" rullgardinsmenyn för att få upp fönstret ND Acquisition.
    2. I ND Förvärv fönstret, klicka på fliken Tid. Ställer in intervallet på "5 min". Ställ Varaktighet till 20 tim. Den slingor fält beräknas automatiskt för antalet upprepningar program kommer att utföra.
    3. Välj "Lambda" fliken. Klicka på den första rutan och i den efterföljande rullgardinsmenyn väljer du lämplig lambda konfiguration för Faskontrast. Upprepa för efterföljande positionerna, väljer lämpliga konfigurationer för varje fluorescerande proteinet som skall avbildas.
    4. Välj "Stor Bild" fliken, som bestämmer parametrarna för flera bilder som ska kombineras till en enda större synfält. En rejäl består av 5 x 2 bilder med en 7% sömmar överlappning. Detta kommer att möjliggöra för det maximala antalet celler per position som skall avbildas utan att påverka frekvensen av bilden förvärvet. Också, avmarkera kryssrutan "Stäng Active Shutter under Stage rörelse". Detta alternativ ökar hastigheten på förvärv genom att inte stänga luckor mellan bilderna.
    5. Välj "XY Positioner"-fliken, för att identifiera flera positioner som kommer att sekventiellt avbildas parallellt under loppet av natten filmen. Välj positioner som definierar mitten point för varje stor bildyta. Välj 6-8 bildpositioner i provet. En bra bild, kommer små kluster av celler i nära beröring med klart definierade axoner. Cellerna bör inte vara staplade ovanpå varandra och axon buntning bör minimeras. Fokuspunkten är cellkärnan. Placera målet så att en klart definierad kärnhöljet ses för majoriteten av cellerna.
    6. Se till att "Z-serien" fliken väljs bort.
    7. Konfigurera Auto-save funktionen som beskrivits ovan i avsnitt 2.6.5.
    8. Testa exponering och position genom att klicka på "1 gång loop". Utvärdera de resulterande bilderna för genomlysningsbelysning, fokus, och inramning. Om fokus har skiftat, återställa fokus för varje position enligt XY fliken. Vänta 10 minuter och upprepa detta steg tills fokus är stabil.
    9. Efter att alla inställningar har kontrollerats och testats, initiera automatiska experimentet genom att klicka på "Kör nu"-knappen.

    Avsnitt 4 - Bildbehandling och export

    Data Export

    1. Dataset erhållits under live-cell imaging av transport eller spridning händelser ska exporteras från NIS Elements i vanliga filtyper för senare användning i presentationer och publikationer (Supplemental Movie 3). För att exportera filmer öppna lämplig rå. ND2 fil i NIS Elements och välj "split-komponent" för att visualisera de önskade fluorescerande kanalerna. Uppspelning av filen på en lämplig hastighet, 5 bilder per sekund är en bra utgångspunkt för visualisering av snabb transport.
    2. Inkludera en tidsstämpel för att representera en realtidsklocka under filmuppspelning. Högerklicka på bilden och välj, Lägg ND-information. En digital räknare visas i det övre vänstra hörnet.
      1. Redigera den tid-stämpel för att visa information. Högerklicka på disken och välj Redigera ND-information. I den efterföljande pop-up fönster, redigera texten för att återspegla fantasinng parametrar som är viktiga. Redigera typsnitt, färg och storlek för klarhet.
    3. Gå till menyn "Redigera" och hitta "Skapa vy ögonblicksbild" eller tryck på "x"-knappen. Detta kommando öppnar "view ögonblicksbild" fönstret. Välj "tillämpas på alla ramar" för att generera en 8-bitars, RGB, export-klar fil innehållande de fluorescerande kanaler från hela filmen.
    4. Spara som en. Avi-fil för plattformsoberoende kompatibilitet. Ställ uppspelningen takt 200 msek per bildruta. De. Avi-filer som genereras av NIS Elements kan sedan komprimeras ytterligare med andra konverteringsprogram in önskad filtyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anterograd Transport

Tillämpningen av detta protokoll till infektioner av dissocierade SCG kulturer med PRV 348, har en rekombinant PRV stam som uttrycker GFP-US9 och GM-mCherry membranproteiner fusion, underlättade visualisering av anterograd transport av virioner (Figur 3 och Supplemental Movie 4). Införlivandet av dessa fusionsproteiner i virala partiklar resulterar i deras upptäckt på transport puncta och ovan nämnda villkor imaging minimera förskjutning av varje fluorofor på en rörlig partikel under filtret växling. I en tre-minuters avbildning fönster, finns många transportera puncta vanligast observerade och stora urvalsstorlekar för colocalization analyser snabbt genereras. Vi har tidigare kvantifierat colocalization av GFP-US9, den alphaherpes viruset axonal inriktning protein, med andra strukturella proteiner med hjälp av denna metod 11. Liknande analyser av andra dual recombinant PRV stammar har också beskrivits 11, och senare arbete har dokumenterat samtidig transport av PRV proteiner med en fluorescerande taggade värd motor protein i en ytterligare förlängning av detta protokoll 21. Använda snabbt byte filter hjul och parade multi-pass dikroiska speglar möjliggör snabb sekventiell förvärv av två eller flera fluorescerande kanaler. Vi kan idag nå två-kanals sekventiell förvärv i hastigheter upp till 0,8 bilder per sekund. För enstaka kanal video mikroskopi, som endast begränsas av den fluorescens exponeringstid och läs-tid för kameran, kan vi uppnå förvärv priserna högre än 6 bilder per sekund.

Anterograd Spread

Att visualisera anterograd spridda händelser, är områden av intresse visualiseras var 5 till 10 minuter för en 20 h period, under vilken tid virioner kommer att transportera ner och utträde från axoner, infektera närliggande epitelceller. En representativ ram från den stora bilden ären visas i figur 4A och Supplemental Movie 5. Notera rumsligt separerade karaktär fluorescerande protein uttryckande celler, en indikation på primär infektion från axoner. Infekterade celler kan spåras bakåt under filmen för att visualisera fluorescerande kapsidema som initierade virusinfektion. Dessa individuella celler kan isoleras från den stora ramen och spåras utan en betydande förlust av detalj. Den representativa ram (Figur 4B) från Supplemental Movie 6 skildrar en tid efter virioner har deponerat den fluorescerande capsid i cytoplasman.

Data Analysis

En rad olika analyser kan utföras på live-cell imaging dataset inklusive partikel spårning, studier colocalization och kvantifiering av händelser virionpartiklar spridning. Vi utför ofta våra analyser direkt i NIS Elements eller använda ett plug-in förlängning tillgänglig för ImageJ programpaket som gör. ND2 stöd filtyp. Olika hypoteser och experimentella uppställningar kräver unika analysmetoder. Vår grupp har beskrivit metoder för att bedöma colocalization av fluorescerande proteiner på dynamiska strukturer 11,21 och tidsförlopp kvantifiering av enskilda händelser partikel spridning 10,12,22. Metoderna beskrivs i detta manuskript och våra tidigare studier är flexibla och kan tillämpas på olika virusinfektioner samt transport av cellulära strukturer, t.ex. mitokondrier 23.

Figur 1
Figur 1. Schematisk av mikroskopi inrättas för levande cell imaging. A) Kultur typer användes för studier av anterograd transporter (dissocierade) och anterograd spridning (kammare) resp. Panel 1 är en faskontrastbilden av en mogen, dissocierade Superior Cervikal Ganglia (SCG). Panel 2 är en schematisk bild av compartmentalized odlingssystemet, avbildad i panel 3, med SCG neurons utstrukna i det vänstra facket med axonal prognoser sträcker sig under de interna hinder längst åt facket. B) Den inverterade epifluorescent mikroskop och skede topp inkubator konfiguration som används för videomikroskopi experiment. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. NIS-Elements programvara gränssnitt. En skärmdump av en standard användargränssnitt i NIS-Elements visas. Den Spela och Stopp styr live-bildfönstret visar de nuvarande maskinvarukonfigurationerna för bildhantering samt vad som för närvarande avbildas. Över den övre panelen är en serie av optiska konfigurationer som genomför förinställda hårdvara SEllningarna att konfigurera mikroskop för trans-belysta eller fluorescensdetektering. Camera Control och exponeringsinställningar tillåter konfiguration av kameran upptäckt att optimera bildkvalitet och snabbhet. Alla experiment samordnas med kontrollerna ND Acquisition. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Levande cell imaging av SCG axoner på 8 timmar efter infektion med PRV 348. PRV 348 infekterade nervceller uttrycker GFP-US9 och GM-mCherry membranproteiner fusion. Anterograd-transporterar strukturer inom distala axoner visualiseras i två fluorescerande kanaler, GFP och mCherry. En anterograd-transportera struktur (vit pil) fortskrider inom axonet som skildras i de sekventiella bilder tagna från Supplemental Movie 4. De båda fluorescerande proteinerna är spatialliera off-set på grund av sekventiell förvärv av fluorescerande kanaler och snabba transporter av virala strukturer. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4. Övernattning Timelapse avbildning av anterograd spridda händelser från infekterade axoner till epitelceller kluster under en multi-färg infektion. Bilderna är från en enda position, stor bild kaklat time-lapse film av virion överföring från PRV 427 infekterade axoner till mottagarens epitelceller. A) En sammanslagna bilden av de överförda, YFP och RFP fluorescerande bilder i taget efter infektion där recipientceller börjar uttrycka YFP-CAAX och VP26-mRFP fusionsproteiner. I den andra panelen är YFP och RFP kanaler visas tillsammans. Notera det stora antalet mRFP puncta assoförenade med axonet traktater. Dessa är monterade virioner genomgår långväga transporter inom axoner (Supplemental Movie 2). Den vita rutan representerar området av intresse markeras i del B. B) representativ bild av mottagarens epitelceller innehållande infekterar kapsid församlingar (Se även Supplemental Movie 3). Panel 1 är en sammanslagning av överförda och RFP-kanaler. Panel 2 är RFP kanalen ensam. Panel 3 är RFP-kanal med en schematisk bild av cellens kontur (fast vit linje), kärna (hashed vit linje), och axoner (blå linjer). Klicka här för att visa en större bild .

Supplemental Movie 1. Programvara inställningar för snabb, sekventiell förvärv av axonal virioner. Stegen är förknippade med att bestämma exponering inställningar, konfigurera kontrollerna ND förvärv, och skaffa en snabb ram förvärv movie av fluorescerande virioner genomgår axonal transport presenteras. SCG neuron kulturen infekterades med PRV 427 åtta timmar före avbildning. Klicka här för att se filmen .

Supplemental Movie 2. Programvara inställningar för natten avbildning av axon-till-cell spridning. Stegen är förknippade med att konfigurera kontrollerna ND förvärv för övernattning avbildning av axon-till-cell spridning händelser presenteras. Klicka här för att se filmen .

Supplemental Movie 3. Omvandling av. ND2 filer till presentabel filmformat. Stegen samband med konvertering av rådata. ND2 filer i heller. Avi eller. Mov filformat för presentation med vanliga videospelare. Klicka hennee för att visa filmen.

Supplemental Movie 4. Levande cell imaging av SCG axoner vid 8 h efter infektion med PRV 348. Klicka här för att se filmen .

Supplemental Movie 5. Stor bildyta på natten avbildning av axon-till-cell spridning. Klicka här för att se filmen .

Supplemental Movie 6. Utvidgat område för natten Timelapse avbildning av axon-till-cell spridning. Klicka här för att se filmen .

Stam Genotyp Utility
PRV 341 GFP-US9 (membran) / mRFP-Vp26 (kapsid) Virion transport experiment 11
PRV 348 GFP-US9 (membran) / GM-mCherry (membran) Virion transport experiment 11
PRV 427 mRFP-VP26 (kapsid) / YFP-CAAX (cellulära plasmamembran) Anterograd spridning experiment 10

Tabell 1. Användbara rekombinanta PRV stammar som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner.

Namn Company Katalognummer
35 mm glas botten kultur skålen MatTek Corporation, Ashland, MA P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish Ibidi USA LLC, Verona, WI 81.156
Mikroskop kropp Nikon Instruments Inc. Nikon Eclipse Ti
Motoriserade mikroskop XY skede Prior Scientific, Rockland, MA H117 ProScan Flat Top
Motordrivna filter hjul Prior Scientific HF110 10 ställning filterhjul
Fluorescerande belysningskälla Lumen Dynamics, Mississauga, Ontario Canada X-Cite 120Q
Multi-band fluorescens filter sätter Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET
EM-CCD-kamera Andor Technology USA, South Windsor, CT iXon3 897
Chamlide skede topp miljö inkubator Levande cell Instrument, Seoul, Sydkorea TC-L-10
Objektiv värmare Bioptecs, Butler, PA 150803 Controller150819-12-08 Värmare
Analys programvara Nikon Instruments Inc., Melville, NY NIS Elements

Tabell 2. Särskilda reagenser och utrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet för levande cell imaging observerar biologiska processer när de inträffar utan väsentlig förändring av lagen för observation. Detta mål uppnås genom att optimera tre variabler: miljökontroll, hastighet av att avbilda, och fluorescens belysning. Dessa inter-beroende variabler måste balanseras för att uppnå livskraftiga avbildningsbetingelser. De presenterade protokoll utnyttjar särskilda villkor för att producera de representativa resultat. Vi kommer att kort diskutera miljö-kontroller och observationer skador innan uppgifter om de specifika metoder som presenteras.

Etablera och upprätthålla relevanta biologiska förhållanden på mikroskopet är avgörande för framgångsrik övervakning av cellulära händelser. Att uppnå mål-förhållanden är beroende av ett antal variabler som är specifika för mikroskop och inkubatorn konfiguration. Alla inkubator inställningar bör valideras med hjälp av en oberoende temperaturmätning av en mock prov i inkubatorn tagitpå flera positioner, inklusive, med avseende objektiv kontakt mitten av kulturen skålen, och kanten av kulturen skålen. Inställningar bör optimeras för att minimera områden som är mer än 1 ° C varmare än 37 ° C samt att upprätthålla en temperatur nära 37 ° C vid punkten för objektiv kontakt. Varje kultur skålen och objektiv konfiguration som används för avbildning måste testas och valideras före experimentet. Idealt skulle alla prover övervakas med avseende på temperatur under avbildning, men detta visar sig vara opraktiskt för ett antal system och kompliceras när biologiskt farliga ämnen används. Validering av inkuberingsförhållanden är viktigt, eftersom inkubera proverna vid för låg eller för hög för en temperatur kan resultera i artefaktuella resultat eller snabb cellulär nedbrytning.

Identifiera och minimera resultat från observationsstudier skador är viktigt för protokoll utveckling. Frekvent belysning kan förändra biologiska processer, irreversibly inaktivera fluorescerande molekyler, eller inducerar ett antal cellulära död vägar. Validering temperatur är viktigt att reproducera biologiskt liknande betingelser på scenen toppen analoga med dem för en standard vävnadsodlingsinkubator. Styra för effekterna av frekventa belysning är svårare och kräver ofta iterativ trial and error metoder. Jämföra parallella prov hålls i inkubatorer vävnadsodling för morfologiska skillnader eller biologiskt relevanta ändringar kan avgöra om live-cell imaging villkor resulterar i betydande cellulär toxicitet. I de experiment som beskrivs här, har vi övervakat produktiviteten av virusinfektion genom virustiter samt omfattningen av viral spridning mellan celler.

Att uppnå realtid avbildning av snabba transporter inom axoner kräver optimering av bilden förvärvet hastighet längs intensiteten av fluorescens belysning. Hastigheten på bilden förvärvet bestäms av camera inställningar och mikroskopet hårdvara, speciellt när man samlar flera fluorescerande kanaler sekventiellt. Belysningsintensitet påverkar kvaliteten på fluorescerande signaler och graden av förvärvet. Större belysningsintensitet möjliggör enklare visualisering av fluorescerande proteiner, särskilt för dem som införliva partiklar i små mängder. Men provet bleker snabbare och lider ökad fototoxisk skada. Minskad belysning genom neutrala täthetsfilter kräver längre exponeringstider, att minska frekvensen av bilden förvärvet och potentiellt orsaka rumslig deformation av fluorescerande strukturer på grund av deras rörelse under detektering. Att hitta den rätta balansen av belysningsintensitet med bildtagning frekvens beror mycket på det fluorescerande proteinet signalen och graden av rörlighet på den struktur som studeras. Det är endast nödvändigt att förvärva tillräckligt signal för att skilja de fluorescerande strukturerna över bakgrunden, snarare änframställa bilder med hög kontrast som kräver längre exponeringstider.

Övernattning Timelapse avbildning använder en liknande maskinvarukonfiguration som realtid live-cell imaging men kraftigt påverkad av ackumulerade foto-skador i samband med långvarig, frekvent fluorescensbelysning. Till skillnad realtid avbildning, är behovet av att begränsa fluorescensbelysning intensitet avgörande, och alla andra variabler är modifierade för att ta hänsyn till denna begränsning. Begränsning av intensiteten av exponeringen möjliggör mer frekvent belysning av flera fluorescerande kanaler utan signifikant skada de avbildade cellerna. Anterograd axon-till-cell spread händelser är tidsmässigt och rumsligt olikartade, så att avbilda ett stort område är viktigt för att fånga så många av dessa ovanliga händelser som möjligt.

Ett antal publikationer har gett noggranna översikter och rekommendationer för levande praxis cell imaging 24-26. De protokoll som beskrivs här represenent våra bästa försök att minimera effekterna av fluorescens avbildning på virusreplikation, transport och spridning samtidigt som de väsentliga inslag i virusinfektion. Kombinera dessa protokoll med noggrann utveckling av fluorescerande fusionsproteiner och robusta neuronala kulturer har besvarat mina grundläggande frågor om herpesvirus infektion och patogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

LWE och RK stöds av amerikanska National Institutes of Health bidrag R37 NS033506-16 och R01 NS060699-03. MPT stöddes av ett American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). De råd och kunskap om Dr Matthew Lyman och Dr Oren Kobiler bidrog utformningen mikroskopet konfiguration och levande cell imaging metoder. Vi utökar också tack vare Neal Barlow och Brian T. Kain av Nikon Instrument för sitt tekniska bistånd i förvärv, installation och performance av mikroskopet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dish MatTek Corporation; Ashland, MA P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish Ibidi USA LLC, Verona, WI 81156
Microscope body Nikon Instruments Inc. Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage Prior Scientific; Rockland, MA H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels Prior Scientific HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD camera Andor Technology USA; South Windsor, CT iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator Live Cell Instruments; Seoul, South Korea TC-L-10
Objective lens heater Bioptecs; Butler, PA 150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software Nikon Instruments Inc.; Melville, NY NIS Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
  2. Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
  3. Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
  4. Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
  5. Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
  6. Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
  7. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  8. Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
  9. Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
  10. Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
  11. Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
  12. Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
  13. Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
  17. Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
  18. Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
  19. Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
  20. Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
  21. Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
  22. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
  23. Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
  24. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
  25. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
  26. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).

Tags

Virologi 78 infektion immunologi medicin molekylärbiologi cellbiologi mikrobiologi genetik mikroskopi fluorescens neurobiologi herpesvirus fluorescerande protein epifluorescent mikroskopi neuronal kultur axon virus video mikroskopi virus levande cell imaging
Levande cell imaging av Alphaherpes Virus Anterograd Transport och Spread
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. P., Kratchmarov, R.,More

Taylor, M. P., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread. J. Vis. Exp. (78), e50723, doi:10.3791/50723 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter