Summary
Vi præsenterer den procedure, for at samle en frøskal sengetøj assay (SCBA) fra Arabidopsis thaliana frø. Den SCBA viste sig at være et effektivt redskab til at udforske genetisk og in vitro hvordan endosperm kontrol frøspiring i hvilende frø og som reaktion på lys signaler. Den SCBA er i princippet gælder i henhold til enhver situation, hvor endosperm er mistænkt for at påvirke embryonale vækst.
Abstract
Arabidopsis frøhvide består af et enkelt cellelag omkring modne foster og spiller en afgørende rolle for at forhindre spiring af hvilende frø eller af nondormant frø bestrålet med et langt rødt (FR) lyspuls. For yderligere at få indsigt i de molekylære genetiske mekanismer bag spiring undertrykkende aktivitet udøves af endosperm, blev en "frøskal strøelse" assay (SCBA) udtænkt. Den SCBA er en dissektion procedure fysisk adskillelse frøskaller og embryoner fra frø, som tillader overvågning væksten af fostre på et underliggende lag af frøskaller. Bemærkelsesværdigt, at SCBA genopretter spiringen undertrykkende aktiviteter frøskallen i forbindelse med frø vækstdvale og FR-afhængig styring af frøspiring. Siden SCBA tillader kombinatoriske brug af hvilende, nondormant og genetisk modificerede frø pels og embryonale materialer, de genetiske mekanismer, der styrer spiring og specifikt opprimær i endosperm og embryo kan dissekeres. Her har vi detaljeret gennemgang af proceduren for at samle en SCBA.
Introduction
I Arabidopsis modne frø er frøskallen består af frøskal, et ydre lag af dødt væv af maternel oprindelse og endosperm et enkelt cellelag af levende væv, der omslutter embryo 1. Endosperm og embryoet stammer fra separate befrugtning begivenheder: endosperm er en triploid væv med to mødre og en faderlig genom mens fosteret er en diploid væv med en maternel og en faderlig genom 2.
Den vigtigste funktion traditionelt tildelt endosperm, er en nærende væv. Imidlertid er det i stigende grad klart, at endosperm også spiller en central rolle for at kontrollere frøspiring. Dette begreb blev først synlige i tilfælde af hvileperioden, et træk, som udvises af nyligt fremstillede frø. Hvilende frø ikke spire på trods af tilstedeværelsen af gunstige spiringsbetingelser. Frø mister deres hviletilstand efter en modningsperiode og blive nondormant, dvs de vil spire når de udsættes for gunstige spiringsbetingelser. I mange plantearter, herunder den model plante Arabidopsis er frøskal absolut påkrævet for at forhindre spiring af hvilende frø siden frøskal fjernelse udløser embryonale vækst og grønnere 3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Observeret, at spiring forblev undertrykt efter fjernelse af testa samtidig bevare endosperm omgiver endosperm 5.. Disse observationer stærkt indiceret, endosperm er væv i frøskallen udøver en undertrykkende aktivitet på embryoet. Men frøskal fjernelse eksperimenter ikke nødvendigvis bidrage til at tydeliggøre arten af spiring undertrykkende aktivitet, som frøskallen heller ikke identificere de gener, der gennemfører det.
Vi har for nylig indført en frøskal sengetøj assay (SCBA) hvor frøskaller og embryoner er fysisk adskilte, men holdt i tæt Proximelse, således at spiring undertrykkende aktivitet, som endosperm opretholdes 6. Den SCBA tillader det kombinatoriske anvendelse af hvilende, nondormant, og genetisk modificerede frøskal og embryonale materialer. Som et resultat heraf kan de genetiske mekanismer, der styrer spiring og specifikt opererer i endospermen og embryo dissekeres. Den SCBA blev brugt i forbindelse med vækstdvale at vise, at endosperm frigiver phytohormone abscisinsyre (ABA) mod foster til at undertrykke sin 6. vækst. Desuden kunne vi bruge SCBA at identificere de signalveje, der opererer i frøhvide og embryonale væv for at fremme vækstdvale.
Den rolle, endosperm at kontrollere spiring blev yderligere styrket ved at overveje tilfælde af nondormant frø udsat for en puls af langt rødt (FR) lys. Tidligt på frø imbibition en FR lyspuls er kendt for at hæmme spiring 7,8. Når frøskaller blev fjernet fra frø en puls af FR lysvar ude af stand til at hæmme spiring, kraftigt tyder på, at frøhvide også kan undertrykke spiring af nondormant frø 9. Bemærkelsesværdigt kunne SCBA også anvendes til at rekapitulere FR-afhængig inhibering af spiring. Dette lov til at vise, at der FR-afhængig hæmning af frøspiring er også en proces, der involverer ABA frigivelse fra endosperm 9. Desuden SCBA tilladt at identificere de forskellige lys-signalveje, der opererer i endosperm og embryoet til at styre nondormant frøspiring reaktion på lys tidskoder 9,10.
Den SCBA synes derfor at være en pålidelig teknik til at undersøge funktionen af endosperm i forbindelse med kontrollen af frøspiring. Det er også et effektivt redskab til at vurdere, in vitro, om gener, der mistænkes for at styre spiring opererer i endosperm, fosteret eller begge væv. Her har vi detaljeret de forskellige trin, der kræves for at samle en SCBA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Når SCBA er samlet, er væksten af embryoner overvåget i løbet af flere dage. Derfor før frø dissektion procedure og samling af SCBA, er man nødt til at sterilisere frø til at undgå fremtidige forureninger, der kunne forhindre en korrekt vurdering af effekten af frøskal materiale på embryonale vækst.
1.. Seed Sterilisation
- Hæld 50-60 ul af modne og tørre Arabidopsis frø i en 1,5 ml mikrocentrifugerør og forberede en 70% ethanol opløsning.
- Der tilsættes 1 ml 70% ethanol-opløsning til mikrocentrifugerør indeholdende frø og rystes ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1.200 rpm i en vortex.
- Centrifuge mikrocentrifugerør i 3 sekunder ved 4.000 xg at koncentrere frø i bunden af røret.
- Aspirer 70% ethanol-opløsning ved hjælp af et vakuum sugespids omhyggeligt forlader frøene nederst mikrocentrifugerøret.
- Der tilsættes 1 ml sterilt, destilleret vand til t han mikrocentrifugerør stadig indeholder frø.
- Ryst ved stuetemperatur i 10 minutter ved 1.200 rpm.
- Centrifuge mikrocentrifugerør i 3 sekunder ved 4.000 xg at koncentrere frø i bunden af røret. Aspirere vand supernatanten under anvendelse af et vakuum sugespids omhyggeligt forlader frøene i bunden af røret.
- Tilsæt 1 ml sterilt vand, destilleret vand til mikrocentrifugerør stadig indeholder frø. Sørg for, at strømmen af vand homogent suspenderer frøene inde i røret. Målet her er at undgå yderligere ryste for at bevare integriteten af de frø.
- Lad frøene slå sig ned ved hjælp af tyngdekraften på bunden af røret ved at lade røret stadig i 30 sek. Aspirere vand supernatanten under anvendelse af et vakuum sugespids omhyggeligt forlader frøene i bunden af røret.
- Gentag fire gange trin 1,8-1,9. Samlet sterilisering procedure tager omkring 30 minutter.
2. Frø Belægning
NDHOLDET "> Alle efterfølgende trin udføres inde i et lagdelt stinkskab for at bevare sterile forhold.- Forbered en petriskål plade (100 mm i diameter, 20 mm højde), der indeholder 30 ml spiringsmedium fremstillet ved autoklavering af en opløsning indeholdende 4,3 g / l Murashige og Skoog-medium i 2,5 mM 2 - (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES-KOH ; pH 5,7) og 0,8 g / l agar. Lad opløsningen køle ned i et 50 ° C vandbad før hælde det på petriskålen plade.
- Tilsæt 200 pi sterilt, destilleret vand til røret indeholdende frø. Resuspender frøene og overføre dem på overfladen af spiringen medium ved anvendelse af en standard pipette med en 1 ml spids.
- Fjern vandet omkring frøene på overfladen af spiringen medium ved anvendelse af et vakuum sugespids.
- Lad petriskål indeholdende frø uden låg inde i lagdelt stinkskab i 2 timer til yderligere tørring. Luk petriskål med låg og lad den stå under laminareflow skab til omkring 90 minutter, således at omkring 4 timer er gået siden indledningen af frø sterilisering procedure (trin 1.2).
3. Seed Dissection
Følgende trin nødvendiggøre arbejder med et stereomikroskop placeret inde i laminar flow hætte kabinet. En Dumont pincet # 5 med trunkerede (dvs. stump) tips i høj grad letter håndtering af frø (Figur 1A).
- Forbered en ny petriskål plade indeholdende 30 ml spiring medium. Sted på overfladen af mediet to sidestillede rektangulære sterile Whatman 3MM papir (1,5 cm x 1,0 cm, Figur 1B, trin 1). Whatman 3MM papir steriliseres i en autoklave.
- Overfør frø på Whatman 3MM papirer ved hjælp af steril pincet (figur 1B, trin 2).
- Hold en individuel frø mod Whatman 3MM papir ved forsigtigt at trykke frøene ved hjælp af de sidestillede stumpe spidser afstumpede pincet (
- Skær frøskallen (frøskal og endosperm) af frø ved hjælp af en kanyle (fx U100 insulinsprøjte + 1 ml sprøjte, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (figur 1B, trin 4). Formen af Arabidopsis frø er ellipseformet, og det anbefales at skære frøskallen langs de længste semi-hovedakse så tæt som muligt på det sted, hvor kimbladene er forbundet til kimroden (dvs. væk fra den radikale tip). Dette hjælper sikker frigivelse af embryoet i næste trin af dissektion procedure.
- Skub frø mod Whatman 3MM papir ved hjælp af de sidestillede stumpe spidser afkortede pincet (figur 1B, trin 5). Dette trin frigiver embryon ud frøskallen gennem åbningen oprettet i trin 3.4 (fig. 1B, trin 6). Det anbefales at anvende tryk på frø, hvor spidsen af kimbladene er tættest på spidsen af kimroden (dvs. væk frabout åbningen).
4.. Montering af frøskaller Bedding Assay (SCBA)
Se diskussionen for korrekt valg af antallet af frøskaller og embryoner.
- Forbered en ny petriskål plade indeholdende 30 ml spiring medium. Sted på overfladen af mediet en steril rektangulært stykke (3,5 cm x 5,0 cm) Nylon mesh (figur 2, trin 1).
- For at undgå skader kan embryoner og frøskaller flyttes til overfladen af de metalliske kanter af tangen ved forsigtigt at skubbe dem ved hjælp af kanylen (fig. 2, trin 2). Overfør embryoner og frøskaller på Nylon mesh (figur 2, trin 3).
- Saml en cirkulær og enkelt lag af frøskaller ved hjælp af stumpe pincet og nålen at sikre, at frø frakker er så meget tættere som muligt (fig. 2, trin 4). Forsøge at udsætte så meget som muligt frøskallen åbning genereret afnålen opad. Dette skridt blev ikke systematisk testet. Imidlertid kunne det øge effektiviteten af SCBA siden diffunderbare stoffer hæmmer væksten af fosteret forventes direkte diffundere ud mod embryoet snarere end bort fra det.
- Placer embryoner som en cirkulær enkelt lag på midten af frøskallen seng samles i trin 4.3 (fig. 2, trin 5). Sørg for, at embryonerne er så meget tættere som muligt.
- Inkubér SCBAs under konstant lys (40 mmol / m 2 s ec) ved 20-21 ° C. I tilfælde, hvor en FR puls anvendes til standsning spiring, samle SCBA i normalt lys, anvende FR puls som beskrevet 9 og efterlade petriskål i mørke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere arbejde viste, at mutant frø ude af stand til at syntetisere GA var ude af stand til at spire som et resultat af høj ABA ophobning i frø 11,12. Men manglende evne til at spire kræver frøovertrækket siden dens fjernelse udløser embryonale vækst på 13. Dette stærkt indiceret, endosperm frø ude af stand til at syntetisere GA frigiver ABA at blokere embryonale vækst. Vi forventer derfor frø frakker i stand til at syntetisere GA at blokere væksten af embryoner i en SCBA modsætning frøskaller ude af stand til at syntetisere GA og ABA. Her bruger vi GA1-21 (Salk indsættelse linje Salk_109115) mutant frø bærer en T-DNA indsættelse forstyrre GA1 genet (tiltrædelse AT4G02780) koder ent-copalyl difosfat syntase, hvilket er afgørende for GA biosyntese 14 (SALK_109115 indsættelse linje i GA1 (Col økotype) er refereret i SALK SIGNAL databasen 15 ( http://signal.salk. Edu /).
I overensstemmelse med tidligere resultater 13, kunne GA1-21-mutant frø ikke spire 80 timer efter frø imbibition (Figur 3, Panel 1). I kontrast og yderligere i overensstemmelse med tidligere resultater 13, frøskal fjernelse udløste GA1-21 embryo vækst (Figur 3, panel 2), medmindre ABA var til stede i mediet (Figur 3, panel 3).
Panel 4 i figur 3 blev taget 80 timer efter frø opsugning og viser en SCBA med GA1-21-embryoner på en seng på 80 GA1-21-frøskaller. I overensstemmelse med vores hypotese, GA1-21-mutant frøkapper blokerede væksten af GA1-21 embryoner.
Tidligere arbejde viste, at frøskallen i hvilende frø syntetiserer og frigiver ABA mod embryoet som et resultat af konstitutiv ekspression af GA-respons DELLA faktor RGL2, som fremmer ABA akkumulering i indsugesfrø 6,11. Under forhold, hvor GA-syntese er blokeret den DELLA faktor RGL2 konstitutivt akkumuleres og fremmer ABA ophobning 11. Fravær af RGL2 og ABA-syntese i GA1-21-frøskaller forventes derfor at tillade vækst af GA1-21-embryoer i en SCBA. For at teste denne hypotese anvendte vi aba2-1 mutant allel (Col økotype) mangelfuld i ABA syntese som et resultat af en punktmutation i genet, der koder Xanthosin dehydrogenase (AT1G52340) og rgl2-14 T-DNA-insertionen linje (Salk_027654, Col økotype) 16.
Figur 1. Procedure for frø dissektion. A) Diagram der beskriver hvordan man laver afkortede pincet for frø dissektion. Tang kan afkortes med en saks eller knibtang. Når tangen er lukket sammenstillet afkortede tips Shou. ld dækker en overflade på størrelse med et frø B) Trin 1: to side om side rektangulære sterile Whatman 3MM papirer er lagt på en petriskål plade indeholdende MS fast medium. Trin 2: frø overføres på overfladen af Whatman papir 4 timer efter opsugning. Trin 3: dissektion procedure kræver at holde frø mod Whatman papiret ved hjælp af afkortede pincet. Trin 4: En kanylen bruges til at skære frøskallen som vist. Trin 5 og 6: sidestillede tips af de lukkede pincet bruges til forsigtigt at skubbe foster ud af frøskallen gennem webstedet af snittet.
Figur 2. . Procedure for samling af frøskal strøelse assay Trin 1: Et rektangulært stykke nylonnet er lagt på en petriskål plade indeholdende MS fast medium. Trin 2 og 3: dissekeret embryoner og frøskaller er forsigtigtflyttes til kanterne af tangen ved hjælp af kanylen før overføre dem på nylonnet. Trin 4 og 5: Saml en cirkulær og enkelt lag af frøskaller og bortskaffe embryoner som en cirkulær enkelt lag på midten af den samlede frøkappe seng.
Figur 3. Repræsentative resultater med frø materiale i stand til at syntetisere GA. Frøskal sengetøj assays hjælp frøskaller og embryoner dissekeret fra GA1 (GA1-21) mutant frø, ude af stand til at syntetisere GA. Paneler viser plantemateriale som beskrevet i figur 80 timer efter frø opsugning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frøskallen sengetøj assay (SCBA) her beskrevne procedure er i princippet anvendelse på enhver omstændighed, hvor Arabidopsis spiring er blokeret (eller forsinket), og hvor endosperm er mistænkt for at gennemføre denne anholdelse. Sidstnævnte kan dokumenteres ved at fjerne frøskallen (Testa og endosperm) og observere, at embryonale vækst provenu hurtigere i forhold til der ses, når fostre er omgivet af frøskallen. Spiring kan være blokeret som reaktion på særlige miljømæssige fysiske parametre (fx vand potentielle eller lyskvalitet), eller i specifikke genetiske baggrunde (f.eks fravær af GA syntese som i GA1 mutanter, se figur 3).
Der findes ingen generelle regler for antallet af frøskaller og embryoner, der skal anvendes til en SCBA. Dette afhænger af frø batch (og især dens friskhed) og type forsøg, der skal udføres. Det er derfor afgørende for adjust mængden af dissekeret materiale til hvert enkelt tilfælde ved at overvåge vækst på embryoner på sengen af frøskaller på daglig basis. Det er dog nødvendigt regel få frøskaller, når der anvendes meget sovende Arabidopsis økotyper. Nedenfor er typiske mængder af frøskaller og embryoner, der blev brugt med succes ved samling SCBAs:
SCBA med hvilende frø materiale 6:
* Friskhøstede (dvs. dvale) Kap Verde Island økotype (CVI): Brug 10 embryoner og 20 frøskaller.
* Friskhøstede Landsberg (Ler) frø: Brug 10 embryoner og 80 frøskaller.
SCBA i fravær af gibberellin (GA)-biosyntese (figur 3):
* GA1 mutant frø (Columbia - Col - økotype): Brug 10 embryoner og 80 frøskaller.
* Wild typen Col frø med 10 pM paclobutrazol (en hæmmer af GA biosyntese), i spiring medium: Brug 10 embryos og 100 frøskaller. Tilføj Paclobutrazol når mediet afkøles til 50 ° C før udhældning i petriskålen.
SCBA efter en puls på langt rødt (FR) lys 9:
* Brug 12 embryoner og 100 frøskaller.
Den eneste begrænsning af SCBA teknik er, at det kræver tålmodighed og fingerfærdighed så hurtigt samle dissekerede seed-materialer, mens ikke at dræbe embryoner. En erfaren forsker kan dissekere 100 frø inden for 20-30 min. Dog kan mindre erfarne brugere skal 1 time og forventer fosterskader. Til vores viden er der hidtil ingen alternative teknikker til at udforske den rolle, endosperm til styring af frøspiring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation og staten i Genève.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
