Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50729
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Cancer Biology, University of Virginia Health Sciences Center

Summary

Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами.

Abstract

Центральное место в области бактериального патогенеза является возможность определить, если и как микробы выживают после воздействия эукариотических клетках. Современные протоколы для решения этих вопросов, включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. Кол колонии и защиты гентамицин анализы только оценки жизнеспособности всей популяции бактерий и не в состоянии определить индивидуальный бактериальную жизнеспособность. Электронной микроскопии может быть использован для определения жизнеспособности отдельных бактерий и предоставить информацию относительно их локализации в клетках-хозяевах. Тем не менее, бактерии часто показывают диапазон плотностей электронов, что делает оценка жизнеспособности трудно. В этой статье описываются протоколы для использования флуоресцентных красителей, которые показывают жизнеспособность отдельных бактерий внутри и связанных с клетками-хозяевами. Эти анализы были разработаны первоначально для оценки выживаемости гонококков в первичных человеческих нейтрофилов, но должно бытьpplicable для любого взаимодействия бактерия-клетки-хозяина. Эти протоколы объединить мембранные проницаемым флуоресцентные красители (SYTO9 и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола [ДАПИ]), который окрашивает все бактерии, с мембранными непроницаемый флуоресцентных красителей (пропидийиодидом и Sytox зеленый), которые доступны только для нежизнеспособные бактерии. До эукариотической клеточной проницаемости, антитело или флуоресцентный реагент добавляют к идентификации внеклеточных бактерий. Таким образом, эти анализы дискриминации жизнеспособность бактерий приверженцем и внутри эукариотических клетках. Протокол также предоставляется для использования жизнеспособность красителей в сочетании с флуоресцентными антителами к эукариотических клеток маркеров, для того, чтобы определить внутриклеточную локализацию отдельных бактерий. Бактериальные жизнеспособности красители, обсуждаемые в этой статье, являются чувствительными дополнением и / или альтернативой традиционным методам микробиологических оценить жизнеспособность отдельных бактерий и предоставить информацию о том, где бактерии выживают в клетке-хозяинес.

Introduction

Существует динамическое взаимодействие и коэволюция между бактериями и хозяев, в которых они проживают. Бактерии развивались приверженности органеллы, секреции системы, и / или способность производить токсины, которые позволяют их производственного заражение хозяина фагоцитарную и не-фагоцитов. Бактерии также должна будет бороться с признанием и антимикробных деятельности иммунной системы хозяина. Хозяин иммунная система состоит из врожденного и приобретенного компонентов, включая физических и химических барьеров, иммунных клеток, системы комплемента, и других компонентов гуморального иммунитета. Хотя многие бактерии чувствительны к гибели и очистки с помощью многослойной иммунного ответа, некоторые патогенные и условно-патогенные бактерии развивались механизмы заражают различные клетки-хозяева и саботировать зазор иммунного ответа 1. Гонококков является одним из примеров бактериальным патогеном что в высшей степени приспособлен упорствовать в своем человеческого организма. N. гонореи легко колонизирует просвета поверхности эпителиальных клеток слизистых урогенитального тракта, глотки, конъюнктивы, и прямой кишки. Колонизация вызывает обильное вербовку нейтрофилов в местах слизистой. Нейтрофилов профессиональные фагоциты, которые обладают различными антимикробными процессов, чтобы убить микроорганизмы, однако Н. гонореи способен выживать в присутствии нейтрофилов 2-5. Принципы действия бактериальных патогенов, таких как N. гонореи подорвать, подавить и захватить иммунный ответ, в конечном счете выжить в обычно враждебной среде принимающих имеет решающее значение для разработки новых методов лечения для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Экспериментальные протоколы часто используются, чтобы исследовать выживаемость бактерий в клетках-хозяевах включают количество колоний анализы, анализы, гентамицин защиты и электронной микроскопии. В подсчета колоний анализов, население зараженных клеток лизируется (например, с помощью моющего средства для WHич бактерии устойчивы), чтобы освободить бактерии. Лизаты разбавляют и высевают на агар на основе информации, а колониеобразующих единиц в лизатах перечислены для каждой временной точки и / или экспериментальных условиях. Этот подход сообщает жизнеспособность всей популяции бактерий, но не способны дифференцироваться между внутриклеточным и внеклеточным выживания. Вариация на количество колоний анализа, анализа защиты гентамицин, специально измеряет внутриклеточный выживаемость бактерий, основанный на неспособности к антибиотикам гентамицин, чтобы пересечь эукариотической мембрану плазмы 6. Тем не менее, этот анализ зависит от бактерий, являющихся восприимчивыми к гентамицину погибли на (или другого антибиотика, который аналогичным образом эукариотической мембраной impermeant) и неспособности антибиотика, чтобы иметь доступ к внутренним бактерий. Таким образом, защита гентамицин анализ не может быть эффективным для изучения всех видов бактерий или при рассмотрении выживаемость бактерий в сильнопиноцитозные клетки, такие как нейтрофилы. Ни один из этих подходов раскрывает внутриклеточную локализацию или другой поведение отдельных бактерий (например, если бактерии образуют агрегаты или микроколонии, которые ведут себя иначе, чем отдельных бактериальных клеток). Другим часто используемым подходом для изучения жизнеспособности отдельных внешних и внутренних бактерий тонкого раздел просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Этот подход имеет то преимущество, что она может предоставить информацию о местоположении бактерий в клетках-хозяевах (например Фагосомы, цитоплазма, аутофагосом), которые могут быть дополнительно исследованном иммуноэлектронной микроскопии с золотом в сочетании антител против внутриклеточных маркеров. Тем не менее, электронная микроскопия не особенно чувствительны при оценке бактериальной жизнеспособности. Когда срезы окрашивали уранилацетатом, цитратом свинца или других электронно-плотные реагенты и отображаемого с помощью электронной микроскопии, электронно-плотные бактерии считаются жизнеспособными и электроэлектрон-Lucent нежизнеспособным 7,8. Однако это предположение переоценивает бактериальную жизнеспособность, так как только те мертвых бактерий с сильно разрушенных мембран и лишены цитоплазмы появляются электронно-Lucent. Кроме того, некоторые виды бактерий могут вывести диапазон плотности электронов в зависимости от их стадии роста, что делает его трудно определить жизнеспособность.

В качестве альтернативы или в дополнение к этим широко используемых методов, здесь мы предлагаем протоколы и обоснование для использования флуоресцентных красителей, которые указывают бактериальной жизнеспособности для оценки выживаемости бактерий, прикрепленных к и усвоены клеток-хозяев. Для идентификации внеклеточных бактерий, инфицированные клетки сначала подвергают воздействию флуоресцентного реагента, такого как лектина или бактерии-специфические антитела. Инфицированные клетки затем проницаемыми и подвергаются ДНК-специфичных красителей, которые дифференциально доступны для бактерий с нетронутыми против деградированных мембран, в качестве суррогата жизнеспособность бактерий. В первом рrotocol, мембрана SYTO9 проницаемой краситель определяет общее бактериальное население, в то время как иодид пропидия доступна только для тех бактерий, которые скомпрометированы мембраны и, таким образом, считается нежизнеспособным. Пропидийиодидом и SYTO9 были использованы для оценки жизнеспособности бактерий в биопленки, различать патогенные от непатогенных бактерий и перечислить жизнеспособных воду бактерий 9-12. Во второй схеме, 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) определяет общие бактерии, в то время как Sytox Зеленый доступен только на нежизнеспособных населения. Эти пары жизнеспособность красителя может быть объединен с иммунофлюоресценции, чтобы определить местоположение каждой бактерии в отношении представляющего интерес белка, например, чтобы определить бактериальную внутриклеточную локализацию. Использование этих анализов содержит ключевую представление о взаимодействий, которые приводят к гибели бактерий или выживание при заражении клеток-хозяев. Протоколы, изложенные в этой статье, были использованы для оценки жизнеспособностиН. гонореи, который прилагается к и внутри первичных человеческих нейтрофилов, в том числе в разных популяциях нейтрофилов фагосом 5,13,14. Тем не менее, эти протоколы могут быть применены для оценки жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий в профессиональных фагоцитах, непрофессиональной фагоцитов, и простейших 15-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Оценивая жизнеспособность бактерий с пропидийиодидом и SYTO9

  1. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с бактерий, представляющих интерес. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
  2. Промыть клетки один раз осторожно в 0,1 М 3 - (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS), рН 7,2, содержащем 1 мМ MgCl 2 (MOPS / MgCl 2).
  3. Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl 2, чтобы обнаружить внешние бактерии.

Примечание: Поведение управления с живых и мертвых бактерий, в отсутствие клеток-хозяев, чтобы показать, что лектин или интерес антитело связывает все бактерии, независимо от жизнеспособности (рис. 1).

  1. Промыть клеткам два раза MOPS / MgCl 2.
  2. Аспирируйте мEdia из клеток и добавить 0,5 мл Live / Dead красящий раствор. Live / Мертвые окрашивающим раствором составляет 5 мкм SYTO9, 30 мкМ йодид пропидия и 0,1% сапонина (конечные концентрации) в MOPS / MgCl 2.
  3. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
  4. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl 2.
  5. Обратить покровные лицом вниз на стеклах и печать с четкой лака для ногтей. Не используйте монтажные СМИ.
  6. Получение изображений в течение 30 мин, с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами фильтров, совместимых с зеленого, красного и дальней красной получения изображений.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оба обычных флуоресцентной микроскопии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть использован. Через 30 мин флуоресцентные красители не начнут протекать от бактерий и данные, полученные больше не точны. Изображения, показанные в этой статье были приобретены на Nikon Eclipse E800 вертикальном флуоресцентного микроскопа с Хамамацу Orca-ER цифровой видеокамеры с помощью OpenLAB программное обеспечение. Флуоресценция Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно цвета синий. Флуоресценции от пропидийиодидом был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 540 - 580 нм и эмиссии фильтра 600 - 660 нм. Флуоресценции от SYTO9 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм.

  1. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются синий + красный, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются красные только внешние жизнеспособных бактерий появляются синий + зеленый, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются только зеленый. Всего на глаз число бактерий, которые являются внешними нежизнеспособным, внутренняя нежизнеспособным, внешний жизнеспособным, и внутренняя жизнеспособным.
  2. Рассчитать процент жизнеспособных бактерий внешних путем деления количества внешних жизнеспособных бактерий на общее количество внешних бактерий (жизнеспособным плюс nonviсостоянии). Рассчитать процент жизнеспособных бактерий внутренних путем деления количества внутренних жизнеспособных бактерий на общее количество внутренних бактерий (жизнеспособным плюс нежизнеспособными) (рис. 4).
  3. Есть два основных управления для выполнения с этим протоколом. Во-первых, проверьте, что все нежизнеспособные бактерии пропидий йодид-положительных и все живые бактерии являются SYTO9-положительным. Середины логарифмической культура бактерий (в отсутствие каких-либо клеток-хозяев) должна быть> 95% SYTO9-положительными. Показанный на рисунке 2 является среднего логарифмическая культура N. гонореи (в 10 8 колониеобразующих единиц на мл) инкубировали с Live / Dead красящий раствор. Во-вторых, проверить, что оба пропидий йодид и SYTO9 можете ввести проницаемыми, зараженные клетки-хозяева.
    1. Чтобы создать популяцию мертвых бактерий, собирать 2 х 10 8 бактерий колониеобразующих единиц в 1,5 мл пробирке, добавить 70% изопропанола и сидеть в течение 10 мин. Гранул бактерии в микроцентрифужную ай мыть бактерии дважды в PBS для удаления остаточного изопропанола. Затем следуйте протокол шаги 1.5 - 1.7. Добавьте 5 мкл бактериальной суспензии на предметное стекло и наложения с покровное. Образцы изображение как в протоколе шагом 1,9. В этих условиях 100% населения должны быть пропидий йодид-позитивными (рис. 2). В некоторых видов бактерий, пропидий йодид не может полностью подавить окрашивание SYTO9 и нежизнеспособные бактерии могут появиться желтые или оранжевые.
    2. Для фагоцитов как нейтрофилов, разоблачить клетки изопропанол убитых бактерий и убедитесь, что на 100% из внутриклеточных бактерий являются пропидий йодо-положительным (рис. 3). Для nonphagocytic клеток, которые не могут интернализации мертвые бактерии, может быть достаточным для лечения инфицированных клеток с азидом натрия или других проникающий в клетку антимикробных агентов перед добавлением Live / Мертвые окрашивающим раствором.

2. Оценивая жизнеспособность бактерий с Sytox Greeп и DAPI

  1. Этикетка бактерии интересов с 10 мкг / мл DAPI в Морса определенной среде 25 в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
  2. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с DAPI-меченых бактерий. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
  3. Промойте клетки один раз MOPS / MgCl 2.
  4. Инкубируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl 2, чтобы обнаружить внешние бактерии. См. примечание в протоколе шагом 1.3 для предложенных управления.
  5. Аспирируйте медиафайлы от клеток и добавить 0,5 мл 0,4 мкм Sytox Грин в MOPS / MgCl 2.
  6. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте.
  7. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl 2.
  8. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl 2 в течение 5 мин.

ПРИМЕЧАНИЕ: флуоресценции от Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно цвета красный. Флуоресценции от Sytox Грин был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм. Флуоресценции от DAPI был обнаружен с помощью фильтра с длине волны возбуждения 355 - 375 нм и барьерным фильтром 400 нм.

  1. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются красный + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый + синий, внешние жизнеспособных бактерий появляются красный + синий, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только (рис. 4). Количественная процентов внешних и внутренних бактерий, как описано в протоколе стер 1,11.
  2. Элементы управления, описанные в протоколе шагом 1,12 должна быть выполнена с комбинацией DAPI / Sytox Зеленая краска (рис. 2 и 3).

3. Оценивая жизнеспособность бактерий Наряду внутриклеточной локализации

  1. Этикетка бактерии интересов с 10 мкг / мл DAPI в определенной среде Морса в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
  2. Инфицировать клетки, которые прилегает к диаметром 12 мм круглых покровные стекла в 24-луночных планшетах с DAPI-меченых бактерий. НЕ фиксации клеток с альдегидов или органических растворителей.
  3. Промойте клетки один раз MOPS / MgCl 2.
  4. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре в темноте с Alexa Fluor 647-антитела или в сочетании лектина, который связывается с бактериальных видов, представляющих интерес, в MOPS / MgCl 2, чтобы обнаружить внешние бактерии. См. примечание в протоколе шагом 1.3 для предложенных управления.
  5. Аспирируйте медиафайлы от клеток и промыть клеткам два тиМЧС в MOPS / MgCl 2.
  6. Инкубируйте клетки с Alexa Fluor 555-сочетании антитела против маркера субклеточном интереса в течение 20 мин, в MOPS / MgCl 2, содержащий 0,2% сапонина.
  7. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl 2.
  8. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl 2 в течение 5 мин.
  9. Аспирируйте медиафайлы от клеток и добавить 0,4 мкм Sytox Грин в MOPS / MgCl 2.
  10. Инкубируйте клетки 5 мин при комнатной температуре в темноте.
  11. Промыть клеткам два раза в MOPS / MgCl 2.
  12. Промывают клетки один раз в MOPS / MgCl 2 в течение 5 мин.
  13. Получение изображений слайдов в течение 30 мин на флуоресцентном микроскопе. См. протокол шаг 1,9 для описания микроскопа, цифровой камеры и программного обеспечения приобретения.

ПРИМЕЧАНИЕ: флуоресценции от Alexa Fluor 647 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 590 - 650 нм и эмиссии фильтр 663 - 735 нм, и ложно-фиолетового цвета,. Флуоресценции ером Alexa Fluor 555 был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 540 - 580 нм и эмиссии фильтра 600 - 660 нм. Флуоресценции от Sytox Грин был обнаружен с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 465 - 495 нм и эмиссии фильтр 515 - 555 нм. Флуоресценции от DAPI был обнаружен с помощью фильтра с длине волны возбуждения 355 - 375 нм и барьерным фильтром 400 нм.

  1. Этот протокол приведет изображений, где внешние нежизнеспособные бактерии появляются фиолетовые + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый + синий, внешние жизнеспособных бактерий появляются фиолетовые + синий, внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только и субклеточная белок появляется красный (рис. 4). Количественная perecent внешних и внутренних жизнеспособных бактерий, как описано в протоколе шаги 1,11.
  2. Элементы управления, описанные в протоколе шагом 1,12 должна быть выполнена с комбинацией DAPI / Sytox Зеленая краска (рис. 2 и 3).
  3. Вдополнение к подсчету жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий, классифицировать каждый бактерий, положительным или отрицательным для колокализации с субклеточном маркера интерес.
  4. Рассчитать процент жизнеспособных бактерий локализуется с субклеточном маркера путем деления количества жизнеспособных бактерий локализуется на общее число жизнеспособных бактерий. Вычислить процентов нежизнеспособных бактерий локализуется с субклеточном маркера путем деления количества нежизнеспособных бактерий локализуется на общее количество нежизнеспособных бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протоколы, изложенные были использованы для изучения выживание N. гонореи после воздействия первичного нейтрофилов человека 5,26. Нейтрофилы были инфицированы N. гонореи и обрабатываются с протоколом 1, используя SYTO9 зеленый-люминесцентные жизнеспособность красителя и красный флуоресцентные пропидий йодида (Рисунок 4A). Красители были добавлены в присутствии сапонина, который изолирует холестерина предпочтительно проницаемыми клетка-хозяин плазматические мембраны, а не N. гонореи мембраны. Другие моющие средства, возможно, должны быть проверены, если мембраны бактерий, представляющих интерес содержат большое количество холестерина. Все Н. гонореи пятно с SYTO9, но только бактерии с ослабленной мембран окрашиваются пропидийиодидом. Йодид пропидий преодолевает флуоресценции SYTO9, поэтому живые бактерии появляются зеленые и мертвые бактерии появляются красные 27. В некоторых видов бактерий, пропидий йодид не может полностью преодолеть SYTO9 staininг, в результате чего мертвых бактерий появляются желтые или оранжевые. Отношение пропидийиодидом в SYTO 9 мая должны быть оптимизированы для различных видов бактерий. До permeabilizing клетки и добавление SYTO9 и пропидий йодида, Alexa Fluor 647-связанных соевый лектин был добавлен в инфицированных клетках, чтобы обнаружить внеклеточный N. гонореи, и дальней красной сигнал флуоресценции было ложным цвета синий. Таким образом, в данном протоколе внешние жизнеспособных бактерий появляются бирюзовый (синий + зеленый) и внешних нежизнеспособным появляются пурпурный (голубой + красный). Внутренние жизнеспособных бактерий появляются зеленый только (стрелка), и внутренние нежизнеспособные бактерии появляются красные только (стрелку). Важно отметить, что в инфицированных клетках, ядро эукариотической клетки будут окрашивали SYTO9 и пропидийиодидом ("N", фиг.4А). Внешние жизнеспособные, внешние нежизнеспособные, внутренние жизнеспособные, и внутренние нежизнеспособные бактерии количественно от флуоресцентных изображений с получением процентов интернализованных бактерий черезй процент жизнеспособных бактерий внутри и снаружи клеток-хозяев.

Рисунок 4B является представителем образ N. гонореи-инфицированных нейтрофилы обработанные с протоколом 2, используя жизнеспособность красители Sytox Зеленые и DAPI. Этот протокол позволяет избежать использования пропидийиодидом, который флуоресцирует в красных и ультрафиолетовых каналов на флуоресцентном микроскопе. Все Н. гонореи пятно с DAPI (синий), но только бактерии с ослабленной мембран окрашиваются Sytox Грин. Как описано выше, перед permeabilizing клетки, Alexa Fluor 647-связанных соевый лектин был добавлен в инфицированных клетках, чтобы обнаружить внеклеточный N. гонореи, чьи флуоресценции в этом случае ложно-красный цвет. Таким образом, появляются внешние жизнеспособных бактерий пурпурный (красный + синий) и внешние нежизнеспособные бактерии появляются желтые (красный + зеленый / синий). Внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только (стрелки), и внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый / синий (наконечники стрел). Дезависимости от относительной интенсивности DAPI против Sytox зеленую флуоресценцию, нежизнеспособные бактерии могут появиться бирюзовый. Как и в клетках, обработанных с пропидийиодидом и SYTO9, нейтрофилов ядро окрашивали Sytox зеленый и DAPI на фиг.4В (обозначенной "N"). Воздействие на инфицированные клетки в Sytox зеленый и DAPI показывает процентное интернализации и жизнеспособность бактерий в клетках-хозяевах, количественно, как описано выше для пропидийиодидом и SYTO9. Результаты N. гонореи-инфицированных нейтрофилы обрабатываются с помощью Sytox Зеленый и DAPI сопоставимы с результатами, полученными с пропидийиодидом и SYTO9 26.

Как показано на фиг.4С, протокол 3 как адаптация схемы 2, в котором жизнеспособность бактерий красители были объединены с иммунофлюоресценции для первичной или азурофильной нейтрофилов гранул белка CD63. Этот эксперимент был проведен с целью определения состава фагосомы отсеков яNside нейтрофилы, которые содержат жизнеспособную или нежизнеспособных N. гонореи 26. Этот протокол требует микроскоп для четырьмя цветами способности флуоресценции для обнаружения жизнеспособных бактерий, нежизнеспособных бактерий, внеклеточных бактерии и субклеточную маркер. Так как жизнеспособность красители не совместимы с альдегидной фиксации (наши неопубликованные данные), мы выполнили иммунофлюоресценции без фиксации, с использованием антитела непосредственно соединенный с флуорофором минимизировать время, необходимое для обнаружения антигена внутри клеток. Это антитело в сочетании с красным флуорофора Alexa Fluor 555. Как и в протоколе 2, жизнеспособные и нежизнеспособные бактерии были выделены с использованием DAPI и Sytox Green, соответственно, и внешние бактерии окрашивали с использованием Alexa 647-сочетании соевого лектина. Внешние бактерии светиться дальней красной и ложны цвета фиолетовый. Внешние жизнеспособных бактерий появляются фиолетовые + синий и внешние нежизнеспособные бактерии появляются фиолетовые + зеленый / синий. Внутренние жизнеспособных бактерий появляются синий (стрелка) и междуNAL нежизнеспособные бактерии появляются зеленый (стрелки). CD63-положительных гранулы и фагосомы выглядят красными. Нейтрофилов ядро ​​окрашивали конкретных красителей ДНК ("N"). При анализе этих фотографий, каждая отдельная бактерия была классифицирована как внешний против внутреннего, жизнеспособной по сравнению с нежизнеспособными, и положительные или отрицательные для кольца окрашивания CD63. N. гонореи считался проживать в нейтрофилов CD63-положительных фагосомы если есть ≥ 50% из кольца CD63 флуоресценции окружающей бактерии, и в CD63-негативных фагосомы если есть <50% от кольца CD63 флуоресценции окружающей бактерии . Нежизнеспособными внутриклеточный бактерия обозначено стрелкой на фиг.4С имеет кольцо окрашивания для CD63 окружающей бактерии. Это кольцо указывает первичные гранулы обогащены в этом фагосомы. Жизнеспособным внутриклеточный бактерия, указанном стрелкой, отсутствует окрашивание на CD63, что указывает на первичные гранулы не обогащенный на его фагосомы. Мыиспользовал эту технику, чтобы показать корреляцию между жизнеспособности N. гонореи и проживание в первичном гранул-отрицательных фагосомы 26. Поскольку этот анализ отслеживает как жизнеспособность и локализации бактерий с использованием белка, представляющего интерес, можно определить, если нежизнеспособные и жизнеспособные бактерии находятся в одном или разных местах. Эта информация дает важную начальную понимание механизмов, которые способствуют выживаемости бактерий в клетках-хозяевах.

Рисунок 1
Рисунок 1. Сочетание жизнеспособного и нежизнеспособных N. гонореи подвергали воздействию Alexa Fluor 647-связанных соевого лектина, пропидийиодидом и SYTO9 в соответствии с протоколом 1, в отсутствие клеток-хозяев. Все бактерии являются доступными для лектина и флуоресцирует голубым. Нежизнеспособные бактерии появляются синий + красный и нежизнеспособные бактерии появляются синий+ Зеленый.

Рисунок 2
Рисунок 2. (АВ) Середина логарифмическая фаза Н. гонореи подвергалась пропидийиодидом и SYTO9 как в протокола 1, с (а) или без (B) изопропанол лечения, чтобы убить бактерии. Нежизнеспособные бактерии являются доступными для пропидийиодидом и выглядят красными. Жизнеспособные бактерии окрашивают SYTO9 и кажутся зелеными. (CD) Середина логарифмическая фаза Н. гонореи подвергался DAPI и Sytox Грин, как и в протоколе 2, с (С) или без (D) изопропанол лечения, чтобы убить бактерии. Нежизнеспособные бактерии доступны для DAPI и Sytox Грин и кажутся синими + зеленый. Жизнеспособные бактерии окрашивают только DAPI и кажутся синими только.

альт = "Рисунок 3" FO: содержание-шир = "6 дюймов" Первоначально "/ files/ftp_upload/50729/50729fig3.jpg" />
Рисунок 3. (A) Нейтрофилы дают связаться и усвоить изопропанол-убил N. гонореи, то подвергается пропидийиодидом и SYTO9 в соответствии с протоколом 1. Нежизнеспособные бактерии окрашивают пропидийиодидом и выглядят красными. Как все бактерии нежизнеспособными, не SYTO9 положительным, зеленые бактерии не обнаружены. (B) Нейтрофилы дают связаться и усвоить изопропанол-убил N. гонореи, то подвергается DAPI и Sytox Грин в соответствии с протоколом 2. Нежизнеспособные бактерии окрашивают DAPI и Sytox Грин и появляются синий + зеленый. Как все бактерии нежизнеспособными, не DAPI только, голубые только бактерии не обнаружены. N этикетки нейтрофилов ядро. Шкала бар = 5 мкм. Стрелки указывают некоторые из нежизнеспособных бактерий.

в "SRC =" / files/ftp_upload/50729/50729fig4.jpg "/>
Рисунок 4. (A) N. гонореи-инфицированных нейтрофилы человека подвергались Alexa Fluor 647 связью сои лектин (ложно-синего цвета), то проницаемыми с сапонина в присутствии жизнеспособности красители пропидий йодида (красный), чтобы обозначить мертвые бактерии, и SYTO9 (зеленый), чтобы контрастирующая живые бактерии. Внешние нежизнеспособные бактерии появляются синий + красный, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются красные только внешние жизнеспособных бактерий появляются синие + зеленый, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются только зеленый. (B) N. гонореи метили DAPI (синий), то представляется нейтрофилов. Инфицированные клетки затем подвергают воздействию Alexa Fluor 647-связанных соевого лектина (ложно-красный цвет), затем проницаемыми с сапонина в присутствии Sytox Green (зеленый), чтобы маркировать мертвые бактерии. Внешние нежизнеспособные бактерии появляются красный + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленый + синий, внешний жизнеспособного BACTeria появляются красный + синий, и внутренние жизнеспособных бактерий появляются только синий. (C) N. гонореи-инфицированных нейтрофилов были обработаны, как в В, за исключением с Alexa Fluor 555-сочетании антитела против белка нейтрофилов первичной гранул CD63 (красный) добавляли в момент проницаемости. 647-сои окрашивание лектин Alexa Fluor было ложным цвета фиолетовый. Внешние нежизнеспособные бактерии появляются фиолетовые + зеленый, внутренние нежизнеспособные бактерии появляются зеленые только внешние жизнеспособных бактерий появляются фиолетовые + синий, внутренние жизнеспособных бактерий появляются синие только и окрашивание CD63 появляется красный. На вставке показана CD63 флуоресценции области изображения, указанного с белым квадратом. В AC, N этикетки нейтрофилов ядро. Шкала бар = 5 мкм. Стрелки указывают нежизнеспособные бактерии и стрелки указывают жизнеспособные бактерии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь представлены два протокола, которые используют связывания ДНК и жизнеспособность красители в сочетании с флуоресцентным лектина, чтобы идентифицировать живые и мертвые бактерии, прикрепленные к и внутри клеток человека. Поскольку оба протокола эффективно различать в прямом эфире из мертвых бактерий, выбор, какой протокол использовать, зависит от цели эксперимента. Первый протокол использует пропидий йодида для обнаружения нежизнеспособных бактерий и SYTO9 обнаружить нетронутые бактерии. Показано на рисунке 4A является представителем образ протокола 1 применяется для нейтрофилов человека, инфицированных N. гонореи. Эти красители были объединены с лектин, соевый агглютинина, признать внеклеточный N. гонореи, но флуоресцентно сочетании бактерии специфические антитела могут быть использованы в качестве альтернативы. Протокол 1 легко показывает жизнеспособность отдельных бактерий, так как исключение SYTO9 по пропидийиодидом делает нежизнеспособные бактерии светиться красным и жизнеспособных бактерий светиться зеленым цветом. Howeveг, этот протокол не могут быть объединены с иммунофлюоресценции для принимающих белков, за счет флуоресценции пропидийиодидом в двух из четырех каналов, доступных для обычной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, протокол 2 был разработан, которая использует Sytox Green определить нежизнеспособных бактерий и DAPI обнаружить общее бактериальное население. Пример N. гонореи, связанные с и внутри нейтрофилов человека и обработаны с использованием Sytox зеленый и DAPI показано на фиг.4В и пример в сочетании с иммунофлюоресценции показано на фиг.4С. Кроме наличия двух дополнительных каналов флуоресценции, этот протокол выгоден для использования лиц с красно-зеленой дальтонизм. Тем не менее, нежизнеспособные бактерии могут светиться зеленым или сине-зеленый, в зависимости от относительной интенсивности DAPI и Sytox Green окрашивания и от параметров захвата изображений. Один недостаток с использованием DAPI, что он может вытекать из N. гонореив ходе инфекции, хотя это не может быть проблемой для других бактерий, таких как золотистый стафилококк (наши неопубликованные данные). Чтобы противодействовать эту проблему, инфицированные клетки метили DAPI вместе с Sytox Green после инфицирования, но интенсивность окрашивания DAPI ядерной подавлен флуоресценцию N. гонореи (наши неопубликованные данные). В дополнение к этим двум протоколам, другие коммерчески доступные красители могут быть использованы для выявления бактериальной жизнеспособности. Например, карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир (CFSE) может маркировать общее бактериальное население, и Sytox Оранжевый или синий может определить нежизнеспособных бактерий. Так как относительная эффективность этих процедур может изменяться с бактерией и зараженной типа клеток, важно, что исследователи сравнить различные комбинации жизнеспособность красителя в их системах инфекции.

В настоящее время мы сами просмотреть каждое изображение получается с этими протоколами количественно зацент интернализация, процентов жизнеспособность внутри клеток и вне клеток, и колокализация с субклеточных маркеров. В то время как автоматизированные компьютерные методы на основе теоретически может быть использован для количественной оценки этих параметров, то они могут быть осложнена любой неравномерной окраски бактерий с жизнеспособностью красителей и сильного сигнала флуоресценции ядра клеток. Кроме того, определение бактериального колокализации с субклеточном маркера возможно, должны быть оптимизированы для бактерий, типа клеток и маркера, представляющего интерес.

Одним из ограничений этих протоколов является предположение, что проницаемость для пропидийиодидом или Sytox Грин является истинной мерой бактериальной смерти. Молекулярная масса пропидийиодидом и Sytox Green является 668,4 Da и 600 Da, соответственно. Эти красители считаются мембраной impermeant и не должны получить доступ к бактериальной цитоплазме если бактерии не имеют без ремонта повреждения мембраны. Тем не менее, остается вероятность, что бактерии попадают в состояние застояили даже восстановить их повреждения мембраны и продолжают расти в более поздние времена. Второе ограничение в том, что протоколы не позволяют жизнеспособность отдельных бактерий, которые необходимо отслеживать с течением времени. Life Technologies рекомендует оценки жизнеспособность бактерий с пропидийиодидом и SYTO9 быть выполнена в течение 30 мин после воздействия красителей, так как бактерии потеряет жизнеспособность чем дольше они установлены и отображаемого с помощью флуоресцентной микроскопии. Зараженные клетки, меченные комбинации зеленого красителя DAPI / Sytox также должны быть быстро отображены после монтажа (наши неопубликованные наблюдения). В-третьих, протоколы не совместимы с наиболее часто используемых методов фиксации. Метанол или ацетон фиксация будет проницаемыми и убить бактерии, связанные с клетками-хозяевами, и альдегидов основе фиксаторы проницаемыми N. гонореи внутри нейтрофилов человека к пропидийиодидом и Sytox Грин (неопубликованные данные). Таким образом, используя эти протоколы требуется непосредственный доступ к флуоресценции микрoscope и способность при заполнении протоколов в один день. Наконец, каждый из красителей, используемых в этих протоколах BIND двухцепочечной нуклеиновой кислоты и хозяина связывают ядерную ДНК, а также бактериальной ДНК (рис. 1). Поскольку флуоресценции ядерной ДНК значительно светлее, чем флуоресценции бактериальной ДНК, жизнеспособность бактерий, которые в непосредственной близости от эукариотической ядра не могут быть оценены. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и prelabeling бактерии с DAPI помощью уменьшить сигнал ядерной флуоресценции. Флуоресценция ядерной ДНК останется осложнением этих протоколов, пока не-ДНК-связывающие жизнеспособность бактерий красители не будут разработаны.

Несмотря на эти ограничения, протоколы в этой статье, чувствительной способ оценки жизнеспособности отдельных бактерий, прикрепленных к и внутри эукариотических клетках. Кол колонии или гентамицин-защиты анализы были основой микробного исследования патогенеза. Тем не менее, они провязь оценку выживаемости бактерий через потенциально гетерогенной популяции. Напротив, протоколы жизнеспособность красителя, описанные здесь, позволяют целостность отдельных бактерий, подлежащих рассмотрению. Таким образом, исследователи могут собрать данные о судьбах внеклеточных против внутриклеточных бактерий, бактерий в различных типах phagosomal или бактерий в фагосомы против цитоплазме. Тонкие разделе просвечивающая электронная микроскопия часто используется для изучения жизнеспособности отдельных бактерий. В то время как бактерии, которые не появляются электронно-Lucent или больше не нетронутыми с помощью ПЭМ явно нежизнеспособные, это более трудно оценить, насколько бактерии, которые сохраняют некоторую электронную плотность в их цитоплазме фактически нетронутыми. Кроме того, это может занять много часов времени электронного микроскопа, чтобы приобрести достаточно микрофотографии для анализа, в то время как многие поля маломощные могут быть получены из клеток, подвергнутых воздействию флуоресцентных основе жизнеспособности красителей, даже за то короткое время, предоставляемой для получения изображения. В то время как полоDED протоколы были оптимизированы с N. гонореи и первичные нейтрофилы человека, они могут быть адаптированы для оценки жизнеспособности многих видов грамотрицательных и грамположительных бактерий в различных типах клеток, включая все фагоцитарную и nonphagocytic эукариотических клетках 5,15-24,26. Жизнеспособность бактерий красители дают мощный инструмент для экспериментального изучения механизмов бактериальной патогенеза в эукариотических клетках и способности эукариотических клеток для контроля бактериальной инфекции. В будущем, эти протоколы могут стать еще более полезным с лучшими инструментами для автоматизированного получения изображений и обработки, наряду с развитием бактериальных жизнеспособности красителей, которые совместимы с альдегидной фиксации и специфичны для прокариот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим Asya Смирнов и Лаура Gonyar за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH R00 TW008042 и R01 AI097312 в AKCMBJ была частично поддержана NIH T32 AI007046.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251  
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480  
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070  
Dextran 500 Sigma 31392  
Sodium Chloride Fisher Scientific S641  
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200  
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802  
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03  
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401  
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1  
24-well plates Corning Incorporated 3524  
Pooled Human Serum Sigma S7023  
RPMI Mediatech 15-040-CV  
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103  
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF  
MOPS Sigma M3183  
MgCl2 Fisher Scientific BP214  
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012  
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012  
Saponin Fluka Analytical 47036  
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463  
DAPI Sigma D8417  
SYTOX Green Life Technologies S7020  
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6  
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187  
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492  
Forceps EMS 78320  
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Tags

Микробиология выпуск 79 иммунология инфекции биологии рака генетика клеточная биология молекулярная биология медицина биомедицинской инженерии микроскопия конфокальной микроскопии, флуоресценции бактерии бактериальные инфекции и микозы бактерии инфекции жизнеспособность флуоресцентной микроскопии сотовый работы с изображениями
Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. B., Criss, A. K.… More

Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter