Summary
אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.
Abstract
האנדוספרם ארבידופסיס מורכב משכבה תא בודדת המקיפה את העובר הבוגר ומשחקת תפקיד חיוני כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים או שזרעי nondormant מוקרנים על ידי אדום רחוק (FR) דופק את אור. על מנת לקבל תובנות לגבי המנגנונים גנטיים המולקולריים שבבסיס פעילות דיכוי הנביטה המופעל על ידי האנדוספרם נוסף, assay "מצעי מעיל זרע" (SCBA) תוכנן. SCBA הוא הליך נתיחת מפרידה פיזית בין מעילי זרע ועוברים מן הזרעים, המאפשר ניטור הצמיחה של עוברים בשכבה בסיסית של מעילי זרע. למרבה הפלא, SCBA reconstitutes פעילות דיכוי הנביטה של מעיל הזרע בהקשר של תרדמת זרעים ובקרת FR תלויה של נביטת זרעים. מאז SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל רדום, nondormant וזרעים מהונדסים גנטי וחומרים עובריים, המסלולים הגנטיים שליטה נביטה ובמיוחד אופעל דוושה בהאנדוספרם והעובר יכולה להיות גזור. כאן אנו מפרט את ההליך כדי להרכיב SCBA.
Introduction
בזרעים בוגרים ארבידופסיס, מעיל הזרע מורכב מטסטה, שכבה חיצונית של רקמה מתה ממוצא אימהי, והאנדוספרם, שכבת תא בודדת של רקמה חי ישירות המקיפה את העובר 1. האנדוספרם והעובר נגזרים מאירועים נפרדים הפריה: האנדוספרם הוא רקמת triploid עם שתי אימהיים ואבהי גנום אחד ואילו העובר הוא רקמה דיפלואידי עם אימהי אחד והגנום אבהי אחד 2.
הפונקציה העיקרית שהוקצתה באופן מסורתי להאנדוספרם היא זה של רקמה תזונתית. עם זאת, זה הופך ברור יותר ויותר שהאנדוספרם גם ממלא תפקיד מרכזי לשלוט נביטת זרעים. רעיון זה הפך ראשון נראית לעין במקרה של תרדמת, תכונה הוצגה על ידי זרעי הפיק חדש. זרעים רדומים מצליחים לנבוט למרות נוכחותם של תנאי נביטה חיוביים. זרעים מאבדים תרדמתם אחרי תקופת הבשלה והפכו nondormant, כלומר הם ינבטו כאשר הם נחשפים לתנאי נביטה חיוביים. במיני צמחים רבים, כוללים צמח מודל ארבידופסיס, מעיל הזרע דרוש לחלוטין כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים מאז הסרת מעיל זרע מעוררת צמיחה עוברית והורקת 3,4. בארבידופסיס, Bethke et al. ציין כי הנביטה נשארה מודחקת לאחר הסרת טסטה, תוך שמירה על האנדוספרם שמקיף את האנדוספרם 5. תצפיות אלו מצביעות על כך שמאוד האנדוספרם הוא הרקמה בתוך מעיל זרע הפעלת פעילות דיכוי בעובר. עם זאת, ניסויי הסרת מעיל זרע לא בהכרח יעזרו להבהיר את אופי פעילות דיכוי הנביטה הניתן על ידי מעיל הזרע ולא בזיהוי גנים הליישם אותה.
לאחרונה הצגנו assay מצעי מעיל זרע (SCBA) שבו מעילי זרע ועוברים מופרדים פיזי אך המשיכו בקרבת proxiMity כך שפעילות דיכוי הנביטה הניתנת על ידי האנדוספרם נשמר 6. SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל זרע רדום, nondormant, ומהונדס גנטי וחומרים עובריים. כתוצאה מכך, יכולים להיות גזורים המסלולים הגנטיים השליטה נביטה ובמיוחד פועלים בהאנדוספרם והעובר. SCBA שימש בהקשר של תרדמת כדי להראות שהאנדוספרם משחרר חומצת phytohormone abscisic (ABA) לעובר להדחיק הצמיחה שלה 6. יתר על כן אנו יכולים להשתמש SCBA לזהות את מסלולי איתות הפועלים בהאנדוספרם ורקמות עובריים כדי לקדם תרדמת.
התפקיד של האנדוספרם לשלוט נביטה התחזק עוד יותר על ידי בהתחשב המקרה של זרעי nondormant נחשפו לדופק של אור אדום רחוק (FR). מוקדם על שקי זרע דופק FR אור ידוע לעכב נביטה 7,8. כאשר מעילי זרע הוצאו מזרעי דופק של FR אורלא היה מסוגלת לעכב נביטה, חזק המצביע על כך האנדוספרם יכול גם לדכא את הנביטה של זרעי nondormant 9. למרבה הפלא, SCBA יכול לשמש גם כדי לסכם עיכוב FR תלוי של נביטה. זה אפשר להראות כי כי עיכוב FR תלוי של נביטת זרעים הוא גם תהליך כרוך שחרור ABA מהאנדוספרם 9. יתר על כן, SCBA אפשר זיהוי מסלולי אור איתות השונים הפועלים בהאנדוספרם והעובר לשלוט נביטת זרעי nondormant בתגובה לאותות אור 9,10.
SCBA נראה אפוא להיות טכניקה אמינה לחקור את הפונקציה של האנדוספרם בהקשר של השליטה על נביטת זרעים. זהו גם כלי רב עוצמה על מנת להעריך במבחנה אם הגנים חשודים לשלוט נביטה לפעול בהאנדוספרם, העובר או שניהם הרקמות. כאן אנו פירוט הנדרש כדי להרכיב SCBA את השלבים השונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ברגע שSCBA מורכב, הצמיחה של עוברים מנוטרת על פני כמה ימים. לכן, לפני הליך הזרע לנתיחה וההרכבה של SCBA, צריך לעקר זרעים כדי למנוע זיהומים בעתיד שיכול למנוע הערכה נכונה של ההשפעה של חומר מעיל זרע על צמיחה עוברית.
1. עיקור זרע
- יוצקים 50-60 μl של זרעי ארבידופסיס בוגרים ויבשים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולהכין פתרון אתנול 70%.
- הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול פתרון לצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים ולנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל"ד בvortexer.
- צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור.
- לשאוב את פתרון אתנול 70% באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של צינור microcentrifuge.
- הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי לא הוא צינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים.
- לנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל"ד.
- צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור.
- הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים מים סטריליים לצינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. ודא כי זרימת המים homogenously משהה את הזרעים בתוך הצינור. המטרה כאן היא למנוע טלטול נוסף, כדי לשמור על שלמות הגרעינים.
- בואו הזרעים להתיישב על ידי כוח הכבידה בחלק התחתון של הצינור על ידי השארת הצינור עדיין ל30 שניות. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור.
- חזור על פעולה ארבע פעמים על שלבים 1.8-1.9. בסך הכל הליך העיקור לוקח בערך 30 דקות.
2. זרעי ציפוי
ontent "> כל הצעדים הבאים מבוצעים בתוך זרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים.- הכן צלחת צלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ, 20 גובה מ"מ) המכיל 30 מיליליטר של מדיום נביטה שהוכן על ידי מעוקר תמיסה המכילה 4.3 g / L Murashige ובינוני Skoog ב2.5 מ"מ 2 - (N-morpholino) חומצת ethanesulfonic (MES-KOH ; PH 5.7) ואגר 0.8 גר '/ ליטר. תן הפתרון להתקרר באמבט מים 50 מעלות צלזיוס לפני ששופך אותה על צלחת צלחת פטרי.
- הוסף 200 μl של מים מזוקקים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים. Resuspend את הזרעים ולהעביר אותם על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות פיפטה סטנדרטית עם טיפ 1 מיליליטר.
- הסר את המים המקיפים את הזרעים על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות קצה יניקת ואקום.
- השאר את צלחת פטרי המכילה את הזרעים בלי המכסה שלו בתוך הזרימה למינרית לשעה 2 לייבוש נוסף. סגור את צלחת פטרי עם המכסה ולתת לזה לעמוד מתחת למינריתזרימת ממשלה כ -90 דקות, כך שבערך 4 שעות חלפו מאז תחילתו של הליך עיקור זרעים (שלב 1.2).
3. Dissection הזרע
השלבים הבאים מחייבים עבודה עם סטראו הונח בתוך ארון הזרימה למינרית. מלקחיים דומון # 5 עם טיפים קטומים (כלומר קהה) מקל באופן משמעותי את הטיפול בזרעים (איור 1 א).
- הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של שני מסמכים זה לצד זה מלבני הבינוני סטרילי Whatman 3MM (1.5 סנטימטר x 1.0 סנטימטר; איור 1, שלב 1). טמן 3MM נייר מעוקר ב החיטוי.
- העבר את הזרעים על ניירות Whatman 3MM באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 1, שלב 2).
- תחזיק זרע בודד נגד עיתון Whatman 3MM ידי הלחיצה בעדינות את הזרע באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (
- חותכים את קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) של הזרע באמצעות מחט מזרק (מזרק מיליליטר למשל U100 אינסולין מזרק + 1, 0.33 מ"מ (29 G) x 12.7 מ"מ) (איור 1 ב, שלב 4). הצורה של זרעי ארבידופסיס היא ellipsoidal ומומלצת לחתוך את מעיל הזרע לאורך הציר למחצה העיקרי הארוך ביותר הקרוב ככל האפשר למקום שבו הפסיגים מצטרפים לradicle (כלומר הרחק בקצה הקיצוני). זה עוזר לשחרורו הבטוח של העובר בשלב הבא של הליך הנתיחה.
- לדחוף את הזרע נגד עיתון Whatman 3MM באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (איור 1, שלב 5). צעד זה משחרר את העובר מתוך מעיל הזרע דרך הפתח שנוצר בשלב 3.4 (איור 1 ב, שלב 6). מומלץ ליישם את הדחיפה בזרע שבו קצה הפסיגים נמצא בקרוב ביותר לקצה radicle (כלומר משם frאום הפתיחה).
4. הרכבה של מעיל זרע מצעים Assay (SCBA)
ראה דיון לבחירה הנכונה של מספר שכבות זרע והעוברים.
- הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של מדיום חתיכת סטרילי מלבנית (3.5 סנטימטר x 5.0 סנטימטר) של רשת ניילון (איור 2, שלב 1).
- כדי למנוע נזק, ניתן להעביר עוברים ומעילי זרע אל פני השטח של הקצוות המתכתיים של המלקחיים על ידי בעדינות דוחף אותם באמצעות מחט המזרק (איור 2, שלב 2). העברת עוברים ומעילי זרע על רשת ניילון (איור 2, שלב 3).
- להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע באמצעות המלקחיים הקהות ואת המחט ולוודא כי מעילי זרעים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר (איור 2, שלב 4). נסה לחשוף עד כמה שניתן את פתיחת מעיל הזרע שנוצרה על ידימחט כלפי מעלה. צעד זה לא נבדק באופן שיטתי. עם זאת, זה יכול להגביר את היעילות של SCBA מאז חומרי diffusible עיכוב הצמיחה של העובר צפויים לנטרל ישירות לכיוון את העובר ולא ממנו.
- מניחים את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע שנאספה בשלב 4.3 (איור 2, שלב 5). להבטיח כי העוברים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר.
- דגירה SCBAs תחת אור הרציף (40 μmol / m 2 של EC) בשעה 20-21 ° C. במקרה שבו דופק FR משמש לעצור את הנביטה, להרכיב SCBA תחת אור רגיל, להחיל את דופק FR כמתואר 9 ולהשאיר צלחת פטרי בחושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העבודות קודמות הראו כי זרעים שעברו מוטציה מסוגל לסנתז GA לא היו מסוגלים לנבוט כתוצאה מהצטברות הגבוהה ABA בזרעי 11,12. עם זאת, חוסר היכולת לנבוט דורשת מעיל הזרע מאז הסרתו מעוררת 13 צמיחה עוברית. זה מאוד הצביע על כך שהאנדוספרם של זרעים מסוגלים לסנתז GA מפרסם ABA לחסום צמיחה עוברית. לכן אנו מצפים מעילי זרעים מסוגלים לסנתז GA כדי לחסום את הצמיחה של עוברים בSCBA ניגוד מעילי זרע מסוגלים לסנתז GA וABA. כאן אנו משתמשים ga1-21 (קו הוספת סאלק Salk_109115) זרעים שעברו מוטציה שנשאו החדרת T-DNA לשבש את גן GA1 (הצטרפות AT4G02780) קידוד synthase דיפוספט ent-copalyl, שהוא חיוני לביוסינתזה GA 14 (קו הוספת SALK_109115 בGA1 (Col ecotype) הוא הפניה באתר 15 (סאלק אות http://signal.salk. Edu /).
עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות 13, ga1-21 זרעים שעברו מוטציה לא יכולים לנבוט 80 שעות לאחר שקיה זרע (איור 3, 1 לוח). בניגוד לכך ועקבי יותר עם תוצאות קודמות 13, הסרת קליפת זרע מופעלת ga1-21 צמיחת עובר (איור 3, לוח 2), אלא אם כן ABA היה נוכח במדיום (איור 3, לוח 3).
לוח 4 באיור 3 נלקח 80 שעות לאחר שקיה זרע ומראה SCBA עם ga1-21 עוברים על מצע של 80 ga1-21 מעילי זרע. עולה בקנה אחד עם ההשערה שלנו, ga1-21 מעילי זרע מוטנטי חסמו את הצמיחה של ga1-21 עוברים.
עבודות קודמות הראו כי בזרעים רדומים מעיל הזרע מסנתז ומשחרר ABA לעובר כתוצאה מביטוי המכונן של RGL2 גורם DELLA GA-התגובה, אשר מקדמת את הצטברות ABA בספגזרעים 6,11. בתנאים שבו סינתזת GA חסומה RGL2 גורם DELLA constitutively מצטבר ומקדם הצטברות ABA 11. היעדר RGL2 וסינתזת ABA בga1-21 מעילי זרע צפוי ולכן כדי לאפשר את הצמיחה של ga1-21 עוברים בSCBA. כדי לבדוק השערה זו השתמשנו באלל aba2-1 המוטציה (ecotype Col), חסר בסינתזת ABA כתוצאה ממוטציה נקודתית בגן המקודד דהידרוגנז Xanthosin (AT1G52340) וקו הוספת rgl2-14 T-DNA (Salk_027654, ecotype col) 16.
איור 1. הליך לנתיחה זרע. א) תרשים המתאר איך לעשות מלקחיים קטומים לנתיחה זרע. יכולים להיות מקוצצים מלקחיים באמצעות מספריים או מלקחיים. כאשר המלקחיים סגור shou טיפים קטועים זה לצד זה. כיסוי ld משטח בערך בגודל של זרע ב ') שלב 1: שני צד בניירות סטרילי מלבניים צד Whatman 3MM מונחים על צלחת צלחת פטרי המכילה בינוני מוצק טרשת נפוצה. שלב 2: זרעים מועברים על פני השטח של ניירות Whatman 4 שעות לאחר שקיה. שלב 3: ההליך לנתיחה דורש מחזיק הזרע נגד עיתון Whatman באמצעות המלקחיים הקטומים. שלב 4: מחט מזרק משמש לחיתוך מעיל הזרע כפי שמוצג. שלבים 5 ו -6: טיפים לצד זה של המלקחיים הסגורים המשמשים לדחוף בעדינות את העובר מחוץ למעיל הזרע דרך האתר של החתך.
איור 2. . הליך להרכבה של assay מצעי מעיל זרע שלב 1: פיסת רשת ניילון מלבנית מונחת על צלחת צלחת פטרי המכילה בינוני מוצק טרשת נפוצה. שלב 2 ו -3: עוברים גזורים ומעילי זרע הם בעדינותעבר לקצות המלקחיים באמצעות מחט המזרק לפני העברתם על גבי רשת ניילון. שלב 4 ו -5: להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע ולהשליך את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע התאסף.
איור 3. נציג תוצאות עם חומר זרע מסוגל לסנתז GA. מבחני מצעי מעיל זרע באמצעות מעילי זרע ועוברים גזורים מga1 זרעים (ga1-21) מוטציה, לא מסוגלים לסנתז GA. פנלים להראות חומר צמחי כמתואר באיור שעה 80 לאחר שקיה זרע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך assay מצעי מעיל הזרע (SCBA) שתואר כאן הוא בעיקרון חל על כל נסיבות שבי נביטת זרעי ארבידופסיס חסומה (או עיכוב) ושבו האנדוספרם חשד לביצוע המעצר הזה. יכול להיות שמעיד האחרון על ידי הסרת קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) והתבוננות שתמורת צמיחה עוברית מהר יותר ביחס לזה שנצפתה כאשר עוברים מוקפים בקליפת הזרע. נביטה עשויה להיחסם בתגובה לפרמטרים פיזיים סביבתיים מסוימים (לדוגמא: פוטנציאל מים או איכות אור) או ברקע גנטי ספציפי (למשל היעדר סינתזת GA כמו במוטציות ga1, ראה איור 3).
אין כללים כלליים בדבר מספר מעילי זרע והעוברים שישמשו לSCBA. זה תלוי במנת הזרע (ובפרט הרעננות שלה) ואת הסוג של ניסוי שיבוצע. לכן זה קריטי לadjust כמות חומר גזור לכל מקרה ומקרה על ידי ניטור הצמיחה על העוברים על המיטה של מעילי זרע על בסיס יומי. עם זאת, בדרך כלל כמה מעילי זרע נחוצים כאשר ecotypes ארבידופסיס הרדום מאוד נמצא בשימוש. מוצגים להלן כמויות אופייניות למעיילי זרע ועוברים שהיו בשימוש בהצלחה כאשר הרכבת SCBAs:
SCBA עם חומר זרעים רדום 6:
* טרי שנקטפו ecotype (כלומר רדום) קייפ ורדה איילנד (CVI): השתמש 10 עוברים ו20 מעילי זרע.
* זרעים לנדסברג שנקטפו טרי (הימלר): השתמש 10 עוברים ו80 מעילי זרע.
SCBA בהעדר ג'יברלין (GA) ביוסינתזה (איור 3):
* זרעים שעברו מוטציה ga1 (קולומביה - Col - ecotype): השתמש 10 עוברים ו80 מעילי זרע.
* זרעי Col סוג פרוע עם 10 paclobutrazol מיקרומטר (מעכב של ביוסינתזה GA) במדיום הנביטה: שימוש 10 עוברים ו100 מעילי זרע. הוספת Paclobutrazol כאשר המדיום הוא התקרר ל50 מעלות צלזיוס לפני שנשפך לתוך צלחת פטרי.
SCBA אחרי דופק של (FR) אור אדום רחוק 9:
* השתמש 12 עוברים ו100 מעילי זרע.
המגבלה היחידה של טכניקת SCBA היא שזה דורש סבלנות ומיומנות כדי להרכיב במהירות את חומרי זרע גזורים ואילו לא הורג את העוברים. חוקר מנוסה יכול לנתח 100 זרעים בתוך 20-30 דקות. עם זאת, משתמשים מנוסים פחות ייתכן שיצטרכו שעה 1 ומצפים לנזק עוברי. למיטב ידיעתנו יש כל כך הרבה אין טכניקות חלופיות כדי לחקור את תפקידה של האנדוספרם לבקרה של נביטת זרעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהשויצריים הקרן הלאומית למדע ועל ידי המדינה של ז'נבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
