荧光显微镜方法测定细菌在协会的可行性与哺乳动物细胞

Summary

中央细菌发病机理的字段是定义是否以及如何暴露于真核细胞中后微生物生存的能力。本文概述了使用，揭示内部以及与宿主细胞相关的各个细菌的生存能力荧光染料的协议。

Abstract

中央细菌发病机理的字段是定义是否以及如何暴露于真核细胞中后微生物生存的能力。目前的协议来解决这些问题包括菌落总数测定，庆大霉素保护法和电子显微镜。菌落总数和庆大霉素保护法只评估整个细菌群体的生存能力，也就无法确定单个细菌的生存能力。电子显微镜可以用于确定个体的细菌的生存能力和提供关于其在宿主细胞中的定位信息。然而，细菌常常显示一个范围的电子密度，使得可行性评估困难。本文概述了使用，揭示内部以及与宿主细胞相关的各个细菌的生存能力荧光染料的协议。这些分析是独自开发，以评估在小学人类嗜中性粒细胞淋球菌存活，但应该是一个pplicable任何细菌宿主细胞的相互作用。这些协议结合膜可渗透荧光染料（SYTO9和4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚[DAPI]），其染色所有的细菌，具有不可透过膜的荧光染料（碘化丙锭和SYTOX绿），这是唯一的访问不能存活的细菌。前的真核细胞透化，抗体或荧光试剂加入到识别细胞外细菌。因而这些测定鉴别细菌粘附于和里面的真核细胞的生存能力。一种协议还提供了使用的可行性染料结合的荧光抗体的真核细胞的标记物，以确定个别细菌的亚细胞定位。这篇文章中讨论的细菌存活染料是一个敏感的补充和/或替代传统的微生物学技术来评估个体细菌的生存能力，并提供有关在细菌的宿主细胞生存信息秒。

Introduction

有一个动态的互动和在其居住的细菌和宿主之间的共同进化。细菌已经进化粘附细胞器，分泌系统，和/或产生毒素，使宿主吞噬细胞和非吞噬细胞的生产性感染的能力。此外，细菌还必须与认可与宿主免疫系统的抗菌活性。宿主的免疫系统包括先天性和适应性组件，包括物理和化学屏障，免疫细胞，补体系统，免疫和体液免疫的其它部件。虽然许多细菌很容易受到杀伤和清除由多层宿主的免疫反应，一些致病性和投机细菌已经进化机制来感染多种宿主细胞和宿主的免疫反应¹颠覆间隙。 淋球菌是一种细菌病原体的一个例子这是高度适应坚持其人类宿主。Ñ。淋病容易定殖泌尿生殖道癌，咽癌，结膜，和直肠的粘膜上皮细胞的腔表面。定植触发嗜中性粒细胞的大量招聘在粘膜部位。中性粒细胞是专业的吞噬细胞是具有多种抗微生物过程，以杀死微生物，但是，N。淋病是能够存活在嗜中性粒细胞^2-5的存在。了解如何细菌病原体如N。淋球菌颠覆，压制，并劫持了免疫反应通常在恶劣的环境中主机的最终生存是至关重要的防治传染性疾病的新疗法的发展。

常用于宿主细胞研究细菌生存实验的协议包括菌落总数测定，庆大霉素保护法和电子显微镜。在菌落计数测定法，受感染的细胞群被裂解（例如，用洗涤剂的whICH细菌有抗药性）解放细菌。将裂解物稀释并涂布在琼脂上的媒体，以及集落形成单位中的溶胞产物被列举为每个时间点和/或实验条件。此方法报道的全部细菌群体的生存力，但并不能够胞内和胞外生存区分的。上的菌落计数测定法，庆大霉素保护测定法，一种变化明确地测量细胞内细菌存活，基于抗生素庆大霉素无法越过的真核细胞膜^6。但是，这种测定法是依赖于细菌会受影响杀庆大霉素（或另一种抗生素是类似的真核细胞膜透性）和抗生素的无力获得内部的细菌。因此，庆大霉素保护法可能无法有效检查所有细菌种类或检查高度细菌生存时胞饮细胞如嗜中性粒细胞。这些方法都不揭示了亚细胞定位或个人的细菌等行为（ 例如 ，如果细菌形成聚集体或行为不同于单个细菌细胞菌落）。另一种经常使用的方法，检查单个外部和内部的细菌的生存能力是薄截面的透射电子显微镜（TEM）。这种方法的优点在于，它可以提供有关该细菌在宿主细胞中的位置（ 例如，吞噬体，细胞质，自噬体），它可以被进一步研究通过免疫电镜用金偶联抗体亚细胞标记信息。然而，电子显微镜是不是在评估细菌生存力特别敏感。当包埋切片进行染色用醋酸双氧铀，柠檬酸铅，或其他电子密度试剂和通过电子显微镜成像，电子致密的细菌被认为是可行的和电子角TRON朗讯不能存活^7,8。然而，这个假设高估细菌生存能力，因为只有那些死去的细菌严重破坏细胞膜和细胞质泯灭的出现电子透亮。此外，某些细菌种可能显示的范围内的电子密度取决于生长的阶段，因此很难确定可行性。

作为替代或除了这些广泛使用的方法，在这里我们提供的协议和原理为利用荧光染料，表明细菌生存力评估附着并通过宿主细胞内在化细菌的存活。以识别细胞外的细菌，感染的细胞首先暴露于荧光试剂，如凝集素或菌特异性抗体。然后将感染的细胞透化，并暴露于DNA特异性染料是差分访问的细菌与完整与退化的膜，作为替代的细菌存活率。在第一protocol，膜渗透性染料SYTO9识别细菌总人口，而碘化丙啶是只对那些破坏细胞膜，因此被认为无法存活的细菌。碘化丙锭和SYTO9已被用于评价细菌存活在生物膜中，判别从非致病性细菌致病，并且列举可行的水性细菌^9-12。在第二协议，4'，6'-二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）确定总的细菌，而SYTOX Green是唯一可访问的无活力的人口。这些活力染料对可与免疫有关的感兴趣的蛋白质，以确定各细菌的位置，例如以限定细菌亚细胞定位进行组合。利用这些分析提供关键洞察导致宿主细胞的感染过程中杀死细菌或生存的相互作用。在这篇文章中列出的协议被用来评估的可行性是连接到与内初级人嗜中性粒细胞，包括中性粒细胞的吞噬体^5,13,14的不同人群淋病奈瑟氏球菌 。然而，这些协议可以被用于评估在专业的吞噬细胞，非专业吞噬细胞和原生动物^15-24的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生存能力。

Protocol

1。评估细菌存活与碘化丙啶和SYTO9

1. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板中与感兴趣的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
2. 漂洗细胞一次轻轻地在0.1M 3 - （N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），pH值7.2，含1mM的MgCl _2（MOPS / MgCl ₂的）。
3. 孵育细胞在黑暗中10分钟，在室温下用的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl ₂的，以检测外部细菌。

注：行为与活的和死的细菌控制，在没有宿主细胞，表明感兴趣的凝集素或抗体结合所有的细菌，无论生存能力（ 图1）。

4. 冲洗细胞两次，MOPS / _氯化镁 。
5. 吸米EDIA从细胞和加入0.5毫升活/死染色溶液。活/死染色溶液为5微米SYTO9，30微米碘化丙啶，并在MOPS / _氯化镁 0.1％皂素（终浓度_）。
6. 孵育细胞15分钟，在室温下在黑暗中。
7. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ _氯化镁。
8. 反转盖玻片面朝下放置玻片和密封用透明指甲油。不要使用安装媒体。
9. 在30分钟内采集图像，使用荧光显微镜与绿色，红色和远红色图像采集兼容的过滤器集。

注意：两个常规荧光显微镜和共焦激光扫描显微镜可以使用。经过30分钟的荧光染料开始从细菌到泄漏和获取的数据不再准确。本文中显示图像，在使用的OpenLAB软件滨松的Orca-ER数码相机尼康的Eclipse E800直立荧光显微镜收购。 650纳米和663的发射滤波器 - - 使用过滤器以590激发波长检测的Alexa Fluor 647的荧光735纳米，并且是伪色的蓝色。 580纳米和600的发射滤波器 - - 660纳米使用过滤器以540激发波长检测从碘化丙啶荧光。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTO9荧光。

10. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现蓝色+红色图像，内部自生能力的细菌仅出现红色，外​​部活菌出现蓝+绿，内部活菌只呈现绿色。由眼计数的细菌是没有自生能力的外部，内部没有自生能力，外部可行的，并且内部可行的数字。
11. 通过将外部的活菌数由外部细菌的总数（计算外部活菌百分比可行加nonvi能）。通过将内部的活菌数由内部的细菌总数（可行加上不能存活）（ 图4）计算出内部的存活细菌的百分比。
12. 有两个基本的控制与此协议来执行。首先，验证所有的自生能力的细菌是碘化丙啶阳性和所有活细菌是SYTO9阳性。细菌（在没有任何宿主细胞）在对数中期文化应> 95％SYTO9阳性。 如图2中所示为N的对数中期培养淋病 （10 ⁸菌落形成每毫升为单位）孵育活/死染色溶液。第二，验证这两个碘化丙锭和SYTO9可以进入通透，感染的宿主细胞。
    1. 为了产生死菌的群体，收集2×10 ⁸菌落形成单位在1.5 ml离心管中，加入70％的异丙醇和坐10分钟。沉淀的细菌在微量一个第二次洗，细菌在PBS中以除去残留的异丙醇。然后，按照协议执行步骤1.5 - 1.7。添加5μl的细菌悬浮液在载玻片上并覆盖盖玻片。图像样本作为协议的步骤1.9。在这些条件下，人口的100％应是碘化丙啶阳性（ 图2）。在某些细菌物种，碘化丙啶未必完全压倒SYTO9染色，并不能存活的细菌可能会出现黄色或橙色。
    2. 对吞噬细胞如嗜中性粒细胞，暴露细胞异丙醇-杀死的细菌，并确保该胞内细菌的100％的碘化丙啶阳性（ 图3）。对于非吞噬细胞，可能不内化死的细菌，它可以是足以治疗感染的细胞中与叠氮化钠或其它渗透细胞的抗微生物剂添加的活/死染色溶液之前。

2。细菌性评估与可行性格力SYTOXn和DAPI

1. 与10微克/毫升的DAPI 20分钟，在室温下在黑暗中在莫尔斯的定义中²⁵兴趣标签细菌。
2. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板用DAPI标记的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
3. 与MOPS / _氯化镁冲洗一次细胞_。
4. 孵育细胞10分钟，在室温下在黑暗中的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl ₂的，以检测外部细菌。见注在协议的步骤1.3中建议的控制。
5. 从细胞中吸媒体和加入0.5毫升0.4微米SYTOX格林在MOPS / _氯化镁 。
6. 孵育细胞5分钟，在室温下在黑暗中。
7. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ _氯化镁 。
8. 在MOPS / _氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。

注意：使用过滤器具有590激发波长检测到的Alexa Fluor 647荧光 - 650 nm和663发射滤光片 - 735纳米，是假色红。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTOX绿色荧光。 375 nm和400 nm的屏障过滤器 - 使用过滤器以355激发波长检测来自DAPI的荧光。

10. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现红光+绿光图像，内部自生能力的细菌出现绿+蓝，外部活菌出现红+蓝，和内部活菌出现蓝色只（ 图4）。作为协议的输注液定量描述外部和内部的细菌的百分比p 1.11。
11. 在协议步骤1.12中描述的控制应与DAPI / SYTOX Green染料组合（ 图2和图3）来执行。

3。评估细菌生存能力除了亚细胞定位

1. 在莫尔斯的定义中20分钟，在室温下在黑暗中有10微克/毫升的DAPI兴趣标签细菌。
2. 感染的细胞，粘附到12毫米直径的圆形盖玻片在24孔板用DAPI标记的细菌。 不修复的细胞与醛或有机溶剂。
3. 与MOPS / _氯化镁冲洗一次细胞_。
4. 孵育10分钟，在室温下在黑暗中的Alexa Fluor 647 -偶联抗体或凝集素，其结合到感兴趣的细菌菌种来说，在MOPS / MgCl ₂的，以检测外部细菌。见注在协议的步骤1.3中建议的控制。
5. 从细胞中吸媒体和冲洗细胞2 TIMES在MOPS / _氯化镁。
6. 培养细胞的Alexa Fluor针对感兴趣的亚细胞标记物555偶联抗体20分钟，在MOPS / MgCl ₂的含有0.2％皂苷。
7. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ _氯化镁 。
8. 在MOPS / _氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。
9. 从细胞中吸媒体，并添加0.4微米SYTOX格林在MOPS / _氯化镁 。
10. 孵育细胞5分钟，在室温下在黑暗中。
11. 冲洗细胞两次在公开资讯观测站/ _氯化镁 。
12. 在MOPS / _氯化镁 5分钟洗涤细胞一次。
13. 在荧光显微镜30分钟获得的幻灯片图像。看显微镜，数码相机和采集软件描述协议的步骤1.9。

注意：使用过滤器具有590激发波长检测到的Alexa Fluor 647荧光 - 650 nm和663发射滤光片 - 735纳米，是假色紫色。的荧光F580纳米和600的发射滤波器 - - 660纳米的ROM的Alexa Fluor 555使用滤波器540的激发波长进行检测。 495 nm和515发射滤光片 - - 555 nm处使用过滤器具有465激发波长检测从SYTOX绿色荧光。 375 nm和400 nm的屏障过滤器 - 使用过滤器以355激发波长检测来自DAPI的荧光。

14. 该协议将导致在外部不能存活的细菌出现紫色+绿色的图像，内部自生能力的细菌出现绿+蓝，外部活菌出现紫色+蓝色，内生菌只出现蓝色，和亚细胞蛋白质呈红色（ 图4）。量化外部和内部活菌如协议中描述的perecent步骤1.11。
15. 在协议步骤1.12中描述的控制应与DAPI / SYTOX Green染料组合（ 图2和图3）来执行。
16. 在除了计数可行的和无法存活的细菌，细菌每一个分类为正或负的共定位与所关注的亚细胞标记。
17. 计算除以共同定位的存活细菌的数量通过活菌总数共定位与亚细胞标记物的存活细菌的百分比。计算除以无活力共定位的细菌数量由无活力的细菌总数共定位与亚细胞标记物不能存活的细菌的百分比。

Representative Results

概括的协议被用来研究N的生存淋球菌暴露于人原后中性粒细胞^5,26。中性粒细胞被感染N.淋病和与方案1进行处理，利用绿色荧光活力染料SYTO9和红色荧光碘化丙啶（ 图4A）。染料被加入以皂角苷的存在下，该螯合胆固醇优先透化的宿主细胞的质膜，而不是全淋球菌膜。其他洗涤​​剂可能需要进行测试，如果感兴趣的细菌的细胞膜含有高量的胆固醇。所有N。淋球菌污渍SYTO9，但只有妥协膜细菌染色用碘化丙啶。的碘化丙啶克服了SYTO9荧光，所以活的细菌出现绿色和死菌呈红色^27。在某些细菌种类，碘化丙啶可能无法完全克服SYTO9 stainin克，导致死菌出现的黄色或橙色。碘化丙啶至SYTO 9的比例，可能需要为不同的细菌种类进行优化。前透化细胞，并加入SYTO9和碘化丙啶，一个的Alexa Fluor 647偶联的大豆凝集素加入到被感染的细胞以检测胞外N。淋球菌，以及远红外荧光信号是假色蓝色。因此，在这个协议的外部活菌出现绿松石（蓝+绿）和外部无生存能力的出现品红（蓝+红）。内生菌只出现绿色（箭头），以及内部不能存活的细菌只出现红色（箭头）。要注意的是在被感染的细胞，真核细胞的细胞核将由SYTO9和碘化丙啶（“N”， 图4A）染色是重要的。外部可行的，不能存活的外部，内部可行的，并且内部不能存活的细菌从荧光图像量化，以产生内化细菌的百分第二内外宿主细胞的百分比存活细菌。

图4B是N的代表图像淋球菌感染与协议2处理的嗜中性粒细胞，使用活力染料SYTOX绿和DAPI。这个协议避免了使用碘化丙啶，其荧光在荧光显微镜红色和紫外线的通道。所有N。淋球菌染色用DAPI（蓝色），但只有妥协膜细菌染色与SYTOX绿色。如上所述，透化的细胞之前，一个的Alexa Fluor 647偶联的大豆凝集素加入到被感染的细胞以检测胞外N。淋球菌 ，其荧光在这种情况下是假色的红色。因此，外部活菌出现紫红色（红+蓝）和外部不能存活的细菌出现黄色（红+绿/蓝）。内生菌只出现蓝色（箭头），以及内部不能存活的细菌出现绿/蓝（箭头）。德未决的DAPI与SYTOX绿色荧光的相对强度，不能存活的细菌可能会出现绿松石。类似的细胞用碘化丙啶和SYTO9处理，中性粒细胞细胞核是由SYTOX绿色和DAPI 图4B（用“N”表示）染色。曝光感染细胞SYTOX绿和DAPI的揭示百分数的内化和细菌的生存能力在宿主细胞中，如以上对碘化丙锭和SYTO9量化。结果从N。淋球菌感染中性粒细胞处理使用SYTOX绿色和DAPI可媲美与碘化丙啶和SYTO9 ²⁶获得。

如描绘在图4C中 ，协议3是方案2的适应，其中的细菌存活率染料结合免疫荧光为伯或嗜中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒蛋白CD63。这个实验是为了确定吞噬体隔室的组合物进行的我包含可行的或无法存活的全 nside中性粒细胞淋球菌 ^26。此协议需要在显微镜对四色荧光探测能力的活菌，不能存活的细菌，细胞外的细菌，和亚细胞标记物。由于可行性的染料是不与醛固定（我们的未出版的观察）兼容，我们进行免疫荧光而不固定，使用直接耦合到荧光团的抗体，以减少来检测细胞内的抗原所需的时间。此抗体被结合到红色荧光的Alexa Fluor 555。由于在协议2，可行的和不能存活的细菌是用DAPI和SYTOX绿色，区分分别与外部细菌利用Alexa的647耦合大豆凝集素染色。外部细菌荧光远红和是假色紫色。外部活菌出现紫色+蓝色和外部不能存活的细菌出现紫色+绿色/蓝色。内部活菌显示为蓝色（箭头）和跨NAL不能存活的细菌出现绿色（箭头）。 CD63阳性颗粒和吞噬体呈现红色。中性粒细胞胞核染色与DNA特异染料（“N”）。当分析这些图像，每个单独的细菌被分为外部与内部的，可行的对比不能存活，而阳性或阴性CD63染色的环。N.淋球菌被认为是驻留在嗜中性粒细胞CD63阳性的吞噬体是否存在周围的细菌CD63荧光的环≥50％，并且在一个CD63-阴性吞噬体是否存在周围的细菌CD63荧光的环的<50％的。由图4C中的箭头所指示的无活力的细胞内细菌具有染色为CD63周围细菌的环。这枚戒指表示主颗粒富集在这个吞噬。活细胞内的细菌，由箭头指示的，缺乏染色CD63，表明初级颗粒不富集在其吞噬体。我们使用这种技术来显示N的生存能力之间的相关性淋球菌和居住在一所小学颗粒阴性吞噬体^26。因为该测定中同时跟踪生存能力和细菌本地化使用感兴趣的蛋白，它是可能的，以确定是否无活力和存活细菌驻留在相同或不同的位置。这个信息提供了重要的初步洞察，在宿主细胞有助于细菌的生存机制。

图1。可行的和无生存能力N的组合淋病是根据方案1暴露于的Alexa Fluor 647偶联的大豆凝集素，碘化丙啶，和SYTO9，在没有宿主细胞，所有的细菌都可以访问的外源凝集素和荧光蓝色。不能存活的细菌出现蓝色+红色和无法存活的细菌呈现蓝色+绿。

图2。 （AB）中对数生长期N。淋球菌被暴露在碘化丙啶和SYTO9在协议1，用（A）或无（B）异丙醇处理，以杀死细菌。无活力的细菌都可以访问碘化丙啶并显示为红色。活菌沾满SYTO9和呈现绿色。 （CD）中对数生长期N。淋球菌接触到DAPI和SYTOX绿色作为协议2，用（C）或无（ 四）异丙醇处理，以杀死细菌。不能存活的细菌都可以访问DAPI和SYTOX绿色，并出现蓝+绿。活菌沾满仅DAPI，只有蓝色的出现。

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图3。 （A）中性粒细胞被允许结合和内化异丙醇-杀死N。淋球菌 ，然后根据方案1暴露在碘化丙锭和SYTO9。不能存活的细菌染色用碘化丙啶并显示为红色。由于所有的细菌都不能存活，没有SYTO9阳性，绿菌检测。 （ 二）中性粒细胞被允许结合和内化异丙醇-杀死N。淋球菌 ，然后根据协议2接触到DAPI和SYTOX绿色。不能存活的细菌被用DAPI染色和SYTOX绿色，并出现蓝+绿。由于所有的细菌都不能存活，没有仅DAPI，蓝色只有细菌检测。 n个标签的中性粒细胞的细胞核。比例尺= 5微米。箭头指出一些没有自生能力的细菌。

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图4。 （A）N。淋球菌感染的人嗜中性粒细胞被暴露的Alexa Fluor 647偶联的大豆凝集素（假色的蓝），然后用皂苷透化的可行性的存在下染料碘化丙啶（红色），以标记死亡的细菌，和SYTO9（绿色），为了对活细菌。外部没有自生能力的细菌出现蓝色+红色，内部自生能力的细菌只出现红色，外部活菌出现蓝+绿，内部活菌只呈现绿色。 （B）N。淋病是用DAPI标记（蓝色），然后提供给中性粒细胞。然后感染细胞暴露于的Alexa Fluor 647偶联大豆凝集素（假色红色），然后用透皂甙在SYTOX绿色（绿色）的存在标示死菌。外部不能存活的细菌出现红光+绿光，内部自生能力的细菌出现绿+蓝，外部可行BAC特里亚出现红+蓝，和内部活菌只显示为蓝色。 （C）N。淋球菌感染中性粒细胞进行处理如B，除了针对CD63（红）加在透化时的嗜中性粒细胞初级颗粒的蛋白质的Alexa Fluor 555 -偶联抗体。该的Alexa Fluor 647-大豆凝集素染色呈假色紫色。外部不能存活的细菌出现紫色+绿色，内部无生存能力的细菌只会出现绿色，外部活菌出现紫色+蓝色，内部活菌只显示为蓝色，而CD63染色呈红色。插图显示与白色正方形表示的图像的区域的CD63的荧光。 交流中，n个标签的中性粒细胞细胞核。比例尺= 5微米。箭头表示不能存活的细菌和箭头指示活菌。

Discussion

这里呈现的是使用DNA结合和可行性染料与荧光凝集素识​​别连接到内部和人体细胞活的和死的细菌结合两种协议。由于这两种协议都有效地死菌歧视的活，要使用哪个协议的选择取决于实验的目的。第一个协议使用碘化丙啶检测不能存活的细菌和SYTO9检测的细菌。 如图4A所示是方案1的代表性图像施加到感染N.人中性粒细胞淋球菌 。这些染料结合的凝集素，大豆凝集素，识别细胞外N。淋病 ，但荧光耦合菌特异性抗体可作为一种替代方法。协议1容易地揭示了个体细菌的生存能力，因为排斥SYTO9的碘化丙啶使得不能存活的细菌荧光红和活细菌发出绿色荧光。 HoweveR，这个协议不能用免疫荧光对宿主蛋白质结合时，由于碘化丙啶的2的四个信道可用于传统的荧光显微镜的荧光。因此，方案2的开发，它使用SYTOX绿色来标识不能存活的细菌和DAPI检测细菌总人口。 N的一个范例淋病与和人中性粒细胞内相关联，并用SYTOX绿和DAPI处理示于图4B，并与免疫组合的例子示于图4C。除了两个额外的荧光通道的可用性，此协议有利于通过红绿的色盲人士使用。然而，不能存活的细菌可以发出荧光绿色或蓝绿色的，这取决于DAPI和SYTOX绿染色的相对强度以及在图像采集参数。一个缺点利用DAPI的是，它可以从N.泄漏淋病感染的过程中，虽然这可能不是一个问题，对其他细菌如金黄色葡萄球菌 （我们的未发表的观察结果）。为了对付这个问题，受感染的细胞，DAPI标记与绿色SYTOX感染后，但是核DAPI染色强度制服N的荧光淋病 （我们未发表意见）。除了这两个协议，其它市售的染料可用于揭示细菌生存能力。例如，羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记可以为细菌总人口和SYTOX橙色或蓝色可以识别没有自生能力的细菌。由于这些过程的相对功效可与细菌和感染的细胞类型而有所不同，但重要的是，研究人员在感染系统比较不同活力染料的组合。

目前，我们手动检查这些协议获得的每一个图像每量化仙国际化，百分比生存能力细胞内和细胞外，并共定位与亚细胞标记。而自动化的基于计算机的方法理论上可以用来量化这些参数，它们可以通过与活力染料和细胞核内的强荧光信号细菌的任何非均匀染色复杂。另外，对于亚细胞标记物的细菌共定位的定义可能需要为细菌，细胞类型以及感兴趣的标记来进行优化。

这些协议的一个限制是假设渗透性碘化丙啶或SYTOX绿色是细菌死亡的真实测​​量。碘化丙啶和SYTOX绿的分子量是668.4 Da和600道尔顿，分别。这些染料被认为是膜透性，不应该访问的细菌胞浆除非细菌有未修复细胞膜损伤。然而，可能仍然是细菌进入淤滞状态甚至他们的修复细胞膜损伤和继续增长在稍后时间。第二个限制是，协议不允许被跟踪一段时间内个别细菌的生存能力。 Life Technologies公司建议细菌生存能力用碘化丙锭和SYTO9的评估被暴露于染料之后30分钟内进行的，因为它们被安装并通过荧光显微镜成像的细菌就会失去活力的时间越长。感染细胞标记的DAPI / SYTOX绿色染料组合，还必须安装（我们未发表意见）后迅速成像。第三，该协议不与常用的固定技术兼容。甲醇或丙酮固定将通透，并杀死宿主细胞相关的细菌，和醛类固定剂通透N。淋球菌人中性粒细胞，以碘化丙啶和SYTOX绿色（未发表意见）内。因此，使用这些协议需要立即访问荧光MICRoscope需要和完成协议在一天的能力。最后，每一个在这些协议中所使用的染料结合双链核酸和结合宿主细胞核DNA以及细菌DNA（ 图1）。因为核DNA的荧光比细菌DNA的荧光显著亮，细菌，是在接近真核细胞核的生存能力无法评估。共聚焦激光扫描显微镜和预先标注的细菌用DAPI帮助减少核荧光信号。核DNA的荧光将保持这些协议的一种并发症，直到非DNA结合细菌生存力染料的开发。

尽管有这些限制，本文中的协议提供了一个敏感的方法来评估连接到内部和真核细胞中单个细菌的生存能力。菌落总数或庆大霉素保护法已经微生物发病机制的研究骨干。然而，它们PROV跨内使用一个潜在的异质群体细菌生存的评估。相反，此处所描述的生存能力染料协议允许被检个体的细菌的完整性。因此，研究人员可以收集有关细胞外与细胞内的细菌，细菌在吞噬体不同类型或细菌在吞噬体与细胞质的命运数据。薄截面透射电子显微镜经常被用来检查个别的细菌的生存能力。而出现的电子朗讯或不再完整通过TEM细菌显然不能存活，它更难以评估该保留部分的电子密度在其细胞质中的细菌是否实际上是完整的。此外，它可以采取许多小时的电子显微镜的时间来获得足够的显微照片来分析，而许多低功耗的字段可以从细胞暴露于基于荧光的可行性染料被收购，即使是在很短的时间得到的图像采集。而普罗维DED协议进行了优化与北淋病和原代人中性粒细胞，它们可以适合于评估许多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中的各种细胞类型的活力，包括所有吞噬细胞和非吞噬的真核细胞^{5,15-24,26。}细菌生存能力染料提供了有力的实验工具，研究细菌致病的真核细胞的机制和真核细胞，以控制细菌感染的能力。在未来，这些协议可能会变得更加有用与自动图像采集和处理，随着细菌的生存能力染料与醛固兼容，具体为原核生物的开发更好的工具。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377