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Biology

आनुवांशिक रूप से लगाने के लिए एक बीज कोट बिस्तर परख Published: November 9, 2013 doi: 10.3791/50732
Automatic Translation
1, 1
1Département de Botanique et de Biologie Végétale, Université de Genève

Summary

हम Arabidopsis thaliana के बीज से एक बीज कोट बिस्तर परख (SCBA) को इकट्ठा करने की प्रक्रिया मौजूद है. SCBA आनुवंशिक रूप से और इन विट्रो में पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होना दिखाया गया था कि कैसे निष्क्रिय बीज में और प्रकाश संकेत के जवाब में एण्डोस्पर्म नियंत्रण बीज अंकुरण. SCBA एण्डोस्पर्म भ्रूण के विकास को प्रभावित करने का संदेह है, जहां किसी भी स्थिति के तहत लागू सिद्धांत में है.

Abstract

Arabidopsis एण्डोस्पर्म परिपक्व भ्रूण आसपास और निष्क्रिय बीजों के अंकुरण या एक (एफआर) अब तक लाल बत्ती नाड़ी द्वारा विकिरणित nondormant बीज की कि को रोकने के लिए एक आवश्यक भूमिका निभा रहा है एक एकल कोशिका परत के होते हैं. आगे एण्डोस्पर्म द्वारा लगाए अंकुरण दमनकारी गतिविधि अंतर्निहित आणविक आनुवंशिक तंत्र में जानकारी हासिल करने के लिए, एक "बीज कोट बिस्तर" परख (SCBA) तैयार किया गया था. SCBA शारीरिक रूप से बीज कोट का एक अंतर्निहित परत पर भ्रूण के विकास को निगरानी की अनुमति देता है, जो बीज से बीज कोट और भ्रूण को अलग एक विच्छेदन की प्रक्रिया है. उल्लेखनीय है, SCBA बीज निद्रा और बीज अंकुरण की एफआर पर निर्भर नियंत्रण के संदर्भ में बीज कोट का अंकुरण दमनकारी गतिविधियों reconstitutes. SCBA, निष्क्रिय nondormant और आनुवंशिक रूप से संशोधित बीज कोट और भ्रूण सामग्री, अंकुरण को नियंत्रित आनुवंशिक रास्ते के मिश्रित उपयोग की अनुमति देता है और विशेष रूप से सेशन के बादएण्डोस्पर्म और भ्रूण में erating विच्छेदित किया जा सकता है. यहाँ विस्तार एक SCBA इकट्ठा करने की प्रक्रिया में हम.

Introduction

Arabidopsis परिपक्व बीज, बीज कोट टेस्टा, मातृ मूल के मृत ऊतक के एक बाहरी परत, और एण्डोस्पर्म, सीधे भ्रूण 1 आसपास रहते ऊतक का एक एकल कोशिका परत से बना है. एण्डोस्पर्म और भ्रूण अलग निषेचन घटनाओं से प्राप्त कर रहे हैं: भ्रूण एक मातृ और एक पैतृक जीनोम 2 के साथ एक द्विगुणित ऊतक है जबकि एण्डोस्पर्म मातृ और एक पैतृक जीनोम दो के साथ एक triploid ऊतक है.

परंपरागत रूप से एण्डोस्पर्म को सौंपा मुख्य समारोह एक पोषक ऊतक की है. हालांकि, यह एण्डोस्पर्म भी बीज अंकुरण को नियंत्रित करने के लिए एक केंद्रीय भूमिका निभाता है कि तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है. यह धारणा, निद्रा के मामले में नव निर्मित बीज द्वारा प्रदर्शित एक विशेषता पहले स्पष्ट हो गया. प्रसुप्त बीज अनुकूल अंकुरण की स्थिति की मौजूदगी के बावजूद उगना असफल. बीज एक पकने की अवधि के बाद उनकी निद्रा खो और nondorman बनअनुकूल अंकुरण की स्थिति से अवगत कराया जब टी, यानी वे अंकुरित होना होगा. मॉडल संयंत्र Arabidopsis सहित कई प्रजातियों के पौधे, में, बीज कोट बिल्कुल बीज कोट हटाने भ्रूण विकास और 3,4 हरियाली से चलाता है के बाद से निष्क्रिय बीजों के अंकुरण को रोकने के लिए आवश्यक है. Arabidopsis में, Bethke एट अल. अंकुरण एण्डोस्पर्म 5 आसपास एण्डोस्पर्म को बनाए रखते हुए टेस्टा हटाने के बाद दमित बने रहे मनाया. इन टिप्पणियों दृढ़ता से एण्डोस्पर्म भ्रूण पर एक दमनकारी गतिविधि exerting बीज कोट के भीतर ऊतक है कि संकेत दिया. हालांकि, बीज कोट हटाने प्रयोगों जरूरी बीज कोट द्वारा प्रदान की अंकुरण दमनकारी गतिविधि की प्रकृति को स्पष्ट और न ही इसे लागू कि जीन की पहचान करने में मदद नहीं करते.

हमने हाल ही में बीज कोट और भ्रूण शारीरिक रूप से अलग कर दिया, लेकिन करीब proxi में रखा जाता है जहां एक बीज कोट बिस्तर परख (SCBA) शुरू कीmity एण्डोस्पर्म द्वारा प्रदान की अंकुरण दमनकारी गतिविधि 6 बनाए रखा है कि इतनी. SCBA, निष्क्रिय nondormant, और आनुवंशिक रूप से संशोधित बीज कोट और भ्रूण सामग्री के मिश्रित उपयोग की अनुमति देता है. नतीजतन, अंकुरण और विशेष रूप से एण्डोस्पर्म और भ्रूण में सक्रिय नियंत्रित आनुवंशिक रास्ते विच्छेदित किया जा सकता है. SCBA एण्डोस्पर्म 6 इसके विकास को दबाने की भ्रूण की ओर phytohormone abscisic एसिड (ए.बी.ए.) विज्ञप्ति दिखाने के लिए कि निद्रा के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा हम निद्रा को बढ़ावा देने के संकेत दे एण्डोस्पर्म में सक्रिय रास्ते और भ्रूण के ऊतकों की पहचान करने के लिए SCBA इस्तेमाल कर सकते हैं.

अंकुरण को नियंत्रित करने के एण्डोस्पर्म की भूमिका आगे दूर लाल (एफआर) प्रकाश की एक नाड़ी के संपर्क में nondormant बीज के मामले पर विचार से मजबूत बनाया गया था. प्रारंभिक बीज इम्बीबिशन पर एक एफआर प्रकाश नाड़ी अंकुरण 7,8 बाधित करने के लिए जाना जाता है. बीज कोट बीज से एफआर प्रकाश की एक नाड़ी हटा रहे थे जबदृढ़ता से एण्डोस्पर्म भी nondormant बीज 9 के अंकुरण को दबाने कर सकते हैं, सुझाव है कि अंकुरण को बाधित करने में असमर्थ था. उल्लेखनीय है, SCBA भी अंकुरण की एफआर पर निर्भर निषेध पुनरावृत्ति करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह बीज अंकुरण की है कि वित्तीय संसाधन पर निर्भर निषेध भी एण्डोस्पर्म 9 से ए.बी.ए. रिहाई शामिल प्रक्रिया है कि दिखाने के लिए अनुमति दी. इसके अलावा, SCBA एण्डोस्पर्म और प्रकाश cues 9,10 के जवाब में nondormant बीज अंकुरण को नियंत्रित करने के भ्रूण में सक्रिय विभिन्न प्रकाश संकेत दे रास्ते की पहचान करने की अनुमति दी.

SCBA बीज अंकुरण के नियंत्रण के संदर्भ में एण्डोस्पर्म के समारोह में पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक होने के लिए इसलिए दिखाई देता है. यह भी अंकुरण को नियंत्रित करने के लिए संदिग्ध जीन एण्डोस्पर्म, भ्रूण या दोनों के ऊतकों में संचालित है कि क्या इन विट्रो में आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यहाँ विस्तार एक SCBA इकट्ठा करने के लिए आवश्यक विभिन्न कदम हम.

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Protocol

SCBA इकट्ठे हो जाने के बाद, भ्रूण के विकास को कई दिनों से नजर रखी है. इसलिए, SCBA के बीज विच्छेदन की प्रक्रिया और विधानसभा से पहले, एक भ्रूण के विकास पर बीज कोट सामग्री के प्रभाव का उचित मूल्यांकन को रोकने सकता है कि भविष्य संदूषण से बचने के लिए बीज बाँझ की जरूरत है.

1. बीज बंध्याकरण

  1. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में परिपक्व और शुष्क Arabidopsis बीज के 50-60 μl डालो और एक 70% इथेनॉल समाधान तैयार करें.
  2. बीज युक्त microcentrifuge ट्यूब में 70% इथेनॉल के समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक vortexer में 1,200 rpm पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला.
  3. 3 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र microcentrifuge ट्यूब 4,000 XG पर ट्यूब के नीचे बीज ध्यान केंद्रित करने के लिए.
  4. ध्यान से microcentrifuge ट्यूब के नीचे बीज छोड़ने एक वैक्यूम सक्शन टिप का उपयोग कर 70% इथेनॉल समाधान aspirate.
  5. टी के लिए बाँझ आसुत जल के 1 मिलीलीटर जोड़ें वह microcentrifuge ट्यूब अभी भी बीज युक्त.
  6. 1,200 rpm पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला.
  7. 3 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र microcentrifuge ट्यूब 4,000 XG पर ट्यूब के नीचे बीज ध्यान केंद्रित करने के लिए. ध्यान से ट्यूब के नीचे बीज छोड़ने एक वैक्यूम सक्शन टिप का उपयोग कर पानी सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  8. अभी बीज युक्त microcentrifuge ट्यूब बाँझ पानी आसुत जल के 1 मिलीलीटर जोड़ें. पानी के प्रवाह homogenously ट्यूब के अंदर बीज निलंबित सुनिश्चित करें. यहाँ लक्ष्य बीज की अखंडता की रक्षा करने के लिए इतनी के रूप में आगे झटकों से बचने के लिए है.
  9. बीज 30 सेकंड के लिए अभी भी ट्यूब को छोड़ कर ट्यूब के नीचे गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने करते हैं. ध्यान से ट्यूब के नीचे बीज छोड़ने एक वैक्यूम सक्शन टिप का उपयोग कर पानी सतह पर तैरनेवाला aspirate.
  10. 1.8-1.9 कदमों चार बार दोहराएँ. कुल मिलाकर नसबंदी प्रक्रिया के बारे में 30 मिनट लगते हैं.

2. बीज चढ़ाना

"ontent> सभी बाद के चरणों बाँझ शर्तों को संरक्षित करने के लिए एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस-KOH - एक पेट्री डिश प्लेट 2.5 मिमी 2 में 4.3 ग्राम / एल Murashige और Skoog मध्यम युक्त समाधान autoclaving द्वारा तैयार अंकुरण माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त (100 मिमी व्यास, 20 मिमी ऊंचाई) तैयार करें , पीएच 5.7) और 0.8 ग्राम / एल अग्रवाल. समाधान पेट्री डिश प्लेट पर यह गिरने से पहले एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शांत हो जाओ.
  2. बीज युक्त ट्यूब को बाँझ आसुत जल के 200 μl जोड़ें. बीज Resuspend और एक 1 मिलीलीटर टिप के साथ एक मानक पिपेट का उपयोग अंकुरण माध्यम की सतह पर उन्हें स्थानांतरण.
  3. एक वैक्यूम सक्शन टिप का उपयोग अंकुरण माध्यम की सतह पर बीज आसपास के पानी को निकाल दें.
  4. आगे सुखाने के लिए 2 घंटे के लिए लामिना का प्रवाह कैबिनेट के अंदर अपनी ढक्कन बिना बीज युक्त पेट्री डिश छोड़ दें. ढक्कन के साथ पेट्री डिश को बंद करें और यह लामिना तहत खड़े हो जाओलगभग 4 घंटा बीज नसबंदी प्रक्रिया (1.2 चरण) की दीक्षा के बाद से पारित कर दिया है कि इतने के बारे में 90 मिनट के लिए कैबिनेट प्रवाह.

3. बीज विच्छेदन

निम्नलिखित कदम लामिना का प्रवाह हुड कैबिनेट के अंदर रखा एक stereomicroscope के साथ काम करने की जरूरत है. एक Dumont संदंश # 5 छोटा कर दिया है (यानी कुंद) सुझावों के साथ बहुत बीज की हैंडलिंग (चित्रा 1 ए) की सुविधा.

  1. अंकुरण माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त एक नया पेट्री डिश थाली तैयार है. मध्यम दो juxtaposed आयताकार बाँझ वाटमान 3mm कागजात (चित्रा 1 बी, चरण 1 1.5 सेमी x 1.0 सेमी) की सतह पर जगह. वाटमान 3mm कागज एक autoclave में निष्फल है.
  2. बाँझ संदंश (चित्रा 1 बी, चरण 2) का उपयोग वाटमान 3mm कागजात पर बीज स्थानांतरण.
  3. धीरे छोटा संदंश की juxtaposed कुंद सुझावों का प्रयोग (बीज दबाकर वाटमान 3mm कागज के खिलाफ एक व्यक्ति बीज पकड़ो
  4. (12.7 मिमी x जैसे U100 इंसुलिन सिरिंज + 1 मिलीलीटर सिरिंज, 0.33 मिमी (29 जी)) एक सिरिंज सुई का उपयोग बीज के बीज कोट (टेस्टा और एण्डोस्पर्म) में कटौती (चित्रा 1 बी, चरण 4). Arabidopsis बीज के आकार ellipsoidal है और यह cotyledons (यानी दूर कट्टरपंथी सिरे से) रेडिकिल शामिल हो गए हैं जहां जगह करने के लिए संभव के रूप में बंद सबसे लंबे समय तक अर्द्ध मुख्य धुरी के साथ बीज कोट में कटौती करने की सिफारिश की है. इस विच्छेदन की प्रक्रिया के अगले चरण में भ्रूण की सुरक्षित रिहाई में मदद करता है.
  5. छोटा संदंश (चित्रा 1 बी, चरण 5) की juxtaposed कुंद सुझावों का उपयोग वाटमान 3mm कागज के खिलाफ बीज पुश. यह कदम 3.4 कदम (चित्रा 1 बी, चरण 6) में बनाया खोलने के माध्यम से बीज कोट बाहर भ्रूण विज्ञप्ति. यह cotyledons की नोक रेडिकिल की टिप करने के लिए करीब में हैं जहां बीज (यानी दूर fr पर धक्का लागू करने की सिफारिश की हैओम खोलने).

4. विधानसभा बीज कोट के बिस्तर परख (SCBA)

बीज कोट और भ्रूण की संख्या का उचित विकल्प के लिए चर्चा देखें.

  1. अंकुरण माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त एक नया पेट्री डिश थाली तैयार है. मध्यम की सतह पर जगह नायलॉन जाल का एक बाँझ आयताकार टुकड़ा (3.5 सेमी x 5.0 सेमी) (चित्रा 2, चरण 1).
  2. नुकसान से बचने के लिए, भ्रूण और बीज कोट धीरे सिरिंज सुई (चित्रा 2, चरण 2) का उपयोग कर उन्हें आगे बढ़ाने संदंश की धातु किनारों की सतह के लिए ले जाया जा सकता है. भ्रूण स्थानांतरण और नायलॉन जाल (चित्रा 2, चरण 3) पर बीज कोट.
  3. बीज कोट जितना संभव हो उतना करीब निकटता (चित्रा 2, चरण 4) में हैं सुनिश्चित करते हुए कि पा संदंश और सुई का उपयोग बीज कोट के एक परिपत्र और एक परत को इकट्ठा करो. जितना संभव को बेनकाब करने का प्रयास करें द्वारा उत्पन्न बीज कोट उद्घाटनऊपर की तरफ सुई. यह कदम व्यवस्थित ढंग से जांच नहीं की गई थी. भ्रूण के विकास में बाधा प्रसारण पदार्थों सीधे इससे दूर भ्रूण की ओर बाहर फैलाना बजाय होने की संभावना है हालांकि, बाद से यह SCBA की क्षमता बढ़ सकते हैं.
  4. 4.3 चरण में इकट्ठे बीज कोट बिस्तर के केंद्र पर एक परिपत्र एकल परत (चित्रा 2, चरण 5) के रूप में भ्रूण रखें. भ्रूण जितना संभव हो उतना करीब निकटता में हैं सुनिश्चित करें.
  5. 20-21 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर प्रकाश (40 μmol / 2 मीटर है ईसी) के तहत SCBAs सेते एक एफआर नाड़ी, अंकुरण गिरफ्तार सामान्य प्रकाश के तहत SCBA इकट्ठा, के रूप में वर्णित एफआर पल्स 9 लागू करते हैं और अंधेरे में पेट्री डिश छोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है जहां मामले में.

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Representative Results

पिछला काम जीए synthesize करने में असमर्थ उत्परिवर्ती बीज बीज 11,12 में उच्च ए.बी.ए. संचय का एक परिणाम के रूप में अंकुरित होना करने में असमर्थ थे. इसके हटाने भ्रूण विकास 13 से चलाता है के बाद से हालांकि, उगना करने में असमर्थता बीज कोट की आवश्यकता है. यह दृढ़ता से जीए synthesize करने में असमर्थ बीज की एण्डोस्पर्म भ्रूण विकास खंड ए.बी.ए. जारी है कि संकेत दिया. इसलिए हम जीए और ए.बी.ए. synthesize करने में असमर्थ बीज कोट के विपरीत एक SCBA में भ्रूण के विकास को अवरुद्ध करने के लिए जीए synthesize करने के लिए बीज कोट असमर्थ उम्मीद है. यहाँ हम का उपयोग ga1 -21 (सॉल्क प्रविष्टि लाइन Salk_109115) गा जैवसंश्लेषण 14 GA1 में (SALK_109115 प्रविष्टि रेखा (के लिए आवश्यक है जो ईएनटी copalyl diphosphate synthase, एन्कोडिंग GA1 जीन (परिग्रहण AT4G02780) में खलल न डालें एक टी डीएनए प्रविष्टि ले जाने उत्परिवर्ती बीज कर्नल ecotype) सॉल्क संकेत डेटाबेस 15 (में संदर्भित है http://signal.salk. Edu /).

पिछले परिणाम 13 के अनुरूप, ga1-21 उत्परिवर्ती बीज बीज इम्बीबिशन के बाद 80 घंटे (चित्रा 3, कक्ष 1) उगना नहीं कर सका. ए.बी.ए. (चित्रा 3, पैनल 3) मध्यम में मौजूद था, जब तक इसके विपरीत है और पिछले परिणाम 13 के साथ आगे संगत में, बीज कोट हटाने ga1-21 भ्रूण विकास (चित्रा 3, पैनल 2) शुरू हो गया.

चित्रा 3 में पैनल 4 बीज इम्बीबिशन के बाद 80 घंटे में ले लिया और 80 ga1-21 बीज कोट के एक बिस्तर पर ga1-21 भ्रूण के साथ एक SCBA पता चलता था. हमारी परिकल्पना के अनुरूप, ga1-21 उत्परिवर्ती बीज कोट ga1-21 भ्रूण के विकास को अवरुद्ध कर दिया.

पिछला काम निष्क्रिय बीज में बीज कोट आत्मसात में ए.बी.ए. संचय को बढ़ावा देता है जो जीए प्रतिक्रिया डेला कारक RGL2, के विधान अभिव्यक्ति का एक परिणाम के रूप में भ्रूण की ओर ए.बी.ए. synthesizes और रिलीज से पता चला किबीज 6,11. जीए संश्लेषण अवरुद्ध है जहां शर्तों के तहत डेला कारक RGL2 अनिवार्यता से जम जाता है और ए.बी.ए. संचय 11 को बढ़ावा देता है. RGL2 के अभाव और ga1-21 बीज कोट में ए.बी.ए. संश्लेषण इसलिए एक SCBA में ga1-21 भ्रूण के विकास की अनुमति की उम्मीद है. हम जीन एन्कोडिंग Xanthosin डिहाइड्रोजनेज (AT1G52340) में एक बिंदु उत्परिवर्तन और rgl2-14 टी डीएनए प्रविष्टि रेखा (Salk_027654 का एक परिणाम के रूप में ए.बी.ए. संश्लेषण में कमी aba2-1 उत्परिवर्ती एलील (कर्नल ecotype) का उपयोग किया था इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, कर्नल ecotype) 16.

चित्रा 1
चित्रा 1. बीज विच्छेदन की प्रक्रिया. ए) आरेख बीज विच्छेदन के लिए छोटा संदंश बनाने के लिए कैसे का वर्णन. संदंश कैंची या आंखें उपयोग कर छोटा कर दिया जा सकता है. संदंश juxtaposed छोटा सुझावों Shou बंद कर दिया है. एलडी कवर एक बीज के आकार के बारे में एक सतह बी) चरण 1: पक्ष आयताकार बाँझ वाटमान 3mm कागजात द्वारा दो पक्ष एमएस ठोस मध्यम युक्त एक पेट्री डिश प्लेट पर रखे जाते हैं. चरण 2: बीज 4 घंटा इम्बीबिशन बाद वाटमान कागजात की सतह पर स्थानांतरित कर रहे हैं. चरण 3: विच्छेदन की प्रक्रिया को छोटा संदंश का उपयोग वाटमान कागज के खिलाफ बीज धारण की आवश्यकता है. चरण 4: एक सिरिंज सुई के रूप में दिखाया बीज कोट में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चरण 5 और 6: बंद संदंश के juxtaposed सुझावों धीरे कटौती की साइट के माध्यम से बीज कोट के बाहर भ्रूण पुश करने के लिए उपयोग किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. . बीज कोट बिस्तर परख की विधानसभा के लिए कदम प्रक्रिया 1: नायलॉन जाल का एक आयताकार टुकड़ा एमएस ठोस मध्यम युक्त एक पेट्री डिश प्लेट पर रखा जाता है. चरण 2 और 3: विच्छेदित भ्रूण और बीज कोट धीरे कर रहे हैंनायलॉन जाल पर उन्हें स्थानांतरित करने से पहले सिरिंज सुई का उपयोग संदंश के किनारों के लिए ले जाया गया. चरण 4 और 5: बीज कोट के एक परिपत्र और एक परत इकट्ठा और इकट्ठे बीज कोट बिस्तर के केंद्र पर एक परिपत्र एक परत के रूप में भ्रूण निपटाने.

चित्रा 3
चित्रा 3. जीए synthesize करने में असमर्थ बीज सामग्री के साथ प्रतिनिधि परिणाम है. जीए synthesize करने में असमर्थ ga1 (ga1-21) उत्परिवर्ती बीज से विच्छेदित बीज कोट और भ्रूण का उपयोग कर बीज कोट बिस्तर assays. बीज इम्बीबिशन के बाद आंकड़ा 80 घंटा में वर्णित के रूप में पैनलों संयंत्र सामग्री दिखा.

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Discussion

यहाँ वर्णित बीज कोट बिस्तर परख (SCBA) प्रक्रिया सिद्धांत में Arabidopsis बीज अंकुरण अवरुद्ध (या देरी) और जहां एण्डोस्पर्म इस गिरफ्तारी को लागू करने का संदेह है, जहां किसी भी परिस्थिति के लिए लागू है. बाद के बीज कोट (टेस्टा और एण्डोस्पर्म) को हटाने और भ्रूण बीज कोट से घिरे रहे हैं जब कि रिश्तेदार तेजी से भ्रूण विकास आय मनाया कि देख कर इसका सबूत किया जा सकता है. अंकुरण विशेष पर्यावरण शारीरिक मापदंडों (जैसे पानी संभावित या प्रकाश गुणवत्ता) या विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि में (ga1 म्यूटेंट में के रूप में जीए संश्लेषण की जैसे अभाव, चित्रा 3 देखें) के जवाब में अवरुद्ध हो सकता है.

बीज कोट और एक SCBA के लिए प्रयोग की जाने वाली भ्रूण की संख्या के विषय में कोई सामान्य नियम नहीं हैं. इस बीज बैच (और विशेष रूप से अपनी ताजगी) पर निर्भर करता है और प्रयोग के प्रकार का प्रदर्शन किया जाना है. यह adjus को इसलिए महत्वपूर्ण हैएक दैनिक आधार पर बीज कोट के बिस्तर पर भ्रूण पर विकास की निगरानी के द्वारा एक विशेष मामले के लिए विच्छेदित सामग्री की राशि टी. अत्यधिक निष्क्रिय एराबिडोप्सिस ecotypes इस्तेमाल कर रहे हैं फिर भी, जब आम तौर पर कुछ बीज कोट जरूरी हैं. SCBAs कोडांतरण जब सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है कि बीज कोट और भ्रूण की विशिष्ट मात्रा में नीचे दिखाया गया है:

निष्क्रिय बीज सामग्री के साथ 6 SCBA:
इस्तेमाल की 10 भ्रूण और 20 बीज कोट: * हौसले (यानी निष्क्रिय) केप वर्डे द्वीप ecotype (CVI) काटा.

* हौसले से काटा Landsberg (LER) बीज का प्रयोग करें: 10 भ्रूण और 80 बीज कोट.

Gibberellin (जीए) जैव संश्लेषण (चित्रा 3) के अभाव में SCBA:
* Ga1 उत्परिवर्ती बीज (कोलंबिया - कर्नल - ecotype): उपयोग 10 भ्रूण और 80 बीज कोट.

इस्तेमाल की 10 भ्रूण: 10 माइक्रोन paclobutrazol अंकुरण माध्यम में (जीए जैवसंश्लेषण के एक अवरोध) के साथ * जंगली प्रकार कर्नल बीजs और 100 बीज कोट. मध्यम पेट्री डिश में गिरने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है जब Paclobutrazol जोड़ें.

SCBA दूर लाल (एफआर) प्रकाश 9 की एक नाड़ी के बाद:
* 12 भ्रूण और 100 बीज कोट का प्रयोग करें.

SCBA तकनीक की ही सीमा भ्रूण हत्या नहीं करते हुए तेजी से विच्छेदित बीज सामग्री इकट्ठा करने के लिए इतनी के रूप में यह धैर्य और कौशल की आवश्यकता है. एक अनुभवी शोधकर्ता 20-30 मिनट के भीतर 100 बीज काटना कर सकते हैं. हालांकि, कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं को 1 घंटा जरूरत है और भ्रूण क्षति उम्मीद कर सकते हैं. हमारे ज्ञान करने के लिए बीज अंकुरण के नियंत्रण के लिए एण्डोस्पर्म की भूमिका का पता लगाने के लिए कोई वैकल्पिक तकनीक अब तक कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा और जिनेवा के राज्य द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer Comfort Eppendorf AG 5355 000.011 Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort INTEGRA Biosciences AG 158 310 Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm) Greiner Bio-One GmbH 664 102 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog Sigma-Aldrich M5524 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES Sigma-Aldrich M3671 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar) Duchefa Biochemie B.V. P1001 Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5 Fine Science Tools GmbH 11251-10 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle BD Micro-Fine 324827 BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX) SEFAR AG 03-50/31 Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber CLF Plant Climatics Percival I-30BLLX CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol Sigma-Aldrich 46046 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 81 प्रौद्योगिकी उद्योग और कृषि जीवन विज्ञान (सामान्य) बीज अंकुरण बीज कोट इंडोस्पर्म निद्रा सुदूर लाल बत्ती abscisic एसिड gibberellins डेला कारकों का नियंत्रण
आनुवांशिक रूप से लगाने के लिए एक बीज कोट बिस्तर परख<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कैसे इंडोस्पर्म नियंत्रण बीज अंकुरण में<em&gt; Arabidopsis thaliana</em
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Lee, K. P., Lopez-Molina, L. A Seed… More

Lee, K. P., Lopez-Molina, L. A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (81), e50732, doi:10.3791/50732 (2013).

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