Summary
私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。
Abstract
シロイヌナズナ胚乳は、成熟した胚を囲むと休眠種子の発芽や（FR）遠赤色光パルスで照射非休眠の種子のことを防止するための重要な役割を果たして、単一の細胞層から構成されています。さらに胚乳によって発揮される発芽抑制活性の基礎となる分子遺伝的メカニズムへの洞察を得るために、「種皮の寝具」アッセイ（SCBA）を考案した。 SCBAは種皮の下地層の上に胚の成長を監視することができ、物理的に種子から種皮と胚を分離する解剖手順です。驚くべきことに、SCBAは、種子休眠と種子発芽のFR-依存制御のコンテキストで種皮の発芽抑圧的な活動を再構成する。 SCBAは、休眠中の非休眠の遺伝子組み換え種皮と胚性材料、発芽を制御する遺伝的経路の組み合わせを使用することができ、具体的にはOP以来胚乳および胚におけるeratingを解剖することができます。ここでは詳細はSCBAを組み立てる手順を私たち。
Introduction
シロイヌナズナ成熟種子において、種皮は種皮、母体起源の死んだ組織の外部層と、胚乳、胚芽、直接1を取り巻く生きている組織の単一細胞層から構成されている。胚乳および胚は、別々の受精イベントから派生されています。胚が1妊産婦と1父方ゲノム2と二倍体組織であるのに対し、胚乳は母親の2と1父方ゲノムと三倍体組織である。
伝統的に胚乳に割り当てられた主な機能は、栄養組織のものである。しかしながら、胚乳はまた、種子の発芽を制御するための中心的な役割を果たしていることがますます明らかになってきている。この概念は、休眠の場合には新たに生産、種子が示す特性最初に明らかになった。休眠種子は、良好な発芽条件が存在するにもかかわらず、発芽していない。種子は熟成期間後に休眠を失い、nondormanなる良好な発芽条件にさらされたときtは、 すなわち 、それらは発芽する。種皮の除去は、胚の成長と緑化3,4をトリガーするため、モデル植物シロイヌナズナを含む多くの植物種では、種皮が絶対的に休眠種子の発芽を防止するために必要とされる。 シロイヌナズナにおいて、Bethke らは、発芽が胚乳5を囲む胚乳を維持しながら種皮を除去した後に抑圧されたままであることを観察した。これらの観察は、胚乳が胚に対して抑制活性を発揮種皮内の組織であることを示した。しかし、種皮除去実験は必ずしも種皮が提供する発芽抑制活性の性質を明らかにしたり、それを実装する遺伝子を同定する助けていない。
我々は最近、種皮と胚を物理的に分離されますが、近いproxiに保存されてい種皮寝具アッセイ（SCBA）を導入公正妥当胚乳によって提供発芽抑制活性を6に維持されるようになっている。 SCBAは、休眠非休眠の、そして遺伝子組み換え種子コートおよび胚性材料の組み合わせを使用することができます。その結果、遺伝的経路の発芽を制御し、特に胚乳及び胚において動作を解剖することができる。 SCBAは胚乳6はその成長を抑制するために、胚に向かって植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）を放出することを示すために休眠の文脈で使用した。さらに私たちは、休眠を促進するため、胚乳や胚組織で動作してシグナル伝達経路を特定するためにSCBAを使用することができます。
発芽を制御するために、胚乳の役割は、（FR）遠赤色光のパルスにさらされる非休眠の種子の場合を考慮することによって強化された。初期の種子吸水時のFR光パルスは7,8発芽を阻害することが知られている。種皮は種子からのFR光のパルスを取り出した際に強く胚乳はまた、非休眠の種子の9の発芽を抑制することができることを示唆し、発芽を抑制することができませんでした。注目すべきことに、SCBAはまた、発芽のFR-依存性阻害を再現するために用いることができる。これは種子発芽のFR依存性阻害にも胚乳9からのABAの放出を伴うプロセスであることを示すことができました。さらに、SCBAは、胚乳と光の合図9,10に対応して非休眠の種子の発芽を制御するために、胚で動作し、異なる光シグナル伝達経路を特定することができました。
SCBAは、種子発芽の制御のコンテキストで胚乳の機能を探索するために信頼性の高い技術であることがありますので。また、発芽を制御するために疑われる遺伝子は胚乳、胚または両方の組織で動作するかどうかをin vitroで評価する強力なツールです。ここでは詳細はSCBAを組み立てるために必要な様々なステップを、私たち。
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Protocol
SCBAが組み立てられると、胚の成長は、数日間にわたって監視される。したがって、SCBAのシード切開手順および組立前、人は、胚成長に対する種皮物質の効果の適切な評価を防ぐことができる将来の汚染を避けるために、種子を殺菌する必要がある。
1。種子消毒
- 1.5ミリリットルの微量遠心管に成熟し、乾燥したシロイヌナズナの種子の50〜60μLを注ぎ、70％エタノール溶液を調製する。
- 種子を含有するマイクロ遠心チューブに70％エタノール溶液1mlを添加し、ボルテックスミキサーで1,200 rpmで10分間室温で振盪する。
- チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。
- 慎重に微量遠心チューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて70％エタノール溶液を吸引する。
- tまでの滅菌蒸留水1ミリリットルを追加彼は、マイクロチューブは、まだ種を含む。
- 1,200 rpmで10分間室温で振盪する。
- チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。
- まだ種を含むマイクロ遠心チューブに滅菌水1mlの蒸留水を加える。水の流れが均一に管内の種を一時停止していることを確認してください。ここでの目標は、種子の整合性を維持するために、さらに揺れないようにすることです。
- 種子は30秒間、まだチューブを残すことによって、チューブの底に重力によって落ち着くましょう。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。
- 1.9 - 1.8ステップ4回繰り返します。全体的な滅菌処理には約30分かかります。
2。シードメッキ
「ontent>その後の工程は、無菌状態を維持するために、層流キャビネット内で実行されています。- （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES-KOH - ペトリ皿プレート2.5mMの2 4.3 g / Lのムラシゲとスコーグ培地を含む溶液をオートクレーブ処理することによって調製発芽培地30mlを含有する（直径100mm、高さ20mm）を準備; pHは5.7）と0.8グラム/ L寒天。溶液をペトリ皿プレート上に注ぐ前に、50℃の水浴で冷やす。
- 種を含むチューブに滅菌蒸留水を200μlを加える。種を再懸濁し、1ミリリットルの先端で、標準的なピペットを用いて発芽培地の表面に転送します。
- 真空吸引チップを用いて発芽培地の表面上に種子を周囲の水を除去する。
- さらなる乾燥のための2時間、層流キャビネット内の蓋なしで種を含むペトリ皿にしておきます。蓋をペトリ皿を閉じて、それが層流の下に放置約4時間後には種子消毒手順（ステップ1.2）の開始から経過したように、約90分間のキャビネット流れ。
3。シード解剖
次の手順は、層流フードキャビネット内部に配置された実体顕微鏡を扱う必要とする。切り捨てられた（ すなわち鈍）チップを備えたデュモンの鉗子＃5が大幅に種子（ 図1A）の対応が容易に行えます。
- 発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。ミディアム2並置長方形の無菌ワットマン3MMペーパー（; 図1B、ステップ1〜1.5センチメートル×1.0センチメートル）の表面に配置します。ワットマン3MM紙はオートクレーブ滅菌されています。
- 滅菌ピンセット（ 図1B、ステップ2）を使用して、ワットマン3MMの紙に種を転送します。
- 優しく切り捨て鉗子（の並置鈍チップを使用して、シードを押して、ワットマン3MM紙に対して個体の種子を開催
- （12.7ミリメートルのX 例：U100インスリン注射器+ 1ミリリットルの注射器、0.33ミリメートル（29 G））注射針を使用した種子の種皮（種皮や胚乳）をカットし（ 図1B、ステップ4）。 シロイヌナズナ種子の形状は楕円形であり、それは子葉（ すなわち離れてラジカル先端から）幼根に接合されている場所にできるだけ近い最長半主軸に沿って種皮をカットすることをお勧めします。これは解剖手順の次の段階で胚の安全な解放を支援します。
- 切り捨てられた鉗子（ 図1B、ステップ5）の並置鈍チップを使用してワットマン3MM紙に対する種子を押してください。このステップは、ステップ3.4（ 図1B、ステップ6）で作成された開口部を介して、種皮から胚を解放します。これは、子葉の先端が幼根の先端に最も近い内にあるシード（ すなわち離れてFR上のプッシュを適用することをお勧めしますOM開口部）。
4。種皮寝具アッセイのアセンブリ（SCBA）
種皮と胚の数を適切に選択するための説明を参照してください。
- 発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。媒体の表面の上に置いて、ナイロンメッシュの無菌矩形 片（3.5センチ×5.0センチメートル）（ 図2、ステップ1）。
- 損傷を避けるために、胚および種皮を穏やかに注射針（ 図2、ステップ2）を用いてそれらを押すことによって、鉗子の金属縁部の表面に移動させることができる。ナイロンメッシュ（ 図2、ステップ3）に移植胚と種皮。
- シードコートは、可能な限り接近されます（ 図2、ステップ4）であることを確認して平滑化鉗子や針を用いて種皮の円形単層を組み立てます。可能な限り公開しようとすることで生成された種皮口上向きに針。このステップは、体系的にテストされていません。胚の増殖を阻害する拡散性物質が直接離れてから胚向かって拡散するよりもむしろことが予想されるので、それはSCBAの効率を高めることができる。
- ステップ4.3で組み立て種皮ベッド（ 図2、ステップ5）の中央に円形の単一層として胚を置きます。胚は可能な限り接近していることを確認してください。
- 20〜21℃での連続光（40μモル/ m 2の S EC）の下でSCBAsインキュベートFRパルスは、発芽を逮捕、通常の光の下でSCBAを組み立て、説明したように、FRパルス9を適用し、暗闇の中でシャーレを残すために使用されている場合には。
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Representative Results
以前の研究は、GAを合成できない変異体の種子は、種子11,12の高いABAの蓄積の結果として、発芽することができなかったことを示した。その除去は、胚の成長13をトリガするので、発芽することができないことは、種皮が必要です。このことは、GAを合成することができない種子の胚乳は、胚の成長をブロックするためにABAを放出していることを示した。そこで、GAとABAを合成できない種皮と違っSCBAにおける胚の発育を阻止するために、GAを合成することが、種子コートはできない期待しています。ここでは、GA生合成14のために必要不可欠であるENT-コパリルリン酸合成酵素（GA1内SALK_109115挿入行（COLをコードGA1遺伝子を破壊するT-DNA挿入を運ぶGA1-21（ソーク挿入ラインSalk_109115）変異体の種子（アクAT4G02780）を使用生態型）をSALK信号データベース15（で参照されhttp://signal.salk。EDU /）。
以前の結果13と一致して、GA1-21変異体の種子は、種子吸水後80時間（ 図3、パネル1）の発芽ができませんでした。 ABA（ 図3、パネル3）培地中に存在していた場合を除き、コントラストと前の結果13とのさらなる整合性では、種皮除去はGA1-21胚の成長（ 図3、パネル2）を引き起こした。
図3のパネル4はシード吸水後の80時間後に撮影し80 GA1-21種皮のベッドの上でGA1-21胚とSCBAを示していた。我々の仮説と一致して、GA1-21変異株種皮はGA1-21胚の成長を阻止した。
以前の研究は、休眠種子種皮が吸収した中で、ABAの蓄積を促進し、GA-応答DELLA因子RGL2の構成的発現の結果として胚に向けて、ABAを合成し、解放したことを示したシード6,11。 GA合成がブロックされている条件でDELLA因子RGL2は構成的に蓄積し、ABAの蓄積11を推進しています。 GA1-21種皮中RGL2とABA合成の不在は、したがってSCBAにおけるGA1-21胚の成長を可能にするために期待されている。この仮説を検証するために、我々は、ABA2-1変異対立遺伝子（Col株）を用いた脱水素酵素（AT1G52340）Xanthosinをコードする遺伝子に点突然変異の結果として、ABA合成が欠損してrgl2-14、T-DNA挿入ライン（Salk_027654、 Col株）16。
図1。シード解剖のための手順。 A）図は、シード解剖のための切り捨て鉗子を作成する方法を説明。鉗子はハサミやペンチを使って切り捨てることができます。鉗子を並置切り捨てヒント寿を閉じているときLD種子の大きさについて表面を覆うb）工程1：無菌ワットマン3MM紙を、MS固形培地を含むペトリ皿プレートに配置されている側の長方形に並べ2を。ステップ2：種子を4時間吸水後ワットマン紙の表面に転写される。ステップ3：解剖の手順は、切り捨てられたピンセットを用いてワットマン紙に対する種子を保持している必要があります。ステップ4：注射針が示すように、種皮を切断するために使用される。ステップ5と6は：クローズ鉗子の並置先端を穏やかに切断したサイトを通じて種皮から胚をプッシュするために使用されている。
図2。種皮寝具アッセイのアセンブリのための手順ステップ1：ナイロンメッシュの矩形片はMS固形培地を含むペトリ皿プレート上に置かれている。ステップ2および3：解剖胚と種皮優しくありナイロンメッシュ上にそれらを転送する前に注射針を用いて鉗子の端に移動した。手順4と5：種皮の円形単層を組み立て、組み立て種皮ベッドの中央に円形の単一層として胚を廃棄してください。
図3。 GAを合成することができない種材料との代表的な結果。種皮寝具アッセイGA1から解剖種皮と胚を用いて、（GA1-21）のGAを合成できない変異体の種子、。種子吸水後の図80時間で説明したようにパネルは植物材料を示しています。
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Discussion
ここで説明する種皮寝具アッセイ（SCBA）手続きは、原則として、 シロイヌナズナ種子の発芽がブロック（または遅延）と胚乳がこの逮捕を実装するために疑われているどのような状況にも適用可能である。後者は、種皮（種皮や胚乳）を除去し、胚は種皮に囲まれているときと比較してより高速な胚成長が進行が認められていることを観察することによって証明することができます。発芽は特定の環境の物理的なパラメータ（ 例えば水ポテンシャルや光の質）、または特定の遺伝的背景にある（GA1変異体のように、GA合成の例がない、 図3を参照）に応じて、ブロックされることがあります。
種皮とSCBAに使用する胚の数については全く一般的なルールはありません。これは、種子バッチ（および特にその鮮度）に依存し、実験のタイプが実行される。したがってadjusにとって非常に重要です日常的に種皮のベッドの上での胚に成長を監視することによって、それぞれの特定の場合のために解剖した材料の量をトン。高度に休眠シロイヌナズナ生態型が使用される場合しかし、通常、数種皮が必要である。 SCBAsを組み立てる際に正常に使用された種皮と胚の典型的な量を以下に示す。
休眠種子材料6を装着しなければならない：
使用10胚および20種皮：*新鮮（ すなわち休眠）カーボベルデ島生態型（CVI）に収穫。
*新鮮ランツベルク（LER）の種子を収穫：10胚および80種皮を使用してください。
ジベレリン（GA）生合成（ 図3）がない状態で装 着しなければならない：
* GA1変異型種子（コロンビア - コル - 生態型）：使用10胚および80種皮。
発芽培地中で10μMのパクロブトラゾール（GA生合成の阻害剤）を持つ*野生型コル種子：使用10胚Sと100種皮。培地をペトリ皿に注ぐ前に、50℃まで冷却したときパクロブトラゾールを追加する。
遠赤色（FR）のパルスの後SCBA光9：
* 12胚および100種皮を使用してください。
SCBA技術の唯一の制限は、胚を殺していない間に急速に解剖シード材料を組み立てるようにそれは忍耐と器用さを必要とすることである。経験豊富な研究者は、20〜30分以内に100種を解剖することができます。しかし、経験の少ないユーザーが1時間を必要とし、胚の損傷を受けたりできる。我々の知る限りでは種子発芽の制御のための胚乳の役割を探求する代替技術は、これまでのところ存在しない。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、スイス国立科学財団からの補助金によって、ジュネーブ州によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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